Đề tài Khảo sát hoạt tính kháng phân bào in vitro của gossypol và plumbagin

thƣơng tổn ung thƣ. - Xác ƣớp ngƣời Ai cập ở Gaza cách đây 5000 năm thấy có ung thƣ xƣơng và ung thƣ bàng quang. - Thời Hypocrates đã để lại một số bản viết tay mô tả 2 loại ung thƣ: loại sùi ra ngoài nhiều chân nhƣ loài tôm cua gọi là carcinoma và loại phát triển sâu trong thịt gọi là sarcoma. - 1846 R.Virchop (ngƣời Đức) mô tả tế bào ung thƣ máu và đƣa ra giả thuyết về nguồn góc ung thƣ tế bào. - 1953 J.Watson và F. Crick dƣa ra mô hình chuỗi xoắn kép phân tử DNA mô phỏng các loại gen của tế bào. Công trình nhận giải Nobel Sinh học. - 1979 Richard Doll lãnh đạo nhóm nghiên cứu nguyên nhân gây ung thƣ trên ngƣời từ môi trƣờng sống. Trong đó ông và Petro nhấn mạnh vai trò quan trọng của hút thuốc, dinh dƣỡng và các ung thƣ nghề nghiệp. - 1981 Cesar Milstein đã phát triển kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng (nhận giải Nobel 1987). - 1981 S.D.Thomas đã thành công ghép tủy xƣơng trên ngƣời ứng dụng xạ trị toàn thân và điều trị hóa chất mạnh trong bệnh bạch huyết cấp (nhận giải Nobel năm 1990). 2. Tế bào ung thƣ 2.1. Nguồn gốc tế bào ung thƣ Có một số giả thuyết khác nhau nhằm giải thích các quan sát về quần thể tế bào ung thƣ. 2.7.7. Thuyết đơn dòng tế bào 7 Là quan niệm kinh điển: khối u sinh ra từ 1 tế bào mẹ nhân lên. Ví dụ: từ bệnh bạch cầu thể tủy trên phụ nữ da đen thấy tế bào đồng nhất thƣơng tổn nhiễm sắc thể 10. Các tế bào ung thƣ đều tiết men Glucose-6-phosphate dehydrogenase. 2.7.2. Thuyết đa dòng tế bào Khi quan sát về hình thái và chức năng ngƣời ta thấy: - Tổ chức ung thƣ có nhiều loại tế bào nên chẩn đoán hình thái học dễ nhầm lẫn. - Về chức năng: nhiều chất chỉ điểm sinh học. 2.1.3. Thuyết về kém ổn định gen của tế bào ung thƣ Có thể ban đầu là một dòng, do gen tế bào ung thƣ không ổn định nên có các tế bào biến dị tạo nên hàng loạt các tế bào hỗn hợp. Ví dụ: U lympho ác tính tế bào lớn, tế bào nhỏ. Các loại ung thƣ phổi thể hỗn hợp, ung thƣ liên kết hỗn hợp. 2.2. Các đặc tính tế bào ung thƣ - Hình thái học: tăng kích thƣớc nhân, tăng tỷ lệ nhân so với bào tƣơng, không còn ức chế tiếp xúc. - Chức năng: + Hai đặc tính tại cho: xâm lấn lan rộng, tế bào thoát mạch di chuyển và đi căn do hiện tƣợng phân bào mạnh. + Tế bào biệt hóa thấp, không làm đƣợc chức năng bình thƣờng, nếu bị thiếu dƣỡng chất dễ bị hoại tử nhất là vùng trung tâm u. + Đôi khi tiết ra những hoạt chất lạ mà qua đó ta có thể gián tiếp thấy đƣợc sự hiện diện của tế bào ung thƣ khá đặc hiệu: αFP: trong ung thƣ gan CA125: trong ung thƣ buồng trứng CA25: trong ung thƣ vú CEA: trong ung thƣ đại trực tràng 8 HCG: trong ung thƣ nhau, ung thƣ tinh hoàn β2Microglobulin, Belcezol: trong đa u tủy xƣơng. 3. Sơ lƣợc về cơ sở sinh học phân tử của ung thƣ 3.1. Phần quy định sinh sản tế bào là DNA của nhân tế bào Trong ung thƣ việc thay đổi DNA dẫn đến sinh sản vô tổ chức là hậu quả của quá trình đột biến gen, chứng cớ mạnh mẽ nhất là: - Những chất gây đột biến gen tế bào chính là những tác động hoá lý gây ung thƣ. - Những tác động gây ung thƣ cũng gây nên đột biến gen. 3.2.Các gen gây ung thƣ (Oncogen) Cho đến nay đã tìm ra trên 40 loại. Có 3 giả thuyết cho việc hình thành Oncogen. - Oncogen là những gen để phát triển tế bào, hoạt hóa nhờ yếu tố tăng trƣởng (growth factor). Do rối loạn cơ chế điều hành, yếu tố tăng trƣởng hoạt hóa mạnh kích thích Oncogen sinh ung thƣ. - Oncogen là những đoạn DNA bị thƣơng tổn bởi các tác nhân gây bệnh nhƣ hóa học, sinh học, vật lý. Cơ thể đã sửa chữa những đoạn DNA này nhƣng không hoàn chỉnh, nên cùng tác nhân gây ung thƣ, có ngƣời bị ung thƣ có ngƣời không bị ung thƣ. - Oncogen là do các genome của virus đƣa vào cơ thể vì thấy các Oncogen này giống với DNA của virus ví dụ: HPV (cổ tử cung, dƣơng vật), EBV (Burkitt) và HBV (ung thƣ gan). Một số gen gây ung thƣ Gen Vị trí Sai lạc Loại ung thƣ Apc 5q Hội chứng Gadner, ung thƣ trực tràng Mcc 5q Khuyết đoạn Đa polip trực tràng Raa 1p Ung thƣ đại tràng, hội chứng lynch P53 Ung thƣ đại tràng Abl 9q +(6; 14) Bạch cầu cấp lympho, ung thƣ buồng trứng Myl 6q +(8; 14) U lympho Burkitt, ung thƣ nguyên bào thần kinh, Myc 8q bạch cầu cấp. 9 Ras 11p Khuyết đoạn U Wilm, carcinoma Fms 5q Nhiều loại ung thƣ p: Nhánh ngắn nhiễm sắc thể q: Nhánh dài nhiễm sắc thể +: Nối đoạn [1] III. ĐẠI CƢƠNG VỀ THUỐC CHỮA UNG THƢ 1. Cơ chế tác động của thuốc chữa ung thƣ Các thuốc chữa ung thƣ có tác động đến các giai đoạn khác nhau trong quá trình tổng hợp acid nucleic (đặc biệt là DNA) cũng nhƣ quá trình tổng hợp protein ở các tế bào ung thƣ vào các thời kỳ khác nhau của chu trình phân chia tế bào. Ở các mô ung thƣ của ngƣời có khoảng 50% tế bào ở giai đoạn nghỉ không phân chia (G0). Sự phân chia của tế bào có thể phân thành 4 giai đoạn: - Giai đoạn G1 là thời kỳ sau gián phân. Thời gian của giai đoạn này rất khác nhau tùy theo loại tế bào. Trong thời kỳ này tế bào sinh ra các protein cần cho tổng hợp DNA. - Giai đoạn s là giai đoạn tổng hợp DNA. - Giai đoạn G2 là giai đoạn tiền gián phân. Trong thời kỳ này xảy ra tổng hợp RNA và các protein đặc hiệu của ung thƣ. - Giai đoạn M là thời kỳ gián phân (thời kỳ phân chia tế bào). Giai đoạn này lại chia thành prophase, metaphase, anaphase và telophase. Các thuốc chữa ung thƣ không ảnh hƣởng đến giai đoạn nghỉ, mà chỉ tác động lên các giai đoạn s, Gọ và M, thậm chí có thuốc chỉ tác động lên một kỳ nào đó của giai đoạn M mà thôi. 2. Sự kháng thuốc của tế bào ung thƣ Các tế bào ung thƣ có thể kháng lại các thuốc chữa ung thƣ cũng nhƣ vi khuẩn kháng kháng sinh. Cơ chế tế bào ung thƣ kháng thuốc có thể là: - Làm giảm khả năng xâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thƣ. - Làm giảm hoạt tính của thuốc do làm thay đổi các phân tử thuốc. - Làm biến đổi các protein mục tiêu và các yếu tố cần cho thuốc tác động lên tế bào ung thƣ. 10 - Làm tăng khả năng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo phân chia tế bào mặc dù bị thuốc tác động. Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu do một loại thuốc nhất định, nhƣng cũng nhƣ kháng kháng sinh, các tế bào ung thƣ cũng có hiện tƣợng kháng chéo thuốc. Ví dụ: một dòng tế bào ung thƣ đã kháng alcaloid của dừa cạn, cũng kháng cả anthracyclin. Hiện tƣợng này gọi là kháng đa thuốc (multidrug resistance) 3. Độc tính của các thuốc chữa ung thƣ Các thuốc chữa ung thƣ có tác dụng độc, ngăn cản sự phân chia các tế bào ung; thƣ, nhƣng đồng thời cũng gây độc cả tế bào lành, do đó chúng thƣờng khá độc. Tác dụng của thuốc chữa ung thƣ không đặc hiệu nhƣ các hóa trị liệu kháng khuẩn. Vì vậy trong điều trị ung thƣ bằng hóa trị liệu thƣờng có nhiều tác dụng phụ có hại nhiều khi khá nặng, đặc biệt là tác hại lên tủy xƣơng, trên các tế bào sinh sản, trên các niêm mạc, da, sự phát triển của tóc, bào thai, trên khả năng sinh miễn dịch. Một trong những cách hiện đại làm tăng tính đặc hiệu của thuốc chữa ung thƣ là gắn chúng lên các kháng thể đơn dòng. Các biểu hiện độc thƣờng là: - Rối loạn tiêu hoá, buồn nôn và nôn mửa - Rụng tóc - Trên tủy xƣơng: làm yếu chức năng tủy, hạn chế tạo huyết cầu. - Ảnh hƣởng xấu đến buồng trứng và tinh hoàn, dẫn đến vô sinh. - Làm chậm tăng trƣởng và phát triển ở trẻ em. - Gây ung thƣ thứ phát do dùng thuốc. - Gây tổn thƣơng mạch máu và đau khi truyền thuốc tĩnh mạch hay sau khi điều trị một thời gian. - Rối loạn tính cách, hành vi. - Sút cân, ngƣời yếu, không còn khả năng làm việc. - Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm. Vì vậy ngƣời đã dùng thuốc chữa ung thƣ thì không nên có con nữa. [2] 11 IV. ĐẠI CƢƠNG VỀ NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT 1. Đặc điểm của tế bào động vật 1.1. Tính cơ học yếu Tế bào động vật không vách nhƣng kích thƣớc tế bào khá lớn (khoảng 10 μm) nên tính bền cơ học yếu. Do đó khi nuôi cấy, tế bào động vật rất dễ vỡ do các lực tác động khi khuấy trộn để tách tế bào, thao tác v.v... Trong trƣờng hợp việc nuôi cấy tế bào động vật cần khuấy hay quay thì tốc độ không đƣợc quá 100rpm (vòng/phút). Thời gian tiến hành các thao tác với tế bào động; vật cũng cố gắng sao cho ngắn nhất, thời gian càng kéo dài, tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ. Trong bảo quản, di chuyển các mẫu tế bào cũng cố gắng thật nhẹ nhàng. 1.2. Tăng trƣởng và phân chia chậm Thời gian tăng gấp đôi số lƣợng của tế bào động vật trong điều kiện sinh lý là 20-40 giờ. Hiệu suất sản sinh các chất có hoạt tính sinh học của tế bào động vật rất thấp và chậm. Do đó cần có thời gian dài và khối lƣợng tế bào lớn khi chúng ta muốn sản xuất chất có hoạt tính từ tế bào động vật. 1.3. Cơ chế kìm hãm ngƣợc (negative feed-back) Cơ chế ức chế sự tổng hợp và tiết ra ngoài môi trƣờng của một chất bởi sự gia tăng nồng độ chất này trong môi trƣờng. Do đó, việc thay mới môi trƣờng sau một thời gian nuôi cấy nhất định là rất cần thiết, nhằm tránh sự hoạt động của cơ chế kìm hãm ngƣợc này. Trong phòng thí nghiệm, cơ chế ức chế ngƣợc còn có thể gây tổn thƣơng tế bào, thậm chí làm chết hàng loạt. 1.4. Tính chất cần giá đỡ Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Thông thƣờng tế bào tăng trƣởng tốt khi sắn vào bề mặt rắn. Tế bào sẽ ngừng phân chia khi đã hình thành lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số dòng tế bào nhƣ tế bào ung thƣ hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thƣờng, sau khi đƣợc thuần hóa, có thể sinh trƣởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần bám vào nền. 1.5. Thay đổi kiểu gen và kiểu hình Các tế bào động vật có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dung hợp 2 tế bào có nhân khác nhau tạo thành tế bào lai (hybridoma). Hoặc quá 12 trình biến nạp, ví dụ: chủng tế bào bình thƣờng có thể đƣợc cảm ứng thành tế bào có các tính chất của tế bào ung thƣ thông qua quá trình biến nạp đƣợc thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thƣ hoặc bằng hóa chất. 1.6. Có thể đƣợc bảo quản lâu dài bằng phƣơng pháp lạnh sâu Các dòng tế bào động vật có thể đƣợc bảo quản lạnh sâu -70°C trong một thời gian vô định. Khi đƣợc giải đông và hoạt hóa, tế bào phục hồi lại khả năng tăng trƣởng và phân chia nhƣ ban đầu. 1.7.Các đặc tính khác Ngoài các đặc tính trên, tế bào động vật còn có các đặc điểm khác nhƣ kém thích nghi với môi trƣờng, nhạy cảm với ion kim loại và đa số tế bào động vật cần huyết thanh, hormon... để tăng trƣởng và phân chia. 2. Môi trƣờng nuôi cây tế bào động vật Thành phần môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi trƣờng nuôi cây vi sinh vật và tế bào thực vật. Trong các công trình đầu tiên về nuôi cây tế bào động vật ngƣời ta dùng hỗn hợp dung dịch muôi sinh lý, huyết thanh và chiết phẩm phôi gà làm môi trƣờng nuôi cấy. Do thành phần huyết thanh và chiết phẩm phôi gà rất rất phức tạp, khó ổn định nên ngƣời ta dần dần quan tâm đến việc nghiên cứu chế tạo các môi trƣờng tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh thành phần môi trƣờng và ổn định môi trƣờng trong những lần nuôi cấy khác nhau. Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập đƣợc thuần hóa với môi trƣờng tổng hợp hoàn toàn, đa số các dòng tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng tổng hợp có bổ sung 5 - 10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh). Thông thƣờng huyết thanh bê đƣợc sử dụng phổ biến hơn cả, nhƣng có một số loại tế bào cần phải sử dụng huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum: FBS). Một vài loại môi trƣờng thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy tế bào và mô động vật: - Môi trường EM (Basal Medium): đây là môi trƣờng cơ bản do H. Eagle thiết lập, khi dùng phải bổ sung; 5-10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và số lƣợng tùy loại tế bào. Thƣờng sử dụng nuôi cây tế bào Hela, tế bào L. - Môi trường E'MEM (Eagle Minimum Essential Medium): còn gọi là môi trƣờng tối thiểu, do H.Eagle thiết lập. Đây là môi trƣờng BM có chứa nồng độ cao 13 hơn các amino acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5-10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào. - Môi trường D'MEM (Dulbecco - Modified Eagle Medium) là môi trƣờng E'MEM do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin cao gấp 4 lần so với môi trƣờng khác để nuôi đƣợc nhiều loại tế bào hơn. - Môi trường F10, F12: do R.G, Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong môi trƣờng này huyết thanh thƣờng đƣợc thay bằng 20μg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.10- 7 M acid linoleic. - Môi trường Iscove: do N.N.Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục cải biến môi trƣờng DMEM. - Môi trường SA: do T.A. Mc.Coy thiết lập, thƣờng đƣợc dùng cho tế bào bệnh bạch huyết. - Môi trường RPMI-1640: đƣợc G.E. Moore thiết lập tại viện nghiên cứu Roswell Part Memorial Institute, đƣợc dùng để nuôi tế bào và mô bạch huyết. - Môi trường 199: do R,C.Parker thiết lập dùng để nuôi tế bào mô cơ phôi gà trong sản xuất vaccin phòng bệnh bại liệt. Trong hầu hết các loại môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh vì nó có những vai trò quan trọng nhƣ sau: - Cung cấp chất dinh dƣỡng quan trọng cho tế bào nhƣ các amino acid thiết yếu, tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lƣợng... - Cung cấp các nhân tố tăng trƣởng, kích thích cho tế bào tăng trƣởng và phân chia. - Kích thích sự phục hồi các tổn thƣơng của tế bào khi cấy chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây tổn thƣơng tế bào. - Cải thiện tính tan của các chất dinh dƣỡng. - Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi nhờ các yếu tố làm tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ. - Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính của oxy. 14 Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của môi trƣờng nuôi cấy). Ngoài ra huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasm và khó ổn định chất lƣợng của những lô môi trƣờng khác nhau cũng nhƣ còn chứa những thành phần gây ức chế sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp không chứa yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy). Vì các lý do đó mà nhiều nhà nghiên cứu đã xây dựng môi trƣờng nuôi cấy tế bào động vật không dùng huyết thanh hay dùng với lƣợng thấp. Có 2 phƣơng pháp điều chế môi trƣờng không có huyết thanh là phƣơng pháp của G. Sato và phƣơng pháp của R.G. Ham. Cả 2 phƣơng pháp này đều thay huyết thanh bằng những yếu tố khác nhƣ: kích thích tố, nhân tố tăng trƣởng, protein vận chuyển, nhân tố kết dính và kéo dài, các chất dinh dƣỡng, khoáng ... [3] 15 PHẦN III: VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP I. VẬT LIỆU 1. Gossypol Gossypol là một sắc tố vàng loại poliphenol trích từ hột của cây bông Gossypium hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C. Hàm lƣợng gossypol trong hạt bông biến đổi từ 0.1 - 6.64% tùy theo giống. Trong kỹ nghệ cây bông, gossypol đƣợc xem nhƣ là phế phẩm có độc tính và thƣờng đƣợc khử từ đầu; hột sau khi loại dầu và khử gossypol thƣờng dùng làm thức ăn gia súc. Nhƣng hiện nay, sossypol có tầm quan trọng đặc biệt. Vào năm 1950, một bác sĩ Trung Hoa đã phát hiện có sự gia tăng bất thƣờng các cặp vợ chồng không có con trong vùng dùng nhiều dầu bông còn chứa gossypol. Những thí nghiệm trên động vật và sau đó trên con ngƣời cho thấy gossypol có tính diệt tinh trùng. Về cấu trúc hóa học gossypol gồm 2 đơn vị naptalen đối xứng mang 3 nhóm chức phenol và 1 chức aldehid. Công thức nguyên C30H30O8, trọng lƣợng phân tử là 518.54, có nhiệt độ nóng chảy là 1820 C. Tác dụng sinh học của gossypol: Năm 1950, ngƣời ta phát hiện tác dụng lên tinh trùng của gossypol. Nhiều thử nghiệm trên động vật sau đó cho thấy gossypol gây nên: - Sự giảm bớt tính di động và số lƣợng của tinh trùng cùng với sự xuất hiện nhiều tinh trùng dị dạng. - Giảm thiểu sự sinh sản. - Làm ngƣng trệ testosteron (kích khích tố nam). 16 Năm 1970, những thử nghiệm lâm sàng đã đƣợc thực hiện trên con ngƣời tại Trung Quốc cũng cho thây kết quả tƣơng tự. Tuy nhiên, sau khi ngƣng dùng thuốc 3 tháng thì tinh dịch của ngƣời trở lại bình thƣờng về mặt định tính và định lƣợng. Ngoài ra gossypol còn có nhiều tác dụng khác nhƣ : - Gây co rút ở các loài gặm nhấm. - Kháng khuẩn. - Tác dụng gây độc cho cơ thể: LD50 heo: 550 mg/Kg, LD50 chuột: 2200 mg/Kg. Hiện tƣợng ngộ độc gossypol là sự uễ oãi, nôn mửa, tiêu chảy và khó thở dẫn đến chết vì ngạt thở. [5] Gossypol đƣợc thử nghiệm trên bệnh nhân bị ung thƣ thận (adrenocortical cancer) di căn, kết quả là có 15% trƣờng hợp có đáp ứng. Nghiên cứu tác động của gossypol lên tế bào ung thƣ vú của ngƣời nuôi cấy cho thấy gossypol có thể ức chế sự phân bào và thay đổi sự biểu hiện của nhiều protein điều hòa chu trình tế bào (cell cycle). Một thử nghiệm trên bệnh nhân hóa trị liệu chống ung thƣ vú di căn cho thấy gossypol, ở liều lƣợng phù hợp, có tác động lên những protein điều hòa chu trình tế bào và tác dụng có lợi lên một số bệnh nhân. [13] 2. Plumbagin Plumbagin là tinh thể màu vàng cam, hình kim, nhiệt độ nóng chảy 77 -78oC, đƣợc chiết xuất từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica, họ Plumbaginaceae. Công thức phân tử :C11H8O3 Trọng lƣợng phân tử : 188,18 Tính chất hóa học của plumbagin: - Không tan trong nƣớc. - Tan tốt trong CHCl3, C6H6, AcOH, (CH3)2CO... 17 - Cho màu đỏ máu với FeCl3 - Kết tủa xanh lục với Cu(AcO)2 trong alcol. Tác dụng sinh học của plumbagin: - Tại Ấn Độ và Châu Phi plumbagin đƣợc sử dụng để trị các bệnh đƣờng tiêu hóa, phong ghẻ. - Plumbagin có tác dụng diệt khuẩn, nấm. Plumbagin đƣợc sử dụng làm chất bảo quản đối với thức ăn và hoa quả. - Plumbagin có tác dụng mạnh với nhiều loài vi khuẩn Gram (+) , vi khuẩn Gram (-), nấm, vi khuẩn kháng acid. Ví dụ nhƣ: Staphylococcus aureus, Mycobacterium tubercuosis, Escherichia coli. [4] - Một số tài liệu cho thấy plumbagin có hoạt tính kháng ung thƣ. [11,12] 3. Các dòng tế bào ung thƣ 3.1. Dòng tế bào RD (Rhabdomyosarcoma) Ký hiệu: ATCC CCL 136 RD (từ Catalogue of American Type Culture Collection, ATCC). Dòng tế bào RD đƣợc thiết lập bởi R.M. McAllister từ khối u cơ ở vùng chậu của một bé gái 7 tuổi ngƣời Cap-ca (Caucasian) vào tháng 2 năm 1968. Các tế bào mọc thành những lớp đơn trong môi trƣờng lỏng và tạo thành cụm tế bào (coloni) trên môi trƣờng E'MEM Agar (Eagle'Minimum Essential Medium) bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (Fetal Bovine Serum). Tế bào nuôi cấy có 2 dạng, dạng tế bào gần giống tế bào mô ung thƣ ban đầu, và dạng tế bào trãi rộng có nhiều nhân. Tế bào có myoglobin và hoạt tính myosin- ATPase. Dòng tế bào RD là dòng tế bào ung thƣ cơ đầu tiên của ngƣời đƣợc xác định đặc tính và nghiên cứu chi tiết. 3.2. Dòng tế bào HEp2 (Epidermoid carcinoma) Ký hiệu: ATCC CCL HEp2 (từ Catalogue of American Type Culture Collection, ATCC). Dòng tế bào HEp2 đã đƣợc thiết lập bởi A.E. Moore, L. Sabachewsky, và H.W. Toolan vào năm 1952, từ những khối u tạo ra ở chuột vừa dứt sữa sau khi đựơc tiêm mô ung thu biểu bì thanh quản của 1 ngƣời đàn ông ngƣời Cap-ca (Caucasian) 56 tuổi. Việc phân lập in vitro đã đƣợc thực hiện ở nhiều phức hợp của nƣớc ối thai bò, dịch chiết phôi, huyết thanh ngƣời và ngựa, và dung dịch muối cân bằng, những 18 tế bào giống biểu mô này phát triển tốt trong nhiều dạng môi trƣờng nuôi cấy. Đây là một dòng tế bào khỏe mạnh có thể chống lại nhiệt độ, thiếu hụt dinh dƣỡng, và những thay đổi môi trƣờng mà không mất khả năng sống. II. PHƢƠNG PHÁP 1. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào: Tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng E'MEM (Eagle ' Minimum Essential Medium) có thành phần nhƣ sau: Bột E'MEM 4.72g L-Glutamine 200mM 5 ml NaHCO3 7.5% 7.5 ml HEPES 1M 10 ml Amphotericin B 0.1% 125 μl Penicillin 50.000 UI Streptomycin 50 mg Phenol đỏ 0.4% 1 ml Huyết thanh (Fetal bovine serum) 50 ml Nƣớc cất đủ 500 ml pH 7.2 Điều kiện nuôi cây: 37.5o C, 5% CO2. 2. Phƣơng pháp đếm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay): Sau một thời gian nuôi cây trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào đƣợc tách rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào các giếng của đĩa 24 giếng; mỗi giếng gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 100.000 tế bào) và 400μl môi trƣờng. Tế bào đƣợc ủ ở 37.5°C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc 19 plumbagin ở nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đôi với dòng tế bào HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C. Sau thời gian ủ, tách rời tế bào trong mỗi giếng bằng dung dịch trypsin/EDTA, hòa tế bào vào 500 μg/ml môi trƣờng và nhuộm bằng trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1 (dịch huyền phù tế bào: thuốc nhuộm), Số lƣợng tế bào sống (tế bào không bắt màu xanh) đƣợc xác định bằng buồng đếm hồng cầu. Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: Tỷ lệ ức chế (%) = Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm Mật độ tế bào đối chứng 100% [6] 3. Phƣơng pháp MTT (MTT assay): Phƣơng pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím bởi enzyme hô hấp ở ti thể của tế bào. Số lƣợng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật độ quang OD570 của dung dịch. Sau một thời gian nuôi cấy trong bình roux để đạt mật độ cần thiết, tế bào đƣợc tách rời bằng dung dịch trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng; mỗi giếng gồm 100μl dịch huyền phù tế bào (khoảng 10.000 tế bào). Tế bào đƣợc ủ ở 37.50 C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C. Sau thời gian ủ, môi trƣờng xử lý đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa 0.5 mg/ml MTT. Sau 4 giờ ở 37.50 C môi trƣờng chứa MTT đƣợc thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl (0.04M). Đo OD570 của các lô thí nghiêm và đối chứng. Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: [7,8,9,10] Tỷ lệ ức chế (%) = OD570đối chứng - OD570thí nghiệm OD570đối chứng 100% 20 4. Phƣơng pháp clonogenic (clonogenic assay): Phƣơng pháp clonogenic dùng để xác định tỷ lệ tế bào ung thƣ bị ức chế phân bào dƣới tác động của hoạt chất. 5000 tế bào RD, hoặc 500 tế bào HEp2, đƣợc cây vào mỗi giếng của đĩa 24 giếng. Tế bào đƣợc ủ ở 37.50 C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa gossypol ở nồng độ 0.1μg/ml - 20μg/ml với cả 2 dòng tế bào hoặc plumbagin ở nồng độ 0.1μg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0.1μg/ml -10μg/ml đối với dòng tế bào HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37.50 C. Sau thời gian ủ, số cụm (colony) tế bào hình thành trong mỗi giếng đƣợc đếm dƣới kính hiển vi. Khả năng ức chế phân bào của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: Tỷ lệ ức chế (%) = Số colony đối chứng - Số colony thí nghiệm Số colony đối chứng × 100% [9,10] 5. Phƣơng pháp xử lý thống kê Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm đƣợc xử lý thông kê bằng phần mềm MSTATC của Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ. 21 PHẦN IV: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN I. TÁC ĐỘNG CỦA GOSSYPOL LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 Bảng 1: Tác động của gossypol lên dòng tế bào RD Nồng độ (μg/ml) Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 18.72 ± 12.18 C 4.56 ±10.52 C 21.98 ± 23.1 B 1 28.68 ± 23.76 C 3.52 ±5.06 C 24.78 ±23.67 B 5 72.89 ± 11.98 B 71.47 ± 16.86 B 95.72 ± 1.93 A 10 86.56 ± 10.51 AB 78.68 ± 19.17 B 100 ± 0.0 A 20 99.77 +0.68 A 97.20 ± 2.7 A 100 ±0.0 A LSD ∞=0.01 17.73 13.74 18.89 Biểu đồ 1: Tác dộng của gossypol lên RD T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ gossypol (ug/ml) Kết quả ở bảng 1 và biểu đồ 1 cho thấy gossypol có tác động lên sự phát triển của tế bào RD. Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào RD (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ 10-5μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic gần nhƣ 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả 22 các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD thấp hơn 100% (khoảng 70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 5-10 μg/ml. Ở nồng độ thấp hơn 5μg/ml (1, 0.1μg/ml), gossypol cũng làm giảm số tế bào RD có khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic Bảng 2: Tác động của gossypol lên hai dòng tế bào HEp2 là khoảng trên 20%. Nồng độ (μg/ml) Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 0.00 ± 18.51 D 0.00 ±4.88 C 10.85 ± 16.48 B 1 16.83 ± 11.41 C 0.00 ±6.81 C 21.23 ±26.00 5 63.30 ± 23.83 B 72.14 ± 13.48 B 84.65 ±11.5 A 10 88.90 ± 5.35 A 72.14 ± 10.02 B 100 ±0.0 A 20 98.70 ±3.11 A 89.10 ±8.62 A 100 ±0.0 A LSD ∞=0.01 18.65 10.06 18.73 Biểu đồ 2: Tác động của gosypol lên HEp2 T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ gossypol (ug/ml) 23 Bảng 2 và biểu đồ 2 cho thấy tác động của gossypol lên tế bào HEp2. Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ 10 μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào HEp2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 10 μg/ml. Ở nồng độ 5μg/ml, gossypol cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 80 - 20%. Ở nồng độ 0.1μg/ml, gossypol không có tác động đáng kể lên tế bào HEp2. II. TÁC ĐỘNG CỦA PLUMBAGIN LÊN TẾ BÀO RD VÀ HEp2 Bảng 3: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào RD Nồng độ (μg/ml) Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 57.96 ± 12.06 C 17.69 ± 21.27 C 71.19 ± 8.41 B 0.5 92.07 ±1.57 B 71.46 ± 10.12 B 100 ±0.0 A 1 99.73 ±0.82 A 90.75 ±3.3 B 100 ±0.0 A 1.5 98.56 ±3.23 AB 91.45 ± 2.11 A 100 ±0.0 A 2 100 ±0.0 A 95.26 ±3.03 A 100 ±0.0 A LSD α=0.01 7.197 11.73 4.789 24 Biểu đồ 3: Tác động của plumbagin lên RD T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ plumbagin (ug/ml) Bảng 3 và biểu đồ 3 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào RD. Ở nồng độ từ 1 μg/ml trở lên, plumbagin giết chết gần nhƣ hoàn toàn tế bào RD (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ 0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này, Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 80-90%), nhƣ vậy chứng tỏ một phần tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ plumbagin 0.5 μg/ml. Ở nồng độ 0.1μg/ml, plumbagin vẫn có khả năng ức chế mạnh sự phân chia của tế bào RD, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là hơn 70%. 25 Bảng 4: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào HEp 2 Nồng độ (μg/ml) Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 14.29 ± 14.14 C 4.36 ±14.55 D 49.16 ±7.67 B 0.5 23.59 ± 13.42 C 17.81 ± 19.49 C 99.91 ±0.19 A 1 56.41 ±8.23 B 65.07 ±9.64 B 99.85 ±0.22 A 5 99.10 ±0.98 A 85.38 ±6.34 A 99.82 ±0.21 A 10 100 ±0.0 A 94.59 ±3.94 A 100 ±0.0 A LSD α=0.01 12.08 12.53 4.38 Biểu đồ 4: Tác động của plumbagin lên HEp2 T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ plumbagin (ug/ml) Bảng 4 và biểu đồ 4 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào HEp2. Ở nồng độ trên 5 μg/ml, plumbagin giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ trong khoảng 1-0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào HEp2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ 26 vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 20-60%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 1 - 0.5 μg/ml. Ở nồng độ 0. l μg/ml, plumbagin cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 50%. Nhƣ vậy: Ở cả hai hoạt chất, chúng tôi đều tìm thấy một nồng độ mà ở đó tác động ức chế phân bào rất mạnh. gần tƣơng; đƣơng với những nồng độ cao gấp 2, 3 lần nhƣng tính sây độc (không làm chết tế bào) lại thấp hơn. Nồng độ đó là 5 μg/ml đối với gossypol và 0.5 μg/ml đối với plumbagin trên cả hai dòng tế bào thử nghiệm. Điều này thể hiện rõ nhất trên tế bào dòng HEp2 khi xử lý với plumbagin (biểu đồ 4). Các kết quả thu nhận từ cả ba phƣơng pháp thử nghiệm đều phù hợp với nhau. Phƣơng pháp nhuộm với trypan blue và MTT cho phép đánh giá tỉ lệ sống của tế bào sau khi xử lý với hoạt chất còn khả năng phân bào thì đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp clonogenic. Việc sử dụng phối hợp cả ba phƣơng pháp cho phép khẳng định kết quả, đồng thời đánh giá một cách tƣơng đối toàn diện tác động của hoạt chất lên dòng tế bào ung thƣ. 27 PHẦN V: KẾT LUẬN 1. Gossypol và plumbagin đều có tác động lên sự phát triển của 2 dòng tế bào ung thƣ RD và HEp2 ở điều kiện khảo sát. Tùy theo nồng độ tác động, gossypol và plumbagin có thể giết chết hoàn toàn, ức chế phân bào hoàn toàn hay ức chế phân bào một phần tế bào ung thƣ. 2. Plumbagin có tính kháng phân bào mạnh hơn gossypol trên 2 dòng tế bào khảo sát. Nồng độ plumbagin giết chết 100% tế bào RD là 2 μg/ml, HEp2 là 5 μg/ml trong khi với gossypol nồng độ phải là 20 μg/ml. 3. Tế bào HEp2 ít nhạy cảm với hoạt chất hơn so với tế bào RD. Điều này cũng phù hợp với đặc tính của tế bào HEp2 (phần HI, mục I) 4. Ba phƣơng pháp thử nghiệm sử dụng trong bài này cho phép đánh giá chính xác các mức độ tác động của hoạt chất lên sự phát triển của tế bào. Chúng tôi chân thành cảm ơn: 1. Phòng thí nghiệm Virus đƣờng ruột - Viện Pasteur TP.HCM đã cung cấp 2 dòng tế bào ung thƣ và hổ trợ chúng tôi về kỹ thuật nuôi cây tế bào. 2. Tiến sỹ Nguyễn Kim Phi Phụng và cộng sự - Khoa Hóa học - ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM đã cung cấp cho chúng tôi các hoạt chất sử dụng trong đề tài. 28 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Bá Đức, Bộ môn Ung thƣ - Đại học Y Hà Nội. Bài giảng Ung thƣ học. Nhà xuất bản Y học, 2001. 2. Đỗ Trung Đàm. Thuốc chữa ung thƣ. Nhà xuất bản Y học, 1995. 3. Phan Kim Ngọc, Nguyễn Đăng Quân, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Nguyễn Kim Thiên Nga, Đỗ Minh Sĩ, Trần Nguyễn Bích Châu. Giáo trình thực tập Công nghệ Sinh học Động vật cơ sở. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên. 4. Võ Hƣng Sơn. 1995. Cô lập plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica Linn, họ Plumbaginaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên TP.HCM. 5. Trần Đệ Thăng. 1995. Khảo sát chất gossypol cô lập từ hột cây bông Gossypium hirsutum, họ Malvaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên TP.HCM. 6. World Health Organization. 1997. Manual for the virological investigation of polio, Global programme for vaccines and immunization. 35-37. 7. Xin Lin, Wen Kui Li, Pei gen Xiao. 1999. Effects of Icariside II from Epimedium koreanum on tumour cell lines in vitro. - Pharm. Pharmacol. Commun. 5:701-703. 8. K.V.Anis, G.Kuttan, R.Kuttan .1999. Role of Berberine as an adjuvant response modifier during tumour therapy in mice. Pharm. Pharmacol. Commun. 5:697 - 700. 9. Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi Ho Lee, Chang Han Kim. 2000. Induction of apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL 60 and U 937 by Diethylhexylphthalate isolated from Aloe vera Linne. J. Pharm.Pharmacol. 52: 1037- 1041. 10. Ana. M. Pintao, M. Salome S. Pais, Helen Coley, Lloyd R. Kelland, Ian R. Judson. 1995. In vitro and in vivo antitumor activity of Benzyl Isothiocyanate: A natural product from Tropaeolum majus. Planta Med. 61: 233-236. 11. Uma Devi, F.E. Solomon, A.C. Sharada. 1999. Plumbagin, a plant naphthoquinon with antitumor and radiomodifying properties. Pharmaceutical biology. 3:231-236. 29 12. V. Elangovan, Nalini Ramamoorthy, S. Balasubramanian, N. Sekar, S. Govindasamy - Studies on the antiproliferative effect of some naturally occurring bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma - 180 cell lines. - Indian Journal of Pharmacology 1994; 26: 266-269. 13. Clinical pharmacology and pharmacology of gossypol. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001 ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI T.S Dƣơng Thị Bạch Tuyết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC SƢ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH. KHOA SINH HỌC BÁO CÁO TÓM TẮT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ NĂM 2000-2001 ĐỀ TÀI: KHẢO SÁT HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO IN VITRO CỦA GOSSYPOL VÀ PLUMBAGIN MÃ SỐ: CS 2000-15 Nhóm thực hiện: Dƣơng Thị Bạch Tuyết(1) Nguyễn Đăng Quân (2) Phan Kim Ngọc(2) Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng(2) (1) Khoa Sinh học - Đại học Sƣ Phạm Tp. Hồ Chí Minh (2) Khoa Sinh học - Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. Hồ Chí Minh Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 11 năm 2002 1 Ung thƣ là một trong những bệnh phổ biến và có tỷ lệ gây tử vong cao nên việc nghiên cứu các phƣơng pháp điều trị bệnh ung thƣ đang rất đƣợc chú trọng trên thế giới. Một trong những hƣớng nghiên cứu đƣợc nhiều nhà khoa học quan tâm hiện nay là những hoạt chất thiên nhiên, đặc biệt là từ thực vật, có hoạt tính kháng ung thƣ. Việt Nam là một nƣớc nhiệt đới với nguồn tài nguyên cây thuốc phong phú, trong đó có nhiều cây thuốc chứa các hoạt chất kháng ung thƣ mạnh có thể ứng dụng vào điều trị. Vì vậy, việc phát triển những phƣơng pháp thử nghiệm nhằm xác định hoạt chất kháng ung thƣ là cần thiết. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành xây dựng các phƣơng pháp khảo sát hoạt tính kháng phân bào của 2 hoạt chất gossypol và plumbagin có nguồn gốc từ cây thuốc dân gian đƣợc biết là có khả năng kháng ung thƣ [11,13] trên hai dòng tế bào ung thƣ của ngƣời trong điều kiện in vitro. I. VẬT LIỆU - PHƢƠNG PHÁP: 1. Hoạt chất: a. Gossypol: Gossypol là một sắc tố vàng loại polyphenol có độc tính, đƣợc chiết xuất từ hạt cây bông Gossypium hirsutum, họ Malvaceae, có nhiệt độ nóng chảy là 182°C. [5] Công thức hóa học: b. Plumbagin: Plumbagin là tinh thể màu vàng cam, hình kim, nhiệt độ nóng chảy 77 - 78°C, đƣợc chiết xuất từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica, họ Plumbaginaceae.[4] Công thức hóa học: Gossypol và plumbagin sử dụng trong nghiên cứu này đƣợc TS. Nguyễn Kim Phi Phụng và cộng sự, bộ môn Hoá hữu cơ, khoa Hóa, ĐH.Khoa học Tự nhiên TP.HCM cung cấp. 2. Các dòng tế bào và điều kiện nuôi cấy: Chúng tôi sử dụng hai dòng tế bào ung thƣ ở ngƣời: dòng tế bào ung thƣ cơ RD (Rhabdomyosarcoma) và dòng tế bào ung thƣ biểu bì HEp2 (Epidermoid carcinoma). Hai dòng tế bào này đƣợc cung cấp bởi Viện Pasteur TP.HCM. 2 Tế bào đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng EMEM có chứa glutamine, penicillin, streptomycine, HEPES, NaHCO3, phenol red, pH 7.2, bổ sung 10% huyết thanh phôi bò (FBS: Foetal Bovine Serum). Ủ ở 37,50 C 3. Phƣơng pháp nhuộm tế bào với trypan blue (Trypan blue exclusion assay) Sau một thời gian nuôi cấy, tế bào đƣợc tách bằng trypsin/EDTA và đƣợc cấy vào plate 24 giếng; mỗi giếng gồm 100μl dịch huyền phù tế bào và 400μl môi trƣờng. Tế bào đƣợc ủ ở 37,50C trong 24 giờ. Sau đó môi trƣờng cũ đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa gossypol với nồng độ 0,lμg/ml - 20μg/ml hoặc plumbagin với nồng độ 0,lμg/ml - 2μg/ml đối với dòng tế bào RD và 0,1μg/ml - 10μg/ml đối với dòng tế bào HEp2. Lô đối chứng đƣợc xử lý với môi trƣờng chứa dung môi hòa tan hoạt chất là DMSO. Các lô đƣợc ủ 72 giờ ở 37,50C. Tế bào đƣợc tách bằng trypsin/EDTA, đƣợc hòa vào 500 μl môi trƣờng và nhuộm bằng trypan blue 0,4% theo tỷ lệ 1:1. Số lƣợng tế bào sống (tế bào không bắt màu) đƣợc xác định bằng buồng đếm hồng cầu. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần. Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: Tỷ lệ ức chế (%) = Mật độ tế bào đối chứng - Mật độ tế bào thí nghiệm Mật độ tế bào đối chứng 100 % [6] 4. Phƣơng pháp MTT (MTT assay): Phƣơng pháp MTT dựa trên sự chuyển chất MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) thành MTT-formazan có màu xanh tím bởi enzyme hô hấp ở ti thể của tế bào. Số lƣợng tế bào sống tỉ lệ thuận với nồng độ formazan, thể hiện qua giá trị mật độ quang (OD570 ) của dung dịch. Tế bào đƣợc cấy vào plate 96 giếng. Các lô thí nghiệm và đối chứng đƣợc xử lý với hoạt chất tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp trên. Sau 72 giờ ở 37,50C, môi trƣờng xử lý đƣợc thay bằng môi trƣờng chứa 0,5 mg/ml MTT. Sau 4 giờ ở 37,50C môi trƣờng chứa MTT đƣợc thay bằng hỗn hợp isopropanol-HCl (0,04M). Đo OD570 của các lô thí nghiệm và đối chứng. Mỗi thí nghiệm đƣợc lặp lại ba lần. Khả năng ức chế sự phát triển các dòng tế bào ung thƣ của hoạt chất đƣợc tính theo công thức: Tỷ lệ ức chế (%) = OD570đối chứng - OD570thí nghiệm OD570đối chứng 100 % [7,8,9,10] 3 5. Phƣơng pháp clonogenic (clonegenic assay): Phƣơng pháp clonogenic dùng để xác định tỷ lệ tế bào ung thƣ bị ức chế phân bào dƣới tác động của hoạt chất. 5000 tế bào RD, hoặc 500 tế bào HEp2, đƣợc cấy vào mỗi giếng của plate 24 giếng. Các lô thí nghiệm và đối chứng đƣợc xử lý với hoạt chất tƣơng tự nhƣ phƣơng pháp trên. Sau 72 giờ ủ ở 37,50C, số cụm (colony) tế bào hình thành trong mỗi giếng đƣợc đếm dƣới kính hiển vi. Khả năng ức chế phân bào của hoạt chất đƣợc tính theo công thức : Tỷ lệ ức chế (%) = Số colony đối chứng - Số colony thí nghiệm Số colony đối chứng 100 % [9,10] 6. Phƣơng pháp xử lý thống kê Số liệu thu đƣợc từ các thí nghiệm đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm MSTATC của Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ. 4 II. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 1. Tác động của gossypol lên tế bào RD và HEp2 Bảng 1: Tác động của gossypol lên dòng tế bào RD Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) (μg/ml) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 18.72 ± 12.18 C 4.56 ± 10.52 C 21.98 ±23.1 B 1 28.68 ± 23.76 C 3.52 ± 5.06 C 24.78 ± 23.67 B 5 72.89 ± 11.98 B 71.47 ± 16.86 B 95.72 ± 1.93 A 10 86.56 ± 10.51 AB 78.68 ± 19.17 B 100 ± 0.0 A 20 99.77 ±0.68 A 97.20 ± 2.7 A 100 ± 0.0 A LSD ∞=0.01 17.73 13.74 18.89 Biểu đồ 1: Tác dộng của gossypol lên RD T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ gossypol (ug/ml) Kết quả ở bảng 1 và biểu đồ 1 cho thấy gossypol có tác động lên sự phát triển của tế bào RD. Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào RD (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ 10-5 μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic gần nhƣ 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, 5 kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào RD thấp hơn 100% (khoảng 70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 5-10 μg/ml. Ở nồng độ thấp hơn 5μg/ml (1, 0.1μg/ml), gossypol cũng làm giảm số tế bào RD có khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng trên 20%. Bảng 2: Tác động của gossypol lên hai dòng tế bào HEp2 Nồng độ (μg/ml) Tỷ lệ ức chế phân bào (%) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 0.00 ± 18.51 D 0.00 ± 4.88 C 10.85 ± 16.48 B 1 16.83 ±11.41 C 0.00 ± 6.81 C 21.23 ±26.00 B 5 63.30 ±23.83 B 72.14+ 13.48 B 84.65 ±11.5 A 10 88.90 ± 5.35 A 72.14 ± 10.02 B 100 ± 0.0 A 20 98.70±3.11 A 89.10 + 8.62 A 100 ± 0.0 A LSD ∞ = 0.01 18.65 10.06 18.73 Biểu đồ 2: Tác động của gosypol lên HEp2 T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ gossypol (ug/ml) 6 Bảng 2 và biểu đồ 2 cho thấy tác động của gossypol lên tế bào HEp2. Ở nồng độ trên 20 μg/ml, gossypol giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ 10 μg/ml, gossypol ức chế khả năng phân bào của tế bào HEp2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ gossypol này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 70-80%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 10 μg/ml. Ở nồng độ 5-lμg/ml, gossypol cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 80 - 20%. Ở nồng độ 0.1μg/ml, gossypol không có tác động đáng kể lên tế bào HEp2. 2. Tác động của plumbagin lên tế bào RD và HEp2 Bảng 3: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào RD Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) (μg/ml) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 57.96 ± 12.06 C 17.69 ± 21.27 C 71.19 ±8.41 B 0.5 92.07 ±1.57 B 71.46 ± 10.12 B 100 ± 0.0 A 1 99.73 ±0.82 A 90.75 ± 3.3 B 100 ± 0.0 A 1.5 98.56±3.23 AB 91.45 ±2.11 A 100 ± 0.0 A 2 100 ± 0.0 A 95.26 ±3.03 A 100 ±0.0 A LSD α=0.01 7.197 11.73 4.789 7 Biểu đồ 3: Tác động của plumbagin lên RD T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ plumbagin (ug/ml) Bảng 3 và biểu đồ 3 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào RD. Ở nồng độ từ lμg/ml trở lên, plumbagin giết chết gần nhƣ hoàn toàn tế bào RD (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ 0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào RD thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 80-90%), nhƣ vậy chứng tỏ một phần tế bào RD vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ plumbagin 0.5 μg/ml. Ở nồng độ 0.1μg/ml, plumbagin vẫn có khả năng ức chế mạnh sự phân chia của tế bào RD, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là hơn 70%. 8 Bảng 4: Tác động của plumbagin lên dòng tế bào HEp 2 Nồng độ Tỷ lệ ức chế phân bào (%) (μg/ml) Trypan blue MTT Clonogenic 0.1 14.29 ± 14.14 C 4.36 ±14.55 D 49.16 ±7.67 B 0.5 23.59 ± 13.42 C 17.81 ± 19.49 C 99.91 ±0.19 A 1 56.41 ±8.23 B 65.07 ±9.64 B 99.85 ± 0.22 A 5 99.10 ±0.98 A 85.38 ±6.34 A 99.82 ±0.21 A 10 100 ±0.0 A 94.59 ±3.94 A 100 ± 0.0 A LSD α = 0.01 12.08 12.53 4.38 Biểu đồ 4: Tác động của plumbagin lên HEp2 T ỷ l ệ ứ c ch ế( % ) Nồng độ plumbagin (ug/ml) Bảng 4 và biểu đồ 4 cho thấy tác động của plumbagin lên sự phát triển của tế bào HEp2. Ở nồng độ trên 5 μg/ml, plumbagin giết chết hoàn toàn tế bào HEp2 (không còn tế bào sống trong giếng) thể hiện qua tỷ lệ ức chế gần nhƣ 100% ở cả 3 thử nghiệm trypan blue, MTT và clonogenic. Ở nồng độ trong khoảng 1-0.5 μg/ml, plumbagin ức chế khả năng phân bào của tế bào HEp2 thể hiện qua tỷ lệ ức chế đƣợc xác định bởi thử nghiệm clonogenic là 100%, hay gần nhƣ không có colony nào đƣợc hình thành trong giếng nuôi, nhƣ 9 vậy tất cả các tế bào đều không có khả năng phân chia ở nồng độ plumbagin này. Tuy nhiên, kết quả ở 2 thử nghiệm trypan blue và MTT lại cho thấy tỷ lệ ức chế tế bào HEp2 thấp hơn 100% (khoảng 20-60%), nhƣ vậy chứng tỏ các tế bào HEp2 vẫn còn sống đƣợc ở nồng độ gossypol 1 - 0.5 μg/ml. Ở nồng độ O.lμg/ml, plumbagin cũng làm giảm số tế bào HEp2 có khả năng phân chia, thể hiện qua tỷ lệ ức chế xác định bằng thử nghiệm clonogenic là khoảng 50%. Nhƣ vậy: Ở cả hai hoạt chất, chúng tôi đều tìm thấy một nồng độ mà ở đó tác động ức chế phân bào rất mạnh, gần tƣơng đƣơng với những nồng độ cao gấp 2, 3 lần nhƣng tính gây độc (không làm chết tế bào) lại thấp hơn. Nồng độ đó là 5 μg/ml đối với gossypol và 0.5 μg/ml đối với plumbagin trên cả hai dòng tế bào thử nghiệm. Điều này thể hiện rõ nhất trên tế bào dòng HEp2 khi xử lý với plumbagin (biểu đồ 4). Các kết quả thu nhận từ cả ba phƣơng pháp thử nghiệm đều phù hợp với nhau. Phƣơng pháp nhuộm với trypan blue và MTT cho phép đánh giá tỉ lệ sống của tế bào sau khi xử lý với hoạt chất, còn khả năng phân bào thì đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp clonogenic. Việc sử dụng phối hợp cả ba phƣơng pháp cho phép khẳng định kết quả, đồng thời đánh giá một cách tƣơng đối toàn diện tác động của hoạt chất lên dòng tế bào ung thƣ. III. KẾT LUẬN 1. Gossypol và plumbagin đều có tác động lên sự phát triển của 2 dòng tế bào ung thƣ RD và HEp2 ở điều kiện khảo sát. Tùy theo nồng độ tác động, gossypol và plumbagin có thể giết chết hoàn toàn, ức chế phân bào hoàn toàn hay ức chế phân bào một phần tế bào ung thƣ. 2. Plumbagin có tính kháng phân bào mạnh hơn gossypol trên 2 dòng tế bào khảo sát. Nồng độ plumbagin giết chết 100% tế bào RD là 2μg/ml, HEp2 là 5μg/ml trong khi với gossypol nồng độ phải là 20 μg/ml. 3. Tế bào HEp2 ít nhạy cảm với hoạt chất hơn so với tế bào RD. Điều này cũng phù hợp với đặc tính của tế bào HEp2 (phần III, mục I) 4. Ba phƣơng pháp thử nghiệm sử dụng trong bài này cho phép đánh giá chính xác các mức độ tác động của hoạt chất lên sự phát triển của tế bào. 10 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Nguyễn Bá Đức, Bộ môn Ung thƣ - Đại học Y Hà Nội. Bài giảng Ung thƣ học. Nhà xuất bản Y học, 2001. 2. Đỗ Trung Đàm. Thuốc chữa ung thƣ. Nhà xuất bản Y học, 1995. 3. Phan Kim Ngọc, Nguyễn Đăng Quân, Huỳnh Thị Lệ Duyên, Nguyễn Kim Thiên Nga, Đỗ Minh Sĩ, Trần Nguyễn Bích Châu. Giáo trình thực tập Công nghệ Sinh học Động vật cơ sở. Tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên. 4. Võ Hƣng Sơn. 1995. Cô lập plumbagin từ rễ cây bạch hoa xà Plumbago zeylanica Linn, họ Plumbaginaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên TP.HCM. 5. Trần Đệ Thăng. 1995. Khảo sát chất gossypol cô lập từ hột cây bông Gossypium hirsutum, họ Malvaceae. Luận văn tốt nghiệp Cử nhân Hoá học ĐH. Khoa học Tự nhiên TP.HCM. 6. World Health Organization. 1997. Manual for the virological investigation of polio, Global programme for vaccines and immunization. 35-37. 7. Xin Lin, Wen Kui Li, Pei gen Xiao. 1999. Effects of Icariside II from Epimedium koreanum on tumour cell lines in vitro. - Pharm. Pharmacol. Commun. 5:701-703. 8. K.V.Anis, G.Kuttan, R.Kuttan .1999. Role of Berberine as an adjuvant response modifier during tumour therapy in mice. Pharm. Pharmacol. Commun. 5:697 - 700. 9. Keyong Ho Lee, Hee Sun Hong, Chi Ho Lee, Chang Han Kim. 2000. Induction of apoptosis in human leukaemic cell lines K562, HL 60 and U 937 by Diethylhexylphthalate isolated from Aloe vera Linne. J. Pharm.Pharmacol. 52: 1037 - 1041. 10. Ana. M. Pintao, M. Salome S. Pais, Helen Coley, Lloyd R. Kelland, Ian R. Judson. 1995. In vitro and in vivo antitumor activity of Benzyl Isothiocyanate: A natural product from Tropaeolum majus. Planta Med. 61: 233-236. 11.Uma Devi, F.E. Solomon, A.C. Sharada. 1999. Plumbagin, a plantnaphthoquinon with antitumor and radiomodifying properties. Pharmaceutical biology. 3:231-236. 11 12. V. Elangovan, Nalini Ramamoorthy, S. Balasubramanian, N. Sekar, S. Govindasamy - Studies on the antiproliferative effect of some naturally occurring bioflavonoidal compounds against human carcinoma of larynx and sarcoma - 180 cell lines. - Indian Journal of Pharmacology 1994; 26: 266-269. 13. Clinical pharmacology and pharmacology of gossypol.