Đề tài Giám sát sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 trên đàn gia cầm tại các chợ của 3 tỉnh Bắc Trung Bộ thuộc dự án VAHIP bằng phương pháp PCR (Real time RT – PCR)

ệnh một cách nhanh chóng và chính xác dựa trên triệu chứng, bệnh tích điển hình. Đồng thời tiến hành lấy mẫu xét nghiệm. Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm, do vậy sự bùng phát của bệnh vẫn tuân theo những quy luật chung của quá trình sinh dịch. Do vậy khống chế bệnh chính là tác động vào các khâu của quá trình sinh dịch nhằm phá vỡ vòng truyền lây tác nhân gây bệnh, đó là 3 yếu tố: nguồn bệnh, động vật cảm thụ, yếu tố truyền lây bệnh truyền nhiễm nói chung. Theo khuyến cáo của OIE thì đó là các hoạt động: Loại trừ tác nhân gây bệnh: tiêu hủy gia cầm, sản phẩm gia cầm nhiễm bệnh và tiến hành sát trùng, tiêu độc. Giảm tiếp xúc giữa tác nhân và vật chủ: sử dụng vacxin phòng bệnh, tăng cường chăm sóc nuôi dưỡng nhằm nâng cao sức đề kháng. Thay đổi môi trường sống: thực hiện các biện pháp an toàn sinh học, ngăn chặn tác nhân gây bệnh xâm nhập vào môi trường bằng cách cách ly triệt để toàn bộ khu vực có dịch. Song song với những việc làm đó tiến hành tuyên truyền cho tất cả các chủ vật nuôi gia cầm biết cách phát hiện và phòng bệnh cúm gia cầm. 2.7.2. Phòng bệnh bằng vacxin. 2.7.2.1. Các loại vacxin cúm đang được sử dụng. Các chủng virus cường độc A/H5N1 sau năm 1996, qua thời gian tiến hóa có xu hướng biến đổi nội gen nhằm tăng tính gây bệnh và thay đổi thành phần nội gen kháng nguyên làm mất tương quan miễn dịch giữa chúng và các chủng vacxin được tạo ra. Do vậy, vấn đề này phải được hết sức chú ý trong chiến lược chế tạo vacxin. Đối với bệnh truyền nhiễm, vacxin được coi là biện pháp có tính chiến lược, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch. Đối với dịch cúm A/H5N1 ở gia cầm và dự phòng dịch cúm trên người, nghiên cứu phát triển vacxin không những ngăn ngừa làm giảm được bệnh ở gia cầm, mà còn khống chế nguồn truyền lây của loại virus nguy hiểm này sang người. Kháng thể đặc hiệu có thể được cơ thể sinh ra do kích thích của kháng nguyên trong vacxin, và đó là các kháng thể kháng HA, NA, MA và nhiều loại hình khác của virus đương nhiễm, góp phần vô hiệu hóa virus cúm đúng đối tượng khi chúng xâm nhập vào. Các vacxin phòng bệnh hiện nay dựa trên cơ sở hai loại chính: vacxin truyền thống và vacxin thế hệ mới. Vacxin truyền thống. Bao gồm vacxin vô hoạt đồng chủng và dị chủng. Vacxin vô hoạt đồng chủng (homologous vaccine), đó là các loại vacxin được sản xuất chứa cùng những chủng virus cúm gà giống như chủng gây bệnh trên thực địa. Vacxin vô hoạt dị chủng (heterologous vaccine) là vacxin sử dụng các chủng virus có kháng nguyên HA giống chủng virus trên thực địa, nhưng có kháng nguyên NA dị chủng. Vacxin thế hệ mới hay vacxin công nghệ gen: là loại vacxin được sản xuất dựa trên sử dụng kỹ thuật gen loại bỏ các vùng “gen độc” đang được nghiên cứu và đưa vào sử dụng phổ biến, bao gồm: Vacxin tái tổ hợp có vector đậu gia cầm dẫn truyền: sử dụng virus đậu gia cầm làm vector tái tổ hợp song gen H5 và N1 phòng chống virus type H5N1 và H7N1. Vacxin dưới nhóm chứa protein kháng nguyên NA, HA tái tổ hợp và tách chiết làm vacxin. Vacxin tái tổ hợp có vector dẫn truyền: sử dụng adenovirus hoặc Newcastle virus hoặc virus đậu chim làm vector dẫn truyền, lắp ghép gen kháng nguyên H5 vào hệ gen của adenovirus, tạo nên virus tái tổ hợp làm vacxin phòng chống virus cúm A/H5N1. Vacxin DNA: sản phẩm DNA plasmid tái tổ hợp chứa gen HA, NA, NP, M2 đơn lẻ hoặc đa gen. Vacxin nhược độc virus cúm nhân tạo: được sản xuất bằng kỹ thuật di truyền ngược, đó là việc lắp ghép virus cúm nhân tạo chứa đầy đủ hệ gen, trong đó các gen kháng nguyên H5 có vùng "độc" đã được biến đổi bằng kỹ thuật gen. Có 3 loại vacxin đã được Tổ chức Y tế thế giới (WHO) công nhận về độ an toàn và khuyến cáo đưa vào chương trình sản xuất vacxin trên thế giới hiện nay, đó là NIBRG-14 (NIBSC), VN/04xPR8-rg (SJCRH) và VNH5N1-PR8/CDC-rg (CDC). 2.7.2.2. Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và khuyến cáo OIE Các nhà khoa học của tổ chức OIE, WHO... đã khuyến cáo các nước có cúm gia cầm như sau: - Sử dụng vacxin vào mục đích khống chế dịch bệnh cúm gia cầm chỉ là một giải pháp hỗ trợ để dập dịch, khoanh vùng dịch và khống chế dịch và vacxin chỉ hạn chế bài xuất virus cường độc ra ngoài môi trường chứ không loại bỏ được tận gốc bệnh cúm. - Chỉ tiêm phòng vacxin khi thật khẩn cấp. - Để có quyết định tiêm phòng phải dựa vào năng lực và điều kiện sau: Phải có hệ thống chẩn đoán đủ năng lực xác định được cúm gia cầm có độc lực cao (HPAI) hay có độc lực thấp (LPAI). Phải có ngân hàng vacxin đủ các chủng loại kháng nguyên H và N nhằm hạn chế tối đa hậu quả biến chủng virus cúm sau khi tiêm phòng. Phải có hệ thống kiểm soát thú y chặt chẽ từ trung ương đến địa phương nhằm kiểm soát những đàn đã sử dụng vacxin với những đàn chưa sử dụng vacxin. Với những điều kiện trên thì nước ta còn gặp nhiều khó khăn, do vậy việc tiêm phòng, quản lí tiêm phòng chưa được triệt để. Tuy nhiên với những nổ lực của ngành trong năm 2004, 2005 đã có nhiều đề tài, dự án, thử nghiệm và khảo nghiệm vacxin cúm đã được triển khai và thu được kết quả khả quan. Phần IIIĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNGPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG - Gà, vịt bán tại một số chợ của 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên – Huế. 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU - Tiến hành thu nhận mẫu. - Xử lí mẫu. - Tiến hành chiết tách RNA. - Tiến hành template mẫu. - Tiến hành làm phản ứng Real time RT – PCR. - Đọc kết quả. - Xử lí số liệu và phân tích kết quả. 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1. Nguyên liệu 3.3.1.1. Mẫu thí nghiệm Mẫu swabs được lấy theo công văn hướng dẫn chương trình giám sát cúm gia cầm năm 2010 của dự án VAHIP. 3.3.1.2. Phương pháp lấy mẫu Mẫu được gửi theo quy định của dự án VAHIP. Thường mẫu được gửi đến là mẫu Swab. Phương pháp lấy mẫu Swab: Ngoáy ổ nhớp: cho que ngoáy vào sâu trong hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành hậu môn rồi rút ra cho vào ống chứa dung dịch bảo quản, đậy nắp kín. Ngoáy họng, khí quản: đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu dịch nhầy, sau đó từ từ rút ra rồi đưa và ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que cho vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp. 3.3.1.3. Phương pháp bảo quản mẫu. Sau khi ngoáy ở các lỗ tự nhiên, que ngoáy được bảo quản trong dung dịch BHI ( Brain Heart Influsion). 3.3.1.4. Phương pháp xử lí mẫu Mẫu Swab gộp gửi đến được bảo quản trong dung dịch chứa trong các lọ penicyclin hoặc lọ chuyên đựng mẫu swab. Vortex các lọ trên, sau đó trộn lẫn 2 lọ vào một rồi tiếp tục vortex. Sau đó chia dung dịch trong lọ penicycline đó vào các ống Eppendorf. Tùy vào lượng dung dịch mà chia thành 1 hoặc 2 ống eppendorf. Quá trình trộn lẫn giữa các mẫu chỉ được tiến hành trong 1 lô mẫu. Sau khi xử lí mẫu các ống eppendorf được bảo quản ở nhiệt độ bình thường nếu tiến hành tách RNA ngay sau đó. Nếu mẫu không được tách RNA ngay thì sẽ được bảo quản trong tủ âm sâu -800C và trước khi tách mẫu được mang ra rải đông. 3.3.1.5 Dụng cụ, máy móc, hóa chất. - Bộ Micropipet các cỡ, ống eppendorf có thể tích khác nhau. - Bộ kít RNeasy Mini kit Qiagen, hệ thống chiết tách bằng chân không dùng trong chiết tách RNA. - Kít RT – PCR Qiagen one step dùng trong Master mix tạo hỗn hợp cho quá trình nhân gen (nếu có). - Máy Real time RT – PCR Bio – rad hoặc smart cycler và các tube phù hợp với từng máy. 3.3.2. Phương pháp tiến hành phản ứng Real time RT – PCR 3.3.2.1. Nguyên lí phản ứng Real time PCR (RT – PCR). - Phản ứng Real time PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép DNA. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuyếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di DNA trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT – PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy DNA khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với Primer gọi là Probe. Khi DNA tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỷ lệ với sự gia tăng lượng DNA. Khi sử dụng máy BIO – RAD, máy có bộ phận (Camera) có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng CT (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng. Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là RNA nên trong phản ứng real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ RNA → DNA gọi là Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là Real time RT – PCR - Nguyên lí hoạt động của Probe. Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên Primer và Probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng Real time RT – PCR là Taqman Probe. Hình 3.1. Cơ chế hoạt động của Taqman probe Taqman probe được sử dụng như một trình tự oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer. Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài DNA trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho DNA mạch đôi của Taq sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỷ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu. 3.3.2.2. Các bước tiến hành phản ứng Real time RT – PCR. Các bước tiến hành phản ứng được thực hiện theo quy trình chung “hướng dẫn của cục thú y” trong phòng thí nghiệm . Bao gồm các bước: Chiết tách RNA. Chuẩn bị Master mix. Template mẫu. Chạy PCR trên máy Bio – Rad hoặc Smart Cycle. Đọc kết quả 3.3.2.2.1. Quy trình chiết tách RNA Trước khi chiết tách RNA ta cần chuẩn bị: dung dịch đệm RLT bổ sung 2-mecraptoethanol tỷ lệ 1:100 và RPE bổ sung 4 lần thể tích ethanol. Mẫu sau khi được xử lí sẽ tiến hành chiết tách RNA theo các bước sau [9]: Cho 600µl đệm RLT đã được bổ sung 2-mecraptoethanol vào ống eependorf 1,5ml. Chuyển 200µl mẫu vào ống eependorf. Vortex trong 15s sau đó spin ở 5000vòng/phút trong 5s cho lắng xuống. Ủ 5 phút ở nhiệt độ phòng. Cho thêm 480µl ethanol 96 – 100% và 120µl nước Nuclease free water. Vortex 10s rồi ly tâm 9000 vòng/phút trong 5 phút. Lắp khóa van vào hệ thống và gắn cột lọc vào van. Bật máy hút chân không, điều chỉnh khóa van để P = 600. Cho hết toàn bộ mẫu trên vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. Cho 700µl RW1 vào cột lọc, rút hết dung dịch rửa trong cột lọc. Cho 500µl RPE vào cột lọc, rút hết dung dịch trong cột lọc. Lặp lại bước 7. Lấy cột lọc ra cho vào ống lọc, li tâm 1400 vòng/phút trong 3 phút Lấy cột lọc đặt vào ống eppendorf, cho vào cột lọc 50µl đệm DW. Sau đó giữ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút rồi ly tâm 1100 vòng/phút trong 3 phút. Bỏ cột lọc, thu lấy RNA. Sơ đồ chiết tách RNA 600µl đệm RLT 200µl mẫu. Vortex 15s, spin 5000vòng/phút trong 5 phút 480 µl ethanol 96÷100% + 120µl nước free RNase. Vortex 15s ly tâm 9000vòng/phút trong 5 phút Gắn cột lọc và điều chỉnh hệ thống máy hút chân không. Cho toàn bộ mẫu vào cột lọc 700µl RW1. Rút hết dung dịch trong cột lọc 700µl RPE. Rút hết dung dịch trong cột lọc Cho cột lọc vào ống lọc. Ly tâm 1400vòng/phút trong 3 phút Lấy cột lọc cho vào ống eppendorf Ly tâm 1100vòng/phút trong 3 phút. Thu lấy RNA trong ống eependorf 3.3.2.2.2.Master mix Hiện nay Cơ quan thú y vùng III đang sử dụng bộ kít trong phản ứng Realtime RT – PCR là Quiagen one step. Master mix là bước nhằm trộn lẫn các chất phản ứng cũng như các chất đệm, chất xúc tác cho quá trình sao chép DNA khi có sự tương đồng giữa primer và bộ gen đã chiết tách. Quá trình Master mix được tiến hành trong buồng vô trùng và thực hiện như sau: Chuẩn bị ống Eppendorf , vortex rồi spin các ống nguyên liệu rồi lần lượt cho các chất vào ống eppendorf như sau: ReagentLượng (µl)DW10.55x Reaction Mix5MgCl2 25mM1.2d NTP0.8P.P.P1.5Enzyme mix1Tổng20 Sau khi cho các chất trên vào ống Eppendorf ta tiến hành Vortex và spin trong thời gian 10 – 15giây. 3.3.2.2.3. Template mẫu Template là quá trình chuẩn bị các tube mẫu trước khi chạy trên máy RT – PCR. Trước khi template mẫu, ta chuẩn bị số tube 0,2ml tương ứng với số lượng mẫu cần chẩn đoán. Sau đó tiến hành theo các bước sau: - Cho 20µl hỗn hợp Master mix vào các tube 0,2ml. - Cho 50µl nước Free RNase vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng âm (Negative). - Cho 50µl RNA mẫu đã chiết tách được ở trên vào hỗn hợp Master mix của các tube mẫu. - Cho 50µl mẫu đối chứng (+) vào hỗn hợp Master mix của tube đối chứng dương (Postive). 3.3.2.2.4. Chạy trên máy RT – PCR Trước khi cài đặt, vận hành máy ta đặt các tube vào well (giếng) của máy. Khởi động màn hình máy tính và kích các biểu tượng Bio – rad hoặc smart cycler tiến hành cài đặt máy. Khai báo vị trí mẫu và cài đặt màu cho probe, chu trình nhiệt... Sau khi khai báo xong thì ta bắt đầu chạy máy. Bộ kit One-step RT-PCR của hãng Qiagen thực hiện phản ứng RT-PCR chạy trên chu trình nhiệt như sau: RT(bước phiên mã ngược)PCR500C-30phút40chu kỳ x (95C-10giây+58C-50giây)95C-15phút 3.3.2.2.5. Đọc kết quả Theo công văn của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2010) về việc hướng dẫn chương trình giám sát cúm gia cầm năm 2010 của dự án VAHIP, đối với mẫu giám sát cúm gia cầm là mẫu swab gộp thì được tiến hành như sau: Các mẫu swab gộp sẽ được xét nghiệm để xác định type A (M gene). Nếu dương tính với virus cúm A sẽ tiếp tục xét nghiệm để xác định kháng nguyên H5. Nếu âm tính với H5 thì có thể xác định một số H khác (nếu được sự đồng ý của Dự án). Tất cả các mẫu swab dương tính với kháng nguyên H5 sẽ tiếp tục xét nghiệm tìm kháng nguyên N1; nếu dương tính với kháng nguyên H5 mà âm tính với kháng nguyên N1 thì có thể sẽ xác định N khác (nếu được sự đồng ý của Dự án). Tất cả các mẫu swab dương tính với virus cúm gia cầm H5N1 hoặc dương tính với kháng nguyên N sẽ được gửi tới phòng thí nghiệm của Trung tâm Chẩn đoán Thú y trung ương để phân lập virus hoặc gửỉ đi nước ngoài để phân tích gene nhằm xác định sự biến chủng của virus. Kết quả xét nghiệm từng chỉ tiêu căn cứ vào giá trị Ct Mẫu dương tính khi giá trị Ct ≤ 35 Mẫu nghi ngờ khi giá trị Ct > 35 Mẫu âm tính khi không có giá trị Ct Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Dựa trên công văn và hướng dẫn chương trình giám sát Cúm gia cầm của dự án VAHIP năm 2010 của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, Trung tâm thú y vùng III đã tiến hành cho lấy mẫu swab trên 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên - Huế tại các chợ buôn bán gia cầm khác nhau như sau: Tỉnh Thanh Hóa lấy mẫu ở 5 chợ: Chợ Bản, Chợ Tây Thành, Chợ Đông Thành, Chợ Kim Tân, Chợ Lưu Vệ. Tỉnh Hà Tĩnh lấy mẫu trên 4 chợ: Chợ Nghèn Can Lộc, Chợ Thành phố Hà Tĩnh, Chợ Hội Cẩm Xuyên, Chợ Thị xã Hồng Lĩnh. Tỉnh Thừa Thiên - Huế lấy mẫu trên 5 chợ: Chợ An Lỗ, Chợ Thủy Phương, Chợ Phú Dương, Chợ Hương Chữ, Chợ Xuân Phú. Mẫu sau khi lấy được bảo quản và gửi về phòng chẩn đoán trung tâm thú y vùng III để tiến hành chẩn đoán. Sau khi thu mẫu, tiến hành kiểm tra mẫu thì hầu hết các mẫu đều đạt yêu cầu và chúng tôi tiến hành xét nghiệm theo các bước của phương pháp Real time RT – PCR đã trình bày như trên. Kết quả xét nghiệm được xử lí bằng phần mềm ứng dụng Excel theo công thức: Số mẫu dương tính Tỷ lệ nhiễm(%) = x 100 Tổng số mẫu xét nghiệm 4.1. TỔNG HỢP KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM MẪU SWAB 4 THÁNG ĐẦU NĂM 2010 CỦA 3 TỈNH THANH HÓA, HÀ TĨNH VÀ THỪA THIÊN – HUẾ. Trong năm 2010 các tỉnh thuộc dự án VAHIP trong đó có tỉnh Thanh Hóa, tỉnh Hà Tĩnh, tỉnh Thừa Thiên – Huế tiếp tục thực hiện việc giám sát lưu hành virus và mẫu được lấy tại các chợ khác nhau. Bằng phương pháp xét nghiệm là realtime RT – PCR, kết quả xét nghiệm mẫu swab 4 tháng đầu năm 2010 của 3 tỉnh Hà Tĩnh, Thanh Hóa, Thừa Thiên – Huế được thể hiện ở bảng 4.1 Bảng 4.1. Kết quả xét nghiệm mẫu 4 tháng đầu năm 2010 của 3 tỉnh Tỉnh Kết quả xét nghiệmSố mẫu xét nghiệmLoại gia cầmMH5N1Số mẫu (+)Tỷ lệ (%)Số mẫu (+)Tỷ lệ (%)Số mẫu (+)Tỷ lệ (%) Tỉnh Thanh HóaTháng 160Vịt1525,0023,3300Tháng 2 60Vịt000000Tháng 360Vịt813,3358,3358,33Tháng 460Vịt23,3311,6711,67Tổng240Vịt2510,4283,3362,50 Tỉnh Hà TĩnhTháng 148Gà000000Tháng 248Gà24,1712,0812,08Tháng 348Gà000000Tháng 448Gà12,0812,0800Tổng192Gà31,5621,0410,52Tỉnh Thừa Thiên -HuếTháng 160Vịt1931,6758,3300Tháng 260Vịt1830,000000Tháng 360Vịt1118,3335,0000Tháng 460Vịt58,3323,3300Tổng240Vịt5322,08104,1700Từ bảng tổng hợp kết quả xét nghiệm trên ta thấy rằng: Trong 3 tỉnh, tỉnh Thừa Thiên - Huế có tỷ lệ lưu hành virus cúm type A cao nhất, tiếp đó là tỉnh Thanh Hóa và thấp nhất là tỉnh Hà Tỉnh. Điều này tương ứng với kết quả xét nghiệm năm 2009 (Theo kết quả chẩn đoán ổ dịch năm 2009 của phòng chẩn đoán xét nghiệm trung tâm thú y vùng III) Với 240 mẫu xét nghiệm, tỉnh Thừa Thiên - Huế có tỷ lệ mẫu dương tính với M là cao nhất 53 mẫu chiếm 22,08%, trong 53 mẫu đó có 10 mẫu dương tính với H5 chiếm 4,17% và không có mẫu nào dương tính với N1. Cũng với 240 mẫu Tỉnh Thanh Hoá chỉ có 25 mẫu dương tính với M, 8 mẫu dương tính với H5 và trong 8 mẫu đó có 6 mẫu dương tính với N1. Ở tỉnh Hà Tĩnh, với 192 mẫu xét nghiệm, số mẫu dương tính với M chiếm 1,56%, số mẫu dương tính với H5 chiếm 1,04% và số mẫu dương tính với N1 chiếm 0,52%. Một điều nhận thấy rõ ở đây là tỷ lệ mẫu dương tính với M của tỉnh Thừa Thiên - Huế qua các tháng đều cao, tuy nhiên tỷ lệ dương tính với H5 và N1 giảm dần và đặc biệt không có mẫu nào dương tính với N1. Trong khi đó tỷ lệ mẫu dương tính với H5 và N1 của 2 tỉnh Thanh Hóa và Hà Tĩnh tương đối cao. Điều này cho ta thấy sự biến chủng của bệnh Cúm gia cầm type A ngày càng diễn ra phức tạp ở Tỉnh Thừa Thiên Huế, đồng thời nó cũng phản ánh sự lưu hành virus cúm type A chủng H5N1 trên 2 tỉnh Thanh Hóa và Hà Tĩnh. Nói như vậy không có nghĩa là ở hai tỉnh Thanh Hóa và Hà Tĩnh sự biến chủng của virus cúm type A không diễn ra phức tạp hay ở tỉnh Thừa Thiên - Huế không có sự lưu hành của virus cúm type A chủng H5N1 mà kết quả chẩn đoán ở trên chỉ phản ánh tương đối một phần nào sự lưu hành các chủng virus. Bởi lẽ trong quá trình lấy mẫu, kỹ thuật lấy mẫu có thể không đáp ứng được yêu cầu. Khi lấy mẫu swab, nếu gia cầm bị mắc bệnh thì virus sẽ tồn tại nhiều trong các dịch quanh ổ nhớp. Do vậy nếu người lấy mẫu không ngoáy 2 bên thành của ổ nhớp mà chỉ ngoáy phần ngoài thì dịch ta lấy được chủ yếu là phân nên số lượng virus sẽ giảm đi. Bên cạnh đó đối tượng lấy mẫu cũng ảnh hưởng đến phần nào đánh giá sự lưu hành của virus. Đối tượng lấy mẫu phải là mẫu đại diện được cho tỉnh đó. Cũng từ bảng 4.1 ta thấy tỉnh Hà Tĩnh mẫu swab lấy chủ yếu trên gà trong khi đó hai tỉnh Thừa Thiên - Huế và Thanh Hóa lấy mẫu trên vịt. Kết quả cho thấy tỷ lệ lưu hành virus cúm ở tỉnh Hà Tĩnh thấp hơn so với hai tỉnh còn lại. Điều này có nghĩa là tỷ lệ lưu hành virus cúm type A trên vịt (thủy cầm) cao hơn trên gà. Điều này tương ứng với kết quả xét nghiệm năm 2009 (Theo số liệu chẩn đoán ổ dịch năm 2009 của phòng chẩn đoán xét nghiệm trung tâm thú y vùng III). Mỗi một tỉnh tiến hành lấy mẫu ở các chợ khác nhau, điều này cũng phản ánh phần nào sự khác nhau về kết quả giám sát sự lưu hành virus của 3 tỉnh. Để làm rõ điều này chúng tôi tiến hành so sánh tỷ lệ nhiễm các gen M, H5, N1 giữa các chợ trong từng tỉnh. 4.2. TỶ LỆ NHIỄM CÁC GEN CÚM GIA CẦM TYPE A/H5N1 CỦA TỈNH THANH HÓA. Dựa trên công văn hướng dẫn của dự án VAHIP Trung tâm Thú y vùng III đã cho tiến hành lấy mẫu tại các chợ của tỉnh Thanh Hóa : chợ Bản, chợ Đông Thành, chợ Tây Thành, chợ Kim Tân và chợ Lưu Vệ. Mỗi chợ 1 tháng tiến hành lấy 12 mẫu và kết quả xét nghiệm mẫu trong 4 tháng cho thấy ở các chợ khác nhau tỷ lệ nhiễm các gen của virus là khác nhau. Điều này được thể hiện ở biểu đồ 4.1. Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ lưu hành virus tại các chợ của tỉnh Thanh Hóa Từ đồ thị ta thấy rõ tỷ lệ nhiễm các gen của virus cúm gia cầm ở hai chợ Đông Thành và chợ Tây Thành cao nhất trong 5 chợ. Tỷ lệ nhiễm giữa các chợ được thể hiện ở bảng 4.2. Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm mẫu lấy tại các chợ của tỉnh Thanh Hoá ChợSố mẫu xét nghiệmKết quả xét nghiệmSố mẫu (+)Tỷ lệ % (+)MH5N1MH5N1Chợ Bản48000000Chợ Đông Thành48105320,8310,426,25Chợ Tây Thành48123325,006,256,25Chợ Kim Tân482004,1700Chợ Lưu Vệ481002,0800 Từ bảng kết quả xét nghiệm và tỷ lệ số mẫu dương tính với các gen virus cúm type A ta thấy: Chợ Đông Thành với 48 mẫu xét nghiệm trong 4 tháng có 20,83% số mẫu dương tính với M (10 mẫu), khi tiếp tục xét nghiệm các mẫu này với gen H5 có 5 mẫu dương tính chiếm 10,42%, khi tiếp tục xét nghiệm với gen N1 có 3 mẫu dương tính chiếm 6,25%. Chợ Tây Thành có tỷ lệ mẫu dương tính M là 25% (12 mẫu) cao hơn chợ Đông Thành, khi xét nghiệm tiếp các mẫu dương tính M này với các gen H5 và N1 thì tỷ lệ mẫu dương tính với H5 thấp hơn chỉ là 6,25% và tỷ lệ dương tính với N1 bằng chợ Đông Thành là 6,25% Trong 5 chợ tiến hành lấy mẫu đó Chợ Bản không có mẫu nào dương tính với M. Hai chợ Kim Tân và Lưu Vệ tỷ lệ nhiễm với M là 4,17% và 2,08% khá thấp so với hai chợ Tây Thành và Đông Thành và cả hai chợ này không có mẫu nào dương tính với H5 và N1. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến sự khác nhau về tỷ lệ mẫu dương tính với các gen của virus cúm gia cầm type A. Cũng như hai tỉnh Thừa Thiên - Huế và Hà Tĩnh chúng ta không thể không nói tới ảnh hưởng của nguyên nhân chủ quan. Đó là phương pháp lấy mẫu không đúng kỹ thuật và đối tượng lấy mẫu chưa đại diện được cho tỉnh đó. Bên cạnh nguyên nhân chủ quan là nguyên nhân khách quan cũng ảnh hưởng tới sự khác nhau này. Như ta biết, Chợ Đông Thành và Chợ Tây Thành là hai trong số các chợ lớn của tỉnh Thanh Hóa. Hai chợ này đều nằm trên địa bàn thành phố Thanh Hóa, có Quốc lộ 1A chạy qua. Với quy mô, diện tích lớn đây là nơi tập trung nhiều mặt hàng buôn bán có nhiều nguồn gốc khác nhau. Trong số đó, gia cầm là mặt hàng kinh doanh của nhiều tư thương. Gia cầm đã được các tư thương thu gom từ các hộ chăn nuôi ở nhiều nơi khác nhau sau đó tập trung đưa về chợ. Bên cạnh đó, gia cầm còn được các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ mang đến chợ. Từ đây gia cầm lại được mua bán và chuyển đi nơi khác. Ba chợ Bản, Kim Tân và Tây Vệ do quy mô buôn bán nhỏ, lượng gia cầm ít hơn nên nguy cơ nhiễm với các gen của virus cúm thấp hơn. Có thể nói rằng chợ Tây Thành và chợ Đông Thành là hai chợ đầu mối về gia cầm, là nơi tập trung gia cầm có nhiều nguồn gốc khác nhau mà không có cơ sở để đảm bảo an toàn dịch bệnh. Đó là một trong những nguyên nhân làm cho tỷ lệ mẫu dương tính với các gen của virus cúm gia cầm type A của hai chợ này cao hơn ba chợ còn lại. 4.3. TỶ LỆ NHIỄM CÁC GEN CÚM GIA CẦM TYPE A/H5N1 CỦA TỈNH HÀ TĨNH. Tỉnh Hà Tĩnh chỉ tiến hành lấy mẫu tại 4 chợ : chợ Hồng Lĩnh, chợ Nghèn Can Lộc, chợ gia cầm Thành phố Hà Tĩnh và chợ Hội Cẩm Xuyên. Kết quả xét nghiệm được thể hiện ở bảng 4.3 Bảng 4.3. Kết quả xét nghiệm mẫu lấy tại các chợ của tỉnh Hà Tĩnh ChợSố mẫu xét nghiệmKết quả xét nghiệmSố mẫu (+)Tỷ lệ %(+)MH5N1MH5N1Chợ Nghèn Can Lộc481002,0800Chợ Thành phố Hà Tĩnh48000000Chợ Hội Cẩm Xuyên482214,174,172,08Chợ Thị Xã Hồng Lĩnh48000000 Từ bảng 4.3 trên ta thấy trong 4 chợ chỉ có 2 chợ có sự lưu hành virus cúm gia cầm type A nhưng số mẫu dương tính khá thấp so với tỉnh Thừa Thiên - Huế. Trong số các chợ đó, chợ Hội Cẩm Xuyên là chợ có số lượng mẫu dương tính với các gen cúm gia cầm type A cao nhất. Với 48 mẫu xét nghiệm, tại chợ Hội Cẩm Xuyên có 2 mẫu dương tính với M chiếm 4,17%, khi tiếp tục xét nghiệm hai mẫu này với gen H5 thì cả hai mẫu đều dương tính với H5 chiếm 4,17%, xét nghiệm với N1 có 1 mẫu dương tính với N1 chiếm 2,08%. Ở chợ Nghèn Can Lộc tỷ lệ mẫu dương tính với M là 2,08% chiếm 2 trong 48 mẫu chẩn đoán, khi tiếp tục xét nghiệm hai mẫu này với gen H5 và N1 không có mẫu nào dương tính. Cũng với 48 mẫu xét nghiệm nhưng cả hai chợ thành phố Hà Tĩnh và Thị xã Hồng Lĩnh không có mẫu nào dương tính với các gen của virus cúm. Sự khác nhau về tỷ lệ nhiễm virus tại các chợ của tỉnh Hà Tĩnh được thể hiện ở biểu đồ 4.2. Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ lưu hành virus tại các chợ của tỉnh Hà Tĩnh Câu hỏi đặt ra là tại sao Tỉnh Hà Tĩnh có số mẫu dương tính với các gen cúm gia cầm ít như vậy? Sỡ dĩ như vậy vì trước tết Nguyên Đán nhận thấy tình hình vận chuyển và giết mổ trái phép gia cầm diễn ra rất phức tạp, nên Chi cục Thú y Hà Tĩnh đã tăng cường công tác phòng, chống dịch bệnh cho vật nuôi đồng thời đẩy mạnh công tác kiểm dịch, kiểm soát giết mổ, kiểm tra vệ sinh thú y. Vì thế mà hầu hết gia cầm ở các chợ này đều được kiểm tra chặt chẽ trước khi giết mổ và đưa đi tiêu thụ. Trong tháng 1/2010, tại nhiều xã của tỉnh Hà Tĩnh đã bùng phát dịch cúm gia cầm và trong đó có huyện Cẩm Xuyên. Theo chương trình giám sát bị động của dự án VAHIP, từ ngày 18 – 26/01/2010 phòng chẩn đoán đã nhận được mẫu tissue và swab của các hộ ở huyện Cẩm Xuyên gửi về chẩn đoán bệnh. Kết quả cho thấy 19 mẫu gửi về cả 19 mẫu đều dương tính với H5N1. Trong khi đó các chợ lớn, ngay cả chợ Hội Cẩm Xuyên cũng không có mẫu nào kết luận dương tính với H5N1. Khi có kết quả chẩn đoán dương tính với H5N1 thì các cơ quan chức năng của tỉnh Hà Tĩnh tiến hành tiêu hủy toàn bộ đàn gia cầm đó, đồng thời tiến hành xử lý môi trường phun hóa chất tại các hộ nuôi gia cầm có kết quả dương tính với H5N1. Không chỉ có vậy mà Chi cục Thú y tỉnh Hà Tĩnh đã thành lập các chốt kiểm dịch tại các nút giao thông quan trọng. Như vậy, kết quả giám sát chủ động tỉnh Hà Tĩnh không có mẫu nào dương tính với subtype H5, N1 trong khi đó kết quả giám sát bị động thì 100% mẫu gửi đến đều dương tính với H5N1. Chợ Hội nằm trong huyện Cẩm Xuyên là nơi có dịch cúm H5N1 xảy ra mạnh mẽ nhất nhưng khi lấy mẫu tại chợ kiểm tra, kết quả cho thấy không có mẫu nào dương tính với H5N1. Qua đó ta thấy công tác khống chế khi có dịch xảy ra, công tác kiểm soát giết mổ, kiểm soát sự lưu thông gia cầm tại các chợ của tỉnh Hà Tĩnh rất chặt chẽ và triệt để. Chính điều này góp phần không nhỏ làm cho tỷ lệ lưu hành cúm gia cầm của tỉnh ít hơn rất nhiều so với các tỉnh khác. Tuy nhiên, số lượng mẫu dương tính với các gen cúm H5N1 nhỏ cũng không thể không nói tới nguyên nhân chủ quan đó là phương pháp lấy mẫu, đối tượng lấy mẫu chưa đảm bảo và chưa đạt được tính đại diện chung cho tỉnh. 4.4. TỶ LỆ NHIỄM CÁC GEN CÚM GIA CẦM TYPE A/H5N1 CỦA TỈNH THỪA THIÊN – HUẾ. Với tỉnh Thừa Thiên - Huế, Cơ quan thú y vùng III đã cho tiến hành lấy mẫu ở các hộ buôn bán gia cầm tại 5 chợ khác nhau. Kết quả xét nghiệm được thể hiện ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả xét nghiệm mẫu lấy tại các chợ  của tỉnh Thừa Thiên - Huế ChợSố mẫu xét nghiệmKết quả xét nghiệmSố mẫu (+)Tỷ lệ % (+)MH5N1MH5N1Chợ An Lỗ48145029,1710,420Chợ Thủy Phương4863012,506,250Chợ Phú Dương48102020,834,170Chợ Hương Chữ48120025,0000Chợ Xuân Phú48110022,9200 Từ bảng trên ta thấy tại các chợ khác nhau có số mẫu nhiễm các gen của cúm gia cầm là khác nhau. Nhưng có sự tương đồng đó là số mẫu dương tính với cúm gia cầm type A (gen M) ở các chợ khá đồng đều và khá cao; trong số đó chợ An Lỗ có số mẫu nhiễm nhiều nhất 29,17%. Khi tiếp tục xét nghiệm với gen H5 số lượng mẫu dương tính ở các chợ giảm dần và có sự khác biệt rõ rệt. Đặc biệt hai chợ Hương Chữ và chợ Xuân Phú không có mẫu nào dương tính với subtype H5. Trong khi đó với 48 mẫu xét nghiệm ở chợ Thủy Phương có 6,25% số mẫu dương tính với H5, cao nhất là chợ An Lỗ có 5 mẫu dương tính với H5 chiếm tỷ lệ 10,42% và thấp nhất là chợ Phú Dương có 2 mẫu chiếm 4,17%. Và cả 5 chợ tiến hành lấy mẫu xét nghiệm không có chợ nào có mẫu dương tính với N1. Như vậy, trong 5 chợ lấy mẫu xét nghiệm có thể nói 3 chợ An Lỗ, Thủy Phương và Phú Dương có số mẫu nhiễm các gen của virus cúm type A là nhiều nhất. Sự giống và khác nhau này được thể hiện ở biểu đồ 4.3. 29,17 12,5 20,83 25 22,92 10,42 6,25 4,17 0 0 0 0 0 0 0 0 5 10 15 20 25 30 Tỷ lệ nhiễm (%) M H5 N1 Chỉ tiêu chẩn đoán Chợ An Lỗ Chợ Thủy Phương Chợ Phú Dương Chợ Hương Chữ Chợ Xuân Phú Biểu đồ 4.3. Tỷ lệ lưu hành virus tại các chợ của tỉnh Thừa Thiên – Huế. Sỡ dĩ có sự khác nhau về số mẫu dương tính giữa các chợ ngoài các nguyên nhân chủ quan như cách lấy mẫu hay đối tượng lấy mẫu thì nguyên nhân khách quan cũng là một yếu tố đáng kể. Đó là đặc điểm kinh doanh, buôn bán và nguồn gốc gia cầm của các chợ đó. Như ta biết chợ An Lỗ, chợ Thủy Phương, chợ Phú Dương là 3 chợ đầu mối lớn của tỉnh Thừa Thiên - Huế. Đây là nơi cung cấp một lượng lớn gia cầm cho Thành phố Huế và gia cầm ở đây có nguồn gốc từ các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ. Do đó, ta thấy một điều tại các chợ này gia cầm sẽ có nhiều nguồn gốc khác nhau mà khả năng kiểm soát sự an toàn dịch bệnh còn nhiều hạn chế. Bởi lẽ khâu kiểm dịch tại các chợ này còn qua loa, con được đóng dấu con thì không. Khâu vệ sinh và sát trùng thì không triệt để, các khu chợ chỉ được tiêu độc khử trùng một lần tại nơi bán gia cầm, còn trong quá trình gia cầm được vận chuyển ra vào chợ thì không cần tiêu độc, khử trùng. Không chỉ có vậy hiện tượng gà, vịt mổ chui tại các chợ này cũng khá phổ biến. Bên cạnh đó, khi gia cầm được gom đủ lên các xe tư thương cán bộ thú y ở đây chỉ kiểm tra một cách sơ sài rồi cấp giấy phép lưu thông. Qua đó ta thấy, sự phức tạp về nguồn gốc gia cầm kết hợp với công tác vệ sinh, kiểm dịch qua loa của cán bộ thú y ở đây đã một phần làm cho tỷ lệ mẫu dương tính với virus cúm gia cầm type A ở các chợ này tăng cao. Không chỉ vậy mà đó cũng được xem là một trong những nguyên nhân làm lây lan dịch bệnh nhanh nếu có dịch xảy ra. Thông qua kết quả chẩn đoán ta thấy ngoài sự lưu hành của virus cúm type A/H5N1 thì sự lưu hành các subytype khác của virus cúm type A cũng khá cao. 4.5. SO SÁNH SỐ MẪU DƯƠNG TÍNH VỚI CÁC GEN M, H5, N1 4 THÁNG ĐẦU NĂM 2009 VÀ 2010. Để làm rõ thêm một số nguyên nhân làm cho dịch cúm gia cầm xảy ra nhiều hơn chúng tôi tiến hành so sánh kết quả xét nghiệm mẫu với các gen M, H5, N1 của 4 tháng đầu năm 2009 và 2010 của 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Thừa Thiên – Huế. Kết quả xét nghiệm mẫu được thể hiện trong bảng 4.5. Từ bảng kết quả xét nghiệm mẫu 4 tháng đầu năm 2009 và 2010, nhìn chung tổng số mẫu dương tính với các gen của virus cúm type A của 4 tháng đầu năm 2010 cao hơn 4 tháng đầu năm 2009. Riêng tỉnh Thanh Hóa có số mẫu dương tính với các gen cúm type A đầu năm 2009 lại cao hơn năm 2010. Điều này phù hợp với tình hình dịch bệnh những tháng đầu năm 2009 của tỉnh Thanh Hóa. Dịch cúm gia cầm đã xảy ra tại tỉnh Thanh Hóa từ ngày 28/12/2008 và đến ngày 6/1/2009 đã được Cục thú y công bố dịch (phòng dịch tễ, ‘tình hình dịch cúm gia cầm và lợn tai xanh’, cục thú y.) Năm Tỉnh20092010 Số mẫu xét nghiệm  Kết quả xét nghiệmSố mẫu xét nghiệm Kết quả xét nghiệm∑ M (+)∑ H5 (+)∑ N1 (+)∑ M (+)∑ H5 (+)∑ N1 (+)Thanh Hóa24027972402366Hà Tĩnh192421192321Thừa Thiên - Huế240304024053100Bảng 4.5 . Kết quả xét nghiệm mẫu 4 tháng đầu năm 2009 và 2010 của 3 tỉnh Như ta biết, 4 tháng đầu năm là những tháng của mùa xuân, khí hậu thường ẩm ướt và có mưa phùn. Tuy nhiên 2 năm gần đây thời tiết có sự thay đổi nhỏ. Những tháng đầu năm 2009 khí hậu tương đối ổn định, thời tiết ấm áp. Trong điều kiện khí hậu này, virus không hoạt động mạnh đồng thời sức đề kháng của con vật không bị giảm sút. Cùng với phương thức chăn nuôi hợp lí sức đề kháng của gia cầm được nâng cao. Chính vì lẽ đó mà tỷ lệ lưu hành virus những tháng đầu năm 2009 thấp hơn so với năm 2010. Những tháng đầu năm 2010 thì ngược lại, mặc dầu nhiệt độ môi trường không cao nhưng khí hậu thường xuyên thay đổi. Trong mỗi một tuần có thể nắng, mưa, lạnh và sự biến đổi này diễn ra liên tục trong nhiều tuần. Điều này làm cho khả năng thích ứng với môi trường của gia cầm không đáp ứng kịp nên sức đề kháng của gia cầm giảm sút. Đồng thời đây cũng là điều kiện thuận lợi cho virus và các mầm bệnh khác trỗi dậy, xâm nhập và gây bệnh. Đây là một trong những nguyên nhân dẫn đến tỷ lệ lưu hành virus cúm những tháng đầu năm 2010 cao hơn năm 2009. Qua kết quả xét nghiệm mẫu những tháng đầu năm 2009 và 2010 ta thấy các điều kiện của môi trường về nhiệt độ, khí hậu là một trong những nguyên nhân có ảnh hưởng trực tiếp tới sự lưu hành của virus cúm gia cầm. 4.6. ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ TIÊM PHÒNG VACXIN TỚI SỰ LƯU HÀNH VIRUS. Như ta đã biết vacxin là một chế phẩm sinh học trong đó chứa chính mầm bệnh hoặc kháng nguyên của mầm bệnh gây ra bệnh đó. Nếu là mầm bệnh thì phải được làm vô hoạt hoặc nhược độc bằng các yếu tố vật lí, hóa học và sinh học. Khi sử dụng vacxin cho động vật, vacxin sẽ tạo ra một đáp ứng miễn dịch chủ động giúp động vật chống lại được sự xâm nhiễm của mầm bệnh tương ứng. Chính vì lẽ đó mà để phần nào hạn chế sự lưu hành virus trên các tỉnh Bắc Trung Bộ nói chung và ba tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh, Thừa Thiên - Huế nói riêng thì trung tâm Thú y vùng III đã tiến hành tiêm phòng vacxin cúm gia cầm cho các tỉnh trong vùng. Trong 1 năm thường sẽ có hai đợt tiêm phòng: đợt 1 vào tháng 3 và tháng 4, đợt hai vào tháng 9 và tháng 10. Kết quả tỷ lệ tiêm phòng vụ đông xuân năm 2009 được thể hiện ở bảng 4.6 Bảng 4.6. Tỷ lệ tiêm phòng vacxin cúm gia cầm vụ đông xuân năm 2009 TỉnhKết quả tiêm phòngTổng đàn (con)Số con được tiêm phòng (con)Tỷ lệ tiêm phòng (%)Thanh Hóa11 776 37810 356 40087,94Hà Tĩnh9 672 4838 742 61390,39Thừa Thiên - Huế8 534 1787 332 25385,92 Từ bảng trên ta thấy trong ba tỉnh trên Tỉnh Hà Tĩnh đạt tỷ lệ tiêm phòng cao nhất đạt 90,39%, tiếp đó là tỉnh Thanh Hóa đạt 87,94% và thấp nhất là tỉnh Thừa Thiên - Huế đạt 85,92%. Gia cầm không được tiêm phòng vacxin thì cơ thể không hình thành đáp ứng miễn dịch chủ động. Do đó, khi có mầm bệnh nguy cơ nhiễm bệnh của những con này là rất cao và làm cho tỉnh đó có sự lưu hành virus cao. Đúng như vậy, nhìn lại bảng 4.1 thì số mẫu dương tính với các gen của virus cúm gia cầm type A của Tỉnh Thừa Thiên - Huế là cao nhất, 53 mẫu dương với M, 10 mẫu dương tính với H5 không có mẫu nào dương tính với N1. Tiếp đó là tỉnh Thanh Hóa, cũng với 240 mẫu xét nghiệm thì chỉ có 25 mẫu dương tính với M, 8 mẫu dương tính với H5, 6 mẫu dương tính với N1. Thấp nhất là tỉnh Hà Tĩnh, với 192 mẫu xét nghiệm thì chỉ có 6 mẫu dương tính với M, 4 mẫu dương tính với H5 và 3 mẫu dương tính với N1. Qua trên ta thấy tỷ lệ tiêm phòng càng cao thì khả năng mắc bệnh hay tỷ lệ lưu hành virus cúm gia cầm tại tỉnh đó càng giảm. Tuy nhiên nó chỉ mang tính chất tương đối bởi lẽ trong số những con tiêm phòng có những con đạt tỷ lệ bảo hộ ngược lại có những con lại không đạt. Mặt khác, do hình thức chăn nuôi của nước ta nói chung và ba tỉnh trên nói riêng còn lẻ tẻ, không tập trung, có sự bổ sung thêm đàn sau khi tiêm vacxin. Vì vậy việc tiêm phòng vaxcin không triệt để. Bên cạnh đó, ý thức của người dân về phòng bệnh cho vật nuôi cũng có phần hạn chế nên việc khống chế dịch bệnh cũng gặp nhiều khó khăn và dịch bệnh diễn ra ngày càng phức tạp. Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. KẾT LUẬN Từ những kết quả thu được của đề tài chúng tôi rút ra những kết luận sau đây: Bốn tháng đầu năm 2010, ở 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Thừa Thiên – Huế đều có sự lưu hành virus cúm type A tại các chợ. Tỉnh Thanh Hóa với 240 mẫu xét nghiệm có 25 mẫu dương tính với M; trong số đó có 8 mẫu dương tính với H5, 6 mẫu dương tính với N1. Tỉnh Hà Tĩnh với 192 mẫu xét nghiệm có 3 mẫu dương tính với M; trong số đó có 2 mẫu dương tính với H5, 1 mẫu dương tính với N1. Tỉnh Thừa Thiên –Huế với 240 mẫu xét nghiệm có 53 mẫu dương tính với M, trong số đó có 10 mẫu dương tính với H5, không có mẫu nào dương tính với N1. Số mẫu dương tính với các gen cúm gia cầm type A của 3 tỉnh 4 tháng đầu năm 2010 nhìn chung cao hơn 4 tháng đầu năm 2009. Tỉnh Thanh Hóa, 4 tháng đầu năm 2009 có dịch Cúm gia cầm xảy ra nên với 240 mẫu xét nghiệm có 27 mẫu dương tính với M; trong số đó có 9 mẫu dương tính với H5, 7 mẫu dương tính với N1. 4 tháng đầu năm 2010 với 240 mẫu xét nghiệm có 23 mẫu dương tính với M; trong số đó có 6 mẫu dương tính với H5, 6 mẫu dương tính với N1. Tỉnh Hà Tĩnh, 4 tháng đầu năm 2009 với tổng số mẫu xét nghiệm là 192 có 4 mẫu dương tính với M; trong số đó có 2 mẫu dương tính với H5, 1 mẫu dương tính với N1. Năm 2010, 4 tháng đầu cũng với tổng số mẫu xét nghiệm là 192 nhưng có 3 mẫu dương tính với M; trong số đó có 2 mẫu dương tính với H5, 1 mẫu dương tính với N1. Tỉnh Thừa Thiên – Huế, 4 tháng đầu năm 2009 với 240 mẫu xét nghiệm chỉ có 30 mẫu dương tính với M; trong số đó có 4 mẫu dương tính với H5, không có mẫu nào dương tính với N1. 4 tháng đầu năm 2010 cũng với 240 mẫu xét nghiệm có 53 mẫu dương tính với M; trong số đó có 10 mẫu dương tính với H5, không có mẫu dương tính với N1. Tỷ lệ tiêm phòng vacxin cúm gia cầm của 3 tỉnh có ảnh hưởng tới sự lưu hành virus của 3 tỉnh. Tỉnh Thanh Hóa có tỷ lệ tiêm phòng vacxin 87,94%, kết quả xét nghiệm cho thấy tỷ lệ lưu hành virus của tỉnh Thanh Hóa là 10,42% thấp hơn so với tỉnh Thừa Thiên – Huế nhưng cao hơn tỉnh Hà Tĩnh. Tỉnh Hà Tĩnh có tỷ lệ tiêm phòng vacxin cao nhất trong 3 tỉnh ((90,39%) do vậy tỷ lệ lưu hành virus cúm thấp nhất trong 3 tỉnh (1,56%). Tỉnh Thừa Thiên – Huế có tỷ lệ tiêm phòng vacxin thấp nhất trong 3 tỉnh (85,92%) nên có tỷ lệ lưu hành virus cao (22,08%). 4.2. ĐỀ NGHỊ. Qua kết quả xét nghiệm ta thấy ngoài sự lưu hành subtype H5 và N1 thì còn có nhiều subtype H và N của virus cúm type A mà hiện nay chưa xác định được. Vì thế cần có nhiều đề tài, dự án nghiên cứu về virus cúm gia cầm nhằm xác định subtype khác của virus cúm type A. Đối tượng lấy mẫu không đạt tính đại diện là một trong những nguyên nhân ảnh hưởng đến kết quả sự lưu hành virus. Do vậy cũng là lấy mẫu ở chợ nên có sự thay đổi các chợ lấy mẫu cũng như các hộ lấy mẫu trong các tháng. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Ban quản lí các dự án Nông nghiệp, ” Hướng dẫn chương trình giám sát cúm gia cầm năm 2010”. Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ (2004), “Bệnh cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh”, tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11 (3), tr. 69 – 75. Bùi Quang Anh, “Báo cáo về dịch cúm gia cầm tại hội nghị kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực Châu Á” do FAO, OIE tổ chức tại Thành phố Hồ Chí Minh từ 23 – 25/02/2005. Cục thú y, 2004, “Tài liệu tập huấn các phương pháp chẩn đoán cúm gia cầm”. Cục thú y (2007), “Sổ tay chẩn đoán cúm gia cầm”. Cục thú y, phòng dịch tễ “Báo cáo tổng kết công tác phòng chống dịch bệnh gia súc, gia cầm năm 2009 và phương hướng năm 2010”, tr 1 – 4. Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webter, Kent Inui, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Viết Không, Ngô Thanh Long (2004), “Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003/2004”, tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y 11(3), tr 6 – 14. Phạm Sỹ Lăng (2004) “Diễn biến cúm gia cầm ở Châu Á và các hoạt động phòng chống bệnh”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr. 87 - 93. Tô Thành Long(2004), “Thông tin cập nhập về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm ở các nước Châu Á”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 11(4), tr.87 – 93. Tổ chức y tế thế giới (2004), “Hướng dẫn phòng chống lây nhiễm bệnh cúm gà”, Nhà xuất bản Nông nghiệp Hà Nội. Tô Long Thành (2005) “Kinh nghiệm phòng chống dịch cúm gia cầm và sử dụng vaccine cúm gia cầm ở Trung Quốc”, Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y 12(3), tr 87 – 93. Sổ tay Qiagen one step mini kit. Các trang web tiếng Việt. 13. Cục thú y.  HYPERLINK "" . 14. Cục thú y.  HYPERLINK "" . 15. Dịch cúm gia cầm ở Việt Nam.  HYPERLINK ""  16. Hội nghị quốc tế lần thứ hai về cúm gia cầm ở Châu Á.  HYPERLINK "" . 17. Nguyễn Tuấn Anh (2006), dịch cúm gia cầm hai năm qua – nguyên nhân, tính chất dịch và những tồn tại.  HYPERLINK "" . 18. Quy trình chẩn đoán cúm gia cầm (Cục thú y).  HYPERLINK "" . 19. Sinh học Việt Nam  HYPERLINK ""  20. Tổng cục thống kê.  HYPERLINK ""  21. Viện sốt rét và kí sinh trùng.  HYPERLINK " qn/vn/portal/InfoDetail.jsparea=58&cat=945&ID=3666"  qn/vn/portal/InfoDetail.jsparea=58&cat=945&ID=3666 22. Bách khoa toàn thư mở wikipedia.  HYPERLINK ""  TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI Các trang web bằng tiếng anh. 23. Avian influenza – Highly Pathogenic (HPAI), Fowl Plague.  HYPERLINK "" . 24. . Cumulative Number of Confirmed Human Cases of Avian Influenza A/(H5N1) Reported to WHO.  HYPERLINK "" . 25. Tien Dung Nguyen, The Vinh Nguyen, Dhanasekaran Vijaykrishna, robert G. Webster, Yi Guan, J.S. Mail Peiris and Gavin J.D. Smith (2008). Multiple sublineages of Influenza A Virus (H5N1), Vietnam, 2005 – 2007.  HYPERLINK "" . 26. Jennife L. McKimm-Breschkin, Paul W. Selleck, Tri Bhakti Usman, and Michael A. Johnson. Reduced sensitivity of Influenza A (H5N1) to Oseltaminvir.  HYPERLINK "" . 27. . Key Facts About Avian Influenza (Bird Flu) and Avian Influenza A (H5N1) Virus ( theo CDC – 2007)  HYPERLINK "" . TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA THÚ Y ---------------- KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM TYPE A/H5N1 TRÊN ĐÀN GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ CỦA 3 TỈNH BẮC TRUNG BỘ THUỘC DỰ ÁN VAHIP BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (REAL TIME RT – PCR) HÀ NỘI - 2010 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA THÚ Y ---------------- KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: GIÁM SÁT SỰ LƯU HÀNH CỦA VIRUS CÚM TYPE A/H5N1 TRÊN ĐÀN GIA CẦM TẠI CÁC CHỢ CỦA 3 TỈNH BẮC TRUNG BỘ THUỘC DỰ ÁN VAHIP BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (REAL TIME RT – PCR) Người thực hiện :NGUYỄN THỊ HẢI YẾNLớp :THÚ Y AKhoá : 50Ngành :THÚ Y Người hướng dẫn 1 :LÊ VĂN LÃNHBộ môn: VI SINH VẬT - TRUYỀN NHIỄMNgười hướng dẫn 2 :ThS. DƯƠNG TẤT THẮNGGiám đốc Trung tâm thú y vùng III Cục Thú y HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Trong suốt 5 năm học tập và rèn luyện tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội em luôn nhận được sự dạy dỗ và chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo trong trường cũng như thầy cô giáo trong khoa Thú y. Nhân dịp này, em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong trường, đặc biệt là thầy cô giáo trong khoa thú y đã cho em những kiến thức cơ bản về ngành học của mình và dạy dỗ em trưởng thành. Hoàn thành thực tập tốt nghiệp này, ngoài sự nổ lực của bản thân, em còn được sự hướng dẫn chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo và các cán bộ Cơ quan Thú y vùng III. Em xin cảm ơn và tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất đến: Thầy giáo Lê Văn Lãnh - Giảng viên bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. Th.s Dương Tất Thắng – Giám đốc trung tâm thú y vùng III – Cục Thú y BSTY. Lê Đình Huệ - trưởng phòng chẩn đoán, xét nghiệm Cơ quan Thú y vùng III. BSTY. Thái Thị Minh Lệ - phó phòng chẩn đoán, xét nghiệm Cơ quan Thú y vùng III. Đồng thời cho em gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Ban chủ nhiệm khoa Thú y, Ban lãnh đạo Cơ quan Thú y vùng III và các anh chị trong phòng chẩn đoán xét nghiệm trung tâm Thú y vùng III. Cuối cùng em xin gửi tới lời cảm ơn tới những người thân trong gia đình, bạn bè đã động viên, giúp đỡ để em có thể hoàn thành khoá luận tốt nghiệp cũng như quá trình học tập. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2010 Sinh viên Nguyễn Thị Hải Yến MỤC LỤC  TOC \h \z \t "1,1,2,2,3,3"  HYPERLINK \l "_Toc263003068" Phần I MỞ ĐẦU  PAGEREF _Toc263003068 \h 1  HYPERLINK \l "_Toc263003069" 1.1. Đặt vấn đề  PAGEREF _Toc263003069 \h 1  HYPERLINK \l "_Toc263003070" 1.2. Mục đích nghiên cứu của đề tài.  PAGEREF _Toc263003070 \h 2  HYPERLINK \l "_Toc263003071" Phần II TỔNG QUAN TÀI LIỆU  PAGEREF _Toc263003071 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc263003072" 2.1. Khái niệm về bệnh cúm gia cầm  PAGEREF _Toc263003072 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc263003073" 2.2. Tình hình bệnh cúm gia cầm trên thế giới và việt nam  PAGEREF _Toc263003073 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc263003074" 2.2.1. Tình hình thế giới  PAGEREF _Toc263003074 \h 3  HYPERLINK \l "_Toc263003075" 2.2.2. Tình hình dịch Cúm ở Việt Nam  PAGEREF _Toc263003075 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc263003076" 2.3. Virus học bệnh cúm gia cầm type A  PAGEREF _Toc263003076 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc263003077" 2.3.1. Cấu trúc chung của virus cúm  PAGEREF _Toc263003077 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc263003078" 2.3.2. Nét đặc trưng về cấu trúc hệ gen  PAGEREF _Toc263003078 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc263003079" 2.3.3. Kháng nguyên của virus  PAGEREF _Toc263003079 \h 13  HYPERLINK \l "_Toc263003080" 2.3.4. Độc lực của virus  PAGEREF _Toc263003080 \h 15  HYPERLINK \l "_Toc263003081" 2.3.5. Cơ chế xâm nhập, nhân lên và gây bệnh của virus  PAGEREF _Toc263003081 \h 16  HYPERLINK \l "_Toc263003082" 2.3.6. Sức đề kháng của virus  PAGEREF _Toc263003082 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc263003083" 2.4. Truyền nhiễm học  PAGEREF _Toc263003083 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc263003084" 2.4.1. Động vật cảm nhiễm  PAGEREF _Toc263003084 \h 18  HYPERLINK \l "_Toc263003085" 2.4.2. Sự truyền lây bệnh  PAGEREF _Toc263003085 \h 19  HYPERLINK \l "_Toc263003086" 2.5. Triệu chứng, bệnh tích  PAGEREF _Toc263003086 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc263003087" 2.5.1. Triệu chứng  PAGEREF _Toc263003087 \h 20  HYPERLINK \l "_Toc263003088" 2.5.2. Bệnh tích  PAGEREF _Toc263003088 \h 21  HYPERLINK \l "_Toc263003089" 2.6. Các phương pháp chẩn đoán  PAGEREF _Toc263003089 \h 21  HYPERLINK \l "_Toc263003090" 2.6.1.Dựa vào dịch tễ.  PAGEREF _Toc263003090 \h 21  HYPERLINK \l "_Toc263003091" 2.6.2. Dựa vào triệu chứng, bệnh tích  PAGEREF _Toc263003091 \h 22  HYPERLINK \l "_Toc263003092" 2.6.3. Phân lập và định danh virus  PAGEREF _Toc263003092 \h 22  HYPERLINK \l "_Toc263003093" 2.7. Phòng bệnh  PAGEREF _Toc263003093 \h 23  HYPERLINK \l "_Toc263003094" 2.7.1 Phòng bệnh bằng vệ sinh  PAGEREF _Toc263003094 \h 23  HYPERLINK \l "_Toc263003095" 2.7.2. Phòng bệnh bằng vacxin.  PAGEREF _Toc263003095 \h 24  HYPERLINK \l "_Toc263003096" Phần III ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  PAGEREF _Toc263003096 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263003097" 3.1. Đối tượng  PAGEREF _Toc263003097 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263003098" 3.2. Nội dung nghiên cứu  PAGEREF _Toc263003098 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263003099" 3.3. Phương pháp nghiên cứu  PAGEREF _Toc263003099 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263003100" 3.3.1. Nguyên liệu  PAGEREF _Toc263003100 \h 28  HYPERLINK \l "_Toc263003101" 3.3.2. Phương pháp tiến hành phản ứng Real time RT – PCR  PAGEREF _Toc263003101 \h 30  HYPERLINK \l "_Toc263003102" Phần IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN  PAGEREF _Toc263003102 \h 38  HYPERLINK \l "_Toc263003103" 4.1.Tổng hợp kết quả xét nghiệm mẫu swab 4 tháng đầu năm 2010 của 3 tỉnh Thanh Hóa, Hà Tĩnh và Thừa Thiên – Huế.  PAGEREF _Toc263003103 \h 39  HYPERLINK \l "_Toc263003104" 4.2. Tỷ lệ nhiễm các gen cúm gia cầm type A/H5N1 của tỉnh Thanh Hóa.  PAGEREF _Toc263003104 \h 41  HYPERLINK \l "_Toc263003105" 4.3. Tỷ lệ nhiễm các gen cúm gia cầm type A/H5N1 của tỉnh Hà Tĩnh.  PAGEREF _Toc263003105 \h 44  HYPERLINK \l "_Toc263003106" 4.4. Tỷ lệ nhiễm các gen cúm gia cầm type A/H5N1 của tỉnh Thừa Thiên – Huế.  PAGEREF _Toc263003106 \h 47  HYPERLINK \l "_Toc263003107" 4.5. So sánh số mẫu dương tính với các gen M, H5, N1 4 tháng đầu năm 2009 và 2010.  PAGEREF _Toc263003107 \h 49  HYPERLINK \l "_Toc263003108" 4.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiêm phòng vacxin tới sự lưu hành virus.  PAGEREF _Toc263003108 \h 51  HYPERLINK \l "_Toc263003109" Phần V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  PAGEREF _Toc263003109 \h 53  HYPERLINK \l "_Toc263003110" 4.1. Kết luận  PAGEREF _Toc263003110 \h 53  HYPERLINK \l "_Toc263003111" 4.2. Đề nghị.  PAGEREF _Toc263003111 \h 54  HYPERLINK \l "_Toc263003112" TÀI LIỆU THAM KHẢO  PAGEREF _Toc263003112 \h 55  HYPERLINK \l "_Toc263003113"   DANH MỤC BẢNG  TOC \h \z \t "5,5"  HYPERLINK \l "_Toc263003114" Bảng 2.1. Số lượng các ca nhiễm cúm gia cầm trên người  PAGEREF _Toc263003114 \h 5  HYPERLINK \l "_Toc263003116" Bảng 2.2. Tình hình dịch cúm gia cầm trong 3 năm (2007 – 2009)  PAGEREF _Toc263003116 \h 9  HYPERLINK \l "_Toc263003117" Bảng 4.1. Kết quả xét nghiệm mẫu 4 tháng đầu năm 2010 của 3 tỉnh  PAGEREF _Toc263003117 \h 39  HYPERLINK \l "_Toc263003118" Bảng 4.2. Kết quả xét nghiệm mẫu lấy tại các chợ của tỉnh Thanh Hoá  PAGEREF _Toc263003118 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc263003119" Bảng 4.3. Kết quả xét nghiệm mẫu lấy tại các chợ của tỉnh Hà Tĩnh  PAGEREF _Toc263003119 \h 44  HYPERLINK \l "_Toc263003120" Bảng 4.4. Kết quả xét nghiệm mẫu lấy tại các chợ của tỉnh Thừa Thiên - Huế  PAGEREF _Toc263003120 \h 47  HYPERLINK \l "_Toc263003121" Bảng 4.5 . Kết quả xét nghiệm mẫu 4 tháng đầu năm 2009 và 2010 của 3 tỉnh  PAGEREF _Toc263003121 \h 50  HYPERLINK \l "_Toc263003122" Bảng 4.6. Tỷ lệ tiêm phòng vacxin cúm gia cầm vụ đông xuân năm 2009  PAGEREF _Toc263003122 \h 51  DANH MỤC BIỂU ĐỒ  TOC \h \z \t "6,6"  HYPERLINK \l "_Toc263003152" Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ lưu hành virus tại các chợ của tỉnh Thanh Hóa  PAGEREF _Toc263003152 \h 42  HYPERLINK \l "_Toc263003153" Biểu đồ 4.2. Tỷ lệ lưu hành virus tại các chợ của tỉnh Hà Tĩnh  PAGEREF _Toc263003153 \h 45  HYPERLINK \l "_Toc263003155" Biểu đồ 4.3. Tỷ lệ lưu hành virus tại các chợ của tỉnh Thừa Thiên – Huế.  PAGEREF _Toc263003155 \h 48  DANH MỤC HÌNH  TOC \h \z \t "8,8"  HYPERLINK \l "_Toc263003387" Hình 2.1. Cấu trúc bên ngoài của virus cúm gia cầm  PAGEREF _Toc263003387 \h 10  HYPERLINK \l "_Toc263003388" Hình 2.2. Cấu trúc hệ gen của virus cúm type A  PAGEREF _Toc263003388 \h 11  HYPERLINK \l "_Toc263003389" Hình 2.3. Quá trình xâm nhập và nhân lên của virus trong tế bào vật chủ  PAGEREF _Toc263003389 \h 16  HYPERLINK \l "_Toc263003390" Hình 3.1. Cơ chế hoạt động của Taqman probe  PAGEREF _Toc263003390 \h 31