Đề tài Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa có khả năng chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR

thấy: hệ số tương đồng di truyền của 40 giống lúa chịu hạn dao động trong khoảng từ 0,02 đến 0,91. Hai cặp giống lúa Khẩu sán - Khẩu đó đón (H37 - H38) và Ble blu và Ble la tong (H7 - H8) có hệ số tương đồng di truyền cao nhất là 0,91 49 Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16 H17 H18 H19 H20 H1 1.00 H2 0.22 1.00 H3 0.18 0.52 1.00 H4 0.38 0.18 0.21 1.00 H5 0.33 0.29 0.21 0.42 1.00 H6 0.15 0.34 0.50 0.10 0.10 1.00 H7 0.10 0.31 0.38 0.07 0.13 0.52 1.00 H8 0.13 0.35 0.38 0.10 0.13 0.52 0.64 1.00 H9 0.29 0.18 0.12 0.41 0.50 0.12 0.10 0.12 1.00 H10 0.26 0.15 0.18 0.38 0.33 0.12 0.13 0.15 0.55 1.00 H11 0.24 0.21 0.20 0.48 0.48 0.09 0.07 0.09 0.68 0.53 1.00 H12 0.15 0.07 0.12 0.41 0.32 0.09 0.10 0.12 0.59 0.50 0.57 1.00 H13 0.18 0.28 0.38 0.18 0.15 0.38 0.44 0.48 0.12 0.25 0.18 0.10 1.00 H14 0.28 0.18 0.12 0.39 0.39 0.17 0.09 0.12 0.74 0.48 0.60 0.57 0.15 1.00 H15 0.24 0.17 0.14 0.38 0.38 0.23 0.12 0.17 0.71 0.42 0.53 0.50 0.20 0.69 1.00 H16 0.12 0.12 0.14 0.15 0.18 0.36 0.33 0.45 0.14 0.09 0.14 0.14 0.33 0.20 0.25 1.00 H17 0.10 0.12 0.23 0.15 0.12 0.33 0.47 0.38 0.09 0.12 0.14 0.15 0.42 0.14 0.14 0.58 1.00 H18 0.15 0.07 0.21 0.18 0.18 0.31 0.39 0.39 0.15 0.13 0.15 0.18 0.39 0.12 0.20 0.50 0.62 1.00 H19 0.15 0.21 0.12 0.32 0.36 0.07 0.07 0.10 0.64 0.41 0.52 0.44 0.10 0.57 0.45 0.17 0.21 0.21 1.00 H20 0.13 0.12 0.24 0.15 0.13 0.34 0.24 0.39 0.15 0.13 0.15 0.15 0.39 0.12 0.23 0.50 0.47 0.64 0.21 1.00 H21 0.22 0.15 0.21 0.25 0.22 0.18 0.18 0.28 0.18 0.15 0.24 0.18 0.24 0.15 0.26 0.37 0.38 0.39 0.24 0.53 H22 0.15 0.15 0.21 0.18 0.15 0.34 0.31 0.35 0.15 0.13 0.15 0.15 0.39 0.12 0.23 0.45 0.52 0.64 0.21 0.70 H23 0.15 0.18 0.14 0.31 0.31 0.07 0.04 0.04 0.42 0.35 0.50 0.34 0.07 0.45 0.32 0.14 0.14 0.15 0.62 0.12 H24 0.13 0.25 0.24 0.33 0.29 0.12 0.13 0.15 0.36 0.29 0.48 0.32 0.10 0.35 0.31 0.24 0.28 0.25 0.61 0.25 H25 0.12 0.07 0.20 0.15 0.15 0.26 0.34 0.31 0.18 0.21 0.17 0.21 0.27 0.14 0.20 0.53 0.60 0.47 0.27 0.52 H26 0.13 0.18 0.24 0.18 0.15 0.31 0.31 0.31 0.21 0.22 0.21 0.21 0.35 0.18 0.26 0.41 0.57 0.48 0.28 0.48 H27 0.10 0.18 0.24 0.15 0.18 0.24 0.28 0.31 0.28 0.22 0.27 0.28 0.31 0.24 0.33 0.37 0.42 0.39 0.35 0.53 H28 0.13 0.12 0.24 0.18 0.15 0.31 0.24 0.24 0.21 0.18 0.21 0.21 0.24 0.21 0.26 0.41 0.52 0.44 0.31 0.48 H29 0.07 0.24 0.33 0.15 0.15 0.37 0.27 0.24 0.21 0.15 0.20 0.21 0.21 0.20 0.29 0.32 0.45 0.42 0.34 0.47 H30 0.07 0.18 0.30 0.15 0.18 0.33 0.27 0.24 0.21 0.15 0.20 0.24 0.18 0.20 0.26 0.32 0.45 0.52 0.31 0.47 H31 0.07 0.18 0.24 0.15 0.13 0.24 0.18 0.21 0.21 0.15 0.21 0.28 0.21 0.21 0.26 0.26 0.27 0.35 0.28 0.59 H32 0.09 0.23 0.23 0.18 0.21 0.32 0.30 0.30 0.23 0.18 0.23 0.26 0.23 0.20 0.32 0.39 0.44 0.45 0.30 0.41 H33 0.15 0.18 0.30 0.21 0.24 0.30 0.24 0.18 0.24 0.18 0.26 0.27 0.21 0.23 0.32 0.29 0.37 0.38 0.24 0.31 H34 0.15 0.15 0.21 0.29 0.32 0.27 0.21 0.21 0.28 0.22 0.27 0.31 0.24 0.27 0.33 0.37 0.38 0.48 0.31 0.39 H35 0.12 0.15 0.17 0.24 0.31 0.17 0.21 0.24 0.31 0.21 0.30 0.31 0.21 0.23 0.29 0.36 0.37 0.47 0.34 0.42 H36 0.18 0.17 0.26 0.31 0.38 0.20 0.17 0.17 0.26 0.18 0.32 0.26 0.20 0.20 0.25 0.35 0.36 0.41 0.26 0.33 H37 0.25 0.18 0.24 0.32 0.32 0.18 0.12 0.12 0.28 0.22 0.34 0.21 0.24 0.27 0.37 0.23 0.27 0.31 0.28 0.31 H38 0.24 0.18 0.26 0.31 0.35 0.17 0.18 0.18 0.24 0.24 0.33 0.31 0.24 0.23 0.29 0.20 0.26 0.34 0.24 0.31 H39 0.26 0.16 0.18 0.30 0.23 0.07 0.07 0.05 0.19 0.23 0.25 0.19 0.10 0.18 0.15 0.02 0.05 0.05 0.13 0.05 H40 0.26 0.16 0.18 0.34 0.23 0.07 0.07 0.05 0.22 0.23 0.25 0.22 0.10 0.22 0.18 0.02 0.05 0.05 0.16 0.05 50 Bảng 3.5. Hệ số tƣơng đồng di truyền giữa 40 giống lúa nghiên cứu (tiếp) H21 H22 H23 H24 H25 H26 H27 H28 H29 H30 H31 H32 H33 H34 H35 H36 H37 H38 H39 H40 H21 1.00 H22 0.59 1.00 H23 0.21 0.15 1.00 H24 0.36 0.25 0.53 1.00 H25 0.47 0.47 0.20 0.31 1.00 H26 0.39 0.64 0.18 0.32 0.52 1.00 H27 0.39 0.53 0.24 0.36 0.47 0.77 1.00 H28 0.53 0.64 0.21 0.36 0.62 0.64 0.48 1.00 H29 0.38 0.52 0.23 0.39 0.45 0.57 0.47 0.62 1.00 H30 0.31 0.42 0.20 0.35 0.45 0.47 0.38 0.52 0.85 1.00 H31 0.31 0.39 0.21 0.32 0.38 0.44 0.53 0.35 0.57 0.57 1.00 H32 0.37 0.55 0.20 0.34 0.40 0.71 0.60 0.50 0.69 0.63 0.55 1.00 H33 0.34 0.38 0.20 0.31 0.33 0.57 0.47 0.47 0.60 0.60 0.42 0.69 1.00 H34 0.39 0.53 0.24 0.36 0.34 0.44 0.39 0.44 0.47 0.52 0.35 0.55 0.47 1.00 H35 0.38 0.42 0.23 0.44 0.33 0.47 0.47 0.38 0.37 0.45 0.42 0.53 0.45 0.68 1.00 H36 0.37 0.37 0.23 0.38 0.32 0.45 0.37 0.41 0.40 0.48 0.33 0.52 0.58 0.66 0.75 1.00 H37 0.39 0.35 0.27 0.32 0.21 0.39 0.39 0.35 0.38 0.34 0.31 0.41 0.57 0.48 0.52 0.60 1.00 H38 0.38 0.34 0.20 0.35 0.20 0.38 0.38 0.31 0.33 0.30 0.34 0.40 0.45 0.47 0.50 0.53 0.68 1.00 H39 0.13 0.07 0.18 0.19 0.07 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.12 0.18 0.10 0.10 0.12 0.13 0.15 1.00 H40 0.13 0.07 0.18 0.16 0.07 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.12 0.18 0.10 0.07 0.12 0.13 0.15 0.91 1.00 Ở mức độ tương đồng di truyền khoảng 26%, 40 giống lúa được phân thành 4 nhóm cách biệt di truyền: * Nhóm I gồm 3 giống lúa: Nếp bồ hóng Hải Dương (H1), Nàng quớt biển (H39) và Nàng quớt vàng (H40). Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong nhóm dao động trong khoảng 0,26 (giống Nếp bồ hóng Hải Dương - H1 và Nàng quớt biển - H39); (giống Nếp bồ hóng Hải Dương - H1 và Nàng quớt vàng - H40) đến 0,91 (giữa giống Nàng quớt biển - H39 và Nàng quớt vàng - H40). * Nhóm II gồm 11 giống được chia thành 2 phân nhóm: - Phân nhóm 2.1 gồm 2 giống: Lúa mộ trắng (H4) và Khẩu mèo (H5) có hệ số tương đồng di truyền với nhau là 0,42. - Phân nhóm 2.2 gồm 9 giống được chia thành 2 phân nhóm phụ: + Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 6 giống: Ble lenh xi (H9), Chiêm đỏ (H14), Lúa muối (H15), Lúa can đỏ (H11), Nếp mậm (H12) và Ble’ la (H10) có hệ số tương 51 đồng di truyền dao động từ 0,42 (giữa giống Ble’ la - H10 và Lúa muối - H15) đến 0,74 (giữa giống Ble lenh xi - H9 và Chiêm đỏ - H14). + Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 3 giống: IR64 (H19), Blech cấu (H23) và Khẩu lẩy khao (H24). Phân nhóm phụ này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,53 (giữa giống Blech cấu - H23và Khẩu lẩy khao - H24) đến 0,62 (giữa giống IR64 - H19 và Blech cấu - H23) * Nhóm III gồm 6 giống: Lia tón (H2), Khẩu nuột cung (H3), B'le tolo (H6), Ble blu (H7), Ble la tong (H8) và Kháu căm pị (H13). Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong nhóm dao động trong khoảng 0,28 (giữa giống Lia tón - H2 và Khẩu căm pị -H13) đến 0,64 (giữa giống Ble blu - H7 và Ble la tong - H8). * Nhóm IV gồm 20 giống được chia thành 3 phân nhóm + Phân nhóm 4.1 gồm 8 giống Ba chơ K'tê (H16), Khẩu kẻn (H17), Chăm soóng (H25), Lọ cang (H28), Tan ngần (H18), Ble mạ mùa (H20), Khẩu bò khá (H22) và Mồng lu (H21) có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,37 (giữa giống Ba chơ K'tê - H16 và Mồng lu - H21) đến 0,70 (giữa giống Ble mạ mùa - H20 và Khẩu bò khá - H22). + Phân nhóm 4.2 gồm 7 giống: Nếp cái cạn (H26), Hang ngụa (H27), Khẩu mà giàng (H29), Khẩu nón (H30), Blào sinh sái (H32), Blào đóng (H33) và Khẩu hin (H31). Phân nhóm này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,38 (giữa giống Hang ngụa - H27 và Khẩu nón - H30) đến 0,85 (giữa giống Khẩu mà giàng - H29 và Khẩu nón - H30). + Phân nhóm 4.3 gồm 5 giống Blào cô ném (H34), Khẩu cụ (H35), Chạo lựu (H36), Khẩu sán (H37) và Khẩu đó đón (H38). Phân nhóm này có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,47 (giữa giống Blào cô ném - H34 và Khẩu đó đón - H38) đến 0,75 (giữa giống Khẩu cụ - H35 và Chạo lựu - H36). Những kết quả phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa thông qua khoảng cách di truyền và sơ đồ hình cây phân nhóm di truyền đã cho thấy sự đa dạng khá lớn về mặt di truyền giữa 40 giống lúa địa phương nghiên cứu. Kết hợp kết quả phân nhóm di truyền bằng ch thị phân tử SSR với những thông tin về khả năng chịu hạn của các giống lúa cũng như nguồn gốc của các giống lúa, chúng tôi đã chọn 8 giống lúa đại diện cho các nhóm di truyền đồng thời có kiểu hình chịu 52 hạn tốt và có nguồn gốc khác nhau (Phụ lục 1). Những giống này sẽ là nguồn vật liệu cho nghiên cứu tiếp theo về tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen cây lúa địa phương Việt Nam. 3.4. Kết quả xác định các allele hiếm, allele đặc trƣng nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu 3.4.1. Kết quả xác định các allele hiếm, nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu Thông thường, allele hiếm (rare allele) được định nghĩa dựa trên tần số xuất hiện của chúng. Kimura (1993) đã định nghĩa allele hiếm (allele duy nhất) là allele có tần số xuất hiện nhỏ hơn q với những giá trị nhỏ xác định của q (như q = 0,01). Đối với số lượng mẫu lên đến 100 thì một allele sẽ được xem là hiếm nếu nó xuất hiện không quá hai lần và số lần xuất hiện của một allele hiếm sẽ là không quá 200 lần khi lượng mẫu đạt tới 10.000 [31]. Còn theo Zahida và cộng sự (2009), alelle hiếm là allele xuất hiện với tần số ≤ 0,05 trong tổng số mẫu nghiên cứu [58]. Kết quả thu được từ bộ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu đã thu được tổng số 82 loại allele, trong đó xuất hiện 2 allele hiếm (allele ch xuất hiện ở duy nhất ở một mẫu giống có tần số <0,05) (bảng 3.1). 2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467 với giống Nếp bồ hóng Hải Dương (H1) và cặp mồi RM5811 với giống Ba chơ K'tê (H16). Như vậy, t lệ allele hiếm xuất hiện là 2/82 (2,4%); t lệ allele hiếm trên mỗi locus trung bình là 2/23 (8,7%). 3.4.1.1. Kết quả nhận dạng giống Nếp bồ hóng Hải Dương Hình 3.12. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3467 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) 53 Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3467 (hình 3.12) cho thấy: xuất hiện 5 loại allele khác nhau với kích thước trong khoảng 95bp - 180bp. Trong đó, xuất hiện 1 allele duy nhất ở giống Nếp bồ hóng Hải Dương (H1) có kích thước khoảng 95bp. Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM3467 có thể nhận dạng được chính xác giống Nếp bồ hóng Hải Dương (H1) trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu. 3.4.1.2. Kết quả nhận dạng giống Ba chơ K'tê Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM5811 (M: 100bp DNA Ladder) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi RM5811 (hình 3.13) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau với kích thước trong khoảng 90bp - 130bp. Trong đó, xuất hiện 1 allele duy nhất ở giống Ba chơ K'tê (H16) có kích thước khoảng 130bp. Đây là giống duy nhất có kiểu gen dị hợp tử ở locus RM5811. Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM5811có thể nhận dạng được chính xác giống Ba chơ K'tê (H16) trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu. 3.4.2. Kết quả xác định các allele đặc trưng nhận dạng các giống lúa trong tập đoàn nghiên cứu Kết quả thu được từ bộ tiêu bản điện di sản phẩm PCR của 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu đã thu được tổng số 82 loại allele, trong đó xuất hiện 4 giống có kiểu gen dị hợp tử duy nhất (giống Lúa muối - H15 ở cặp mồi RM1155; giống Blech cấu - H23 ở cặp mồi RM3476; giống Chạo lựu - H36 ở cặp mồi RM3468 và giống Blào sinh sái - H32 ở cặp mồi RM6051). 54 3.4.2.1. Kết quả nhận dạng giống Lúa muối Hình 3.14. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1155 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi RM1155 (hình 3.14) cho thấy: xuất hiện 5 loại allele khác nhau với kích thước trong khoảng 120bp - 190bp. Trong đó, duy nhất mẫu số 15 (giống Lúa muối - H15) xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM1155 có thể nhận dạng được chính xác giống Lúa muối trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu. 3.4.2.2. Kết quả nhận dạng giống Blech cấu Hình 3.15. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3476 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3476 (hình 3.15) cho thấy: xuất hiện 4 loại allele khác nhau với kích thước trong khoảng 118bp - 190bp. Trong đó, duy nhất mẫu số 23 (giống Blech cấu - H23) xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM3476 có thể nhận dạng được chính xác giống Blech cấu trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu. 55 3.4.2.3. Kết quả nhận dạng giống Chạo lựu Hình 3.16. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3468 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3468 (hình 3.16) cho thấy: xuất hiện 5 loại allele khác nhau với kích thước trong khoảng 180bp - 234bp. Trong đó, duy nhất mẫu số 36 (giống Chạo lựu - H36) xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM3468 có thể nhận dạng được chính xác giống Chạo lựu trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu. 3.4.2.4. Kết quả nhận dạng giống Blào sinh sái Hình 3.17. Ảnh điện di sản phẩm PCR của các giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM6051 (M: øX17 - Hea III digest DNA Ladder) Kết quả điện di sản phẩm PCR của 40 mẫu lúa chịu hạn với cặp mồi RM6501 (hình 3.17) cho thấy: xuất hiện 3 loại allele khác nhau có kích thước các allele trong khoảng 118bp - 156bp. Trong đó, duy nhất giống Blào sinh sái (H32) xuất hiện 2 allele (ở trạng thái dị hợp). Các giống còn lại ch xuất hiện 1 allele duy nhất (ở trạng thái đồng hợp). Như vậy, khi sử dụng cặp mồi RM6051 có thể nhận dạng được chính xác giống Blào sinh sái trong tập đoàn 40 giống lúa nghiên cứu. 56 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. Kết luận 1. Tập đoàn giống lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam khá đa dạng về các thành phần allele. Kết quả phân tích 23 ch thị phân tử SSR với 39 giống lúa chịu hạn và giống IR64 thu được tổng số 82 loại allele trung bình 3,57 allele/locus. Hệ số PIC dao động từ 0,22 đến 0,77 (trung bình 0,56). 2. Các giống chịu hạn có độ thuần di truyền khác nhau, tỷ lệ dị hợp của các giống lúa nghiên cứu dao động từ 0 đến 14,29% (trung bình là 3,45%). Mức độ đa dạng di truyền giữa các giống lúa chịu hạn rất cao. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa dao động từ 0,02 đến 0,91. Dựa vào khoảng cách di truyền, 40 giống nghiên cứu được phân thành 4 nhóm cách biệt di truyền. 3. Trong số 23 cặp mồi SSR nghiên cứu có 2 cặp mồi xác định được 2 allele hiếm (trung bình 0,087). Cặp mồi RM3467 xác định được 1 allele hiếm nhận dạng được giống Nếp bồ hóng Hải Dương (H1). Cặp mồi RM5811 xác định được 1 allele hiếm nhận dạng được giống Ba chơ K'tê (H16). Dựa vào các allele đặc trưng có thể nhận dạng chính xác một số giống trong tập đoàn: cặp mồi RM1155 nhận dạng được giống giống Lúa muối (H15); cặp mồi RM3476 nhận dạng được giống giống Blech cấu (H23); cặp mồi RM3468 nhận dạng được giống giống Chạo lựu (H23) và cặp mồi RM6501 nhận dạng được giống Blào sinh sái (H32). Các kết quả thu được rất hữu ích trong việc nhận dạng chính xác các nguồn gen phục vụ cho công tác bảo tồn, khai thác và sử dụng có hiệu quả trong các chương trình chọn tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam. 2. Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu và đánh giá đa dạng di truyền của tập đoàn lúa chịu hạn ở mức hình thái nông sinh học kết hợp với đánh giá bằng ch thị SSR nhằm xác định các marker liên kết với tính trạng chống chịu khô hạn để phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa chịu hạn. Tiếp tục nghiên xác định các allele đặc trưng, allele hiếm để nhận dạng chính xác các nguồn gen ưu tú phục vụ nghiên cứu lai tạo giống và định hướng cho công tác thu thập bảo tồn đa dạng nguồn gen lúa chịu hạn ở mức phân tử. 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Trần Bình, Lê Thị Muội, (1998), Phân lập gen và chọn dòng chống chịu ngoại cảnh bất lợi ở lúa, NXB Đại học quốc gia HN. 2. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2003), Cơ sở di truyền tính chống chịu đối với thiệt hại do môi trường của cây lúa, Nxb Nông Nghiệp TP Hồ chí Minh, tr. 65- 223. 3. Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình (2003), Mối tương quan giữa làm lượng proline và tính chống chịu hạn ở cây lúa, Tạp chí Công nghệ sinh học 1(1), tr. 85-95. 4. Phạm Văn Cường (2009), Các đặc tính quang hợp và rễ liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây lúa, Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 5. Nguyễn Ngọc Đệ (2008), Giáo trình cây lúa, Trường Đại học Cần Thơ. 6. Vũ Tuyên Hoàng, Nguyễn Ngọc Ngân (1992), "Một số kết quả nghiên cứu lúa chịu hạn", Kết quả nghiên cứu cây lương thực, thực phẩm (86-90), Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 47-57. 7. Nguyễn Thị Thu Hoài (2005), “Nghiên cứu khả năng chịu hạn và mối quan hệ di truyền của một số giống lúa cạn địa phương”, Luận văn Thạc sỹ sinh học, trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên. 8. Nguyễn Thế Hùng (2007), Bài giảng dành cho học viên cao học chuyên đề cây ngô, Đại học Nông nghiệp Hà Nội 9. Trần Thị Phương Liên, (1999), “Nghiên cứu đặc tính hóa sinh và sinh học phân tử của một số giống đậu tương có khả năng chịu nóng, chịu hạn ở Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Hà Nội, tr. 18-36. 10. Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Nguyễn Thị Vân Anh (2007), “Sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình chịu hạn của một số giống lúa cạn địa phương miền núi”, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, tr. 759-762. 11. Nguyễn Hoàng Nghĩa (1999), Bảo tồn đa dạng sinh học, Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội. 12. Đinh Thị Phòng (2001), Nghiên cứu khả năng chịu hạn và chọn dòng chịu hạn ở lúa bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học. 58 13. Trần Danh Sửu, Lưu Ngọc Trình, Bùi Bá Bổng (2006), “Nghiên cứu đa dạng di truyền lúa Tám bằng ch thị microsatellite”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (12), tr. 15-18. 14. Phạm Anh Tuấn, Nguyễn Lan Hoa, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Nguyễn Bá Ngọc, Nguyễn Thị Kim Dung, Nguyễn Thị Thanh Thuỷ (2008), Đánh giá đặc tính chịu hạn của một số giống lúa địa phương Việt Nam thông qua phương pháp kiểu hình và ứng dụng ch thị phân tử, Tạp chí Nông nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, tr. 28-35. 15. Phạm Thị Bé Tư, Bùi Thị Dương Khuyều, Nguyễn Thị Lang, Celsa Quinio, Bùi Chí Bửu (2008), “Phân tích đa dạng di truyền của 90 giống lúa mùa địa phương lưu trữ trong ngân hàng gen Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn (4), tr. 12-18. 16. Vũ Văn Vụ (1996), Sinh lý học thực vật, Nxb Giáo Dục, 120 trang. Tài liệu tiếng Anh 17. Adkind S. W., Kunanuvatchaidach R., Godwin I. D., (1995), “Somacional variation in rice% drought tolerant and other agronomic chacracters”, Australian journal of Botany 4 (2), pp. 201-209. 18. Alvarez A., Fuentes J. L., Puldón V., Gómez P. J., Mora L., Duque M. C., Gallego G. and Tohme J. M. (2007), Genetic diversity analysis of Cuban traditional rice (Oryza sativa L.) varieties based on microsatellite markers. Genetics and Molecular Biology, 30 (4), pp. 1109-1117. 19. Bake J., C. Steele, Dure L. I. (1988), Sequence and characterization of 6 LEA proteins and their genes from cotton, Plant Mol Biol 11, pp. 277-291. 20. Bohnert H. L., Jesen R. G. (1996), “Strategies of engineering water stress tolerance in plants”, Tibtech, 14, pp. 89-97. 21. Chakravarthi B. K., and Naravaneni R. (2006), SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa. L), African Journal of Biotechnology, 5 (9), pp. 684-688. 22. Chang T. T. (1985), "Crop history and genetic conservation. Rice, A case study. In: Iwova state", Journal of research vol. 59, pp. 4. 59 23. Cheng C. Y., Motohashi R., Tsuchimoto S., Fukuta Y., Ohtsubo H. (2003), "Polyphyletic origin of cultivated rice: based on the interspersion pattern of SINEs", Mol. Biol. Evol. 20, pp. 67-75. 24. Chen T. H., Muranta N. (2002), “Ehancement of tolerance of a family of plant dehydrin protein”, Physiol plant, pp. 795-803. 25. F.A.O., AGL (2000), Extent and causes of salt-affected soils in participating countries. Global network on intergrated soil management for sustainable use of salt-affected soils, Land and plant nutrition management service. 26. Giarrocco L.E., Marassi M. A. and Salerno G. L. (2007), Assessment of the genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR Markers, Crop Science, 47 (2), pp. 853-860. 27. Goyal K., Walton L. J., Tunnacliffe A. 9 (2005), LEA proteins prevent protein aggrevation due to water stress, Biochem J. 388, pp.151-157. 28. Hoisington D., Jiang C., Khairallah M., Ribault J. M., Bohn M., Melchinger A., Willcox M., Gonzalez-de-Leon D. (1996), QTL for insect resistance and drought tolerance in tropical maize: prospects for markerassisted selection, Sym Soc Exp Biol 50, pp. 39-44. 29. Ingram J., Bartels D. (1996), The molecular basis of dehydration tolerance in plants, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 47, pp. 377-403. 30. Jayamani P., Negraxo S., Martins M., Maçãs B. and Oliveira M. M. (2007), "Genetic Relatedness of Portuguese Rice Accessions from Diverse Origins as Assessed by Microsatellite Markers", Crop Sci 47, pp. 879-884 31. Kimura M. (1983), Rare variant alleles in the light of the neutral theory, Mol. Biol. Evol., 1, pp. 84-93. 32. Lilley J. M., Ludlow M. M., McCouch S. R., O’Toole J. C. (1996), Locating QTL for osmotic adjustment and dehydration tolerance in rice, J. Exp Bot 47, pp. 1427-1436. 33. Mahmoud M. S., Sawsan S. Y., Naglaa A. A., Hany S. A. and Ahmed M. E. S. (2005), "Genetic analysis of some Egyptian rice genotypes using RAPD, SSR and AFLP", African Journal of Biotechnology Vol. 4 (9), pp. 882-890. 60 34. McCouch S. R., Sunita J., Jain R. K (2005), "Genetic analysis of Indian aromatic and quality rice (Oryza sativa L.) germplasm using panels of fluorescently-labeled microsatellite markers", Theoretical and Applied Genetics, (Vol. 109) (No. 5), pp. 965-977. 35. McCouch S. R. et al. (2002), “Development and mapping of 2240 new SSR markers for rice (Oryza sativa L.)”, DNA Res. 9, pp. 199 - 207. 36. Nagaraju J., Kathirvel M., Ramesh Kumar R., Siddiq E. A., and Hasnain S. E., (2002), Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers, PNAS, 99 (9), pp. 5836-5841. 37. Nguyen Thi Lang and Bui Chi Buu, (2008), Fine mapping for drought tolerance in Rice (Oryza sativa L.), Omonrice 16, pp. 9-15. 38. Obara-Okeyo P. and Kako S., (1998), Genetic diversity and identifi cation of Cymbidium cultivars as measured by random amplifi ed polymorphic DNA (RAPD) markers, Euphytica, 99, pp. 95-101. 39. Oka H. I. (1988), "Origin of cultivated rice", J. Sci. Societies press, Tokyo, pp. 129. 40. Olufowote J. O., Xu Y., Chen X., Park W. D., Beachell H. M., Dilday R. H., Goto M., and McCouch S. R. (1997), "Comparative evaluation of within- cultivar variation of rice (Oryza sativa L.) using microsatellite and RFLP markers", Genome 38, pp. 1170-1176. 41. Quarries S., V. Lazic -J., Ivanovic M., Pekic C., Heyl A., Landi P., Lebreton C., Steed A. (1997), “Molecular marker methods to dissect drought tolerance in maize”, In: Tsaftaris A, editor. Genetics, biotechnology and breeding of maize and sorghum, Cambridge (UK): The Royal Society of Chemistry, pp. 52-58. 42. Sakuma Y., Maruyama K., Qin F., Osakabe Y., Shinozaki K., and Yamaguchi S., K. (2006), “Dual function of an Arabidopsis transcription factor DREB2A in water-stress-responsive and heat-stress-responsive gene expression”, Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 103, pp. 18822-18827. 61 43. Shen L., Courtois B., McNally K., McCouch S. R., Li Z. (1999), “Developing nera-isogenic lines of IR64 introgressed with QTLs for deeper and thicker roots through marker-aided selection”, In: Genetic Improvement of Rice for Water- Limited Environments. (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy, IRRI, Philippines, pp. 275-289. 44. Smith J. S. C., Chin C. L., Shu H., Smith O. S., Wall S. J., Senior M. L., Michell S. C., Kresovick S., Ziegle J. (1997), "An evaluation of the utility of SSR loci as Molecular markers in maize (Zea Mays L.): Comparison with data from RFLP and pedigrees", Theor Appl Genet 100, pp. 697-712. 45. Soltis D. E., Soltis P. S. (2003), “The role of phylogenetics in comparative genomics”, Plant Physiol 132, pp. 1790-1800. 46. Sujatha K., Upadhyay R., Kaladhar K., Rani N. S. and Sarla N. (2004), "Genetic relationship among aromatic short grain and Basmati rice based on ISSR and SSR markers", Rice Genetic Newsletter, vol. 21. 47. Tateoka T. (1963), “Taxononic Studies of Oryza III. Key to the species and their enumeration”, Bot. Mag. Tokyo 76, pp. 165-173. 48. Thomashow M. F. (1999), “Plant Cold Acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms”, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50, pp. 571-599. 49. Victoria C. L., Darshan S. B., Toshinori A., Edilberto D. R. (2007), “Assessment of Genetic Diversity of Philippine Rice Cultivars Carring Good Quality trait using SSR marker”, Breeding Science (57), pp. 263-270. 50. Virk P. S., Fork B. V, Jakson M. T., New B. H. J. (1995), “Use of RADP for the study of diversity within plant Germplasm collection”, Heridity (74), pp. 170-179. 51. Wang H., Zhang H., Gao F., Li J., Li Z. (2007), “Comparision of gene expression between upland rice cultivars under water stress using cDNA microarray”, TAG 115, pp.1109-1126. 52. Wong S. C., Yiu P. H., Bong S. T. W., Lee H. H., Neoh P. N. P. and Rajan A., (2009), Analysis of Sarawak Bario Rice Diversity Using Microsatellite Markers, American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 4 (4), pp. 298-304. 62 53. Xiao B., Huang Y., Tang N., Xiong L. (2007), Over-expression of a LEA gene in rice improves drought resistance under the field conditions”, TAG 115, pp. 35-46. 54. Xiong L., Schumaker K. S., Zhu J. K. (2002), Cell signaling during cold, drought, and salt stress”, Plant Cell 14 (Suppl), pp. 165-183. 55. Xu Y., Henry B., Mc Couch S. R. (2004), “A marker approach to broading the genetic base of rice in the USA”, Crop Sci (44), pp. 1847-1959. 56. Xu D., Duan X., Wang B., Hong B., Ho T., Wu R. (1996), Expression of a late embyogenesis abundant protein gene, HVA1, from barley confers tolerance to water deficit and salt stress in transgenic rice”, Plant Physiol 110, pp. 249-257. 57. Yu S. B., Xu W. J., Vijayakumar C. H., Ali J., Fu B. Y., Xu J. L., Jiang Y. Z., Marghirang R., Domingo J., Aquino C., Virmani S.S., and Li Z. K., (2003), Molecular diversity and multilocus organization of the parental lines used in the International Rice Molecular Breeding Program, Theor. Appl. Genet, 108, pp. 131-140. 58. Zahida H. P., Malik A. R., Stephen R. P. and Salman A. M. (2009), “Determination of genetic variability of Asian rice (Oryza sativa L.) varieties using microsatellite markers”, African Journal of Biotechnology Vol. 8 (21), pp. 5641-5651. 59. Zhang J., Zheng H. G., Ali M. L., Triparthu J. N., Aarti A., Pathan M. S., Sarial A. K., Robin S., Thuy T. N., Babu R. C., Bay D. N., Sarkarung S., Blum A., Henry T. N. (1999), “Progress on the molecular mapping of osmotic adjustment and root traits in rice”, In: Genetic Improvement of Rice for Water- Limited Environments, (Eds.) O Ito, JC O’Toole, and B Hardy, IRRI, Philippines, pp. 307- 317. 60. Zhang X., Zhou S, Fu Y., Su Z., Wang X., Sun C. (2006), “Identification of a drought tolerant introgression line derived from Dongxiang common wild rice (O. rufipogon Griff.)”, Plant Mol Biol 62: pp. 247-259. 61. Zhao S. H., Wang F. Z., Lu L., Zhang H. Y., Zhang X.Y. (2000), “Breeding and selection of drought resistant and salt tolerant wheat variety Cang 6001”, Acta Agric Boreall Sin 15, pp. 113-117. 63 Tài liệu Internet 62. www.knowledgebank.irri.org 63. www.nea.gov.vn/html/DDSH/dulieu1/khainiem/ 64 PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1. Danh sách giống lúa sử dụng để giải trình tự ADN Danh sách những giống lúa sử dụng để giải trình tự ADN TT SĐK Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc TGST Năng suất Ph m chất Kháng rầy Bạc lá Đạo ôn Chịu hạn Chịu mặn Chịu rét Chịu ngập Đặc điểm chính 1 412 Nếp bồ hóng Hải Dương H1 Hải Dương 145 39,47 Kthơm NC Ktb K Tốt - Cứng cây yếu, đẻ nhánh mạnh 2 930 Lia tón H2 - 123 47,04 Kthơm NC N NC Tốt - Cây trung bình, đẻ nhánh mạnh 3 3429 Chiêm đỏ H14 Quảng Trị x x x 4 3525 Ba chơ K'tê H16 Bình Định x 5 3588 Tan ngần H18 Yên Bái ngon x 6 4806 Blào sinh sái H32 7 5018 Khẩu sán H37 8 Nàng quớt biển H39 65 2. Phụ lục 2: Bài báo: “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR” đã đƣợc gửi đăng trên Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn ĐÁNH GIÁ ĐA D NG DI TRU ỀN TẬP ĐOÀN L A CHỊU H N CỦA VIỆT NAM B NG CHỈ THỊ PH N T SSR Nguyễn Thị Minh Nguyệt1, Nguyễn Thị Nhài1, Nguyễn Thị Thanh Thủy2, Nguyễn Thúy Điệp1, Kiều Thị Dung1, Nguyễn Thị Thảo3, Khuất Hữu Trung1 TÓM TẮT Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam (bao gồm 39 giống lúa địa phương có khả năng chịu hạn tốt và giống lúa tham khảo - IR64 mẫn cảm với khô hạn) bằng ch thị SSR cho thấy: các giống lúa nghiên cứu rất đa dạng về các thành phần allele. Kết quả phân tích 23 locus SSR thu được tổng số 82 loại allele, trung bình 3,57 allele/locus. T lệ allele hiếm xuất hiện là 8,7% (2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467 và RM5811). Hệ số PIC dao động từ 0,22 - 0,77 (trung bình là 0,56). T lệ dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác nhau dao động từ 0 đến 14,29% (trung bình là 3,45%). Tập đoàn giống lúa nghiên cứu có mức độ đa dạng di truyền rất cao, hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa dao động từ 0,02 đến 0,91. Dựa vào khoảng cách di truyền, 40 giống lúa nghiên cứu được chia thành 4 nhóm lớn. Kết hợp kết quả phân nhóm cách biệt di truyền và những thông tin về kiểu hình chịu hạn, 8 giống lúa điển hình có nguồn gốc khác 1 Viện Di truyền Nông nghiệp Địa ch liên hệ: Tel: 84-4- 37540764; Fax: 84-4-37543196; Email: [email protected] 2 Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn 3 . Đại học Sư phạm Hà Nội 66 nhau đã được chọn để giải trình tự, tạo lập cơ sở dữ liệu nguồn gen phục vụ công tác chọn, tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam. Từ khóa: Chỉ thị SSR, chịu hạn, đa dạng di truyền, lúa địa phương. I. ĐẶT VẤN ĐỀ Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực có khả năng chịu hạn kém và khá nhạy cảm với môi trường bên ngoài. Tính chịu hạn của lúa phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau: khả năng đâm xuyên của rễ, khả năng điều ch nh áp suất thẩm thấu của tế bào lá, cơ chế điều khiển thoát hơi nước ở khí khổng. Những nghiên cứu về sinh lý và di truyền học đã ch ra rằng: có khoảng 200 gen tham gia vào cơ chế kháng hạn ở cây trồng, nhưng các gen này không quy tụ vào một giống cố định. Vì vậy, khả năng và mức độ kháng hạn rất khác nhau phụ thuộc vào sự có mặt và biểu hiện của các gen khác nhau. Hiện nay, hạn hán là nguyên nhân cản trở rất lớn cho việc phát triển bền vững nền nông nghiệp của nước ta, vì vậy việc nghiên cứu, đánh giá các nguồn gen liên quan đến tính chịu hạn ở cây lúa để nâng cao khả năng chịu hạn, ổn định năng suất trở thành vấn đề thời sự mang tính cấp bách và cần thiết. Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lúa chịu hạn của Việt Nam bằng chỉ thị SSR” nhằm tạo lập cơ sở dữ liệu cho nguồn gen lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu hạn. II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu nghiên cứu Vật liệu nghiên cứu là tập đoàn bao gồm 39 giống lúa có đặc tính chịu hạn được thu thập ở nhiều địa phương khác nhau, các giống này đang được lưu giữ và bảo tồn tại ngân hàng gen Cây trồng Quốc gia (Trung tâm Tài nguyên Thực vật) và ngân hàng gen của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long và giống lúa tham khảo - IR64 mẫn cảm với khô hạn (bảng 1). 23 cặp mồi 67 SSR được sử dụng để phân tích thuộc các locus RM được chọn lọc từ 2240 cặp mồi, do hãng IDT (Mỹ) cung cấp dựa vào các thông tin về trình tự, kích thước, số allele chuẩn trên mỗi locus, vị trí phân bố của các locus ở trên 12 nhiễm sắc thể khác nhau đã được công bố (bảng 2) (McCouch et all., 2002). 2. Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết ADN tổng số: mẫu lá của từng mẫu giống được thu thập riêng rẽ và tách chiết ADN tổng số theo phương pháp CTAB của Obara và Kako có cải tiến (Obara và Kako, 1998). Chạy PCR: các phản ứng PCR được thực hiện theo chu trình nhiệt: 94 0 C (5 phút), 35-37 chu kỳ [940C (40s); 55-600C (30s), 720C (30s - 1 phút)] và kết thúc ở 720C (5 phút). Phân tích và xử lý số liệu: kết quả được thống kê dựa vào sự xuất hiện hay không xuất hiện của các băng ADN (các allele). Số liệu được xử lý, phân tích bằng chương trình Exel version 5.0 và phần mềm NTSYSpc 2.1 (Rohlf, 1997). Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được tính theo công thức sau: PIC = 1 - Pi 2 (trong đó Pi là tần số xuất hiện của allele thứ i). Tỷ lệ dị hợp (H) của mỗi mẫu được tính theo công thức: YM X H  % ; trong đó: X là tổng số mồi có xuất hiện 2 allele/1 locus SSR; M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu; Y là tổng số mồi SSR không xuất hiện băng ADN. Tỷ lệ khuyết số liệu (M) được tính bằng công thức: M Z M % ; trong đó: Z là tổng số mồi không xuất hiện băng ADN; M là tổng số mồi sử dụng trong nghiên cứu. 68 Bảng 1. Danh sách, tên, kí hiệu và số đăng kí của các giống lúa nghiên cứu TT SĐK Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc TT SĐK Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc 1 412 Nếp bồ hóng Hải Dương H1 Hải Dương 21 3935 Mồng lu H21 - 2 930 Lia tón H2 - 22 3947 Khẩu bò khá H22 Lai Châu 3 1832 Khẩu nuột cung H3 - 23 3970 Blech cấu H23 - 4 1837 Lúa mộ trắng H4 - 24 4123 Khẩu lẩy khao H24 - 5 2021 Khẩu mèo H5 - 25 4723 Chăm soóng H25 - 6 2125 B'le tolo H6 - 26 4726 Nếp cái cạn H26 - 7 2127 Ble blu H7 - 27 4748 Hang ngụa H27 - 8 2131 Ble la tong H8 - 28 4762 Lọ cang H28 - 9 2135 Ble lenh xi H9 - 29 4792 Khẩu mà giàng H29 - 10 2642 Ble’ la H10 - 30 4793 Khẩu nón H30 - 11 3351 Lúa can đỏ H11 Quảng Nam 31 4794 Khẩu hin H31 - 12 3371 Nếp mậm H12 Quảng Nam 32 4806 Blào sinh sái H32 - 13 7099 Kháu căm pị H13 - 33 4840 Blào đóng H33 - 14 3429 Chiêm đỏ H14 Quảng Trị 34 4843 Blào cô ném H34 - 15 3483 Lúa muối H15 Quảng Ngãi 35 5057 Khẩu cụ H35 - 16 3525 Ba chơ K'tê H16 Bình Định 36 5015 Chạo lựu H36 - 17 6430 Khẩu kẻn H17 37 5018 Khẩu sán H37 - 18 3588 Tan ngần H18 Yên Bái 38 5020 Khẩu đó đón H38 - 19 4666 IR64 H19 IRRI 39 * Nàng quớt biển H39 - 20 3895 Ble mạ mùa H20 Sơn La 40 * Nàng quớt vàng H40 - Ghi chú: SĐK: số đăng kí ở ngân hàng gen;(-) chưa rõ nguồn gốc; (*): Giống lúa mùa địa phương miền Nam III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng các chỉ thị phân tử SSR Kết quả phân tích 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa nghiên 69 cứu thu được tổng số 82 loại allele khác nhau, số allele/locus dao động từ 2 - 5, trung bình 3,57 allele/locus. Cả 23 cặp mồi đều cho các locus đa hình, trong đó có 3 cặp mồi thu được 2 allele, 10 cặp mồi thu được 3 allele, 4 cặp mồi thu được 4 allele và 6 cặp mồi thu được 5 allele (bảng 2). 70 Bảng 2. Số allele thể hiện và hệ số PIC của 23 cặp mồi SSR STT Tên mồi Vị trí trên NST Kích thƣớc sản ph m PCR (bp) Số alen thể hiện Số allele hiếm PIC 1 RM145 2 194-281 5 0 0,61 2 RM152 8 151-175 3 0 0,51 3 RM267 5 150-180 3 0 0,59 4 RM566 9 234-290 4 0 0,72 5 RM1155 4 120-190 5 0 0,62 6 RM1364 7 120-194 4 0 0,63 7 RM1367 2 90-150 5 0 0,77 8 RM3288 4 130-190 3 0 0,50 9 RM3431 6 130-194 2 0 0,29 10 RM3467 3 95-180 5 1 0,70 11 RM3468 1 180-234 5 0 0,72 12 RM3476 5 118-190 4 0 0,70 13 RM3483 12 150-234 5 0 0,72 14 RM3515 2 110-156 3 0 0,66 15 RM3534 4 110-150 3 0 0,53 16 RM5599 11 120-156 3 0 0,53 17 RM5811 1 90-130 3 1 0,50 18 RM6051 9 118-156 3 0 0,46 19 RM7003 12 100-130 2 0 0,46 20 RM7372 9 100-140 3 0 0,46 21 RM7581 1 120-220 3 0 0,22 22 RM25271 10 156-210 2 0 0,38 23 RM25319 10 120-200 4 0 0,61 Tổng 82 2 12,89 Trung bình 3,57 0,087 0,56 Ghi chú: NST: nhiễm sắc thể; PIC: Polymorphic Information Content 71 Hệ số PIC (Polymorphic Information Content) được coi là thước đo tính đa hình của các allele ở từng locus SSR. Qua kết quả thu được ở bảng 2 cho thấy rằng, giá trị PIC của 23 marker thay đổi từ 0,22 (ở mồi xuất hiện 3 allen – RM7581) đến giá trị PIC cao nhất là 0,77 (ở mồi xuất hiện 5 allele- RM1367). Hệ số PIC trung bình của 23 cặp mồi nghiên cứu là 0,56. Có 2 allen hiếm xuất hiện (allele có tần số xuất hiện nhỏ hơn 5%) ở các cặp mồi RM145, RM3467 và RM5811 (chiếm t lệ 8,7%). Những kết quả thu được cũng tương đương với một số kết quả nghiên cứu trên thế giới (bảng 3). Bảng 3. Một số kết quả phân tích đa dạng di truyền sử d ng chỉ thị SSR trên cây lúa đ được công bố TT Tác giả Số giống Số chỉ thị Tổng số allele Trung bình Số allele thể hiện/locus PIC Số allele hiếm/locus 1 Nagaraju J., 2002 24 19 70 3,8 - - 2 Yu S. B., 2003 193 101 628 6,2 0,68 - 3 Chakravarthi B.K., 2006 15 30 462 - - - 4 Giarrocco L.E., 2007 69 26 219 8,4 0,69 1,7 5 Alvarez A., 2007 50 10 66 6,6 0,74 1,4 6 Herrera T.H., 2008 18 48 203 4,23 0,52 - 7 Wong S.C., 2009 8 12 31 2,6 0,52 - 8 Nghiên cứu này 40 23 82 3,57 0,56 0,087 Hình 1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của 40 giống lúa nghiên cứu với cặp mồi RM3468 (M: øX17- Hea III digest DNA ladder) 72 3.2. Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu Bảng 4.Tỷ lệ dị hợp (H%) và tỷ lệ khuyết số liệu (M%) của 40 giống lúa nghiên cứu TT Tên giống M% H% TT Tên giống M% H% 1 Nếp bồ hóng Hải Dương 4,35 0,00 21 Mồng lu 4,35 4,55 2 Lia tón 0,00 0,00 22 Khẩu bò khá 0,00 0,00 3 Khẩu nuột cung 0,00 4,35 23 Blech cấu 4,35 9,09 4 Lúa mộ trắng 4,35 0,00 24 Khẩu lẩy khao 8,70 4,76 5 Khẩu mèo 4,35 0,00 25 Chăm soóng 0,00 4,35 6 B'le tolo 0,00 4,35 26 Nếp cái cạn 0,00 4,35 7 Ble blu 0,00 0,00 27 Hang ngụa 0,00 0,00 8 Ble la tong 0,00 0,00 28 Lọ cang 4,35 4,55 9 Ble lenh xi 0,00 0,00 29 Khẩu mà giàng 0,00 4,35 10 Ble’ la 4,35 0,00 30 Khẩu nón 0,00 4,35 11 Lúa can đỏ 0,00 4,35 31 Khẩu hin 0,00 0,00 12 Nếp mậm 0,00 0,00 32 Blào sinh sái 0,00 8,70 13 Kháu căm pị 0,00 0,00 33 Blào đóng 8,70 14,29 14 Chiêm đỏ 0,00 4,35 34 Blào cô ném 0,00 0,00 15 Lúa muối 0,00 8,70 35 Khẩu cụ 0,00 4,35 16 Ba chơ K'tê 0,00 8,70 36 Chạo lựu 0,00 8,70 17 Khẩu kẻn 0,00 8,70 37 Khẩu sán 4,35 4,55 18 Tan ngần 0,00 4,35 38 Khẩu đó đón 0,00 4,35 19 IR64 0,00 0,00 39 Nàng quớt biển 13,04 5,00 20 Ble mạ mùa 0,00 0,00 40 Nàng quớt vàng 8,70 0,00 Trung bình 1,85 3,45 Qua kết quả thu được ở bảng 4 cho thấy, tỷ lệ dị hợp ở các giống lúa nghiên cứu rất khác nhau. Tỷ lệ dị hợp (H%) cao nhất ở giống lúa Blào đóng với tỷ lệ 14,29%, tiếp theo là giống lúa Blech cấu có tỷ lệ dị hợp 9,09%. Các 73 giống lúa Ba chơ K'tê, Lúa muối, Khẩu kẻn, Blào sinh sái và Chạo lựu đều có tỷ lệ dị hợp 8,70%. Giống lúa Nàng quớt biển có tỷ lệ dị hợp 5,00%. Giống lúa Khẩu lẩy khao có tỷ lệ dị hợp 4,76%. Ba giống lúa Mồng lu, Lọ cang và Khẩu sán có tỷ lệ dị hợp 4,55%. Các giống lúa Khẩu nuột cung, B'le tolo, Lúa can đỏ, Chiêm đỏ, Tan ngần, Chăm soóng, Nếp cái cạn, Khẩu mà giàng, Khẩu nón, Khẩu cụ và Khẩu đó đón đều có tỷ lệ dị hợp 4,35%. 17 giống còn lại có tỷ lệ dị hợp 0% có nghĩa là các dòng này đều đồng hợp ở cả 23 mồi nghiên cứu (ch có 1 allele duy nhất/locus). T lệ dị hợp trung bình của cả tập đoàn là 3,45%. Tỷ lệ số liệu khuyết (M%) cao nhất ở giống lúa Nàng quớt biển với t lệ 14,29% (khuyết số liệu ở 3 mồi). Các giống Khẩu lẩy khao, Blào đóng và Nàng quớt vàng có t lệ khuyết số liệu là 8,7% (khuyết số liệu ở 2 mồi). Các giống Nếp bồ hóng Hải Dương, Lúa mộ trắng, Khẩu mèo, Ble’ la, Mồng lu, Blech cấu. Lọ cang, Khẩu sán có t lệ khuyết số liệu là 4,35% (khuyết số liệu ở 1 mồi). Còn lại 28 giống không bị khuyết số liệu ở tất cả các mồi. Tỷ lệ khuyết số liệu trung bình của cả tập đoàn là 1,85%, không có giống nào có t lệ khuyết số liệu lớn hơn 15%. Như vậy, cả 40 giống nghiên cứu đều có ý nghĩa thống kê trong phân tích đa dạng di truyền. 3.3. Kết quả phân tích mối quan hệ di truyền của các giống lúa nghiên cứu Số liệu thu được từ kết quả điện di sản phẩm PCR của 23 cặp mồi SSR với tập đoàn 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu được thống kê và phân tích bằng phần mềm NTSYSpc 2.1, từ đó thiết lập được bảng hệ số tương đồng di truyền và sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền giữa các giống lúa chịu hạn (hình 2). 74 Coefficient 0.19 0.26 0.33 0.40 0.48 0.55 0.62 0.69 0.76 0.84 0.91 H10MW H1 H39 H40 H4 H5 H9 H14 H15 H11 H12 H10 H19 H23 H24 H2 H3 H6 H7 H8 H13 H16 H17 H25 H28 H18 H20 H22 H21 H26 H27 H29 H30 H32 H33 H31 H34 H35 H36 H37 H38 Hình 2. Sơ đồ hình cây về mối quan hệ di truyền gi a các giống lúa chịu hạn nghiên cứu Qua bảng hệ số tương đồng và sơ đồ về mối quan hệ di truyền giữa các giống nghiên cứu (hình 2) cho thấy: hệ số tương đồng di truyền của 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu dao động trong khoảng từ 0,02 đến 0,91. Ở mức tương đồng di truyền 26%, 40 giống lúa chịu hạn nghiên cứu được chia thành 4 nhóm cách biệt di truyền. * Nhóm I gồm 3 giống lúa: Nếp bồ hóng Hải Dương, Nàng quớt biển và Nàng quớt vàng. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong nhóm dao động trong khoảng 0,26 (giống Nếp bồ hóng Hải Dương và Nàng quớt biển; giống Nếp bồ hóng Hải Dương và Nàng quớt vàng) đến 0,91 (giữa giống Nàng quớt biển và Nàng quớt vàng). * Nhóm II gồm 11 giống được chia thành 2 phân nhóm: - Phân nhóm 2.1 gồm 2 giống: Lúa mộ trắng và Khẩu mèo có hệ số tương đồng di truyền là 0,42. - Phân nhóm 2.2 gồm 9 giống được chia thành 2 phân nhóm phụ + Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 6 giống: Ble lenh xi, Chiêm đỏ, Lúa muối, 75 Lúa can đỏ, Nếp mậm và Ble’ la, có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,42 (giữa giống Ble’ la và Lúa muối) đến 0,74 (giữa giống Ble lenh xi và Chiêm đỏ). + Phân nhóm phụ 2.2.1 gồm 3 giống: IR64, Blech cấu và Khẩu lẩy khao, có hệ số tương đồng di truyền dao động từ 0,53 (giữa giống Blech cấu và Khẩu lẩy khao) đến 0,62 (giữa giống IR64 và Blech cấu). * Nhóm III gồm 6 giống: Lia tón, Khẩu nuột cung, B'le tolo, Ble blu, Ble la tong và Kháu căm pị. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống trong nhóm dao động trong khoảng 0,28 (giữa giống Lia tón và Khẩu nuột cung) đến 0,64 (giữa giống Ble blu và Ble la tong). * Nhóm IV gồm 20 giống được chia thành 3 phân nhóm: + Phân nhóm 4.1 gồm 8 giống Ba chơ K'tê, Khẩu kẻn, Chăm soóng, Lọ cang, Tan ngần, Ble mạ mùa, Khẩu bò khá và Mồng lu có hệ số tương đồng dao động từ 0,37 (giữa giống Ba chơ K'tê và Mồng lu) đến 0,70 (giữa giống Ble mạ mùa và Khẩu bò khá). + Phân nhóm 4.2 gồm 7 giống: Nếp cái cạn, Hang ngụa, Khẩu mà giàng, Khẩu nón, Blào sinh sái, Blào đóng và Khẩu hin. Phân nhóm này có hệ số tương đồng dao động từ 0,38 (giữa giống Hang ngụa và Khẩu nón) đến 0,85 (giữa giống Khẩu mà giàng và Khẩu nón). + Phân nhóm 4.3 gồm 5 giống Blào cô ném, Khẩu cụ, Chạo lựu, Khẩu sán và Khẩu đó đón, Phân nhóm này có hệ số tương đồng dao động từ 0,47 (giữa giống Blào cô ném và Khẩu đó đón) đến 0,75 (giữa giống Khẩu cụ và Chạo lựu). IV. KẾT LUẬN Tập đoàn giống lúa chịu hạn bản địa của Việt Nam khá đa dạng về các thành phần allele. Kết quả phân tích 23 ch thị phân tử SSR với 39 giống lúa chịu hạn và giống IR64 thu được tổng số 82 loại allele, trung bình 3,57 allele/locus. Hệ số PIC dao động từ 0,22 đến 0,77 (trung bình 0,56). T lệ 76 allele hiếm xuất hiện là 8,7% (2 allele hiếm xuất hiện ở các cặp mồi RM3467 và RM5811). Các giống lúa chịu hạn có độ thuần di truyền khác nhau, tỷ lệ dị hợp của các giống lúa nghiên cứu dao động từ 0 đến 14,29% (trung bình là 3,45%). Mức độ đa dạng di truyền giữa các giống lúa chịu hạn rất cao. Hệ số tương đồng di truyền giữa các giống lúa dao động từ 0,02 đến 0,91. Dựa vào khoảng cách di truyền, 40 giống nghiên cứu được phân thành 4 nhóm cách biệt di truyền. Đã chọn được 8 giống lúa điển hình có độ đa dạng cao và có nguồn gốc khác nhau để giải trình tự, tạo lập cơ sở dữ liệu nguồn gen phục vụ công tác chọn, tạo giống lúa chịu hạn của Việt Nam. Lời cảm ơn: Nghiên cứu này được thực hiện trong khuôn khổ đề tài Nghị định thư hợp tác với Vương Quốc Anh:“Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam”. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alvarez A., Fuentes J. L., Puldón V., Gómez P. J., Mora L., Duque M. C., Gallego G. and Tohme J. M. (2007). Genetic diversity analysis of Cuban traditional rice (Oryza sativa L.) varieties based on microsatellite markers. Genetics and Molecular Biology, 30 (4): 1109-1117. 2. Chakravarthi B. K., and Naravaneni R. (2006). SSR marker based DNA fingerprinting and diversity study in rice (Oryza sativa. L). African Journal of Biotechnology, 5 (9): 684-688. 3. Giarrocco L.E., Marassi M. A. and Salerno G. L. (2007). Assessment of the genetic diversity in Argentine rice cultivars with SSR Markers. Crop Science, 47 (2): 853-860. 4. McCouch S. R., Leonid T.2, Y. Xu, K. B. Lobos, K. Clare, M. Walton, B. Fu, R. Maghirang, Z. Li, Y. Xing, Q. Zhang, I. Kono, M. Yano, R. Fjellstrom, G. DeClerck, D. Schneider, S. Cartinhour, D. Ware, L. Stein. (2002), "Development and Mapping of 2240 New SSR Markers for Rice (Oryza sativa L.)”, DNA Res. 9:199-207. 77 5. Nagaraju J., Kathirvel M., Ramesh Kumar R., Siddiq E. A., and Hasnain S. E., (2002). Genetic analysis of traditional and evolved Basmati and non-Basmati rice varieties by using fluorescence-based ISSR-PCR and SSR markers. PNAS, 99 (9): 5836-5841. 6. Nguyen Thi Thanh Thuy, Nguyen Duy Bay, Nguyen Quang Xu, Vu Duc Quang, Tran Duy Quy, Bui Chi Buu, Varapong Chamarerk, Surapong Sarkarung and Henry T. Nguyen, (2000). Genetic evaluation of several characteristics of drought resistance in selected rice line. Proceedings of 18th Conference of Asian Federation of engineering organizations. ASEAN Engineering Cooperation for the Development of the New Millennium: 458-462. 7. Obara O. P. and S. Kako (1998). Genetic diversity and identification of Cymbidium cultivars as measured by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Euphytica, 99: 95-1001. 8. Rohlf F., (1997). NTSYS-pc: numerical taxonomy and multivariate analysis system, 2.1 edn. Department of Ecology and Evolution, State University of NY, Stony Brook. 9. Wong S. C., Yiu P. H., Bong S. T. W., Lee H. H., Neoh P. N. P. and Rajan A., (2009). Analysis of Sarawak Bario Rice Diversity Using Microsatellite Markers. American Journal of Agricultural and Biological Sciences, 4 (4): 298-304. 10. Yu S. B., Xu W. J., Vijayakumar C. H., Ali J., Fu B. Y., Xu J. L., Jiang Y. Z., Marghirang R., Domingo J., Aquino C., Virmani S.S., and Li Z. K., (2003). Molecular diversity and multilocus organization of the parental lines used in the International Rice Molecular Breeding Program. Theor. Appl. Genet, 108: 131-140. 78 ANALYZING GENETIC DIVERSITY OF NATIVE DROUGHT TOLERANT RICE VARIETIES IN VIETNAM BY MICROSATELLITE MARKERS Nguyen Thi Minh Nguyet 1 , Nguyen Thi Nhai 1 , Nguyen Thi Thanh Thuy 2 , Nguyen Thuy Diep 1 , Kieu Thi Dung 1 , Nguyen Thi Thao 3 , Khuat Huu Trung 1 SUMMARY Analyzing genetic diversity of native drought tolerant rice varieties in Vietnam (including 39 local rice varieties tolerant to drought and IR64- reference variety which is sensitive to drought) by SSR markers showed that: These drought tolerant rice varieties have diversity about allele components. The results using 23 SSR markers for analyzing genetic diversity of 40 varieties have obtained 82 differences alleles, with an average of 3.57 alleles per SSR loci. The ratio of rare allele is 8.7% (2 rare alleles occur at RM3467 and RM5811). PIC value changed from 0.22 to 0.77 (with a mean of 0.56) which showed high diversity of the studied SSR loci. The ratio of homozygosity of native drought tolerant rice varieties are very different in 23 SSR loci. The heterozygosity changed from 0-14.29% (with an average of 3,45%). The genetic similarity coefficients of 40 varieties were ranging from 0.02 to 0.91. Genetic similarity was determined using Jaccard’s similarity coefficients and final dedrogram construction using a UPGMA clustering methods showed that 40 varieties were divided into four major groups, which shows great diversity among varieties. Based on genetic clustering result, 1 Agricultural Genetics Institute Author for correspondence: Tel: 84-4- 37540764; Fax: 84-4-37543196; Email: [email protected] 2 Ministry of Agriculture and Rural Development 3 Hanoi National University of Education 79 drought tolerant phenotype and the origins of rice varieties, eight varieties have been selected as materials for further research on establishment of a database for local rice genetic resources in Vietnam. Keywords: Drought tolerance, genetic diversity, local rice varieties, SSR marker.