Đề tài : Cách đếm số lượng vi sinh vật trực tiếp bằng buồng đếm

Click to edit Master title style Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 4/29/2014 ‹#› ĐỀ TÀI: CÁCH ĐẾM SỐ LƯỢNG VI SINH VẬT TRỰC TIẾP BẰNG BUỒNG ĐẾM BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM Khoa: CNSH & KTMT MÔN: VI SINH VẬT KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG GVHD:Nguyễn Duy Thanh NHÓM: 6 MỤC LỤC Mở đầu Trong bất kỳ một loại mẫu vật nào, muốn biết số lượng chung của các nhóm vi sinh vật cũng như số lượng riêng của mỗi nhóm thành phần, đều cần phải đếm số lượng tế bào của chúng. Để xác định số lượng vi sinh vật trong đất, nước, không khí và dịch nuôi cấy … người ta có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau. Trong đó có 2 phương pháp dưới đây được dùng nhiều hơn cả: Phương pháp xác định trực tiếp số lượng tế bào bằng phiến kính có khung đếm Goriaep (phòng đếm hồng cầu). Phương pháp xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch. Mở đầu Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm Cơ sở lý thuyết Phương pháp đếm trực tiếp cho phép ta đếm số lượng vi sinh vật có kích thước lớn như nấm men, tảo, bào tử vi nấm, không dùng để đếm vi khuẩn Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, nhờ buồng đếm hồng cầu Buồng đếm Hemocytometer Cấu tạo của buồng đếm Nguyên tắc cấu tạo của phòng đếm: đó là một phiến kính dày hình chữ nhật, chia thành 3 khoảng, khoảng giữa chia thành 2 khoảng nhỏ. Trên mỗi khoảng này có kẻ một lưới đếm, gồm rất nhiều ô vuông . Mỗi ô vuông lại được chia ra thành 16 ô vuông nhỏ , mỗi ô nhỏ có diện tích là 1/400 mm2, và chiều dày là 1/10 mm, như vậy thể tích 1 ô vuông nhỏ là 1/4000 mm3 hay 1/4000.000 ml. Phòng đếm có 1 lá kính dày để đậy. Cách tiến hành Pha loãng mẫu đảm bảo không lớn hơn 10 tế bào và không nhỏ hơn 2,5 tế bào Lắc đều ống nghiệm pha loãng mẫu. Nhỏ 1 giọt dung dịch mẫu vào giữa phòng đếm và đậy lại bằng lá kính, chú ý không để tạo bọt khí. Di chuyển nhẹ nhàng phòng đếm để dung dịch mẫu tràn đầy các khoang. Đặt phòng đếm lên bàn kính hiển vi, để yên 3 – 5 phút, sau đó tiến hành đếm số lượng tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau (chọn 4 ô ở 4 góc và một ô ở chính giữa). Sau khi cho lên kính hiển vi Cách đếm số lượng vi sinh vật Cách đếm số tế bào trong mỗi ô lớn như sau: mỗi ô nhỏ có 4 cạnh giới hạn, đếm số lượng tế bào nằm trọn trong ô và những tế bào nằm trên 2 cạnh liên tiếp cùng chiều, ví dụ: đếm cạnh bên dưới và cạnh bên phải. Đếm các ô từ trái sang phải, từ hàng trên xuống hàng dưới rồi đổi chiều. Cứ đếm như vậy cho đến ô cuối cùng của 16 ô con. Cách tính toán Gọi A là số lượng tế bào đếm được trong 80 ô nhỏ Số lượng tế bào trong 1mm3 được tính theo công thức sau: số tế bào trong 1mm3 Trong đó: 4000 = 400*10 (1/400 mm2 : diện tích một ô nhỏ ; 1/10 mm: chiều cao từ mặt buồng đếm tới lammelle) APL : độ pha loãng Ưu và nhược điểm của phương pháp Ưu điểm : quá trình này cho phép xác định nhanh chóng mật độ vsv chứa trong mẫu. Nhược điểm: không phân biệt được tế bào sống và tế bào chết. dễ nhầm lẫn tế bào vi sinh vật với các vật thể khác trong mẫu. khó đạt được độ chính xác cao. Không thích hợp với huyền phù vi sinh vật có mật độ thấp. Cho xem đoạn clip https://www.youtube.com/watch?v=pP0xERLUhyc The end Xác định số lượng vi sinh vật gián tiếp bằng phương pháp đếm khuẩn lạc Nguyên tắc của phương pháp Đếm số lượng vi sinh vật hiếu khí xuất hiện trong mẫu Cấy một thể tích mẫu nhất định lên một môi trường đã tạo lập sẵn( hộp petri), thuận lợi cho việc phát triển của vi sinh vật Sau một thời gian nhất định thì mỗi khuẩn lạc được tạo thành tương ứng với số lượng tế bào phát triển lên Ta đếm số khuẩn lạc sau đó tính toán số lượng vi sinh vật Nguyên Liệu và thiết bị Môi trường nuôi cấy PCA Chất hòa tan: Đệm PBP Mẫu Thiết Bị Thiết bị đồng nhất mẫu (stomacher) Buồng nuôi cấy (incubarto) Thiết Bị Máy đếm khuẩn lạc CÁCH TIẾN HÀNH Xử lý mẫu Chuẩn bị môi trường Chuẩn bị dung dịch pha Đĩa petri Buồng nuôi Đếm khuẩn lạc Tính toán 1. CÁC BƯỚC XỬ LÝ MẪU Mẫu ổn định được giữ ở nhiệt độ phòng Mẫu lạnh được giữ ở nhiệt độ 0-5 oC Mẫu lạnh đông được giữ ở nhiệt độ lạnh đông Vận chuyển và bảo quản Rã đông Phân tích mẫu 2.CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG CHUẨN BỊ ĐĨA PETRI GIA NHIỆT MÔI TRƯỜNG LÀM SẠCH BỀ MẶT LÀM VIỆC ĐÁNH DẤU RÕ RÀNG 3. CHUẨN BỊ DỊCH PHA LOÃNG BPB VÔ TRÙNG DỊCH PHA LOÃNG MẪU PHÂN TÍCH PHẢI ĐỒNG NHẤT PHA LOÃNG DUNG DỊCH KHUẤY TRỘN CHỈNH pH ĐỖ ĐĨA Cấy 0,1 ml mẫu nguyên hoặc đã pha loãng vào đĩa môi trường thạch Baird Parker. Dùng que cấy tam giác thủy tinh ( thanh gạt thủy tinh) trải đều mẫu lên bề mặt môi trường cho đến khi khô. Thực hiện lập lại 3 đĩa môi trường thạch Baird Parker cho mỗi loại pha loãng. Đưa mẫu vào máy ủ Lật ngược đĩa, đưa vào tủ trong 24 – 48 giờ đối với môi trường Baird Parker NUÔI CẤY 15-20oC 30-35oC 55oC Vi khuẩn ưa nhiệt Vi khuẩn ưa lạnh Vi khuẩn ưa ấm - Sau 24 giờ, khuẩn lạc S. aureus trên môi trường thạch Baird Parker có đường kính 0,5 – 1 mm, lồi , đen bóng, có vòng sáng rộng khoảng 1 – 2mm bao quanh. - Đánh dấu trên mặt đáy của đĩa các khuẩn lạc có đặc điểm như trên và tiếp tục ủ 48 giờ. - Sau 48 giờ khuẩn lạc S. aureus có đường kính khoảng 1 – 1,5mm, có màu đen bóng, lồi, có vòng trắng đục hẹp và vòng sáng rộng khoảng 2 – 4mm quanh khuẩn lạc. Khuẩn lạc một số dòng S. Aureus có thể không tạo các vòng sáng quanh khuẩn lạc như trên. Cần đến và đánh dấu cả hai loại khuẩn lạc. Lấy bút chì kẻ 2 hoặc đường chéo ở đáy hộp petri (tuỳ theo số khuẩn lạc mọc ít hay nhiều) chia hộp thành 4 hoặc 8 phần, đánh dấu thứ tự từng phần từ 1 – 4 hoặc từ 1 – 8. Đếm số khuẩn lạc từng phần, nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm để tránh trùng lặp. Số lượng tế bào vi sinh vật trong 1 gam mẫu được tính theo công thức sau: 1 N = X .V . M . K Trong đó: N là số tế bào vi sinh vật hay số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) trong 1 gam đất X là số khuẩn trung bình trong mỗi hộp petri ở cùng độ pha loãng. V là thể tích dung dịch mẫu cấy vào mỗi hộp petri. M là độ pha loãng dùng để cấy. K là hệ số khô kiệt của mẫu (K = 100/(100 – x), x là độ ẩm của đất) Chú ý: độ pha loãng thích hợp nhất là độ pha loãng mà số khuẩn lạc đếm được trong mỗi hộp petri sau khi nuôi cấy là 50 – 150 3. PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC: Ưu điểm: Cho phép xác định số tế bào sống. Định lượng chọn lọc vsv. Nhược điểm - Không định lượng được những vsv quá nhạy - Không xác định được hình dạng khuẩn lạc nất định - Khó làm thuần một dòng vsv . Tài liệu tham khảo GIÁO ÁN ĐIỆN TỬ MÔN:KHOA HỌC LỚP 4 Cảm ơn thầy và các bạn đã theo dõi ! The End