Đánh giá độc tính tiền lâm sàng dược chất phóng xạ 90y - Nimotuzumab trên chuột

THE 20th NATIONAL CONGRESS OF VIETNAMESE SOCIETY OF RADIOLOGY AND NUCLEAR MEDICINE ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH TIỀN LÂM SÀNG DƯỢC CHẤT PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB TRÊN CHUỘT NGUYỄN THỊ THU Viện Nghiên cứu hạt nhân hinhanhykhoa.com ĐẶT VẤN ĐỀ Hiệp hội Y học hạt nhân Châu Âu đã đề xuất phương án nghiên cứu độc tính tiền lâm sàng cho thuốc phóng xạ mới, để có thể đưa vào ứng dụng lâm sàng khi DCPX chưa có cấp phép hoặc chuyên khảo nào trong dược điển. Thay cho việc nghiên cứu độc tính cấp truyền thống trước kia, khái niệm nghiên cứu độc tính liều duy nhất mở rộng được đặt ra để thực hiện với các thuốc phóng xạ mới nhằm tạo bộ số liệu tiền lâm sàng để đệ trình các cơ quan có thẩm quyền cấp phép sử dụng thuốc phóng xạ Để có cơ sở dữ liệu về số liệu an toàn tiền lâm sàng về độc tính phóng xạ và định liều phóng xạ: việc đánh giá độc tính tiền lâm sàng của 90Y- nimotuzumab trên chuột được thực hiện. Liều tiêm <1,5ug người: Liều này không độc tính, tuy nhiên độc tố tiềm ẩn, cần phải xác định và bàn luận. Liều tiêm <100ug: Tiêm 100 lần liều tối đa dùng trên bệnh nhân, LD50>1000mg/kg thể trọng, hoặc tiêm 30 con chuột, 10 con mỗi nhóm. Liều tiêm >100ug: thường là thuốc kháng thể Nội dung 1: Điều chế 90Y-nimotuzumab Nội dung 2: Kiểm tra chất lượng 90Y-nimotuzumab  Kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ  Độ ổn định invitro và invivo  Nồng độ phóng xạ  Hoạt độ riêng Nội dung 3: Đánh giá độc tính phóng xạ của 90Y-nimotuzumab trên chuột  Mỗi nhóm 10 con chuột được tiêm tĩnh mạch 90Y-nimotuzumab các liều 9,25, 92,5 và 462,5 MBq/kg, nhóm chứng tiêm NaCl 0,9% và nhóm tiêm nimotuzumab liều 500 mg.  Theo dõi trọng lượng chuột bằng cách cân chuột trước khi tiêm chế phẩm và hàng tuần.  Lấy máu để đánh giá các chỉ số huyết học (CBC), sinh hóa (SGOT, SGPT) Tại thời điểm 3 ngày và 30 ngày  Kiểm tra vi thể tế bào các mô gan, thận, lách, phổi, tim.  So sánh với các nghiên cứu đã thực hiện với 131I-nimotuzumab và 99mTc-NCA90 NỘI DUNG hinhanhykhoa.com ĐiỀU TRỊ UNG THƯ HiỆN NAY TRÊN THẾ GIỚI Nguồn: Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 33 Thống kê trên 14 triệu bệnh nhân ung thư hàng năm, điều trị đích so với các phương pháp khác chưa phổ biến  Nhiều dược chất phóng xạ đang trong giai đoạn lâm sàng như:  131I-antiCD45antibody, 213Bi-anti-CD33 IgG điều trị bệnh bạch cầu dòng tủy,  90Y-epratuzumab điều trị lymphoma thể nang giai đoạn I/II,  177Lu-J591 điều trị ung thư tuyến tiền liệt,  Tuy nhiên điều trị các ung thư dạng rắn ác tính như ung thư vú, ruột kết, tuyến tụy, đầu cổ, thận, phổi, các tác nhân điều trị hiện nay đều chưa hiệu quả,  Việc điều trị vẫn còn nhiều thách thức. GIỚI THIỆU CÁC LOẠI DƯỢC CHẤT PHÓNG XẠ CHẨN ĐOÁN VÀ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẦU CỔ hinhanhykhoa.com • Nimotuzumab (h-R3, 2003), • Cetuximab (Erbitux, 2003), • Panitumumab (Vectibix, 2006), • Zalutumumab (HuMax, 2009). GIỚI THIỆU KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG DÙNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẦU CỔ Kháng thể gắn đồng vị phóng xạ nhắm đích lên tế bào ung thư Đồng vị phóng xạ Yttri-90 (Y-90) phát bức xạ tia beta với năng lượng cao dùng trong điều trị miễn dịch phóng xạ. NGUYÊN VẬT LIỆU, HÓA CHẤT • Kháng thể Nimotuzumab (có tên khác là Cimaher, chai 50mg/10ml, hãng CIMAB, Cuba. Công thức phân tử C6566H10082N1746O2056S40, trọng lượng phân tử 150.000 Da • Đồng vị phóng xạ Yttri-90, 90Yttrium- acetat (CH3COO)3. 90Y, được tách chiết từ máy phát đồng vị 90Sr/90Y bằng phương pháp màng Supported Liquid Membrane (SLM) từ nguồn phóng xạ 90Sr.  Các hóa chất 2-ethylhexyl 2-ethylhexyl phosphonic axit (PC 88A), C16H35O3P, Daihatchi, Nhật, p-NCS-Bn-DOTA, Macrocyclic, Mỹ. MERCK, DMSO (Dimethyl Sulfoxide). CMPO Octyl(phenyl)-N,N diisobutylcarbamoylmethyl phosphin oxide. DTPA (Diethylentriaminpentaacetic axit)  Các dung môi như methanol. n- dodecan, DMSO (Dimethyl Sulfoxide)  Chuột Swiss • Dược chất phóng xạ 90Y-DOTA-p- benzyl-nimotuzumab bao gồm - Kháng thể đơn dòng nimotuzumab - Đồng vị phóng xạ 90Y • Kháng thể đơn dòng nimotuzumab được gắn với p-SCN-benzyl-DOTA bằng kỹ thuật tạo phức giữa một chất là phân tử sinh học với một chất là chất tạo phức càng cua p- SCN-benzyl-DOTA. 90Y-NIMOTUZUMAB PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU hinhanhykhoa.com Điều chế 90Y-nimotuzumab Kiểm tra chất lượng 90Y-nimotuzumab  Kiểm tra độ tinh khiết hóa phóng xạ  Độ ổn định invitro và invivo  Nồng độ phóng xạ  Hoạt độ riêng Đánh giá độc tính phóng xạ của 90Y-nimotuzumab trên chuột  Tiêm tĩnh mạch đuôi chuột các liều 9,25, 92,5 và 462,5 MBq/kg 90Y-nimotuzumab, nhóm chứng tiêm NaCl 0,9% và nhóm tiêm nimotuzumab liều 500 mg.  Tại thời điểm 3 ngày và 30 ngày, lấy máu để đánh giá các chỉ số sinh hóa, huyết học và kiểm tra vi thể tế bào các mô gan, thận, lách, phổi, tim  So sánh với các nghiên cứu đã thực hiện với 131I-nimotuzumab và 99mTc-NCA90 Tài liệu: EJNMMI Radiopharmacy and Chemistry, Cold Spring Habor Laboratory Press. P.41 • Tiêm các liều 9,25, 92,5 and 462,5 MBq/kg và 500 mg kháng thể. • Sau khi tiêm 3 ngày và 30 ngày, đánh giá toàn thân. • Đánh giá các chỉ số huyết học, chỉ số sinh hóa và chụp hình vi thể tế bào. CHUỘT THỰC NGHIỆM TIÊM 90Y-NIMOTUZUMAB • Phân tử DOTA gắn với kháng thể qua liên kết hóa học giữa nhóm amin của lysin trên phân tử kháng thể và nhóm isothioxyanat (SCN) của phức càng cua SCN-Benzyl-DOTA (–C6H5-SCN-DOTA). • Phức p-SCN-benzyl-DOTA-nimotuzumab được đánh dấu với đồng vị phóng xạ 90Y, tạo nên dược chất phóng xạ 90Y-DOTA-p-benzyl- nimotuzumab, có cấu trúc phân tử như sau: ĐIỀU CHẾ 90Y-DOTA-NIMOTUZUMAB: Liên kết phối trí KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CHẤT LƯỢNG PHỨC MIỄN DỊCH PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB Chỉ tiêu chất lượng 90Y-DOTA-nimotuzumab Phương pháp Dung dịch 90Y-DOTA- nimotuzumab 5 mCi/10ml Đánh dấu qua n-Bn-DOTA, lọc sắc ký lọc gel sephadex Độ trong đục Dung dịch trong suốt, không màu Cảm quan Nồng độ phóng xạ 5 mCi/10 ml Đo trên máy đo bêta nhấp nháy lỏng LSC Hoạt độ riêng 10 mCi/mg Tính theo hoạt độ và khối lượng pH 6,5 Giấy đo pH Độ tinh khiết hạt nhân phóng xạ 90Sr (0,546 MeV) < 0,002% 90Y (2,28 MeV) > 99,998 % - Đo phổ beta, - Đo EPC - Đo phổ gamma Theo TCCS-DPPX 14-2010 Độ tinh khiết hóa phóng xạ 90Y-DOTA-nimotuzumab > 98,0% Sắc ký lớp mỏng TLC và TCC Theo TCCS-DPPX 13-2010 Độ vô khuẩn Đạt Theo TCCS-DPPX 15-2010 Nội độc tố vi khuẩn Giới hạn đo 175/V (EU/mL), Kết quả đo < 5 EU/ml Thử nội độc tố vi khuẩn, phương pháp LAL, đo trên máy PTS 100 theo TCCS- DPPX 16-2010 ĐỘ TINH KHIẾT HÓA PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB (TLC) ĐỘ TINH KHIẾT HÓA PHÓNG XẠ 90Y-NIMOTUZUMAB (TCC) 05 10 15 20 25 30 35 40 1 7 14 21 28 30 T rọ n g l ư ợ n g c h u ộ t (g a m ) Thời gian (ngày) Nhóm chứng Nhóm tiêm liều 9,25 MBq/kg Nhóm tiêm liều 92,5 MBq/kg Nhóm tiêm liều 462,5 MBq/kg Nhóm tiêm kháng thể 500 ug/kg KẾT QUẢ KIỂM TRA TRỌNG LƯỢNG CHUỘT TIÊM 90Y-NIMOTUZUMAB Diễn biến trọng lượng chuột sau khi tiêm 90Y-nimotuzumab: Liều tiêm 9,25 - 462,5 MBq/kg, các nhóm chứng và nhóm thực nghiệm tăng giống nhau Kết quả trên không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về sự biến đổi trọng lượng của các nhóm chuột với p>0,05 Sau khi tiêm 3 ngày Liều tiêm (MBq/kg) NaCl 0,9% 9,25 92,5 462,5 500 mg/kg RBC (M/ml) 8,58±0,3 2 8,76±0,62 8,88±0,44 9,54±0,80 8,48±4,24 WBC (K/ml) 1,14±0,48 1,14±0,64 1,16±0,32 1,42±0,38 2,09±1,00 PLT(K/mL) 710±136 540±102 632±120 452±92 596±187 SGOT(U/L) 78,8±41,8 109±23,3 83,6±33,9 118±22,5 96,5±25,1 SGPT(U/L) 43,4±3,5 48,0±9,9 41,2±6,8 58,6±4,1 51,2±16,6 KẾT QUẢ KIỂM TRA CHỈ SỐ HUYẾT HỌC VÀ SINH HÓA (X± SD) Các chỉ số huyết học giữa nhóm đối chứng và nhóm tiêm thuốc không có khác biệt (p>0,05) nhóm chứng có chỉ số hồng cầu là 8,58± 0,32 M/ml và nhóm tiêm liều cao là 9,54± 0,80 M/ml  Sau khi tiêm 30 ngày Liều tiêm (MBq/kg) NaCl 0,9% 9,25 92,5 462,5 500 mg/kg RBC (M/ml) 11,31±0,77 11,49±1,11 10,5±0,74 11,62±1,21 10,96±1,03 WBC (K/ml) 2,09±0,79 3,8±1,74 2,54±0,95 1,87±0,64 2,1±0,89 PLT(K/mL) 720±179 798±129 1013±243 631±267 863±250 SGOT(U/L) 84,6±39 94,2±56 105,8±57,6 102±57,6 83,2±39,8 SGPT(U/L) 47±9,64 42,8±24,4 51,2±34,3 50,3±26,2 44,7±12,04 Số lượng hồng cầu ổn định, nhóm chứng và nhóm tiêm thuốc liều cao là 11,31±0,77 M/ml và 11,62±1,21, bạch cầu 2,09±0,79 K/ml và 1,87±0,64 K/ml. Kết quả cho thấy không thấy sự khác biệt giữa các nhóm chuột tiêm thuốc và nhóm chứng. KẾT QUẢ KIỂM TRA CHỈ SỐ HUYẾT HỌC VÀ SINH HÓA (X± SD) hinhanhykhoa.com - Các tế bào gan nhóm chứng trong giới hạn bình thường, không có nhân đông hay thoái hóa mỡ, không có hoại tử, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, không có ứ mật, xuất huyết, tăng sinh hay xơ hóa. - Nhóm chuột tiêm liều cao tế bào gan có thoái hóa nhẹ gồm thoái hóa nước, thoái hóa hạt và hoại tử nhẹ quanh tĩnh mạch trung tâm, có thoái hóa hạt Eosin mức độ nhẹ, không có thoái hóa mỡ, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, không có ứ mật, xuất huyết, tăng sinh hay xơ hóa. - Nhóm chuột tiêm kháng thể, mô gan có thoái hóa nước, thoái hóa hạt nhẹ, hoại tử quanh tĩnh mạch trung tâm và vùng giữa mức độ nhẹ, hoại tử quanh và trong khoảng cửa mức độ vừa, không có thoái hóa mỡ, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, không có ứ mật, xuất huyết, tăng sinh hay xơ hóa . KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO GAN Tế bào gan chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5mCi/kg (B) và chuột tiêm kháng thể liều 500 mg/kg. Tế bào thận cho thấy có viêm mô thận kẽ mức độ trung bình, tế bào ống thận mất bờ bàn chải nhân co lại, có không bào KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO THẬN Hình ảnh vi thể tế bào thận. Tế bào thận chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C) Các mô lách của chuột cho thấy trong giới hạn bình thường, không viêm, không hoại tử, không xơ hóa. KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO LÁCH Hình ảnh vi thể tế bào lách. Tế bào lách chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C) Phổi trong giới hạn bình thường, không có viêm hay xuất huyết nhu mô phổi. KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO PHỔI Hình ảnh vi thể tế bào phổi. Tế bào phổi chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C) Các tế bào cơ vân tim rõ cấu trúc, giới hạn bình thường, không hoại tử cơ tim, không viêm cơ tim. không có xơ hóa mô kẽ cơ tim KẾT QUẢ CHỤP VI THỂ TẾ BÀO TIM Hình ảnh vi thể tế bào tim. Tế bào tim chuột đối chứng (A), chuột tiêm 90Y-nimotuzumab liều 462,5 mCi/kg (B) và nimotuzumab 500/kg mg (C) So sánh với các nghiên cứu đã thực hiện với 131I-nimotuzumab và 99mTc-NCA90 Các tiểu thuỳ mô gan có cấu trúc rõ ràng, nhân đông nhẹ, có thoái hóa mỡ nhẹ, có tăng sinh tái tạo tế bào gan mức nhẹ ở các nhóm Thận rõ cấu trúc các vùng vỏ và tủy, mô thận bình thường, không hoại tử ống thận, cầu thận không viêm, không xơ hóa Chuột tiêm 131I-nimotuzumab các liều 92,5, 277,5 và 925 MBq/Kg 05 10 15 20 25 30 35 40 1 5 10 15 20 25 30 T rọ n g l ư ợ n g c h u ộ t (g a m ) Thời gian (ngày) Các mô gan chuột bình thường, tiểu thuỳ có cấu trúc rõ ràng, nhân đông nhẹ, gan bình thường. Thận rõ cấu trúc các vùng vỏ và tủy, mô thận bình thường. Các mô tim, lách, phổi trong giới hạn bình thường. Chuột tiêm 99mTc- NCA90 các liều 10, 100, 500 uCi/con  Mục đích đánh giá mức độc tính tiền lâm sàng đối với dược chất phóng xạ kháng thể đơn dòng gắn đồng vị phóng xạ 90Y.  Thời gian thích hợp trong thí nghiệm là 30 ngày là hợp lý đối với thuốc phóng xạ đánh dấu 90Y  Liều tiêm 0,185 MBq, 1,85 MBq và 9,25 MBq mỗi con, tính theo trọng lượng quy đổi thì liều trên kg là 9,25 MBq, 92,5 MBq và 462,5 MBq. Tính theo liều tối đa cho phép đối với 90Y dùng trên người mà chưa có độc tính phóng xạ là 23,6 MBq/kg thì tiêm chuột liều 462,5 MBq/kg ĐÁNH GIÁ CHUNG  Động vật thí nghiệm đều sống qua 5 tuần theo dõi, thậm chí với liều cao nhất là 462,5 MBq/kg. Mức liều tiêm kháng thể 500 mg được dùng, vì ngày nay các loại thuốc mới có bản chất peptid và protein dùng trong điều trị được ICH chỉ dẫn đánh giá ở mức >100 mg. Mức liều không gây ra sự biến đổi trầm trọng (NOAEL: No observed adverse effect level) được xem là dưới 1,5 mg tính cho 1 người 50 kg một ngày, đó là liều 9,25 MBq/kg.  LD50 do gây độc cấp tính không được tính, có thể là ở mức liều cao hơn các mức liều sử dụng trong nghiên cứu này, theo chỉ dẫn ICH S9 (International Conference on Harmonisation). Khi sử dụng liều rất cao, các tế bào máu vẫn ổn định, các mô không bị hư hại, có thể là do lượng yttri đưa vào cơ thể ít, hoạt tính riêng của yttri là 5,43 x 105 mCi/mg, tính ra có 0,05 x 10-4 nmol yttri tham gia trong phức hợp, nên không làm thay đổi tính chất dược lý. ĐÁNH GIÁ CHUNG KẾT LUẬN Với hoạt tính phóng xạ dùng trong thí nghiệm cao hơn liều điều trị tối đa cho phép dùng trên người trong điều trị lâm sàng, độc tính của dược chất phóng xạ 90Y gắn kháng thể đơn dòng trên chuột thực nghiệm ở mức rất nhẹ. Mức gây độc được nghiên cứu xuyên khắp cơ thể nơi mà thuốc phóng xạ kháng thể đơn dòng đi qua. Kết quả nghiên cứu này chỉ ra rằng, các cơ quan nội tạng không có hư hại nào trong các nhóm tiêm liều thấp và cả nhóm tiêm liều cao. Kết quả nghiên cứu giúp cho cơ sở sản xuất có số liệu đệ trình các cấp có thẩm quyền trong việc ứng dụng lâm sàng. XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN