Characterization of the human tlymphocyte phosphoproteome and secretome using proteomic techniques

90alpha secretion and its function in tumor malignancy. Proc Natl Acad Sci USA 106: 21288–21293. 115 192. Wasinger VC, Zeng M, Yau Y (2013) Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics 2013: 180605. 193. Werner T, Sweetman G, Savitski MF, Mathieson T, Bantscheff M, Savitski MM (2014) Ion coalescence of neutron encoded TMT 10-plex reporter ions. Anal Chem 86(7): 3594-3601. 194. White FM, Wolf-Yadlin A (2016) Methods for the Analysis of Protein Phosphorylation-Mediated Cellular Signaling Networks. Annu Rev Anal Chem 9(1): 295-315. 195. Wigmore C, Shan B, Verhaert PD (2015) Quantitative analysis of endogenous peptides with LC-MS/MS directly from complex secretome samples. US HUPO 2015. 196. Will CL and Lührmann R (2011) Spliceosome structure and function.Cold Spring Harb Perspect Biol 3(7): a003707. 197. Wiśniewski JR, Zougman A, Nagaraj N, Mann M (2009) Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat Methods 6(5): 359-362. 198. Wojcechowskyj JA, Didigu CA, Lee JY, Parrish NF, Sinha R, Hahn BH, Bushman FD, Jensen ST, Seeholzer SH, Doms RW (2013) Quantitative phosphoproteomics reveals extensive cellular reprogramming during HIV-1 entry. Cell Host Microbe 13(5): 613-623. 199. Woodsmith J, Kamburov A, Stelzl U (2013) Dual coordination of post translational modifications in human protein networks. PLoS Comput Biol 9(3): e1002933. 200. Wu CC, Chen HC, Chen SJ, Liu HP, Hsieh YY, Yu CJ, Tang R, Hsieh LL, Yu JS, Chang YS (2008) Identification of collapsin response mediator protein-2 as a potential marker of colorectal carcinoma by comparative analysis of cancer cell secretomes. Proteomics 8: 316–332. 201. Wu CC, Hsu CW, Chen CD, Yu CJ, Chang KP, Tai DI, Liu HP, Su WH, Chang YS, Yu JS (2010) Candidate serological biomarkers for cancer 116 identified from the secretomes of 23 cancer cell lines and the human protein atlas. Mol Cell Proteomics 9: 1100–1117. 202. Wu HY and Liao PC (2008) Analysis of protein phosphorylation using mass spectrometry. Chang Gung Med J 31(3): 217-227. 203. Xiao SH and Manley JL (1997) Phosphorylation of the ASF/SF2 RS domain affects both protein-protein and protein-RNA interactions and is necessary for splicing. Genes Dev 11(3): 334-344. 204. Xue H, Lü B, Zhang J, Wu M, Huang Q, Wu Q, Sheng H, Wu D, Hu J, Lai M (2010) Identification of serum biomarkers for colorectal cancer metastasis using a differential secretome approach. J Proteome Res 9: 545–555. 205. Yamashita R, Fujiwara Y, Ikari K, Hamada K, Otomo A, Yasuda K, Noda M, Kaburagi Y (2007) Extracellular proteome of human hepatoma cell, HepG2 analyzed using two-dimensional liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry. Mol Cell Biochem 298: 83–92. 206. Yan GR, Ding W, Xu SH, Xu Z, Xiao CL, Yin XF, He QY (2011) Characterization of phosphoproteins in gastric cancer secretome. Omics J IntegrBiol 15: 83–90. 207. Yang Y, Yixuan Y, Lim S-K, Kiat LS, Choong L-Y, Yee CL, Lee H, Huiyin L, Chen Y, Yunhao C (2010) Cathepsin S mediates gastric cancer cell migration and invasion via a putative network of metastasis-associated proteins. J Proteome Res 9: 4767–4778. 208. Zawadzka AM, Schilling B, Cusack MP, Sahu AK, Drake P, Fisher SJ, Benz CC, Gibson BW (2014) Phosphoprotein secretome of tumor cells as a source of candidates for breast cancer biomarkers in plasma. Mol Cell Proteomics 13: 1034–1049. 209. Zhang J, Yang PL, Gray NS (2009) Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors. Nat Rev Cancer 9(1): 28-39. 117 210. Zwickl H, Traxler E, Staettner S, Parzefall W, Grasl-Kraupp B, Karner J, Schulte-Hermann R, Gerner C (2005) A novel technique to specifically analyze the secretome of cells and tissues. Electrophoresis 26: 2779–2785. 118 TÓM TẮT LUẬN ÁN “Nghiên cứu xác định hệ phosphoprotein và hệ protein tiết của tế bào Lympho T người bằng các kỹ thuật proteomic” 1. Mở đầu Phosphoryl hóa là một trong những cải biến sau dịch mã phổ biến nhất, có tính quyết định đối với chức năng protein. Do đó, sự phosphoryl hóa protein đóng vai trò trung tâm trong nhiều quá trình của tế bào như quá trình phát triển, chết theo chương trình hay dẫn truyền tín hiệu Những bất thường trong quá trình phosphoryl hóa protein là một trong những nguyên nhân gây bệnh cơ bản. Mục tiêu chủ yếu của nghiên cứu phosphoproteomic là nhận diện phosphoprotein cùng với sự thay đổi mức độ phosphoryl hóa của protein trong những điều kiện khác nhau. Nghiên cứu xác định phosphoproteome có thể tìm ra những marker cho trạng thái tế bào, ví dụ như marker đặc trưng cho sự suy giảm miễn dịch hay sự nhạy cảm với thuốc. Xác định những motif đặc trưng cho từng vị trí phosphoryl hóa là tiền đề cho nghiên cứu tìm kiếm những enzyme kinase mới có liên quan đến các quá trình sinh lý học của tế bào cũng như gia tăng hiểu biết về cơ chế kiểm soát hoạt tính và chức năng của protein/enzyme. Phân tích hệ phosphoprotein là bước quan trọng đầu tiên để đưa ra những liệu pháp trị liệu mới sử dụng các loại thuốc tác dụng dựa trên quá trình điều chỉnh hoạt tính của kinase/phosphatase hay các protein quan trọng khác trong chuỗi tín hiệu tế bào. Tế bào Lympho T, một khi được hoạt hóa sẽ trở thành những tế bào hoạt động, có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Sự hoạt hóa của tế bào T là hệ quả của một loạt chuỗi tín hiệu được khởi xướng bởi quá trình kích thích phức hợp thụ thể tế bào T (TCR) và CD3. Do đó, nghiên cứu cơ chế của chu trình tín hiện ở tế bào T và vai trò của từng thành phần trong chuỗi tín hiệu đó là rất cần thiết. Trong thập kỷ vừa qua, hiểu biết về tín hiệu tế bào T đã đạt được những bước tiến đáng kể. Sự kích thích của phức hệ CD3/TCR và/hoặc các thụ thể khác sẽ 119 khởi động các tín hiệu sớm, quá trình dẫn truyền các tín hiệu này đến nhân tế bào sẽ trải qua 1 phức hệ trung gian gọi là LAT signalosome. Phospholipase C gamma1 (PLCγ1) là một thành phần thiết yếu của phức hệ này, có khả năng xúc tác sự thủy phân PIP2 ở màng tế bào thành các phân tử tín hiệu thứ cấp cần thiết cho sự biểu hiện của IL-2 là IP3 và DAG. Do vậy, tìm hiểu vai trò của PLCγ1 đối với sự phosphoryl hóa của tế bào T trong quá trình hoạt hóa có thể gợi mở ra những cơ chế dẫn truyền tín hiệu mới. Tế bào T hoạt động chủ yếu thông qua các protein và peptide tiết ra ngoài môi trường. Những phân tử này tham gia vào nhiều quá trình sinh học khác nhau như quá trình tương tác gian bào, quá trình bám dính, di trú và di căn của tế bào... Bởi vậy, các nghiên cứu về hệ protein tiết, đặc biệt là hệ phosphoprotein tiết có thể mang đến những hiểu biết rõ hơn về chức năng của tế bào T trong các đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Xuất phát từ thực tế đó, chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định hệ phosphoprotein và hệ protein tiết của tế bào lympho T người bằng các kỹ thuật proteomic” với những mục tiêu chủ yếu sau: (1) Xác định hệ phosphoprotein của tế bào Lympho T; (2) Xác định hệ phosphoprotein của các dòng tế bào Jurkat T để tìm hiểu vai trò của PLCγ1 trong tín hiệu tế bào T; và (3) Xác định hệ phosphoprotein tiết của tế bào Jurkat T. 2. Phương pháp nghiên cứu Tế bào lympho T được phân lập từ buffy coat theo phương pháp ly tâm gradient với sự có mặt của Ficoll-Paque. Tế bào Jurkat T được cung cấp bởi ATCC và nuôi cấy theo quy trình tiêu chuẩn. Sau đó, tất cả các dòng tế bào (lympho T và Jurkat T) được hoạt hóa với kháng thể kháng CD3/CD28 hoặc PMA/ionomycin. Protein thu được từ tế bào và canh trường tế bào được thủy phân với trypsin thành tryptic peptide. Những peptide này được đánh dấu với thuốc thử TMT hay 120 iTRAQ cho phân tích định lượng. Mẫu thu được sẽ được phân tách, làm giàu phosphopeptide và phân tích bằng sắc ký lỏng kết nối khối phổ. Quá trình nhận diện peptide và protein được thực hiện bằng một số phần mềm khác nhau (Sequest, Omssa, Phenyx, EasyProt, Peaks) trong đó peptide xác định được bởi 2 phần mềm trở lên sẽ được lựa chọn. Phân tích định lượng được thực hiện bởi phần mềm DanteR hoặc Pquantifier. Bên cạnh đó, một số phần mềm và công cụ tin sinh học khác như Panther, Strap, Motif-X, DAVID... cũng được sử dụng cho phân tích sinh học như phân loại protein theo vị trí, chức năng phân tử và quá trình sinh học, phân tích motif, hay phân tích chu trình tín hiệu. 3. Kết quả và thảo luận Phân tích hệ phosphoprotein của tế bào Lympho T Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiếp tục thực hiện dự án phân tích hệ phosphoprotein tế bào lympho T người đã được khởi xướng từ năm 2008 bởi LP- CSIC/UAB. Tổng hợp các kết quả từ trước đến nay, 15566 vị trí phosphoryl hóa từ 8273 phosphopeptide và 4937 phosphoprotein đã được nhận diện, trong đó 4763 vị trí phosphoryl hóa từ 2315 phosphopeptide và 2272 phosphoprotein đã được định lượng nhờ phương pháp kết hợp đánh dấu với TMT hoặc iTRAQ. Hệ phosphoprotein tổng số và tập hợp các protein chứa vị trí phosphoryl hóa thay đổi được phân loại theo vị trí, chức năng, và quá trình sinh học dựa vào chú giải bản thể gen. Kết quả phân loại này được so sánh kết hợp với hệ protein của người. Chúng tôi nhận thấy, có sự ưu thế của các phân loại có liên quan đến quá trình hoạt hóa của tế bào T như quá trình phosphoryl hóa, dẫn truyền tín hiệu hay quá trình liên quan đến sự thay đổi hình thái cấu trúc của tế bào. Tất cả dữ liệu mới phân tích đã được cập nhật vào cơ sở dữ liệu LymPHOS, cơ sở dữ liệu đầu tiên và đầy đủ nhất về hệ phosphoprotein của tế bào Lympho T người. Trong phiên bản mới nhất (LymPHOS2.0), ngoài sự gia tăng về dung lượng của dữ liệu (ước tính 45 lần so với phiên bản ban đầu), thông tin định lượng của 121 nhiều vị trí phosphoryl hóa sau quá trình hoạt hóa tế bào với kháng thể kháng CD3/CD28 và PMA/Ionomycin cũng được cập nhật. Phân tích hệ phosphoprotein của tế bào Jurkat T Trong phần này, chúng tôi tiến hành phân tích (định tính và định lượng) hệ phosphoprotein của tế bào Jurkat E6.1 (dòng tế bào Jurkat T thông thường) và Jurkat gamma1 (dòng tế bào Jurkat T đột biến khuyết Phospholipase C gamma1 (PLCγ1)). Tổng cộng, chúng tôi đã nhận diện được 5585 phosphopeptide từ 2008 phosphoprotein từ cả 2 dòng tế bào. Trong đó, số lượng phosphopeptide và phosphoprotein nhận diện được ở dòng tế bào Jurkat E6.1 cao hơn không đáng kể so với Jurkat gamma1. Thông qua so sánh với cơ sở dữ liệu PhosphositePlus, chúng tôi phát hiện được 219 vị trí phosphoryl hóa mới từ 188 phosphoprotein; tất cả các vị trí phosphoryl hóa này đều có độ tin cậy cao theo thuật toán Q-Ascore. Đáng chú ý, 95 vị trí phosphoryl hóa trong số đó được xác định từ những phosphopeptide duy nhất và có thể là đích đến cho những nghiên cứu tiếp theo về chu trình tín hiệu cũng như sự hoạt hóa của tế bào lympho T. Kết quả phân tích định lượng cho thấy số lượng cao hơn rất đáng kể của các phosphopeptide và phosphoprotein có chứa vị trí phosphoryl hóa thay đổi ở tế bào Jurakt T bình thường (378 phosphopeptide từ 332 phosphoprotein) so với tế bào Jurkat đột biến khuyết PLCγ1 (71 phosphopeptides từ 71 phosphoproteins). Trong số protein có chứa vị trí phosphoryl hóa thay đổi, một số kinase cũng được nhận diện (18 ở Jurkat E6.1 and 3 ở Jurkat gamma1). Kết quả này phản ánh vai trò quan trọng của PLCγ1 đối với sự phosphoryla hóa protein ở tế bào Jurkat T cũng như quá trình dẫn truyền tín hiệu của tế bào T. Trong chu trình tín hiệu cơ bản của tế bào T (chu trình tín hiệu thụ thể tế bào T - TCR signaling pathway), chúng tôi nhận thấy số lượng phosphoprotein ở cả 2 dòng tế bào tham gia vào chu trình không có sự khác biệt lớn (33 ở Jurkat E6.1 và 26 ở Jurkat gamma1). Ngược lại, số lượng protein có chứa các vị trí phosphoryl hóa 122 thay đổi ở Jurkat E6.1 cao hơn rất đáng kể so với Jurkat gamma1 (8 protein ở Jurkat E6.1 (LCK, GADS, PAK, p38, ITK, NF-AT, AP1, PKCθ và 1 protein ở Jurkat gamma1 (LCK)). Đáng chú ý, protein chứa vị trí phosphoryl hóa thay đổi duy nhất ở Jurkat gamma1 (LCK) đứng trước PLCγ1 trong chuỗi tín hiệu. Điều này cho thấy, sự thiếu hụt của PLCγ1 tác động đến mức độ phosphoryl hóa nhiều hơn là trạng thái phosphoryl hóa của protein. Trong nghiên cứu này, 4 vị trí phosphoryl hóa thay đổi của phân tử LCK đã được phát hiện. Trong đó, mức độ phosphoryl hóa tại Ser-121 của LCK gia tăng theo thời gian hoạt hóa ở cả 2 dòng tế bào, mặc dù ở dòng tế bào JE6.1 mức độ tăng mạnh hơn. Điều này cho thấy, sự phosphoryl hóa ở Ser-121 không liên quan đến vai trò của LCK ở màng tế bào trong việc khởi tạo những tín hiện ban đầu của chu trình tín hiện phụ thuộc vào TCR. Gần đây, sự di chuyển của LCK đến nhân tế bào và hoạt động như là các nhân tố phiên mã của tế bào Lympho T và Jurkat T đã được xác nhận. Do đó, phosphosphryl hóa tại Ser-121 của LCK có thể liên quan đến vai trò của enzyme này trong nhân tế bào và các đáp ứng muộn của quá trình hoạt hóa tế bào T. Đây là những dẫn chứng đầu tiên về sự phosphoryl hóa cũng như vai trò tiềm năng của sự phosphoryl hóa tại Ser-121 của LCK trong các đáp ứng muộn của sự hoạt hóa tế bào T với kháng thể kháng CD3/CD28. Phân tích hệ phosphoprotein tiết của tế bào Jurkat T Trong chương này, chúng tôi tiến hành phân tích hệ phosphoprotein tiết của tế bào Jurkat T (dòng tế bào Jurkat E6.1) trong điều kiện hoạt hóa với PMA/ionomycin. Protein tiết được xác định thông qua quá trình dự đoán các chuỗi peptide tín hiện ngoại bào với phần mềm SignalP và chú giải bản thể gene của protein (Gene Ontology Annotation-GOA). Kết quả chúng tôi đã nhận diện được 125 phosphoprotein trong môi trường nuôi cấy của tế bào Jurkat T, trong đó có 7 proteins được xác định bẳng cả 2 công cụ SignalP và GOA: PRSS23, serotransferrin, 123 PTPRC, ITGA4, leukosialin, calnexin, và VSTM1. Đây là các dữ liệu đầu tiên về các phosphoprotein tiết của tế bào Jurkat T được phân tích và nhận diện. Kết quả phân tích định lượng bước đầu cho thấy, 5 protein có chứa vị trí phosphoryl hóa thay đổi đã được xác định, trong đó 4 protein có chứa vị trí phosphoryl hóa tăng cường (PA2G4, ALDOA, THRAP3, và stathmin) và 1 protein (DOCK2) có chứa vị trí phosphoryl hóa có mức độ thay đổi giảm trong điều kiện hoạt hóa của tế bào Jurkat T với PMA/ionomycin. Những vị trí phosphoryl hóa thay đổi này có thể liên quan đến vai trò của protein ở bên ngoài môi trường của tế bào Jurkat T hoạt hóa. 4. Kết luận 4.1. Nghiên cứu xác định hệ phosphoprotein của tế bào Lympho T Đã góp phần nhận diện và cập nhật những phosphopeptide và vị trí phosphoryl hóa mới vào cơ sở dữ liệu LymPHOS, cơ sở dữ liệu mở về hệ phosphoprotein của tế bào Lympho T người. Phiên bản LymPHOS2.0 cập nhật chứa đựng 15566 vị trí phosphoryl hóa từ 4937 phosphoprotein. Trong đó, hơn 200 vị trí phosphoryl hóa mới được xác định khi so sánh với cơ sở dữ liệu PhosphositePlus. Đối với thông tin định lượng, một số lượng lớn các vị trí phosphoryl hóa thay đổi đã được phát hiện sau quá trình hoạt hóa tế bào Lympho T ở những thời điểm khác nhau (2296, 2430, và 726 vị trí phosphoryl hóa tại 15, 120, và 240 phút). 4.2. Nghiên cứu xác định hệ phosphoprotein các dòng tế bào Jurkat T (i) Đã phát hiện 219 vị trí phosphoryl hóa mới từ 2008 phosphoprotein nhận diện được từ cả 2 dòng tế bào Jurkat E6.1 và Jurkat gamma1 so với PhosphositePlus. Trong số đó, 95 vị trí phosphoryl hóa (70 tại serine, 21 tại threonine, và 4 tại tyrosine) được xác định từ những phosphopeptide duy nhất. 124 (ii) Phân tích định lượng cho thấy, số lượng phosphopeptide chứa vị trí phosphoryl hóa thay đổi ở Jurkat gamma1 thấp hơn đáng kể so với Jurkat E6.1 (71 so với 378), kết quả này khẳng định vai trò quan trọng của PLCγ1 đối với tín hiệu tế bào T. (iii) Đã phát hiện 4 vị trí phosphoryl hóa mới có độ tin cậy cao của LCK ở tế bào Jurkat T. Trong đó, mức độ phosphoryl hóa tại Ser-121 ở Jurkat E6.1 cao hơn đáng kể so với Jurkat gamma1. Sự khác biệt này có thể đưa đến nhận định rằng, sự phosphoryl hóa tại Ser-121 của LCK có thể liên quan đến vai trò mới của protein này bên cạnh vai trò kích hoạt các tín hiệu sớm tại màng tế bào. 4.3. Nghiên cứu xác định hệ phosphoprotein tiết của tế bào Jurkat T Lần đầu tiên, hệ phosphoprotein tiết của tế bào Jurkat T (dòng tế bào Jurkat E6.1) được xác định với 125 protein. Trong đó, một số protein chứa vị trí phosphoryl hóa thay đổi trong điều kiện hoạt hóa với PMA/ionomycin đã được xác định bao gồm: PA2G4, ALDOA, THRAP3, DOCK2, và stathmin. SUPPLEMENTAL DOCUMENTS Supplemental table 3.1. The numbers of peptides and phosphopeptides detected across replicates of human Jurkat T cell clones JE6.1 Jgamma1 201 202 203 209 210 204 205 206 207 208 Non-redundant peptides 4235 5117 4546 3743 3259 3350 3936 3850 4574 4308 Non-redundant phosphopeptides 2584 2369 2549 2048 1510 1699 2274 2046 2166 2207 Efficiency* (%) 61 46.3 56.1 54.7 46.3 50.7 57.8 53.1 47.4 51.2 Average 2212 2078 Total 4346 3971 *The phosphopeptide enrichment efficiency was evaluated by counting the number of identified phosphopeptides over the number of all identified peptides. Supplemental table 3.2. Phosphopeptides and proteins containing regulated P-sites in JE6.1 No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 1 SATTtPSGsPR Q2M2I8 AP2-associated protein kinase 1 D D 2 SDsDAEAQGK Q13131 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-1 U U 3 SGTAtPQR Q13131 5'-AMP-activated protein kinase catalytic subunit alpha-1 D D D D 4 TAsLPGYGR O14639 Actin-binding LIM protein 1 D 5 SSMsGLHLVK Q13085 Acetyl-CoA carboxylase 1 D 6 sGVSITIDDPVR Q9UKV3 Apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus U U 7 RLsQPESAEK U U U U 8 KSLSPGVsR U 9 SLsPGVSR U 10 TAsFSESR P53396 ATP-citrate synthase D D D D 11 GILAADESTGsIAK P04075 Fructose-bisphosphate aldolase A U U 12 GILAADESTGsIAKR U 13 RGsFSSENYWR Q6P6C2 Probable alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase ABH5 D D D 14 LTVAsPK O75179 Ankyrin repeat domain-containing protein 17 D D D 15 RSsLDEK Q9NWB6 Arginine and glutamate-rich protein 1 U U U 16 SEsLESPRGER Q92974 Rho guanine nucleotide exchange factor 2 U U 17 KPsEEEYVIR Q15052 Rho guanine nucleotide exchange factor 6 U U 18 ASEKPVsPK Q14155 Rho guanine nucleotide exchange factor 7 U U U 19 KPsDEEFASR U U U 20 KPSDEEFAsR U U U U 21 GPPNsPDLK Q6ZSZ5 Rho guanine nucleotide exchange factor 18 U U U U 22 RDsFSGVK Q14865 AT-rich interactive domain-containing protein 5B D 23 KMPLDLsPLATPIIR P15336 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-2 U U U 24 RMsDEFVDSFK Q92934 Bcl2 antagonist of cell death U U 25 SLSGsPLK Q9UIG0 Tyrosine-protein kinase BAZ1B D D D 26 KPAPLPsPGLNSAAK Q9C0K0 B-cell lymphoma/leukemia 11B U 27 LKDLFDYsPPLHK Q9NYF8 Bcl-2-associated transcription factor 1 U U U U 28 LKDLFDySPPLHK U U U U 29 SGsIGK Q5T5X7 BEN domain-containing protein 3 D D 30 TsPGGRtSPEAR Q8TD16 Protein bicaudal D homolog 2 D D 31 SVsLSMR O60238 BCL2/adenovirus E1B 19 kDa protein-interacting protein 3-like D D D 32 RDsSDDWEIPDGQITVGQR P15056 Serine/threonine-protein kinase B-raf U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 33 RDSsDDWEIPDGQITVGQR U 34 HGtPDPsPR Q9BRD0 BUD13 homolog D D 35 NSKYEYDPDIsPPR U U U U 36 RPQHNSSGAsPR U 37 ILGSAsPEEEQEKPILDRPTR Q7Z422 UPF0485 protein C1orf144 U U U U 38 TQDPSsPGTtPPQAR Q13112 Chromatin assembly factor 1 subunit B D D 39 RVEsGGAK O15234 Protein CASC3 U U U U 40 SLsDSESDDSK Q13185 Chromobox protein homolog 3 D 41 LTWHsCPEDEAQ U 42 KSLSDSESDDsK D 43 DLLSDLQDIsDSER P21127 Cyclin-dependent kinase 11B U U 44 IGEGtYGVVYK P06493 Cyclin-dependent kinase 1 D D 45 AItPPQQPYK Q9NYV4 Cyclin-dependent kinase 12 U U 46 SVsPYSR U U U U 47 LYSSEESRPYtNK Q14004 Cyclin-dependent kinase 13 D D 48 SRsPYSPVLR U U U U 49 SAsQAGSK Q7Z7K6 Centromere protein V U 50 SRsSAAAK U 51 AAsEDMTsDEER Q96RK0 Protein capicua homolog U U 52 SEEsVSRLPEEIR Q07065 Cytoskeleton-associated protein 4 U 53 GHPHSASSPsER Q15003 Condensin complex subunit 2 U U 54 KSsTPEEVK P23528 Cofilin-1 U 55 AQDLALSLAQtK Q9BV73 Centrosome-associated protein CEP250 U 56 APGsPLSSEGAAGEGVR Q6JBY9 CapZ-interacting protein U U U 57 SKAPGsPLSSEGAAGEGVR U U U 58 RSQsDCGELGDFR D D 59 SsPLIEK U 60 RLsAEK Q5TZA2 Rootletin U U U 61 RPNEDsDEDEEK Q12996 Cleavage stimulation factor subunit 3 U 62 KASSPsPLTIGTPESQR Q9NPI6 mRNA-decapping enzyme 1A D D 63 SSFFSDRGSGsR O00571 ATP-dependent RNA helicase DDX3X D D D D 64 LLEDsEESSEETVSR O60231 Putative pre-mRNA-splicing factor ATP- dependent RNA helicase DHX16 U U U U 65 AGLESGAEPGDGDSDtTK O60832 H/ACA ribonucleoprotein complex subunit 4 U 66 KIsLEDIQAFEK Q8WXX5 DnaJ homolog subfamily C member 9 U U 67 VLGsEGEEEDEALSPAK P18858 DNA ligase 1 U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 68 LTTTGQVTsPVK P49916 DNA ligase 3 D 69 VEQEEPIsPGSTLPEVK Q92608 Dedicator of cytokinesis protein 2 U U U 70 TVtPASSAK Q16555 Dihydropyrimidinase-related protein 2 D D D D 71 PCSEETPAIsPSKR P33316-2 Isoform 2 of Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase, mitochondrial D D D D 72 NRsFSLK O00148 ATP-dependent RNA helicase DDX39A D D D 73 IYQyIQSR Q13627 Dual specificity tyrosine-phosphorylation-regulated kinase 1A D 74 KPsEDEVLNK Q8NDI1 EH domain-binding protein 1 U U U U 75 TCFsPNR O00303 Eukaryotic translation initiation factor 3 subunit F D 76 VSsSPGVK P32519 ETS-related transcription factor Elf-1 D 77 AsVTNDsGPR Q96EB1 Elongator complex protein 4 D D D D 78 RLsPPSSSAASSYSFSDLNSTR P50402 merin U U U 79 YFDsGDYNMAK O43768 Alpha-endosulfine D 80 TFWsPELK O15083 ERC protein 2 U 81 IDSNIsPK Q9H501 ESF1 homolog D 82 SPEAKsPLQSQPHSR Q9UI08 Ena/VASP-like protein U U U U 83 KEDESQMEDPSTsPSPGTR U U U 84 RGsLPDQK Q6P3S6 F-box only protein 42 D 85 ADMtASGSPDYGQPHK Q01543 Friend leukemia integration 1 transcription factor D 86 KDsAQDDQAK Q13045 Protein flightless-1 homolog U U U U 87 RAPsVANVGSHCDLSLK P21333 Filamin-A U U U U 88 RAPSVANVGsHCDLSLK U U 89 TVsDNsLSNSR Q96RU3 Formin-binding protein 1 D D D 90 TRSLSsLR O94915 Protein furry homolog-like D D D 91 MILIQDGsQNTNVDKPLR Q92945 Far upstream element-binding protein 2 U U U U 92 RPMsDPSWNR Q14C86 GTPase-activating protein and VPS9 domain-containing protein 1 U 93 AASSSSPGsPVASsPSR Q92538 Golgi-specific brefeldin A-resistance guanine nucleotide exchange factor 1 U U U 94 LRVSLGtR Q96CW5 Gamma-tubulin complex component 3 U 95 SLSsPTDNLELSLR Q9Y2X7 ARF GTPase-activating protein GIT1 U 96 RHtDPVQLQAAGR O75791 GRB2-related adapter protein 2 U 97 THVGsYK Q12849 G-rich sequence factor 1 D D D D 98 RPsTFGIPR P78347 General transcription factor II-I U U 99 KAAGGAtPK P16403 Histone H1.2 U 100 GTGASGsFK P10412 Histone H1.4 D D D No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 101 KATQAsQEY P16104 Histone H2A.x U U 102 SLDsDEsEDEEDDYQQK Q13442 28 kDa heat- and acid-stable phosphoprotein U 103 IACEEEFsDsEEEGEGGR Q13547 Histone deacetylase 1 U U 104 MLPHAPGVQMQAI PEDAIPEEsGDEDE DDPDKR U U U 105 IACEEEFsDSEEEGEGGRK U U U U 106 KNsSNFK U 107 IACDEEFsDSEDEGEGGRR Q92769 Histone deacetylase 2 U U U U 108 AVEESsDEER Q9BW71 HIRA-interacting protein 3 U U U U 109 AVEESsDEERQR U U U U 110 RPPTPCsDPER U U U 111 SsQPLASK P17096 High mobility group protein HMG-I/HMG-Y D 112 GSSKsGK O60812 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C-like 1 U 113 IDASKNEEDEGHSNsSPR Q14103 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 U 114 IDASKNEEDEGHSNSsPR U U U U 115 DVYLsPR P38159 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G D 116 GLPPsMER D 117 DVYLsPRDDGYSTK D 118 RDVYLsPR D 119 DYDDMsPR P61978 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K D D 120 MGANsLER P52272 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M D 121 TSsTNEDEDLNPEQK Q99081 Transcription factor 12 U U U U 122 RSDSVSAsER O43719 HIV Tat-specific factor 1 D D D D 123 LEEPPELNRQsPNPR Q7Z5L9 Interferon regulatory factor 2-binding protein 2 D 124 RKPsPEPEGEVGPPK Q7Z5L9 Interferon regulatory factor 2-binding protein 2 U 125 VKGPALsR Q16666 Gamma-interferon-inducible protein 16 U 126 SAsVTPK U 127 AFGsGYR P23588 Eukaryotic translation initiation factor 4B D D 128 SGsTTK P06730 Eukaryotic translation initiation factor 4E U U U 129 AYSSFGGGRGsR Q15056 Eukaryotic translation initiation factor 4H D 130 TLsLVK A6NCM1 Putative IQ and AAA domain-containing protein 1-like U 131 RDSWsYINSK P13612 Integrin alpha-4 U 132 SNsEVVEDISTGFR Q08881 Tyrosine-protein kinase ITK/TSK U U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 133 AAVLsDsEDEEK Q96ST2 Protein IWS1 homolog U U U 134 LAsPELER P05412 Transcription factor AP-1 U U 135 RVsVCAETYNPDEEEEDTDPR P13861 cAMP-dependent protein kinase type II-alpha regulatory subunit U 136 ASRDPsPIQDGNEDMK Q16566 Calcium/calmodulin-dependent protein kinase type IV U U U U 137 AQSLVISPPAPsPR P46013 Antigen KI-67 D D D D 138 IACKsPPPESVDTPTSTK U U U 139 ASsLNFLNK Q9H0B6 Kinesin light chain 2 D 140 RSsELLVR Q9NSK0 Kinesin light chain 4 U 141 ALINsMDQNMFR Q04759 Protein kinase C theta type U U U U 142 ANsLEPEPWFFK P06239 Tyrosine-protein kinase Lck U U 143 YVIsDEEEEDDD Q8WVC0 RNA polymerase-associated protein LEO1 U 144 RPtLTTFFGR P16150 Leukosialin U U U 145 ETPHsPGVEDAPIAK Q9UHB6 LIM domain and actin-binding protein 1 U U U 146 SNsLSK P53671 LIM domain kinase 2 D D D D 147 AGGPTtPLsPTR P20700 Lamin-B1 D 148 ATsSSSGSLSATGR Q03252 Lamin-B2 U U U U 149 RHsEVETDSK Q9NX58 Cell growth-regulating nucleolar protein U U U U 150 DRSsPPPGYIPDELHQVAR Q9Y2U5 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2 D 151 TPsEIQFHQVK Q12851 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 2 U 152 TTSRsPVLSR O95819 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 4 D D D D 153 TTsRsPVLSR D D D D 154 ELSSPIsPK P78559 Microtubule-associated protein 1A D D D D 155 ASsSGSASK Q15555 Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 U U 156 RDsFDDR P43243 Matrin-3 U U 157 GPVsPSVSFQPLAR Q7Z434 Mitochondrial antiviral-signaling protein U U 158 VNsMVAYK Q13257 Mitotic spindle assembly checkpoint protein MAD2A D D 159 TIsAPVVRPK O15151 Protein Mdm4 D D D D 160 RNsCNVGGGGGGFK Q7L2J0 7SK snRNA methylphosphate capping enzyme U U 161 TSsKSEAGAR D D D 162 ESGNsQELAR Q86W50 Putative methyltransferase METT10D U U U U 163 AQTGPLRSsLEESPFEA Q86V88 Magnesium-dependent phosphatase 1 U 164 GAGATSGsPPAGRN P16455 Methylated-DNA--protein-cysteine methyltransferase D 165 GAGATsGSPPAGRN D 166 HTDDEMTGyVATR Q16539 Mitogen-activated protein kinase 14 D No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 167 AtSNVFAMFDQSQIQEFK O14950 Myosin regulatory light chain 12B D D D D 168 ATsNVFAMFDQSQIQEFK D 169 RGPTSsNPR P40692 DNA mismatch repair protein Mlh1 D 170 LPLsPPLVEDSAFEPSRK O96007 Molybdopterin synthase catalytic subunit U 171 TGKTEDDSsPK O60669 Monocarboxylate transporter 2 U U U U 172 GEVPPKEtPK P49006 MARCKS-related protein D D 173 WHQPPPsPLPLR Q68DK7 Male-specific lethal 1 homolog D D D D 174 LPEASQsPLVLK Q13330 Metastasis-associated protein MTA1 U U U U 175 AAsDDGSLK Q92614 Myosin-XVIIIa U 176 KGAGDGsDEEVDGK P35579 Myosin-9 U U U U 177 GsFTLLWPSR B0I1T2 Myosin-Ig U 178 LIsVEPRPEQPEPDFR U 179 LSQSSQDSsPVR O95251 Histone acetyltransferase MYST2 D D D 180 sSGsETEQVVDFSDR U U U U 181 KTSDANEtEDHLESLICK Q09161 Nuclear cap-binding protein subunit 1 U U U 182 AQLsPGIYDDTSAR O75376 Nuclear receptor corepressor 1 U U U 183 NDARsPGSISYLPSFFTK D D 184 TCsLPDLSK Q96PY6 Serine/threonine-protein kinase Nek1 D 185 TSsLPPLDWPLPAHFGQCELK Q12968 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3 U 186 SQDATFSPGSEQAEKsPGPIVSR Q86WB0 Nuclear-interacting partner of ALK U U U U 187 TSPGsPR Q05586 Glutamate [NMDA] receptor subunit zeta-1 D D D 188 LIAHAGsLTNLAK O00567 Nucleolar protein 56 D D 189 CGsGPVHISGQHLV AVEEDAEsEDEEEE DVK P06748 Nucleophosmin U U 190 QPDISCILGTGGKsPR P57740 Nuclear pore complex protein Nup107 U 191 TSTsPPPEKSGDEGsEDEAPSGED Q9H1E3 Nuclear ubiquitous casein and cyclin- dependent kinases substrate U U U 192 LELQGPRGsPNAR P19338 Nucleolin D 193 GLsEDTTEETLK D 194 QAAsPLEPK Q14980 Nuclear mitotic apparatus protein 1 U U U 195 SQGDEAGGHGEDRPEPLsPK Q9NZT2 Opioid growth factor receptor U U 196 YLsFTPPEKDGFPSGTPALNAK Q13177 Serine/threonine-protein kinase PAK 2 U 197 IISIFSGTEKGsK D D D No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 198 AGPVsPGCVK Q53GL7 Poly [ADP-ribose] polymerase 10 U U U U 199 MIFEGPNKLsPR O94913 Pre-mRNA cleavage complex 2 protein Pcf11 U U U 200 SGLTVPTsPK Q53EL6 Programmed cell death protein 4 D 201 GHTAsESDEQQWPEEK Q9NTI5 Sister chromatid cohesion protein PDS5 homolog B U U U 202 QPsEEEIIK Q15121 Astrocytic phosphoprotein PEA-15 U 203 HGEsAWNLENR P18669 Phosphoglycerate mutase 1 U 204 ESAsPTIPNLDLLEAHTK O75151 PHD finger protein 2 U U 205 EsASPTIPNLDLLEAHTK U U U U 206 KGsDDAPYSPTAR U U U 207 AQsYDIQAWK Q8WWQ0 PH-interacting protein U U U U 208 GRECsPTSSLER Q9P1Y6 PHD and RING finger domain-containing protein 1 U U U U 209 RGFsDSGGGPPAK Q9H307 Pinin U U 210 RAsFAEK Q15149 Plectin U 211 GsVSDEEMMELR P13796 Plastin-2 U U U 212 GSVsDEEMMELR U U U 213 KCsQTQCPR P29590 Protein PML U U 214 DLAVPAALtPR Q8TEM1 Nuclear pore membrane glycoprotein 210 U U U 215 GLTWIAHsR Q7Z3K3 Pogo transposable element with ZNF domain U 216 GILtLK A5A3E0 POTE ankyrin domain family member F D 217 IQQQFsDLKR O94906 Pre-mRNA-processing factor 6 U 218 ESLKEEDEsDDDNM P25788 Proteasome subunit alpha type-3 U 219 RItSPLMEPSSIEK P28066 Proteasome subunit alpha type-5 U 220 GGPFWPQVTLNsQDRDER Q8NDX1 PH and SEC7 domain-containing protein 4 D 221 DYGNsPLHR P26599 Polypyrimidine tract-binding protein 1 D 222 EDLSPAFDHsPNK P17706 Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 2 D 223 RLSsFVTK P27708 CAD protein U U U U 224 AAsAIYR Q9UKM9-2 Isoform 1 of RNA-binding protein Raly D D D 225 STAVTTSsAK Q9UKM9 RNA-binding protein Raly D 226 TRDDGDEEGLLTH sEEELEHSQDTDA DDGALQ Q9UKM9 RNA-binding protein Raly U 227 AKsIVFHR P62826 GTP-binding nuclear protein Ran U U U U 228 ALsHQEPMVSTQPAPR Q86YV0 RAS protein activator like-3 U 229 RVLsAPPK U U U U 230 TAVIPINGsPR P06400 Retinoblastoma-associated protein D No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 231 IPGGNIYIsPLK D 232 ISEGLPtPTKMtPR D D D D 233 IPGGNIYIsPLKsPYK D D D 234 TLQTDSIDSFETQRtPR D D D 235 ISEGLPTPTKMtPR D D 236 IPGGNIYIsPLKSPYK D D D D 237 SLsPVAAPPLREPR Q8NDT2 Putative RNA-binding protein 15B U U 238 GLVAAYSGEsDsEEEQER P98175 RNA-binding protein 10 U U U U 239 YRsPYSGPK Q14498 RNA-binding protein 39 D 240 IGLPHsIK D 241 SFsSPENFQR Q9Y580 RNA-binding protein 7 D 242 HSTPsPTR P49792 E3 SUMO-protein ligase RanBP2 D 243 SEsWER O43598 Deoxyribonucleoside 5'-monophosphate N-glycosidase U 244 RQSsSYDDPWK Q96D71 RalBP1-associated Eps domain-containing protein 1 D D D 245 NKPLsPIK P35251 Replication factor C subunit 1 U U U U 246 sSSPELVTHLK Q07960 Rho GTPase-activating protein 1 U U 247 SEsESK Q52LW3 Rho GTPase-activating protein 29 U U U U 248 RDsFDNCSLGESSK Q5UIP0 Telomere-associated protein RIF1 D D D 249 VPLAPITDPQQLQLsPLK P31350 Ribonucleoside-diphosphate reductase subunit M2 D 250 AALLKAsPK P50914 60S ribosomal protein L14 U 251 VEAKEESEEsDEDMGFGLFD P05388 60S acidic ribosomal protein P0 U 252 VEAKEEsEESDEDMGFGLFD U U U U 253 KEESEEsDDDMGFGLFD P05386 60S acidic ribosomal protein P1 U U U U 254 KEEsEESDDDMGFGLFD U U U U 255 YSPTsPK P24928 DNA-directed RNA polymerase II subunit RPB1 D D D D 256 QSAPsPTR Q13905 Rap guanine nucleotide exchange factor 1 D D D 257 AAGISLIVPGKsPTR P47736 Rap1 GTPase-activating protein 1 U 258 LTEGCsFR P42677 40S ribosomal protein S27 D D D D 259 LNsSENGEDR Q7L4I2 Arginine/serine-rich coiled-coil protein 2 U 260 IPLVRsFADIGK Q6U841 Sodium-driven chloride bicarbonate exchanger U U U 261 TSGsKER Q15424 Scaffold attachment factor B1 D 262 KSQsPSPK Q99590 Protein SCAF11 U U U U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 263 KLsPTEPK O14828 Secretory carrier-associated membrane protein 3 U 264 IYHLPDAEsDEDEDFKEQTR Q15019 Septin-2 U 265 TMIIsPERLDPFADGGK O75533 Splicing factor 3B subunit 1 D D 266 RWDQTADQTPGAtPK D D D 267 SGsISVK Q8TF01 Splicing factor, arginine/serine-rich 18 D D 268 TPsASNDDQQE O43765 Small glutamine-rich tetratricopeptide repeat-containing protein alpha U 269 EMPQDLRsPAR U 270 FLMPEAYPSsPR O43166 Signal-induced proliferation-associated 1-like protein 1 D 271 RsWDQQIK Q14493 Histone RNA hairpin-binding protein U U U U 272 QPGIHPKtPNK U 273 SAsPDDDLGSSNWEAADLGNEER O00193 Small acidic protein U 274 AISAPTsPTR Q9NQG6 Smith-Magenis syndrome chromosomal region candidate gene 7 protein-like U U 275 EVDYSDsLTEK P51532 Transcription activator BRG1 D U 276 RPDHSGGsPsPPTSEPAR Q8TAD8 Smad nuclear-interacting protein 1 U U U 277 SDsQQAVK Q15036 Sorting nexin-17 D D 278 RSDsQQAVK D D D D 279 RYsDFEWLR O60493 Sorting nexin-3 U U 280 ESDQTLAALLsPK P18583 Protein SON U 281 GSLGIsQEEQ Q9NZD8 Maspardin U 282 AQTLPTSVVTITSESsPGKR Q01082 Spectrin beta chain, brain 1 D 283 TVsASStGDLPK P78362 Serine/threonine-protein kinase SRPK2 U U U 284 SVsGsPEPAAK Q8IYB3 Serine/arginine repetitive matrix protein 1 U U 285 SVSGsPEPAAK U 286 TAsPPPPPK D 287 TRHSPTPQQsNR U U U U 288 APQTssSPPPVR U U U 289 ESPsPAPKPR D D D 290 SPsPAPPPR U 291 SESDsSPDSK Q9UQ35 Serine/arginine repetitive matrix protein 2 D D D 292 AQSGsDSsPEPK U 293 AQSGSDssPEPK U 294 SGsSPEVK D D D 295 SATRPSPsPER D D 296 MSCFSRPSMSPtPLDR D 297 ALPQtPRPR D D D No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 298 SGsSPEVDSK D D 299 SLSGSsPCPK D D D 300 SLsGSSPCPK D D 301 QGSITSPQANEQSVtPQRR D 302 sGSsPGLR U U U U 303 SESDssPDSK U U U U 304 SGssPEVDSK U U U U 305 SGSEssVDQK U U U 306 VPsPTPAPK U U 307 GQSQTsPDHR U U 308 DKFsPFPVQDRPESSLVFK U 309 QSHSSsSPHPK U U U U 310 SGSESsVDQK D D 311 SSSAsSPEMK D D D 312 SRsWTSPK O75494 Serine/arginine-rich splicing factor 10 U 313 RDGSYGsGR Q08170 Serine/arginine-rich splicing factor 4 U U 314 RDGsYGSGR U U U 315 GRDSPYQsR Q13242 Serine/arginine-rich splicing factor 9 U U U 316 GSSPtPPCsPVQPSK Q9NUL3 Double-stranded RNA-binding protein Staufen homolog 2 U U U 317 DLsLEEIQK P16949 Stathmin U U U U 318 AsGQAFELILsPR U U U 319 RAsGQAFELILsPR U U U 320 DLsLEEIQKK U 321 ESVPEFPLsPPKK U 322 KPSGGsSR P35269 General transcription factor IIF subunit 1 U 323 KPSGGSsR U U U U 324 HGGVCAPAAVATsPPGAIPK Q9Y6A5 Transforming acidic coiled-coil-containing protein 3 U U 325 ILsPSMASK U U 326 SPVVSGDTsPR P10636 Microtubule-associated protein tau U U 327 SPVVsGDTsPR U U U U 328 VPssDEEVVEEPQSR Q9C0C2 182 kDa tankyrase-1-binding protein U 329 TIGGGDDsFNTFFSETGAGK P68363 Tubulin alpha-1B chain U U U U 330 LsVDYGK U U U U 331 AYHEQLsVAEITNACFEPANQMVK U U U U 332 IMNTFSVVPsPK P04350 Tubulin beta-4 chain U U U U 333 MsMKEVDEQMLNVQNK P07437 Tubulin beta chain U U U U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 334 NISSSPsVEsLPGGR Q92609 TBC1 domain family member 5 D D D D 335 AALAPAKEsPR Q13428 Treacle protein D D D 336 EAASGTtPQK D 337 HFAsPSK Q92664 Transcription factor IIIA D D D D 338 VFIDQNLsPGK Q14186 Transcription factor Dp-1 D 339 TPVSGSLKsPVPR Q8NI27 THO complex subunit 2 U 340 SRsGEGEVSGLMR Q13263 Transcription intermediary factor 1-beta U U U 341 SRSGEGEVsGLMR U U U U 342 STAPSAAASASAS AAASsPAGGGAEA LELLEHCGVCR Q13263 Transcription intermediary factor 1-beta D 343 AADRLPNLSsPSAEGPPGPPSGPAPR O60784 Target of Myb protein 1 U U U 344 VPDEEENEEsDNEKETEK P11388 DNA topoisomerase 2-alpha U 345 TQMAEVLPsPR D 346 KAsGsENEGDYNPGR Q02880 DNA topoisomerase 2-beta U U U U 347 KASGsENEGDYNPGR U U 348 NREEEWDPEYtPK Q9Y2W1 Thyroid hormone receptor-associated protein 3 D D 349 AsAVSELsPR D 350 SsFSITR D 351 SGSAHGsGK P62995 Transformer-2 protein homolog beta U U U 352 SGsAHGSGK U 353 RSPsPYYsR U U U 354 RPEGPGAQAPSsPR P40222 Alpha-taxilin U U U U 355 AQsEAEK O75643 U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase U U U 356 AsGEMASAQYITAALR P54578 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 U 357 AAPPPPPPPPPLEsSPR Q5T4S7 E3 ubiquitin-protein ligase UBR4 D 358 FVAFSGEGQsLR Q92890 Ubiquitin fusion degradation protein 1 homolog D 359 THPYsPK P22415 Upstream stimulatory factor 1 D D 360 ISLPLPNFsSLNLR P08670 Vimentin D 361 TRPGsFQSLSDALSDTPAK Q9H9C1 VPS33B-interacting protein D D 362 RPEsPSEIsPIK Q7Z5K2 Wings apart-like protein homolog U 363 RPEsPSEIsPIKGSVR U 364 AGTGyASPDRTHVLAAGK O43379 WD repeat-containing protein 62 D 365 AIGSTSKPQEsPK P18887 DNA repair protein XRCC1 D D D 366 AKSPTPDGsER Q96MU7 YTH domain-containing protein 1 U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 367 AKSPtPDGSER U U U U 368 SEPHsPGIPEIFR Q8ND82 Zinc finger protein 280C U U 369 HSAIsPK Q8N5P1 Zinc finger CCCH domain-containing protein 8 D D 370 AsLEDAPVDDLTR Q7Z2W4 Zinc finger CCCH-type antiviral protein 1 U U U 371 KFTYLGsQDR U 372 IHsPIPDMSK Q6NZY4 Zinc finger CCHC domain-containing protein 8 U U 373 ATGDGssPELPSLER Q9H2Y7 Zinc finger protein 106 homolog U U 374 RSsPPPPPSGSSSR Q5VUA4 Zinc finger protein 318 D 375 NPFRGsPK Q14966 Zinc finger protein 638 D D D D 376 SPAGsPELR Q96JM3 Zinc finger protein 828 U U U U 377 KPGPPLsPEIR U U U 378 IHsGEKPFK P17027 Zinc finger protein 23 D D D The lower case indicates the phosphorylation residue U: Up-regulation; D: Down-regulation Uniprot AC: Uniprot accession number The kinases containing regulated P-sites are marked by gray fill Supplemental table 3.3. Phosphopeptides and proteins containing regulated P-sites in Jgamma1 No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 1 GsFTLLWPSR B0I1T2 Myosin-Ig U 2 RLIsVEPRPEQPEPDFR U 3 SSFFSDRGSGsR O00571 ATP-dependent RNA helicase DDX3X U D 4 GPsPSPVGsPASVAQSR O14497 AT-rich interactive domain-containing protein 1A D 5 VsGSFPEDSSK O15400 Syntaxin-7 U 6 MKQEGsAR O43242 26S proteasome non-ATPase regulatory subunit 3 U 7 SRsWTSPK O75494 Serine/arginine-rich splicing factor 10 U 8 QNsLGSNEEK O75554 WW domain-binding protein 4 U 9 AQsEAEK O75643 U5 small nuclear ribonucleoprotein 200 kDa helicase U 10 DsVLTSK O75937 DnaJ homolog subfamily C member 8 U U 11 RDsVLTSK U U 12 IMNTFSVVPsPK P04350 Tubulin beta-4 chain U U 13 AAQPGsGK P05455 Lupus La protein D 14 ILEQsGEWWK P06239 Tyrosine-protein kinase Lck U 15 ANsLEPEPWFFK U 16 MVRPDNCPEELyQLMR U 17 SLVsKGTLVQTK P10412 Histone H1.4 U 18 KAtQASQEY P16104 Histone H2A.x U 19 QGsLAMEELK P16150 Leukosialin D 20 ASGQAFELILsPR P16949 Stathmin D 21 RAsGQAFELILsPR D 22 AsGQAFELILsPR D D 23 SsQPLASK P17096 High mobility group protein HMG-I/HMG-Y U 24 LLQLVEDRGsGR P17844 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX5 U 25 AIGSTSKPQEsPK P18887 DNA repair protein XRCC1 D 26 GLsEDTTEETLKESFDGSVR P19338 Nucleolin D D 27 LAQYEsK P24534 Elongation factor 1-beta U U U 28 SRsAQEPAR P25685 DnaJ homolog subfamily B member 1 D D 29 TDsSPNQAR P26599 Polypyrimidine tract-binding protein 1 U 30 GLPPsMER P38159 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein G D 31 GRDVESVQtPSK P46013 Antigen KI-67 U 32 RVQPQWsPPAGTQPCR P49589 Cysteinyl-tRNA synthetase, cytoplasmic U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 33 SKHEEEEWtDDDLVESL P51946 Cyclin-H U 34 MGsGVER P52272 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M D D 35 MGLsMER D 36 GCGVVKFEsPEVAER U 37 AKsIVFHR P62826 GTP-binding nuclear protein Ran U 38 SGSAHGsGK P62995 Transformer-2 protein homolog beta U 39 RSPsPYYSR U 40 AVFVDLEPtVIDEVR P68363 Tubulin alpha-1B chain U U 41 YRPGtVALR P68431 Histone H3.1 U U 42 GSsDVDQLGK Q00534 Cyclin-dependent kinase 6 U U 43 RDGSYGsGR Q08170 Serine/arginine-rich splicing factor 4 U 44 LTWHsCPEDEAQ Q13185 Chromobox protein homolog 3 U 45 SLsDsESDDSK D 46 AYSSFGGGRGsR Q15056 Eukaryotic translation initiation factor 4H U 47 RASSSGsASK Q15555 Microtubule-associated protein RP/EB family member 2 D 48 AAGGAPsPPPPVR Q4KMP7 TBC1 domain family member 10B D D 49 IINLGPVHPGPLsPEPQPMGVR Q86T03 Transmembrane protein 55B U 50 AAQQQQPSAsPR Q86U86 Protein polybromo-1 U 51 LLsPLSSAR Q8IY67 Isoform 2 of Ribonucleoprotein PTB-binding 1 D 52 SVSGsPEPAAK Q8IYB3 Serine/arginine repetitive matrix protein 1 U 53 TRHsPtPQQSNR Serine/arginine repetitive matrix protein 1 U U 54 TQLsQGR Q8ND56 Protein LSM14 homolog A D 55 TAsGSSVTSLDGTR Q92597 Protein NDRG1 D 56 SsVVFADEK Q92608 Dedicator of cytokinesis protein 2 U 57 ILSQStDSLNMR Q92974 Rho guanine nucleotide exchange factor 2 D 58 AAQAGRQsSAK Q99986 Serine/threonine-protein kinase VRK1 U 59 GAEETSWsGEER Q9H7N4 Splicing factor, arginine/serine-rich 19 U 60 RPLFLAPDFDRWLDEsDAEMELR Q9P035 3-hydroxyacyl-CoA dehydratase 3 D 61 KENPsPLFSIK Q9P1Y6 PHD and RING finger domain-containing protein 1 U 62 STAVTTSsAK Q9UKM 9 RNA-binding protein Raly U U U 63 TRDDGDEEGLLtHSEE ELEHSQDTDADDGAL Q U 64 TRDDGDEEGLLTHsEE ELEHSQDTDADDGAL Q U No Phosphopeptide Uniprot AC Protein name Time (min) 15 30 60 120 65 FTRsQEEAR Q9UKV3 Apoptotic chromatin condensation inducer in the nucleus U 66 STtPPPAEPVSLPQEPPKPR Q9UN86 -2 Isoform B of Ras GTPase-activating protein-binding protein 2 D 67 SGsSPEVK Q9UQ35 Serine/arginine repetitive matrix protein 2 U 68 SGsSPEVDSK U U 69 SGsESsVDQK D 70 SSSAsSPEMK U U 71 GTYVPSsPTR Q9Y4P8 WD repeat domain phosphoinositide-interacting protein 2 D The lower case indicates the phosphorylation residue U: Up-regulation D: Down-regulation Uniprot AC: Uniprot accession number The kinases containing regulated P-sites are marked by gray fill Supplemental table 3.4. Potential secreted phosphoproteins detected in conditioned media of human Jurkat T cells No Uniprot AC P-sites Protein names (1) 1 A5A3E0 S-733 POTE ankyrin domain family member F 2 B0I1T2 S-1010 Unconventional myosin-Ig 3 O14745 S-280 Na(+)/H(+) exchange regulatory cofactor NHE- RF1 x 4 O14950 S20 Myosin regulatory light chain 12B 5 O15511 S-77 Actin-related protein 2/3 complex subunit 5 6 O43491 S-58 Band 4.1-like protein 2 7 O60343 S-588 S-570 TBC1 domain family member 4 8 O95084 S-138 Serine protease 23 9 P00558 S-203 Phosphoglycerate kinase 1 x 10 P02787 S-306 Serotransferrin 11 P04075 T-49, S-39 Fructose-bisphosphate aldolase A x 12 P04406 S-333 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase x 13 P05771-2 T-641 Lupus La protein 14 P06239 Y-505 Tyrosine-protein kinase Lck x 15 P06493 T-14, Y15, Y-160, T- 161, T-166 Cyclin-dependent kinase 1 16 P06733 S-37, S-40, Y-44, S-419 Alpha-enolase x 17 P07910 S-233 Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1/C2 x 18 P08238 S-226, S-255 Heat shock protein HSP 90-beta x 19 P08575 S-973 Receptor-type tyrosine-protein phosphatase C x 20 P09651 S-6 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 21 P10412 S-104 Histone H1.4 22 P10809 S-70 60 kDa heat shock protein, mitochondrial x 23 P13612 S-1021, S-1023 Integrin alpha-4 24 P13639 T-54 Elongation factor 2 x 25 P13796 S-257, S-323, S-5, S-7 Plastin-2 x 26 P13861 S-99 cAMP-dependent protein kinase type II-alpha regulatory subunit 27 P14618 S-37 Pyruvate kinase PKM x 28 P16104 S-140 Histone H2AX 29 P16150 S-355, T-341 Leukosialin 30 P16949 S-16, S-25, S-46, S-31, S-38 Stathmin x 31 P17612 T-196, T-198, T-202, Y- 205 cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit alpha x No Uniprot AC P-sites Protein names (1) 32 P17987 S-551 T-complex protein 1 subunit alpha x 33 P18669 S-14, Y-119 Phosphoglycerate mutase 1 x 34 P19338 T-121, S-67, S-563, T-76 Nucleolin x 35 P21291 S-192 Cysteine and glycine-rich protein 1 x 36 P21333 S-2152, S-2158, S-2163 Filamin-A x 37 P22102 Y-348, T-349 Trifunctional purine biosynthetic protein adenosine-3 x 38 P22234 S-27 Multifunctional protein ADE2 x 39 P22314 S-835 Ubiquitin-like modifier-activating enzyme 1 x 40 P23396 T-220, T-221, S-224 40S ribosomal protein S3 x 41 P23528 S-3, S-41 Cofilin-1 x 42 P25325-2 S-15 DNA replication licensing factor MCM3 43 P25787 Y-6, S-7, S-9, T-11 Proteasome subunit alpha type-2 x 44 P25788 S-250 Proteasome subunit alpha type-3 x 45 P27448 T-211, S-215 MAP/microtubule affinity-regulating kinase 3 46 P27708 S-1859 CAD protein 47 P27816 S-787, S-330, T-332, S- 507, T-521, S-358, S- 941, S-1073 Microtubule-associated protein 4 x 48 P27824 S-583 Calnexin x 49 P30086 T-51, S-52, S-54 Phosphatidylethanolamine-binding protein 1 x 50 P33316 S-99 Deoxyuridine 5'-triphosphate nucleotidohydrolase, mitochondrial x 51 P34932 S-647 Heat shock 70 kDa protein 4 x 52 P35251 S-368 Replication factor C subunit 1 53 P35579 S-1943 Myosin-9 x 54 P35580 S-1956 Myosin-10 x 55 P36507 T-394 Dual specificity mitogen-activated protein kinase kinase 2 56 P36871 T-115, S-117 Phosphoglucomutase-1 x 57 P37837 S-237 Transaldolase x 58 P38159 S-352 RNA-binding motif protein, X chromosome x 59 P40222 S-514 Alpha-taxilin 60 P48634 S-1219 Protein PRRC2A 61 P49006 T-148, S-22, T-85 MARCKS-related protein 62 P49207 S-12 60S ribosomal protein L34 63 P50395 S-61 Rab GDP dissociation inhibitor beta x 64 P50914 S-139 60S ribosomal protein L14 65 P51858 S-165 Hepatoma-derived growth factor x 66 P53396 S-481, S-455 ATP-citrate synthase x 67 P54578 S-143, S-148 Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 14 x No Uniprot AC P-sites Protein names (1) 68 P60174 S-58 Triosephosphate isomerase x 69 P60709 S-60 Actin, cytoplasmic 1 x 70 P61978 S-284, S-216 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K x 71 P62826 S-135 GTP-binding nuclear protein Ran x 72 P63241 S-46 Eukaryotic translation initiation factor 5A-1 x 73 P68363 T-41, S-48 Tubulin alpha-1B chain x 74 Q01082 S-2340, S-2341, S-2138, S-2102, T-2107 Spectrin beta chain, non-erythrocytic 1 x 75 Q01130 S-191, S-26, T-22, T-25 Serine/arginine-rich splicing factor 2 x 76 Q01196 S-212 Runt-related transcription factor 1 77 Q01813 S-386 ATP-dependent 6-phosphofructokinase, platelet type x 78 Q01968 S-156 Inositol polyphosphate 5-phosphatase OCRL-1 79 Q06210 S-261, T-262, T-263 Glutamine--fructose-6-phosphate aminotransferase [isomerizing] 1 x 80 Q07955 S-199, S234, S-238 Serine/arginine-rich splicing factor 1 x 81 Q07960 S-50, S-51 Rho GTPase-activating protein 1 82 Q14004 T-1246 Cyclin-dependent kinase 13 83 Q14103 T-127 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D0 x 84 Q14204 S-4368 x 85 Q14247 S-418, S-417, Y-421 Src substrate cortactin 86 Q14847 T-104 LIM and SH3 domain protein 1 87 Q15019 S-218 Septin-2 x 88 Q15185 S-113 Prostaglandin E synthase 3 x 89 Q15365 S-173, S-189, S-190 Poly(rC)-binding protein 1 x 90 Q16181 T-332, S-334, S-424, T- 426 Septin-7 x 91 Q16555 T-509, T-514 Dihydropyrimidinase-related protein 2 x 92 Q53ET0 S-433 CREB-regulated transcription coactivator 2 93 Q6IAA8 Y-5, S-7, S-12 Ragulator complex protein LAMTOR1 94 Q6KC79 S-2658 Nipped-B-like protein 95 Q6UX27 S-169 V-set and transmembrane domain-containing protein 1 96 Q6UXC1 S-138, S-139 Apical endosomal glycoprotein 97 Q6ZSZ5 S-1103 Rho guanine nucleotide exchange factor 18 98 Q7Z460 S-600 CLIP-associating protein 1 99 Q7Z6Z7 S-1907 E3 ubiquitin-protein ligase HUWE1 100 Q86YV0 S-72, S-51 RAS protein activator like-3 101 Q86YZ3 Y-1349 Hornerin 102 Q8IX21 S-586, S-590, S-591 Protein FAM178A 103 Q8IZP0 S-183, S-225 Abl interactor 1 No Uniprot AC P-sites Protein names (1) 104 Q8ND76 S-326 Cyclin-Y 105 Q8TCD5 S-182 5'(3')-deoxyribonucleotidase, cytosolic type 106 Q92598 S-809 Heat shock protein 105 kDa x 107 Q92608 S-1706, S-1784, S-1791 Dedicator of cytokinesis protein 2 108 Q96BY6- 3 S-13 SH3 domain-containing kinase-binding protein 1 109 Q96FV2 S-55, T-50, T-52 Secernin-2 110 Q96G03 S-165 Phosphoglucomutase-2 x 111 Q96JY6 S-197 PDZ and LIM domain protein 2 112 Q9BUH6 S-148, T-145, S-148 Protein PAXX 113 Q9BUQ8 S-14 Probable ATP-dependent RNA helicase DDX23 114 Q9BY44 S-506 Eukaryotic translation initiation factor 2A x 115 Q9H3Z4 S-10 DnaJ homolog subfamily C member 5 116 Q9H501 S-153 ESF1 homolog 117 Q9NR45 S-275 Sialic acid synthase x 118 Q9NVS9 S-241 Pyridoxine-5'-phosphate oxidase x 119 Q9UNE7 S-19 E3 ubiquitin-protein ligase CHIP 120 Q9UQ80 S-363 Proliferation-associated protein 2G4 x 121 Q9UQN3 S-199 Charged multivesicular body protein 2b 122 Q9Y2V2 S-30, S-32, S-41, T-45 Calcium-regulated heat stable protein 1 x 123 Q9Y2W1 S-243, S-248, S-698, S- 682, S-684, T-685, T- 874, S-253, Y-54, S-55 Thyroid hormone receptor-associated protein 3 x 124 Q9Y512 S-294 Sorting and assembly machinery component 50 homolog 125 Q9Y5K6 S-224 CD2-associated protein (1), compared with Bonzon-Kulichenko et al., 2011 x indicates proteins in common. Uniprot AC: Uniprot accession number