Chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida bằng kỹ thuật gen

- 1 - TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida bằng kỹ thuật gen. Giáo viên phụ trách: TS. Nguyễn Ngọc Hải. Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trung Tuyến. MSSV: 06126179 Khoa: Công Nghệ Sinh Học - 2 - I. ĐẶT VẤN ĐỀ. Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ở mức độ phân tử. Phạm vi nghiên cứu của môn này có phần trùng lặp với các ngành khác trong sinh học đặc biệt là di truyền học và hóa sinh. Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này. Sinh học phân tử là một bộ môn khoa học còn rất non trẻ nhưng đã có nhiều bước tiến vượt bậc và tác động toàn diện đến nhiều ngành khoa học, đến sản xuất và đời sống. Ngành kinh tế chăn nuôi hiện nay đang gặp nhiều nguy cơ đe dọa quá trình phát triển. Trong đó, dịch bệnh đã ảnh hưởng rất lớn về lợi nhuận, quá trình sản xuất, tình hình chăn nuôi gia cầm trên thế giới. Vì vậy, việc ứng dụng những kỹ thuật sinh học phân tử vào việc chẩn đoán, điều trị bệnh trên vật nuôi hiện nay là một tất yếu. Ngày 02 tháng 10 năm 2009. - 3 - II. TỔNG QUAN. II.1. Bệnh tụ huyết trùng. Tụ huyết trùng là bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra. Bệnh chủ yếu gây nhiễm khuẩn huyết. Vi khuẩn tấn công vào cơ quan tiêu hoá, các hạch và nhất là cơ quan hô hấp. Bệnh lưu hành ở từng địa phương, hoặc thành dịch lớn ở trâu, bò, dê, cừu, thỏ, gia cầm. Bệnh ở gia cầm còn gọi là hoắc loạn gà. Bệnh ở trâu, bò, lợn còn gọi là nhiễm khuẩn huyết xuất huyết. Bệnh ở trâu còn gọi là bacbon (barbone). Bệnh thường xảy ra khi thời tiết thay đổi, thường phát vào mùa nóng ẩm ở những vùng ẩm thấp, cơ thể thú nuôi giảm sức đề kháng, bệnh thường lây qua đường hô hấp, tiêu hoá, vết thương ngoài da hoặc tiếp xúc với nguồn bệnh. II.2. Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng. II.2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới. Năm 1875, Bollinger là người đầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở bò tại Đức. Năm 1879, Tousain phát hiên bệnh tụ huyết trùng ở gà. Gà bị bệnh do vi khuẩn Pasteurell amultocida - 4 - Năm 1880, Louis Pasteur, nhà vi trùng học người Pháp đã phát hiện được vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng ở gà (Fowl cholera) Năm 1881, Gaffky phát hiện bệnh ở thỏ và đặt tên là bệnh bại huyết (Septicaemia disease). Năm 1886, Loeffer phát hiện bệnh ở lợn. Hueppe, nhà giải phẫu bệnh lý học người Đức phát hiện thấy sự tương đồng về triệu chứng, bệnh tích ở gà, bò và thỏ mắc bệnh tụ huyết trùng. Năm 1887, Oroste và Armani phát hiện ra bệnh ở trâu và đặt tên là Barbone. Bò chết do bệnh tụ huyết trùng. Trevissan đã đề nghị đặt tên chung cho nhóm vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella để tưởng nhớ đến nhà bác học Louis Pasteur, người đầu tiên phát hiện ra bệnh tụ huyết trùng ở gà. Từ đó người ta căn cứ vào đặc tính sinh bệnh của từng loài vất, chia Pasteurella thành các loài khác nhau: Pasteurella gây bệnh cho bò là: P. boviseptica Pasteurella gây bệnh cho trâu là: P. bubaliseptica Pasteurella gây bệnh cho lợn là: P. suiseptica Pasteurella gây bệnh cho gia cầm là: P. aviseptica Năm 1939, Rosenbusch và Merchant đã đề nghị đặt tên chung cho vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng là Pasteurella multocida để thể hiện khả năng gây bệnh cho nhiều loài vật của vi khuẩn này. - 5 - Vi khuẩn Pasteurella multocida dưới kính hiển vi. II.2.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam. Ở Việt Nam, bệnh tụ huyết trùng trâu, bò được phát hiện lần đầu tiên năm 1798. Từ đó, bệnh được thấy ở khắp các vùng trong nước. Năm 1994, Dương Thế Long đánh giá hiệu quả những biện pháp phòng trị bệnh tụ huyết trùng ở Sơn La trong giai đoạn 1990-1993, khảng định: tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu. Tiêm phòng bệnh tụ huyết trùng là biện pháp hiệu quả, kinh tế và quan trọng hàng đầu. Năm 1995, Nguyễn Ngã nghiên cứu tính kháng nguyên và độc lực vi khuẩn gây bệnh tụ huyết trùng trâu bò ở khu vực miền trung nhằm chọn giống vi khuẩn - 6 - địa phương thích hợp có khả năng kết hợp với giống vi khuẩn nước ngoài để chế tạo vắc-xin có hiệu lực cao. Năm 1996, Hoàng Đạo Phấn nghiên cứu tác động của thực khuẩn thể đặc hiệu đối với khuẩn Pasteurella multocida phân lập từ gia súc gia cầm. Năm 1996, Nguyễn Thu Thiên và Nguyễn Ngã đã phân lập và xác định các type huyết thanh Pasteurella multocida ở trâu bò nuôi tại miền trung Việt Nam. Năm 2000, Đinh Duy Kháng và Lê Văn Phan đã ứng dụng kỹ thuật PCR để định type vi khuẩn Pasteurella multocida phân lập ở miền trung Việt Nam. HB1, HB2 và HS1, HS2 là hai cặp mồi được dung để xác định Pasteurella multocida gây bại huyết, xuất huyết. II.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida. II.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida. Vi khuẩn Pasteurella nằm trong bộ Eubacteriales, thuộc họ Parvobacteriaceae, thuộc giống Pasteurella và chia làm ba loài, trong đó có loài gây bại huyết, xuất huyết cho gia súc, gia cầm là: Passteurella multocida và Pasteurella haemolytica. II.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida. Pasteurella multocida là một cầu trực khuẩn nhỏ, có kích thức 0,25 -0,4 × 0,4 -1,5 μm. Vi khuẩn có giáp mô, không sinh nha bào, không lông, không di động. Trong canh khuẩn thường thấy vi khuẩn hình trứng, hình cầu, đứng riêng lẻ hoặc thành chuỗi ngắn. Trong canh khuẩn già, vi khuẩn suy yếu, biến dạng, thay đổi hình thái như hình gậy, dùi cui, quả đấm, kích thước lớn hơn bình thường, có khi dài 2-3 μm hay hơn nữa. Vi khuẩn Pasteurella multocida - 7 - II.3.3. Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida. Pasteurella multocida bắt màu Gram âm với thuốc nhuộm gram, vi khuẩn thường dễ bắt màu với thuốc nhuộm aniline, tốt nhất là Methylen blue, đỏ Fucsin, có thể thấy khi dùng phương pháp nhuộm Giemsa và Wright. Các chủng có hình thành giáp mô thì có thể dùng phương pháp nhuộm Hiss và Zilnelson. Trong cơ thể gia súc mắc bệnh (máu và phủ tạng) và trong môi trường mới nuôi cấy, vi khuẩn Pasteurella khi nhuộm màu có hiện tượng bắt màu sẫm ở hai đầu, còn ở giữa không bắt màu hoặc bắt màu nhạt hơn so với hai đầu, nên người ta gọi Pasteurella là vi khuẩn lưỡng cực. Năm 1919, Manninger giải thích tính lưỡng cực của vi khuẩn là do tế bào vi khuẩn đang trong giai đoạn phân chia, vi khuẩn tăng lên về kích thước, độc lực và nguyên sinh chất, khi đó nguyên sinh chất dung giải dồn về hai đầu của tế bào. II.3.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida đã được các nhà nghiên cứu khảo sát dựa trên nguyên lý: vi khuẩn là một tế bào sống nên khi được nuôi trong các môi trường dinh dưỡng, quá trình trao đổi chất diễn ra trong tế bào vi khuẩn sẽ tạo ra các sản phẩm có thể làm thay đổi pH của môi trường. Khi đó dựa vào các chất chỉ thị màu thì người ta có thể xác định đặc tính sinh hóa của chúng. - 8 - II.3.5. Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida. Đặc tính kháng nguyên của Pasteurella multocida rất phức tạp và cấu trúc từng loại kháng nguyên cũng luôn thay đổi. Kháng nguyên của Pasteurella multocida có 2 loại chính là kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên thân O. Việc tìm hiểu cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida có vai trò rất quan trọng không những trong phân loại vi khuẩn Pasteurella multocida mà cả trong nghiên cứu đặc tính sinh miễn dịch của chúng và khả năng chế tạo vắc-xin phòng bệnh. Một vắc-xin có hiệu lực tốt phải bao gồm các kháng nguyên tương ứng với các serotype của các chủng phân lập được trong từng vùng hay khu vực. Pasteurella multocida có tính kháng nguyên giao hỗ (tương đồng kháng nguyên) tức là có khả năng miễn dịch chéo giũa các chủng, tính chất này nhiều hay ít phụ thuộc vào từng chủng. II.3.5.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen). Kháng nguyên vỏ K bao xung quanh thân vi khuẩn, che chở cho kháng nguyên O khỏi bị thực bào tác động. Đồng thời kháng nguyên K ngăn cản sự tiếp xúc giữa kháng nguyên O với kháng thể O. Do đó, muốn phát hiện kháng nguyên O phải phá hủy kháng nguyên K. Kháng nguyên K chỉ có ở vi khuẩn P. multocida tạo khuẩn lạc dạng S, không có ở vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng nhầy (M) và xù xì (R). Có 5 type kháng nguyên thân là A, B, D, E và F II.3.5.2. Kháng nguyên thân O (Somatic antigen). Kháng nguyên O có hai nhóm, đặc hiệu và không đặc hiệu. Các chủng vi khuẩn khác nhau sẽ khác nhau về kháng nguyên O. Chỉ có serotype B là hầu như đồng nhất thuộc một nhóm kháng nguyên O. Kháng nguyên O có hai hệ thống phân loại: + Phân loại của Namioka và Murata (1961) kháng nguyên O có 12 yếu tố. + Phân loại của Heddleston (1972) kháng nguyên O có 16 yếu tố, được đánh dấu từ 1-16. Do tầm quan trọng của vi khuẩn Pasteurella multocida trong bệnh học thú y, người ta đã giải trình tự và xác định được 104 gene có liên quan đến khả năng gây bệnh của Pasteurella multocida, chiếm khoảng 7% bộ gene. Đại diện trong số đó là nhóm gene pfh (Pasteurella filamentous hemagglutinin, pfh). Nhóm - 9 - gene này có kích thước 24 kb, bao gồm 2 gene liên quan đến khả năng gây bệnh của Pasteurella multocida đó là gene pfhB1 (tổng hợp protein 2615aa) và pfhB2 (3919aa). Nhóm gene này có những đặc điểm quan trọng sau: - Đầu amino của 2 gene pfhB1 và pfhB2 theo mô hình N(P/Q)NG(I/M), mô hình này liên quan đến tiến trình tiền phiên mả va tính hiệu ngoại bào. - Vùng trung tâm có chứa một vùng quy định khà năng bám dính của vi khuẩn vào bề mặt của tế bào. Điều này giúp vi khuẩn có thể tấn công vô tế bào và gây bệnh cho vật chủ. - Đầu carboxy chứa vùng có cấu trúc tương tự như protein kháng huyết thanh p76 của Haemophilus somnus (có 66% amino acid tương tự). Khả năng này giúp cho Pasteurella multocida tăng khả năng sống sót trong cơ thể vật chủ từ đó tăng cường khả năng gây bệnh của vi khuẩn. II.3.5.3. Xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida. Vi khuẩn Pasteurella multocida mọc dễ dàng trên các môi trường nhân tạo vì vậy việc chuẩn đoán vi khuẩn không có khó khăn gì đặc biệt. Tuy nhiên để xác định chính xác type kháng nguyên của vi khuẩn đó thì lại khá phức tạp khi sử dụng các kỹ thuật thông thường. Việc xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida chủ yếu được thực hiện bằng phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính, ngưng kết trong ống nghiệm, kỹ thuật kết tủa khuếch tán trên thạch (agar gel precipitation test, AGP) và bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu. Ngày nay, việc giám định vi khuẩn có thể được thực hiện nhờ sự trợ giúp của các kỹ thuật phân tử như: kỹ thuật PCR, kỹ thuật RT-PCR, kỹ thuật phân tích thành phần protein của vi khuẩn trên bản gel… III. PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU. III.1. Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B bằng kỹ thuật PCR. Trong quy trình chuẩn đoán này người ta sử dụng 2 cặp mồi. - Cặp mồi HSB - 10 - KTT72 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’ KTSP61 5’-ATCCGCTAACACTCTC-3’ (Townsend và cs., 1998) - Cặp mồi B capsule type (CAPB) CAPB-FWD 5’-CATTTATCCAAGCTCCACC-3’ CAPB-REV 5’-GCCCGAGAGTTTCAATCC-3’ (Townsend và cs., 2001) Với 2 cặp mồi HSB và CAPB sản phẩm DNA tương ứng được tạo ra có kích thước tương ứng là 620 bp và 720 bp (Townsend và cs., 2001). Với cặp mồi HSB có thể nhận diện được hầu hết các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida, trong đó cặp mồi CAPB cho phép phân biệt các chủng Pasteurella multocida serotype B (B:2, B:5, B:2,5). Ngoài ra để xác định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype D người ta sử dụng cặp mồi CAPD (đặc hiệu cho vi khuẩn P. multocida serogroup D) (Townsend và cs., 2001). Do các chủng Pasteurella multocida có thể dương tính cùng lúc với cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB và CAPD, nên để xác định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B hoặc serotype D cần thiết phải sử dụng đồng thời 2 cặp mồi HSB và CAPB hoặc HSB và CAPD. Kết quả PCR có tính chính xác cao và rất nhanh chóng, vì thế có thể sử dụng chúng trong chuẩn đoán và nghiên cứu dịch tễ bệnh do Pasteurella multocida trên gia súc gia cầm. III.2. Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phương pháp nested-PCR. Trong phương pháp này người ta sử dụng 2 cặp mồi: cặp mồi chung cho loài và cặp mồi riêng cho vùng mã hóa chuyên biệt của một serotype nào đó. Cặp - 11 - mồi chung được thiết kế dựa vào vùng bảo tồn của loài Pasteurella multocida, không chuyên biệt cho serotype nào cả. - Sp6 promoter: 5’-TATTTAGGTGAGACTATAG-3’ - T7 promoter: 5’-TAATACGACTCACTAT-3’ Và cặp mồi riêng cho một serotype nào đó. Dưới đây là cặp mồi cho serotype B: - KMT1SP61: 5’-ATCCGCTAACACACTCTC-3’ - KMT1T72: 5’-AGGCTCGTTTGGATTATGAAG-3’ Đầu tiên với cặp mồi Sp6 promoter và T7 promoter, đoạn gene của vùng bảo tồn sẽ được nhân lên với một số lượng nhất định trong lần chạy PCR thứ nhất. Ở lần chạy PCR thứ hai, với cặp mồi KMT1SP61 và KMT1T72, đoạn gene chuyên biệt của serotype B sẽ được khuếch đại cho phép xác định serotype của vi khuẩn. Trong kỹ thuật này người ta có thể sử dụng 2 cặp mồi sau: Cặp mồi thứ nhất là cặp mồi chung được thiết kế áp dụng cho vùng bảo tồn. - PmCapComAni-F: 5’-TATTTTATGGCTTGTTGTGA-3’ - PmCapComAni-R: 5’-CTTTTTGTTTCATTTGGACTG-3’ Cặp mồi thứ hai chuyên biệt cho một serotype Pasteurella multocida. - KMT1T7: 5’-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3’ - 12 - - KMT1SP6: 5’-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3’ III.3. Phân tích thành phần protein của vi khuẩn. Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn được thực hiện trên gel SDS-PAGE. Các chủng vi khuẩn được pha thành dung dịch huyền phù có nồng độ khoảng 5x109 cfu/ml, trộn với dung dịch đệm 15% β-mecapthoethanol. Điện di protein vi khuẩn P. multocida trên thạch Polyacrylamide 10% Cột 1 và 8: Trọng lượng protein chuẩn Cột 1 đến 7: Dịch chiết protein các chủng vi khuẩn Pasteurella multocida. Việc phân tích thành phần protein của vi khuẩn cho phép ta nhận biết các chủng Pasteurella multocida. Những nghiên cứu của Lugtenberg và cộng sự (1984) cho thấy có 3 loại protein màng ngoài khác nhau và kí hiệu chúng là I, II, III. Các protein này thay đổi trọng lượng phân tử từ 28.000 đến 48.000 daltons. Tuy những protein màng - 13 - ngoài này dường như không có mối liên quan tuyệt đối với các chủng gây bệnh, nhưng theo tác giả thì những chủng Pasteurella multocida có lớp protein màng ngoài thuộc loại I sẽ có thể là chủng gây bệnh. Trong khi đó nếu thuộc loại II thì sẽ có thể là những chủng không gây bệnh. III.4. Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2. Đây là sự kết hợp giữa kỹ thuật PCR và kỹ thuật cắt phân đoạn đa hình RFLP. Kỹ thuật PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism (PCR-RFLP) là một kỹ thuật mà trong đó trình tự ADN biến thể được xác định bằng cách khuếch đại thông qua kỹ thuật PCR. Tiếp theo đó sản phẩm của quá trình PCR sẽ được phân cắt bởi một endonuclease hạn chế. Các phân đoạn DNA khác nhau về kích thước và sẽ được phân tách trên gel agarose / gel acrylamide.Việc phân biệt được các serotype Pasteurella multocida dựa trên sự khác biệt nucleic acid của các serotype Pasteurella multocida. Kiến thức về serotype của Pasteurella multocida tham gia vào một ổ dịch là điều rất cần thiết để tạo nên các biện pháp kiểm soát hiệu quả. Đặc tính kháng nguyên của Pasteurella multocida được thực hiện bởi serogrouping capsular và serotyping soma. Tuy nhiên những kỹ thuật này lại được thực hiện bởi các phòng thí nghiệm tham khảo. Điều này thường dẫn đến sự chậm trễ trong việc xác định các serotype cô lập được. Kỹ thuật gene dựa cho sự khác biệt về nucleic acid của serotypes có thể thay thế cho các kỹ thuật thông thường. Một kỹ thuật PCR-REA (Polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis) đã được chuẩn hóa để phân biệt Pasteurella multocida serotype A: 1, A: 3 và B: 2. Vật liệu và phương pháp: Pasteurella multocida chủng DP1 và FP1 cô lập tại Kerala, Ấn Độ serotyped là A: 1 do Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp. Pasteurella multocida chủng LKO serotypes A: 3, B: 2 do Viện Nghiên cứu thú y, Izatnagar, Ấn Độ cung cấp nhằm hình thành các chủng tham khảo cho nghiên cứu này. Hai oligonucleotides dựa theo trình tự của P. multocida X-73 ompH gene, U50907 (Luo et al ., 1997) được thiết kế bằng cách sử dụng phần mềm Primer3. - 14 - Mồi được tổng hợp bằng cách tuỳ chỉnh M / s Bangalore Genei Ấn Độ. Trình tự của hai mồi được như sau: - OmpH 1: 5'-GCG TTT CAT TCA AAG CAT CTC-3' - OmpH 2: 5'-ATG ACC GCG TAA CGA CTT TC -3' Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi trên để khuếch đại đoạn trình tự OmpH gen của Pasteurella multocida. Enzyme giới hạn phân tích sản phẩm OmpH-PCR: Các sản phẩm PCR khuếch đại sẽ được phân cắt bởi các enzym cắt hạn chế Dra I và Hinf I. (ở 370C trong hai giờ, sau đó là bất hoạt các men tiêu hóa ở 800C trong 20 phút). Điện di các kết quả của enzyme cắt giới hạn được tiến hành trên gel acrylamide 8%. Gels được xem trên một transilluminator và chụp ảnh. Kết quả: Các cặp mồi OmpH 1 và OmpH 2, được thiết kế để khuếch đại gen OmpH của Pasteurella multocida thành công với tất cả các serotypes A:1, A:3 và B: 2. Các sản phẩm khuếch đại có kích thước khoảng 1000bp. Đặc trưng của mồi: Cặp primer OmpH 1 và OmpH 2 đã chỉ chuyên biệt cho đoạn OmpH của vi khuẩn Pasteurella multocida. - 15 - Phân tích hạn chế của các sản phẩm khuếch đại của serotypes A: 1, A: 3 và B: 2 đã được tiến hành bằng cách sử dụng cùng một enzyme cắt giới hạn Dra I và Hinf I. Enzyme Hinf I tạo ra mô hình tương tự như ở A: 3 và B: 2 nhưng khác biệt từ A: 1, trong khi Dra I đã cho các cấu hình khác biệt với nhau cho ba serotypes. - 16 - REA sản phẩm khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I tạo ra các cấu hình riêng biệt cho ba serotypes A: 1, A: 3 và B: 2, trong khi Enzyme Hinf I tạo ra mô hình tương tự ở A: 3 và B: 2 nhưng khác biệt ở A: 1 . Vì vậy, REA sản phẩm khuếch đại của OmpH-PCR với Dra I cung cấp một kỹ thuật lý thuyết cho sự khác biệt giữa các serotype của Pasteurella multocida. Nếu mô hình duy nhất cho tất cả các serotypes có thể được xác định một cách tương tự thì chúng ta có thể có một kỹ thuật serotyping đơn giản, nhanh chóng và có thể được thực hiện trong bất kỳ phòng thí nghiệm có năng lực để thực hiện PCR. Sự phát triển của ADN dựa trên một kỹ thuật cho biết sự khác biệt của serotypes có thể cung cấp một thay thế cho hệ thống quy ước serotyping. Tuy nhiên, các nghiên cứu phải tiếp tục được thực hiện với tất cả các serotypes khác nhau để biết hồ sơ duy nhất cho mỗi serotype thu được, trước khi kỹ thuật này có thể được đặt để sử dụng thường lệ. - 17 - IV. KẾT LUẬN. Bệnh tụ huyết trùng là một bệnh nhiễm khuẩn có độc lực cao ở gia súc gia cầm, do vi khuẩn Pasteurella multocida gây ra. Bệnh gây thiệt hại lớn cho nền kinh tế chăn nuôi trên toàn thế giới. Ngày nay với kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại, đặc biệt là kỹ thuật gene đang rất phát triển thì chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida (tác nhân gây bệnh tụ cầu huyết) đã không còn là khó khăn nữa. Một số kỹ thuật gene điển hình được sử dụng trong chuẩn đoán vi khuẩn Pasteurella multocida: - PCR (Polymerase Chain Reaction) - nested-PCR - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) - PCR-RFLP (PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism) - 18 - V. TÀI LIỆU THAM KHẢO. 1. Công nghệ sinh học trong thú y – Nguyễn Ngọc Hải, nhà xuất bản nông nghiệp. 2. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY về các bài báo có liên quan. 3. Bài báo cáo tổng kết KHKT Đề tài KC.04.06, nghiên cứu hoàn thiện công nghệ sản xuất vaccine nhược độc, vô hoạt phòng bệnh cho gia súc, gia cầm và kỹ thuật gene xác định type virus lở mồm long móng, chủ nhiệm đề tài: TS. Tô Long Thành. 6102, 19/09/2006. 4. 5. s_of_pasteurella_multocida_using_polymerase_chain_reaction.htm 6. e/volume_2_number_2_2/article/nucleic_acid_based_differentiation_of_pa steurella_multocida_serotypes.html 7. www.aasp.org/shap/issues/v15n5/v15n5p279.htm 8. 9. Verona/Papers/P-PerezdeRozas1.pdf 10. www.google.com.vn ( các từ khóa Pasteurella multocida, tụ huyết trùng, Fowl cholera, Septicaemia disease, PCR-Restriction Fragment Le 11. ngth Polymorphism…) - 19 - MỤC LỤC I. ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................5 II. TỔNG QUAN. II.1. Bệnh tụ huyết trùng..........................................................................5 II.2. Vài nét lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng................................5 II.2.1. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng trên thế giới.................5 II.2.2. Lịch sử nghiên cứu bệnh tụ huyết trùng ở Viêt Nam .................7 II.3. Vi khuẩn Pasteurella multocida.......................................................8 II.3.1. Đặc tính sinh vật học của vi khuẩn Pasteurella multocida ........8 II.3.2. Đặc tính hình thái của vi khuẩn Pasteurella multocida .............8 II.3.3. Tính bắt màu của vi khuẩn Pasteurella multocida .....................9 II.3.4. Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn Pasteurella multocida ..............9 II.3.5. Đặc tính kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida ......10 II.3.5.1. Kháng nguyên vỏ K (Kapsular antigen) ..............................10 II.3.5.2. Kháng nguyên thân O (Somatic antigen) .............................10 II.3.5.3. Xác định type kháng nguyên của vi khuẩn Pasteurella multocida...................................................................................11 III. PHƯƠNG PHÁP – VẬT LIỆU III.1. Giám định vi khuẩn Pasteurella multocida serotype B bằng kỹ thuật PCR....................................................................11 - 20 - III.2. Xác định serotype vi khuẩn Pasteurella multocida bằng phương pháp nested-PCR...................................................................12 III.3. Phân tích thành phần protein của vi khuẩn .....................................14 III.4. Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP trong việc chuẩn đoán phân biệt Pasteurella multocida serotype A:1, A:3, B:2.....................................15 IV. KẾT LUẬN ................................................................................................19 V. TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................20