Đề tài Nghiên cứu sản xuất sản phẩm rau quả muối chua ở quy mô lớn

sẽ oxy hóa đường tạo thành axit saccaric: CH2OH(CHOH)4CHO + O COOH(CHOH)4COOH Phản ứng tổng là: 4K3Fe(CN)6 + 4 KOH + CH2OH(CHOH)4CHO 4 K4Fe(CN)6 COOH(CHOH)4COOH + H2O *Tiến hành : - Chuẩn bị dịch đường đem phân tích: Cân 50 gam mẫu đã nghiền nhỏ cho vào một bình định mức 250 ml, thêm nước cất tới 3/4 bình rồi đun cách thủy ở 70--80oC trong thời gian 30--45 phút, trong thời gian đun thỉnh thoảng lắc mạnh để chất hòa tan được hòa tan hoàn toàn. Sau đó làm nguội và thêm nước cất tới vạch định mức rồi đem lọc. Sau khi lọc xong lấy 100 ml dịch lọc cho vào bình định mức 250 ml, thêm vào 5--7 ml axit HCl đặc rồi thủy phân ở 75--80oC trong 5 phút. Thủy phân xong đem trung hòa axit dư bằng dung dịch NaOH 30%, rồi thêm nước cất tới vạch định mức ta được dịch đường. - Xác định đường: Lấy 20ml Ferixianua kali 1% và 5ml KOH 2,5N cho vào bình tam giác, nhỏ thêm vài giọt xanh metylen, lắc đều, đun sôi trong 1 - 2 phút. Sau đó dùng dung dịch đường để chuẩn tới khi màu xanh metylen chuyển sang vàng rơm. *Tính kết quả: D: Hàm lượng đường trong mẫu (g/l) V: Số ml dịch đường tiêu hao khi chuẩn hết 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% a: Lượng glucose tương ứng với 20 ml dung dịch Ferixianua kali 1% 4/ Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp trung hòa * Nguyên tắc: Cơ sở của phương pháp là dựa trên phản ứng trung hòa giữa axit và kiềm. Từ lượng kiềm tiêu hao, tính được lượng axit tổng số có trong mẫu. * Tiến hành -Cân 5 - 10g mẫu, nghiền nhỏ bằng cối sứ, thêm vào khoảng 50ml nước cất và đun cách thuỷ ở nhiệt độ 700C -80oơtrong 30-45 phút. Sau đó làm nguội tới nhiệt độ thường rồi định mức đến thể tích 100ml bằng nước cất rồi đem lọc. -Lấy 50 ml nước cất nóng cho vào một bình tam giác 250 ml, thêm vài giọt phenolphtalein rồi dùng NaOH 0,1N đến màu hồng nhạt.Sau đó cho vào bình tam giác 20 ml dịch lọc rồi dùng dung dịch NaOH 0,1 N chuẩn đến màu tương tự. a . k .V X = x 100 v . g *Tính kết quả: X: Lượng axit hữu cơ hoà tan trong mẫu (%) a: Lượng NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ (ml) k: Lượng axit tương ứng với 1ml NaOH 0,1N V: Thể tích mẫu pha loãng (ml) v: Lượng dung dịch lấy để chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 5/ Xác định hàm lượng Vitamin C Hàm lượng vitamin C được xác định bằng phương pháp chuẩn độ Iod 0,01N. Cân 5 - 10 g nguyên liệu cho vào cối sứ nghiền nhỏ, cho vào khoảng 50ml HCL 2% và để trong bóng tối 10 phút để lượng axit ascocbic có trong nguyên liệu được hoà tan hoàn toàn. Sau đó định mức đến 100ml bằng nước cất và đem lọc. a . 0,00088 . V. 100 X = x 1000 v . g Lấy 20 ml dịch lọc, thêm vào vài giọt tinh bột 0,5%, lắc nhẹ rồi chuẩn độ bằng I2 0,01N tới khi bắt đầu xuất hiện màu xanh lam. Tính kết quả: X: Lượng Vitamin C có trong nguyên liệu (mg%) a: Lượng dung dịch I2 0,01 N dùng để chuẩn độ (ml) V: Thể tích mẫu pha loãng (ml) 0,00088: Lượng Vitamin C tương đương với 1ml I2 0,01N v: Lượng dung dịch đem chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 6/ Xác định hàm lượng muối * Nguyên tắc: phương pháp dựa trên phản ứng sau: AgNO3 + NaCl = AgCl + NaNO3 Khi phản ứng kết thúc thì lượng AgNO3 dư sẽ phản ứng với kali cromat và cho kết tủa màu đỏ gạch. Nhờ đó ta nhận biết được điểm tương đương rõ nét hơn. 2AgNO3 + K2CrO4 = Ag2CrO4 + AgNO3 * Tiến hành: Cân 5 - 10g mẫu, nghiền kỹ bằng cối sứ, định mức lên 100ml bằng nước cất nóng, lắc đều và đem lọc. Lấy 10ml dịch lọc cho vào bình tam giác, thêm vài giọt kali cromat10% sau đó đem chuẩn độ bằng AgNO3 0,1N đến khi dung dịch có màu đỏ gạch. a . 0,00584 . V X = x 100 v . g *Tính kết quả: X: Hàm lượng muối ăn (%) A: Thể tích AgNO3 dùng chuẩn độ (ml) 0,00584: Lượng muối ăn ứng với 1ml AgNO3 0,1N V: Dung tích bình định mức (ml) v: Thể tích dung dịch đem chuẩn độ (ml) g: Khối lượng mẫu (g) 7/ Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí nhằm đánh giá chất lượng nguyên liệu về mặt vi sinh vật học. * Nguyên tắc: Nuôi cấy một lượng sản phẩm nhất định trên môi trường đặc trong hộp petri. Sau một thời gian nuôi cấy nhất định, mỗi tế bào sẽ phát triển thành một khuẩn lạc tương ứng. Từ số khuẩn lạc trong hộp thạch tính được số vi sinh vật hiếu khí có trong mẫu cần phân tích. * Tiến hành : Sử dụng một lượng rau cải đã nghiền nhỏ, pha loãng, sau đó dùng micropipet lấy 0,1 ml để nuôi cấy trên môi trường thạch dinh dưỡng đựng trong hộp petri ở nhiệt độ 30 ± 10C trong điều kiện hiếu khí, thời gian 24 - 72h. Đếm tất cả số khuẩn lạc mọc trên đó. *Môi trường nuôi cấy, g/l: Pepton 5 Thạch 15 Cao men 2,5 Nước 1000ml Glucoza 4 * Tổng số vi sinh vật hiếu khí được tính theo công thức sau: SC N = ( n1 + 0,1 n2) d SC : Tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa Số khuẩn lạc đếm được trong một đĩa phải nhân với hệ số 10 (quy cho 1 ml canh trường). n1 :Số đĩa đếm ở nồng độ pha loãng thứ nhất n2 : Số đĩa đếm được ở nồng độ pha loãng thứ hai d : Hệ số pha loãng của đĩa đếm thứ nhất 8/ Xác định tổng số nấm men nấm mốc Xác định tổng số nấm men, nấm mốc tiến hành như đối với xác định vi sinh vật tổng số chỉ khác trong mối trường nuôI cấy có bổ sung tetracylin 9/ Phân lập vi khuẩn lactic Dùng nước dưa đã muối hai ngày làm dung dịch gốc để pha loãng. Pha loãng đến tỉ lệ thích hợp (thường ở độ pha loãng 10-6 - 10-7). Dùng pipet vô trùng lấy 0,05ml dịch pha loãng nhỏ vào môi trường MRS đặc vô trùng đựng trong hộp petri. Dùng que gạt vô trùng dàn đều trên môi trường. Nuôi trong tủ ấm ở 300C trong 2 ngày. Dùng que cấy đầu tròn lấy khuẩn lạc tách rời cấy vào môi trường MRS lỏng đựng trong ống nghiệm. Cấy lặp lại 2 - 3 lần với vật liệu cấy lúc này là giống mọc từ khuẩn lạc tách rời đã thu nhận được từ lần 1. Cấy ra môi trường MRS nghiêng để giữ giống. Mọi thao tác được tiến hành trong phòng cấy vô trùng. Các dụng cụ cũng yêu cầu vô trùng, tránh nhiễm tạp. 10/ Cấy truyền và giữ giống Dùng que cấy vòng lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm chứa dung dịch MRS lỏng. Nuôi trong tủ ấm ở 30 ± 20C. Sau 24h, dùng pipet vô trùng lấy 0,05 ml môi trường lỏng nhỏ vào chính giữa hộp petri đã chứa sẵn môI trường MRS. Sau đó trang đều và nuôi trong tủ ấm cho khuẩn lạc phát triển. Chọn khuẩn lạc riêng rẽ và cấy lên thạch nghiêng. Giống được bảo quản ở ống thạch nghiêng trong tủ lạnh 40C trong vòng 2 tháng. Nếu muốn bảo quản lâu hơn có thể bảo quản trong dung dịch glyxerin 15 - 40% ở điều kiện lạnh sâu. 11/ Nhân giống Môi trường nhân giống là môi trường lỏng được chuẩn bị và thanh trùng trong bình tam giác. Chủng vi khuẩn được lấy từ ống giống cấy vào ống nghiệm chứa10ml môi trường MRS lỏng đã khử trùng. Sau 24 giờ phát triển thì cấy sang bình tam giác (tỉ lệ tiếp giống 10%). Tuỳ thuộc qui mô thí nghiệm mà có các cấp nhân giống thích hợp. 12/ Quan sát khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc được nghiên cứu trên môi trường MRS. Dùng que cấy lấy khuẩn lạc từ môi trường thạch nghiêng cấy trích thẳng vào môi trường thạch chứa trong hộp Petri. Nuôi trong tủ ấm ở 300C trong 2 ngày rồi tiến hành quan sát khuẩn lạc, miêu tả. 13/ Soi tiêu bản sống Dùng que cấy đầu tròn vô trùng lấy tế bào vi sinh vật từ canh trường lỏng giàn đều trong một giọt nước cất vô trùng đã nhỏ sẵn trên một phiến kính, đậy lamel. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. 14/ Nhuộm tiêu bản Sử dụng tế bào vi khuẩn đã được nuôi sau 24h để làm tiêu bản. Làm vết bôi trên phiến kính, để khô sau đó cố định trên ngọn lửa đèn cồn. Đặt bản mẫu đã cố định lên giá thuỷ tinh, nhỏ lên vết bôi vài giọt thuốc nhuộm Fuchsin. Sau 1 - 5 phút đổ thuốc nhuộm đi rồi rửa nhẹ bằng nước. Rửa nước tới khi nào nước chảy qua không còn màu nữa là được. Sau đó để bản mẫu khô tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Quan sát băng vật kính có độ phóng đại 1000 lần. 15/ Nhuộm màu Gram Việc nhuộm màu Gram được tiến hành với những tế bào còn non, thường là các giống nuôi cấy một ngày đêm. Thao tác nhuộm được tiến hành như sau: Nhỏ một giọt huyền phù vi khuẩn lên trên phiến kính, dàn đều. Làm khô vết bôi trong không khí và cố định trên ngọn lửa. Nhuộm vết bôi bằng tím gentian trong 1 - 2 phút, sau đó đổ thuốc nhuộm đi, xử lí bằng dung dịch Lugol trong 1 - 2 phút cho đến khi thẫm lại. Đổ dung dịch Lugol đi rồi khử màu bằng etanol 96% trong 0,5 - 1,0 phút. Rửa sạch tiêu bản bằng nước sau đó nhuộm bổ sung bằng dung dịch fuchsin. Đợi tiêu bản khô thì quan sát bằng vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần. Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ. 16/ Xác định khả năng di động Khả năng chuyển động của vi khuẩn lactic được nghiên cứu trên môi trường bán lỏng có thành phần như sau, g/l: Pepton 5 Cao men 8 Cao thịt 5 MnSO4.4H2O 0,04 Thạch 15 Tween80 0,5ml Kali xitrat 1 Bromocresoltía1,6% 2,8ml Thanh trùng trong nồi hấp áp lực ở 1210C trong 20 phút, pH của môi trường là 6,5. Nhỏ một giọt dịch có chủng nghiên cứu vào chính giữa hộp petri (không giàn đều bằng que gạt). Sau một thời gian phát triển, nếu vi khuẩn có khả năng chuyển động thì axit hữu cơ sinh ra sẽ khuếch tán đều về các phía và làm thay đổi màu của chất chỉ thị trên bề mặt hộp Petri. Nếu vi khuẩn không có khả năng chuyển động thì sự thay đổi màu chất chỉ thị chỉ được quan sát thấy ở xung quanh giọt chất lỏng nhỏ vào. 17/ Xác định kiểu hô hấp Cấy chủng vi khuẩn nghiên cứu vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường MRS đặc bằng cách dùng que cấy đầu nhọn cắm thẳng, sâu. Độ sâu vết cấy là 6 - 7cm. Quan sát sự phát triển của vi khuẩn dọc theo vết cấy. 18/ Xác định nhiệt độ phát triển Sau khi nuôi cấy trên môi trường MRS lỏng, tế bào vi khuẩn được cấy trên ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS. Nuôi ở các nhiệt độ khác nhau. Sau một thời gian nhất định (nếu nuôi ở 150C thì thời gian nuôi là 7 ngày, nếu nuôi ở nhiệt độ cao hơn thì 1 - 2 ngày) tiến hành đo độ đục để nhận xét sự phát triển của vi khuẩn. 19/ Xác định khả năng chịu mặn Môi trường MRS có bổ sung NaCl ở các nồng độ khác nhau được thanh trùng ở 1 atm. Cấy vi khuẩn vào và nuôi trong tủ ấm ở 300C. Theo dõi sự phát triển theo thời gian để rút ra sự mẫn cảm của vi khuẩn với nồng độ NaCl. 20/ Xác định mật độ quang OD Có thể đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn bằng cách đo sự tăng sinh khối thông qua giá trị OD (Optical Density). Các thí nghiệm được đo ở bước sóng 620 nm (OD620). 21/ Xác định axit lactic - Phân tích định tính: Lấy vào ống nghiệm 5 - 7ml dịch cần nghiên cứu, thêm 1ml H2SO4 10% và vài giọt KMnO4 2%. Trên miệng ống đặt một miếng giấy lọc có tẩm dung dịch AgNO3 pha trong NH4OH (1 - 2ml dung dịch AgNO3 10%, thêm vài giọt NH4OH). Đun sôi ống nghiệm. Giấy lọc sẽ đen nếu trong dịch nghiên cứu có axit lactic. - Phân tích định lượng: + Phương pháp chuẩn độ: Trong trường hợp không yêu cầu độ chính xác cao có thể định lượng axit lactic bằng cách dùng NaOH 0,1N để chuẩn độ, chất chỉ thị là phenolphtalein. + Phương pháp đường chuẩn: Dùng nước dưa muối sau 2 ngày để pha loãng axit lactic tinh khiết 86% thành các nồng độ từ 1 đến 5%. Sử dụng NaOH 0,1N chuẩn 10ml axit lactic ở các nồng độ trên và vẽ thành đồ thị quan hệ giữa số ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn 10ml axit lactic có nồng độ khác nhau. Khi chuẩn axit lactic trong dưa, từ số ml NaOH chuẩn 10ml nước dưa, dựa vào đồ thị và phương trình hồi qui ta suy ra số g axit lactic có trong dưa. Đồ thị được trình bày ở phần phụ lục. PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN III. 1. Đánh giá chất lượng của một số nguyên liệu rau quả Chất lượng nguyên liệu là một chỉ tiêu quan trọng, dựa vào những chỉ tiêu này chúng ta sẽ có những biện pháp xử lý nguyên liệu, đưa ra một số điều kiện thích hợp cho quá trình chế biến sản phẩm. Để có thể sơ bộ đánh giá chất lượng nguyên liệu chúng tôi tiến hành phân tích một số chỉ tiêu hóa lý và vi sinh của nguyên liệu sau khi mua ngoài chợ về (sau 18 -20 giờ thu hái) Bảng 1: Một số chỉ tiêu chất lượng nguyên liệu rau qủa Chỉ tiêu Rau cải bẹ Cà chua Dưa chuột Cà pháo Số lượng (bẹ, cái, quả)/1kg 5 ¸7 12¸14 10¸12 130¸150 Chiều dài, đường kính (cm) 22¸25 3¸3,5 7¸10 1,2¸1,5 Chất khô hòa tan(Bx) 3,2¸3,8 7¸8 3,2¸3,5 6,0¸6,3 Hàm lượng nước (%) 94¸95 90¸92 95¸96 88¸90 Hàm lượng đường(%) 1,1¸1,5 2,5¸2,9 1,8¸2 1,5¸1,6 Hàm lượng axit (%) 0,15¸0,16 0,45¸0,5 0,11¸0,15 0,18¸0,2 Hàm lượng muối (%) 0,15¸0,19 0,14¸0,17 0,04¸0,05 0,13¸0,14 Hàm lượng VTM C (mg%) 14 ¸16 37¸40 30¸35 28¸30 Tổng số vi sinh vật (tb x 106/g) 35 13. 106 15 15 Tổng số nấm men, nấm mốc (tb x 106/g) 3 106 1,4 2,1 Các thành phần hóa lý của nguyên liệu có liên quan đến quá trình lên men lactic đó là hàm lượng đường, vitamin C, axit. Theo số liệu của Viện dinh dưỡng thì hàm lượng vitamin C của rau cải bẹ ngay sau khi thu hái là 51 mg%, trong khi đó kết quả thu được trong nghiên cứu này là 16 mg% Sự sai khác giữa các số liệu này có thể là do một phần vitamin C bị oxy hóa và mất đi sau khi thu hái (18 - 24h). Hàm lượng vi sinh vật có trong nguyên liệu là rất lớn và đa số là vi khuẩn. Đồng thời, hàm lượng vi sinh vật trong rau lớn hơn 1,5 - 2 lần so với trong các loại củ và quả. Như vậy trong quá trình muối chua tự nhiên, sự lên men lactic chủ yếu là do sự hoạt động của vi sinh vật có trong bản thân nguyên liệu. Chúng tôi chọn rau cải bẹ, một loại nguyên liệu phổ biến, được trồng quanh năm, để tiến hành các nghiên cứu. Sau đó khảo sát các kết quả thu được trên một số nguyên liệu khác. III.2. Phân lập và chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho quá trình lên men lactic. Như đã nói ở phần tổng quan, các sản phẩm muối chua hiện nay ở nước ta chủ yếu được làm theo phương pháp thủ công, lên men tự nhiên, cho chất lượng không đồng đều, thời gian lên men dài, thời gian bảo quản lại ngắn. Trong khi đó trên thế giới đặc biệt là một số nước châu Á các sản phẩm rau quả muối chua chủ yếu được sản xuất ở quy mô công nghiệp. Trong quá trình sản xuất để tăng chất lượng sản phẩm người ta đã sử dụng chủng vi sinh vật lên men lactic thuần khiết. Sản phẩm không những có chất lượng tốt, ổn định mà còn có thể bảo quản trong thời gian dài. Do vậy, một trong các mục tiên nghiên cứu của chúng tôi là tìm ra chủng vi khuẩn lactic thuần khiết để ứng dụng vào trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả nhằm rút ngắn thời gian lên men, tạo ra được sản phẩm có chất lượng ổn định, thời gian bảo quản lâu. Sử dụng môi trường MRS thạch để phân lập vi khuẩn lactic có trong mẫu nước dưa muối chua tự nhiên sau 48 giờ. Từ các khuẩn lạc riêng rẽ, chúng tôi đã phân lập được một số chủng vi khuẩn sau đó chọn ra hai chủng vi khuẩn có khả năng phát triển tốt nhất để tiếp tục nghiên cứu, ký hiệu là chủng TL5 và TL6. III.2.1. Nghiên cứu một số đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của các chủng Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của hai chủng phân lập được và dùng chủng Lactobacillus lactis sinh axit lactic từ rỉ đường mía Việt Nam do Viện Công nghiệp Thực phẩm cung cấp làm chủng đối chứng. Kết quả thu được được trình bày ở bảng 2, 3 và 4: Bảng 2 : Một số đặc điểm của các chủng vi khuẩn nghiên cứu STT Đặc điểm TL5 TL6 Lb.lactis 1 Đặc điểm khuẩn lạc Tròn, trắng đục, bề mặt nhăn, khô, mép răng cưa Tròn, trắng sữa, bề mặt nhẵn bóng Tròn, trắng đục, bề mặt nhẵn bóng, 2 Hình dáng vi khuẩn, cách sắp xếp tế bào Hình cầu, xếp đơn, đôi hoặc chuỗi Hình cầu, xếp đơn đôi Hình que mảnh,xếp đơn đôi 3 Sinh trưởng trên môi trường MRS lỏng Sinh trưởng tốt, có cặn không đục Sinh trưởng tốt, đục, có cặn Sinh trưởng tốt, đục, có cặn 4 Nhuộm Gram + + + 5 Kiểu hô hấp Kỵ khí không bắt buộc Kỵ khí không bắt buộc Kỵ khí không bắt buộc 6 Khả năng di độmg Không Không Không 7 Khả năng tạo bào tử Không Không Không Bảng 3 : Khả năng sinh trưởng ở các điều kiện nhiệt độ Nhiệt độ, oC TL5 TL6 Lb.lactis 10 - - - 15 ± ± - 20 + + + 30 + + + 40 + + + 50 - - - - Không sinh trưởng ± Sinh trưởng kém + Sinh trưởng tốt Bảng 4: Khả năng sinh trưởng của các chủng ở các pH khác nhau pH TL5 TL6 Lb. lactis 3,5 - - - 5 + + ± 6 + + + 7 + + + 8 ± ± ± 9,5 - - - - Không sinh trưởng ± Sinh trưởng kém + Sinh trưởng tốt Từ các bảng 2, 3 và 4 chúng tôi nhận thấy cả ba chủng trên đều có các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hóa của nhóm vi khuẩn lactic: đều là những vi khuẩn Gram dương, không có khả năng tạo bào tử, hô hấp yếm khí tùy tiện. Đối với quá trình lên men lactic, dựa vào hàm lượng axit lactic tạo ra, có thể kết luận sơ bộ được chủng vi khuẩn lên men lactic là chủng lên men đồng hình hay dị hình. Do đó chúng tôi sử dụng phương pháp đường chuẩn bằng NaOH 0,1N để xác định hàm lượng axit lactic sinh ra, từ đó tính hiệu suất lên men của cả 3 chủng trên 1 lít môi trường MRS lỏng. Bảng 5: Khả năng tạo axit lactic của 3 chủng vi khuẩn Chủng vi khuẩn Hàm lượng axit lactic, g/l Hiệu suất lên men, % Lb.lactis 18 90,1 TL6 18,9 94,3 TL5 16,9 84,5 Qua bảng trên ta thấy cả ba chủng Lb.lactis, TL5, TL6 đều có hiệu suất lên men lớn hơn 80% nên có thể coi ba chủng trên đều là những chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình. Dựa vào những đặc điểm hình thái sinh lý, sinh hóa ở trên có thể đưa ra kết luận sơ bộ hai chủng phân lập TL5 và TL6 thuộc giống Enterococcus hoặc Lactococcus. Để xác định cụ thể hai chủng phân lập được thuộc loại nào, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm của hai chủng này và so sánh với những đặc điểm chung của vi khuẩn thuộc nhóm Enterococcus và Lactococcus. Kết quả được thể hiện ở bảng 6: Bảng 6: Một số đặc điểm của chủng vi khuẩn nghiên cứu Đặc điểm Chủng TL5 Chủng TL6 Enterococcus Lactococcus Hình dạng tế bào Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình cầu Hình thức lên men Đồng hình Đồng hình Đồng hình Đồng hình Nhiệt độ phát triển, 0C 15 -40 15-40 10 - 45 10 - 45 Khả năng phát triển ở pH = 9,5 Không phát triển Không phát triển Có phát triển Không phát triển Các vi khuẩn thuộc giống Enterococcus và Lactococcus. Có rất nhiều đặc điểm chung, chúng đều là những vi khuẩn hình cầu, lên men đồng hình, có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 10 - 45oC. Nhưng vi khuẩn thuộc loại Lactococcus thì không phát triển được ở pH = 9,5 trong khi đó vi khuẩn thuộc giống Enterococcus thì lại có khả năng phát triển ở điều kiện pH = 9,5. Hai chủng vi khuẩn phân lập TL5 và TL6 có tế bào hình cầu, lên men đồng hình, nhiệt độ phát triển từ 15 - 40oC và đặc biệt không phát triển được trong điều kiện pH = 9,5. Do đó chúng tôi có thể đí đến kết luận hai chủng TL5 và TL6 đều thuộc giống Lactococcus . Chúng tôi tạm đặt tên cho hai chủng này như sau: + Lactococcus sp. TL5 ( Lc. TL5) + Lactococcus sp. TL6 ( Lc. TL6) Hình 1: Khuẩn lạc của chủng Lactobacillus lactis Hình 2 : Hình dạng tế bào của chủng Lactobacillus lactis dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần Hình3: Khuẩn lạc chủng Lc.TL6 Hình 4 : : Hình dạng tế bào của chủng Lc.TL6 dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần Hình 5 : Khuẩn lạc chủng Lc.TL5 Hình 6 : Hình dạng tế bào của chủng Lactococcus. TL5 dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần III.2.2 Chọn chủng thích hợp cho quá trình muối chua rau quả III.2.2.1.Khả năng chịu mặn của các chủng Do mục đích của quá trình nghiên cứu là tìm ra chủng vi khuẩn lactic thích hợp cho quá trình muối chua rau quả nên chủng vi khuẩn lựa chọn không những phải có khả năng sinh axit lactic cao trong thời gian ngắn mà còn phải có khả năng lên men trong môi trường có nồng độ muối cao. Vì vậy chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu suất lên men của ba chủng trong môi trường lỏng MRS có bổ sung các nồng độ muối khác nhau. Do nồng độ muối thích hợp cho quá trình muối chua rau quả là 4-7% nên chúng tôi khảo sát nồng độ muối từ 0 -10%. Sử dụng phương pháp chuẩn độ bằng NaOH 0,1N để xác định lượng axit lactic tạo thành, từ đó tính được hiệu suất lên men đường. Hiệu suất sau 7 ngày lên men của các chủng được trình bày trong bảng 7: Bảng 7: Ảnh hưởng của nồng độ muối đến hiệu suất lên men, % Nồng độ muối, % Hiệu suất lên men, % Lc.TL5 Lb.lactis Lc.TL6 Lb.lactis 0 86,5 94,3 90,1 4 80,3 88,0 75,0 6 70,0 77,5 72,0 7 65,0 72,5 69,5 8 60,0 72,5 67,0 10 28,3 32,1 21,1 Qua bảng trên ta thấy khi nồng độ muối tăng thì hiệu suất lên men của các chủng giảm. Các chủng đều có khả năng chịu muối cao, ở nồng độ muối từ 4-8 thì hiệu suất lên men có giảm nhưng vẫn đạt trên 60% còn khi nồng độ muối là 10% thì hầu như các chủng đều bị ức chế (hiệu suất lên men rất thấp). Chủng Lc.TL6 không những là chủng có hiệu suất lên men cao nhất mà còn có khả năng chịu mặn tốt nhất, trong khi đó chủng Lb.lactis có hiệu suất lên men(khi không bổ sung muối) cao hơn so với chủng Lc.TL5 nhưng khả năng chịu mặn lại kém hơn. Hai chủng Lc.TL5 và Lc.TL6 là những chủng phân lập được từ dưa muối tự nhiên do đó nó đã thích ứng với điều kiện môi trường có nồng độ muối cao nên khả năng chịu mặn của chúng tốt hơn. III.2.2.2. Khả năng muối chua rau cải bẹ của các chủng Sử dụng ba chủng vi khuẩn nói trên để muối chua cải bẹ. Công thức muối như sau: đường cho thêm vào là 2%, muối 6%, tỷ lệ giữa nước và nguyên liệu là 1:1, tỉ lệ tiếp giống 2% so với nguyên liệu.Chúng tôi tiến hành muối 4 mẫu : một mẫu muối tự nhiên và ba mẫu muối có bổ sung ba chủng vi khuẩn lactic trên. Hàng ngày xác định hàm lượng axit lactic tạo thành và những thay đổi cảm quan của dưa cũng như nước dưa. Kết quả được trình bày ở hai bảng 8, 9 và đồ thị 1 (hàm lượng axit lactic tạo thành được tính qua số ml dung dịch NaOH 0,1N trung hòa hết lượng axit có trong 100 ml nước dưa). Bảng 8 : Sự tạo thành axit lactic của các chủng trong quá trình muối chua, ml NaOH 0,1 N / 100 ml dịch Chủng Thời gian, h NaOH, ml/100 ml dịch Muối tự nhiên Lb.lactis Lc.TL5 Lc.TL6 0 0 0 0 0 24 4 9 15.5 20.5 48 19 23,5 31 48 72 25 36,5 47,5 64 96 33,5 38 46,5 63,5 Đồ thị 1 : Khả năng tạo axit lactic của ba chủng Bảng 8 cho thấy trong ba ngày đầu các mẫu dưa muối có bổ sung chủng vi khuẩn thuần khiết đều có hàm lượng axit lactic tạo thành lớn hơn nhiều so với mẫu muối tự nhiên không bổ sung chủng. Tuy nhiên mẫu có bổ sung chủng Lb.lactis hàm lượng axit lactic tạo thành thấp hơn so với mẫu muối có bổ sung chủng Lc.TL5 và Lc.TL6. Chúng tôi tiến hành muối dưa và quan sát sự thay đổi cảm quan của dưa và nước dưa trong quá trình muối. Kết quả đánh giá cảm quan của các mẫu dưa muối được trình bày ở bảng 9 : Bảng 9: Những thay đổi cảm quan trong quá trình muối dưa Thời gian, giờ Chủng vi khuẩn Các giá trị cảm quan Màu sắc Mùi vị Trạng thái dưa Độ sánh nước dưa Dưa Nước dưa Dưa Nước dưa 48 Lc. LT5 Vàng Vàng, hơi đục Chua, không thơm Chua, không thơm Dòn Không sánh Lc. LT6 Vàng sáng Vàng, đục Thơm, chua Chua, thơm Dòn Sánh, không nhớt Lb.lactis Hơi vàng Vàng, đục Hơi chua, thơm Thơm, hơi chua Dòn Không sánh Lên men tự nhiên Xanh, hơi vàng Vàng, đục Hăng cay, hơi chua Hăng,hơi chua Dòn Không sánh, nhớt 72 Lc. LT5 Vàng sáng Vàng, đục Chua, không thơm Chua, không thơm Dòn Sánh, không nhớt Lc. LT6 Vàng sáng Vàng, đục Chua, rất thơm Chua, thơm Dòn Sánh không nhớt Lb.lactis Vàng Vàng đục Chua, thơm Chua, thơm Kém dòn Sánh, nhớt Lên men tự nhiên Vàng xỉn Vàng đục, có váng Chua, không thơm Chua, không thơm Kém dòn Sánh, nhớt, có váng Sau ngày muối thứ nhất các mẫu dưa có sự thay đổi cảm quan không rõ rệt, dưa vẫn còn xanh, chưa chua. Sang đến ngày thứ hai đã có sự biến đổi , đối với mẫu muối có bổ sung chủng vi khuẩn thuần khiết, dưa đã chuyển sang trạng thái vàng sáng, dưa vàng đều, đã đạt được độ chua dịu của sản phẩm, nước dưa sánh nhưng không nhớt, trong khi đó mẫu lên men tự nhiên dưa vẫn còn xanh. Mẫu có bổ sung chủng Lc.TL5 cho dưa sản phẩm không có mùi thơm đặc trưng. Mẫu có bổ sung chủng Lc.TL6 có hàm lượng axit lactic tạo thành nhiều nhất đồng thời dưa có chất lượng cảm quan tốt nhất. Do đó chúng tôi đi đến kết luận chọn chủng Lc.TL6 là chủng thích hợp nhất cho quá trình muối chua rau cải bẹ. III.3. Ứng dụng chủng vi khuẩn Lc.TL6 để muối chua rau cải bẹ III.3.1. Các điều kiện thích hợp cho quá trình nhân giống 1/ Chọn môi trường nhân giống Vi khuẩn lactic có đòi hỏi rất cao về nhu cầu dinh dưỡng cho sinh trưởng và phát triển. Môi trường MRS là môi trường có thể đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic. Tuy nhiên trong sản xuất thực tế thì không thể sử dụng môi trường này do tính phức tạp trong chuẩn bị môi trường cũng như tính kinh tế của chúng. Do đó việc tìm một môi trường thay thế cho môi trường MRS, thích hợp cho sự sinh trưởng cũng như phát triển của vi khuẩn lactic, thỏa mãn yêu cầu dễ dàng chuẩn bị môi trường, không gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm và phải có tính kinh tế là rất cần thiết khi muốn đưa chủng giống vi khuẩn lactic vào trong sản xuất ở quy mô lớn. Qua tham khảo một số tài liệu, chúng tối sử dụng các loại môi trường sau: môi trường rau cải bẹ (CB), bắp cải (BC), giá đỗ (GĐ), và môi trường đối chứng MRS (môi trường MRS có thay thế glucoza bằng sacaroza với tỷ lệ tương đương). Khả năng phát triển của vi khuẩn được đánh giá qua giá trị mật độ quang OD620, khả năng tạo axit lactic được xác định qua lượng NaOH 0,1N/100 ml dịch cần phân tích. Kết quả được trình bày ở bảng 1-3 ở phần phụ lục và các đồ thị 2-4 sau: Đồ thị 2 : Ảnh hưởng của các loại môi trường tới thay đổi pH môi trường của chủng Lc.TL6 Đồ thị 3: Ảnh hưởng của các loại môi trường tới khả năng tạo axit lactic của chủng Lc.TL6 Đồ thị 4 : Ảnh hưởng của các loại môi trường tới khả năng phát triển của chủng Lc.TL6 Từ kết quả thu được chúng tôi thấy rằng môi trường MRS vẫn là môi trường thích hợp nhất cho sự phát triển và sinh axit lactic của vi khuẩn lactic. Ở ba môi trường còn lại khả năng phát triển cũng như sinh axit lactic của chủng Lc.TL6 đều giảm. Tuy nhiên do ưu điểm về mặt kinh tế nên ta vẫn chọn một trong ba môi trường trên làm môi trường thay thế cho MRS trong quá trình nhân giống. Khả năng tạo axit lactic của chủng Lc.TL6 trên ba môi trường giá đỗ, cải bẹ và bắp cải là tương đương nhau, nhưng khả năng phát triển của chủng này trên môi trường bắp cải và cải bẹ tương đương nhau và cao hơn so với môi trường giá đỗ. Đối với quá trình nhân giống thì khả năng phát triển (mật độ tế bào) được ưu tiên hơn. Vì vậy có thể chọn môi trường bắp cải hoặc môi trường cải bẹ làm môi trường nhân giống tùy theo từng điều kiện cụ thể, ví dụ như trong muối chua cải bẹ thì có thể sử dụng môi trường nước chiết rau cải bẹ còn trong quá trình muối chua bắp cải thì sử dụng môi trường nước chiết bắp cải. Ở cả ba môi trường giá đỗ, cải bẹ, bắp cải, động học của chủng Lc.TL6 tương đối giống khi phát triển trên môi trường MRS, nghĩa là sau giai đoạn phát triển logarit kéo dài khoảng 12-18 giờ là giai đoạn ổn định. 2/ Chọn nồng độ nhân giống thích hợp Nồng độ nhân giống cũng là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát triển cũng như khả năng sinh axit lactic của vi khuẩn. Không phải tiếp giống càng nhiều thì sự phát triển và khả năng sinh axit lactic càng cao. Chủng vi khuẩn từ môi trường thạch nghiêng được nhân giống nhỏ trên môi trường MRS, sau đó nhân giống lớn trên môi trường đã chọn ở trên - môi trường nước chiết cải bẹ (hoặc bắp cải). Trong sản xuất rau quả muối chua ở quy mô lớn, sự cách biệt giữa các tỷ lệ tiếp giống (cho quá trình nhân giống lớn) liên quan đến vấn đề về kinh tế và giá thành sản phẩm. Nồng độ nhân giống thích hợp đối với các vi khuẩn là 1-5% nên chúng tôi chọn chính những nồng độ này để tiến hành thí nghiệm. Kết quả được trình bày trong các bảng 4--6 ở phần phụ lục và các đồ thị 5-7 : Đồ thị 5: Ảnh hưởng của nồng độ nhân giống tới sự thay đổi pH môi trường của chủng Lc.TL6 Đồ thị 6: Ảnh hưởng của nồng độ nhân giống tới khả năng tạo axit lactic của chủng Lc. TL6, ml NaOH 0,1N /100 ml dịch Đồ thị 7: Ảnh hưởng của nồng độ nhân giống tới khả năng phát triển của chủng Lc. TL6, OD620 Qua các bảng và đồ thị trên chúng tối nhận thấy, khi nồng độ tiếp giống tăng thì khả năng phát triển cũng như khả năng tạo axit lactic của chủng Lc.TL6 tăng. Ở nồng độ tiếp giống 1 và 2% thì hàm lượng axit lactic tạo thành thấp hơn hẳn so với ở các nồng độ khác, còn ở nồng độ 3, 4, 5% thì sự chênh lệch này là không đáng kể. Nhưng đây là quá trình nhân giống nên điều chủ yếu là tạo ra sinh khối nhiều. Đồ thị 7 cho thấy ở nồng độ 4% và 5% thì khả năng phát triển của chủng cao hơn ở các nồng độ khác, nhưng giữa hai nồng độ này thì sự chênh lệch không nhiều. Do đó đảm bảo vấn đề kinh tế chúng tôi chọn nồng độ nhân giống là 4%. 3/ Ảnh hưởng của nhiệt độ Như tất cả các vi sinh vật khác vi khuẩn lactic cũng chịu ảnh hưởng rất lớn bởi nhiệt độ. Kết quả ở phần trên cho thấy rằng chủng Lc.TL6 có khả năng phát triển ở nhiệt độ từ 20-400C. Trong quá trình nhân giống thì cần phải tạo những điều kiện cho vi khuẩn phát triển tốt nhất, vì vậy chúng tối tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ để tìm ra nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của vi khuẩn. Nhưng do điều kiện còn hạn chế nên chỉ chọn ba điểm nhiệt độ là 25, 30 và 350C để tiến hành thí nghiệm.Kết quả được trình bày ở các bảng 7-9 trong phần phụ lục và các đồ thị 8-10 sau: Đồ thị 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi pH môi trường của chủng Lc.TL6 Đồ thị 9: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tạo axit lactic của chủng Lc.TL6 Đồ thị 10 : Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự phát triển của chủng Lc.TL6 Kết quả nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ tăng trong khoảng 25-350C thì khả năng phát triển cũng như khả năng tạo axit lactic của chủng Lc.TL6 tăng. Tuy nhiên nhiệt độ ảnh hưởng không nhiều đến sự tạo thành axit lactic cũng như khả năng phát triển của chủng. Ở nhiệt độ 30 và 350C thì khả năng tạo axit lactic lớn hơn so với ở 250C, còn khả năng phát triển của chủng ở ba nhiệt độ này gần tương đương nhau. Như vậy nhiệt độ 30-350C là nhiệt độ thích hợp nhất cho sự phát triển và tạo axit lactic của chủng Lc.TL6. 4/ Ảnh hưởng của nồng độ muối Trong công nghệ muối chua các sản phẩm rau quả, muối đóng vai trò rất quan trọng. Trước hết, muối tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Ngoài ra, muối còn có tác dụng bảo quản sản phẩm. Muối có tác dụng chủ yếu là gây ra hiện tượng co nguyên sinh ở tế bào rau quả, làm dịch bào tiết ra. Trong dịch bào có chứa nhiều đường và một số chất dinh dưỡng khác, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi khuẩn lactic phát triển, làm cho sản phẩm đạt được chất lượng cao. Trong quá trình muối chua rau quả nồng độ muối tương đối cao: 4-8%. Kết quả phần trên cho thấy chủng Lc.TL6 có khả năng chịu được nồng độ muối từ 4 - 8% nhưng đó là sự phát triển trong môi trường MRS - một môi trường giàu chất dinh dưỡng, đầy đủ các điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi khuẩn. Còn trong quá trình muối chua rau quả thì môi trường để lên men lactic là một môi trường ngèo chất dinh dưỡng, bên cạnh sự phát triển của chủng vi khuẩn lactic đưa vào còn có sự phát triển của hệ vi sinh vật có trong nguyên liệu ban đầu. Do đó chúng tôi muốn bổ sung một lượng muối vào trong môi trường nhân giống để cho chủng vi khuẩn làm quen dần với các điều kiện khắc nghiệt, để khi đưa vào quá trình muối chua sẽ phát triển tốt hơn. Từ những kết quả thu được khi tiến hành trên môi trường nhân giống - môi trường nước chiết cải bẹ - môi trường có tính chất tương đồng như môi trường trong quá trình muối chua cải bẹ sẽ áp dụng trong quá trình muối chua. Vì thế chúng tôi chọn nồng độ muối từ 4 - 10% để khảo sát. Kết quả được trình bày ở bảng 7-9 và đồ thị 8-10 : Đồ thị 8 : Ảnh hưởng của nồng độ muối tới sự thay đổi pH môi trường của chủng Lc. TL6 Đồ thị 9 : Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng sinh axit lactic của chủng Lc.TL6 Đồ thị 10 : Ảnh hưởng của nồng độ muối tới khả năng phát triển của chủng Lc.TL6 Qua các đồ thị trên, chúng tôi nhận thấy trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng là nước chiết rau cải bẹ, khi nồng độ muối tăng thì khả năng phát triển cũng như khả năng sinh axit lactic của chủng Lc.TL6 giảm dần, nhưng trong khoảng nồng độ muối từ 4 - 8% chủng Lc.TL6 vẫn có khả năng phát triển và sinh axit lactic tương đối tốt, còn ở nồng độ muối 10% thì khả năng phát triển và sinh axit lactic giảm mạnh. ở nồng độ muối 0% sự tạo thành axit lactic lớn hơn rất nhiều so với các nồng độ muối khác. Nhưng khả năng phát triển của chủng ở các nồng độ muối 0% so với nồng dộ muối 4% khác nhau không nhiều. Như vậy trong quá trình nhân giống có thể bổ sung muối với nồng độ 4% để cho chủng thích ứng dần với môi trường có nồng độ muối. Còn khi muối chua rau cải bẹ thì có thể chọn nồng độ muối từ 6-8%, đây là nồng độ muối thích hợp cho quá trình muối chua rau quả. III.3.2.Xử lý nguyên liệu trước khi muối chua Quá trình xử lý nguyên liệu ban đầu ảnh hưởng rất lớn tới sự lên men lactic trong quá trình trình muối chua rau quả.Trong đó lượng vi sinh vật ban đầu của rau là một nhân tố rất quan trọng. Rửa rau chỉ cho phép loại bỏ cặn bẩn và một phần nhỏ vi sinh vật. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ dịch sử dụng để muối chua rau cải bẹ đến hàm lượng vi sinh vật có trong nguyên liệu cũng như đến chất lượng của dưa sản phẩm. Ở đây chúng tôi sử dụng dịch để muối chua có các nhiệt độ khác nhau : 300C ( nhiệt độ thường) 500C, 600C, 700C, 800C và 1000C và một mẫu muối chua tự nhiên để làm mẫu kiểm chứng. Sau khi rót dịch thì để nguội đến khoảng 30-350C, sau đó tiếp giống vào đối với những mẫu có bổ sung chủng vi khuẩn. Chúng tôi xác định hàm lượng vi sinh vật của nguyên liệu trước khi xử lý nhiệt và sau khi xử lý nhiệt. Sau khi xử lý nhiệt ở đây là xác định hàm lượng vi sinh vật tại thời điểm trước khi tiếp giống vào. Vì sau khi rót dịch nhiệt độ của hỗn hợp nguyên liệu và nước còn cao, trong thời gian hạ từ nhiệt độ đó xuống nhiệt độ thường thì có một phần lớn lưọng vi sinh vật bị tiêu diệt. Bảng 10: Sự thay đổi nhiệt độ và hàm lượng vi sinh vật của nguyên liệu trước và sau khi rót dịch Mẫu Nhiệt độ,0C Hàm lượng vi sinh vật, tb x 106/g Dịch trước khi rót Dịch và nguyên liệu sau khi rót Trước khi rót dịch Trước khi bổ sung chủng vi khuẩn M1( lên men tự nhiên) 30 30 20 20 M2 30 30 20 20 M3 50 38-40 20 19,7 M4 60 48-50 20 16,1 M5 70 56-58 20 14,3 M6 80 63-65 20 11 M7 100 70-72 20 6,2 Nhiệt độ của dịch sử dụng để muối chua làm thay đổi hàm lượng vi sinh vật ban đầu của nguyên liệu. Riêng đối với mẫu muối chua xử lý nhiệt ở 500C, lượng vi sinh vật giảm không đáng kể vì nhiệt độ 500C chưa đủ để tiêu diệt các vi sinh vật . Nhiệt độ dịch từ 60 - 800C có thể tiêu diệt được 20 - 35% lượng vi sinh vật có trong nguyên liệu. Mẫu xử lý nhiệt ở 1000C có hàm lượng vi sinh vật giảm mạnh. Chúng tôi xác định hàm lượng axit tạo thành và khả năng phát triển của chủng Lc.TL6 (24h/lần) đồng thời theo dõi sự biến đổi cảm quan trong quá trình muối chua của bảy mẫu trên. Kết quả được trình bày ở bảng 9, 10 và đồ thị 11: Bảng 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ dịch tới sự tạo thành axit lactic trong quá trình muối chua, ml NaOH / 100 ml dịch Mẫu Thời gian, giờ 0 24 48 72 98 M1 0 4,5 27,5 32,0 36,5 M2 0 24,5 31 43,0 43,5 M3 0 27,5 37,5 34,5 37,5 M4 0 34,0 47,0 52,5 49,5 M5 0 34,0 55,0 56,5 55,0 M6 0 27,0 30,5 33,5 37,5 M7 0 13,5 22,5 27,5 38,0 Đồ thị 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ dịch tới sự tạo thành axit lactic trong quá trình muối chua, ml NaOH / 100 ml dịch Bảng 12 : Những thay đổi cảm quan trong quá trình muối dưa Thời gian, h Mẫu Các giá trị cảm quan Màu sắc, Mùi vị Trạng thái dưa Độ sánh của nước dưa Dưa Nước dưa Dưa Nước dưa 48 M1 Vàng xanh Vàng, đục Không thơm, hơi chua Hơi chua Dòn Không sánh M2 Vàng đều Vàng, đục Thơm, chua Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt M3 Vàng Vàng, đục Thơm, chua Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt M4 Vàng sáng, đều Vàng, đục Thơm, chua Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt M5 Vàng sáng, đều Vàng đục Thơm, chua Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt M6 Vàng Vàng, đục Mùi nồng, chua Mùi nồng, chua Dòn Sánh, không nhớt M7 Vàng chín Vàng, hơi đục Mùi rất nồng, chua Mùi nồng, chua Kém dòn Không sánh 72 M1 Vàng không đều,hơi xanh đen Vàng đục Không thơm, chua Không thơm, chua Kém dòn Không sánh, nhớt, có váng M2 Vàng đều Vàng đục Thơm, chua Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt M3 Vàng Vàng đục Thơm, chua Thơm, chua Dòn Ãnánh, không nhớt M4 Vàng sáng, đều Vàng đục Thơm, chua Thơm chua Dòn Sánh, không nhớt M5 Vàng sáng, đều Vàng, đục Thơm, chua Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt M6 Vàng Vàng, đục Mùi nồng, chua Mùi nồng, chua Dòn Sánh, không nhớt M7 Vàng chín Vàng, đục Mùi nồng, chua Mùi nồng, chua Kém dòn Hơi sánh, không nhớt Qua các bảng và đồ thị trên ta thấy rằng mẫu dưa muối có xử lý mhiệt ở nhiệt độ 60-700C thì hàm lượng axit lactic tạo thành nhiều nhất và thời gian đạt được nồng độ axit lactic cần thiết ngắn nhất. Theo dõi sự thay đổi cảm quan của các mẫu dưa trong quá trình muối chua kết quả thu được ở bảng 12. Sau một ngày muối ( 24 giờ) thì chưa có sự biến đổi đáng kể, dưa có màu vàng xanh, ít chua, nước trong. Nhưng sang ngày thứ hai thì đã có sự thay đổi các mẫu muối có bổ sung chủng dưa chuyển sang màu vàng, có vị chua dịu còn nước dưa thì đục, sánh nhưng không nhớt. Mẫu muối có nhiệt độ dịch 60-700C thì dưa có các giá trị cảm quan tốt nhất. Dưa có màu vàng sáng, vàng đều, mùi thơm đặc trưng, vị chua dịu, còn nước dưa đục, sánh nhưng không nhớt. Đối với mẫu nhiệt độ dịch dùng muối dưa là 80-1000C , nhiệt độ cao có tác dụng tiêu diệt phần lớn vi sinh vật có trong dưa nguyên liệu nhưng lại làm thay đổi nhiều đến chất lượng của dưa sản phẩm: dưa có màu vàng ủng, đặc biệt có mùi nồng.Các mẫu muối có bổ sung chủng nhưng ở nhiệt độ thường và ở nhiệt độ 500C thì dưa tạo thành có chất lượng tốt nhưng lại xuất hiện váng sau 2-3 ngày muối nên ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm . Như vậy chuáng tôi đi đến kết luận nhiệt độ thích hợp của dịch dùng để muối dưa cải bẹ là 60-700C. III.3.3. Chọn nồng độ tiếp giống thích hợp Quá trình lên men lactic trong rau quả muối chua là kết quả hoạt động của hệ vi sinh vật bao gồm chủ yếu là vi khuẩn và nấm men. Ngoài những vi khuẩn lactic phát triển còn có những vi sinh vật lạ khác cũng phát triển như vi khuẩn axetic, vi khuẩn butiric, vi khuẩn gây thối và một số loại nâm mốc. Để tạo ra sản phẩm muối chua có chất lượng tốt cần tạo điều kiện cho vi khuẩn lactic hoạt động mạnh và ức chế các vi sinh vật lạ. Mục đích của việc đưa chủng vi khuẩn lactic vào quá trình muối chua rau quả là làm tăng hàm lượng vi khuẩn lactic trong môi trường lên men do đó chúng sẽ phát triển mạnh , lượng axit lactic tạo thành nhiều, pH môi trường giảm nhanh do đó ức chế được các vi sinh vật khác. Nếu hàm lượng vi khuẩn bổ sung vào ít thì quá trình lên men lactic diễn ra chậm lượng axit tạo thành ít nên kéo dài thời gian lên men, nhưng nếu lượng tế bào vi khuẩn đưa vào nhiều quá có thể ảnh hưởng tới quá trình lên men mặt khác không đảm bảo vấn đề kinh tế khi sản xuất ở quy mô công nghiệp. Do đó cần tìm ra nồng độ tế bào vi khuẩn bổ sung thích hợp. Theo như tham khảo một số những nghiên cứu trước cho thấy rằng trong quá trình muối chua rau quả thì nồng độ tiếp giống 2-4% so với khối lượng nguyên liệu (tương đương với 2.108 - 4.108 tế bào/1g nguyên liệu). Do đó chúng tôi chọn nồng độ tiếp giống 0-4% để tiến hành thí nghiệm. Kết quả thu được ở bảng 13 và đồ thị 12: Bảng 13 : Ảnh hưởng của nồng độ tiếp giống tới sự tạo thành axit lactic trong quá trình muối chua cải bẹ, ml NaOH 0,1N/ 100 ml dịch Thời gian, giờ NaOH 0,1N, ml/100 ml 0% 1% 2% 3% 4% 0 0 0 0 0 0 24 6,5 24,5 32,5 40 37,5 48 26 31 55 65 63,5 72 32 37 56,5 66 62 96 36,5 40 56 61,3 58,5 Đồ thị 12 : Ảnh hưởng của nồng độ tiếp giống tới sự tạo thành axit lactic trong quá trình muối chua cải bẹ, ml NaOH 0,1N/ 100 ml dịch Kết quả cho thấy rằng mẫu muối chua tự nhiên (nồng độ tiếp giống 0%) và mẫu có nồng độ tiếp giống 1% thì hàm lượng axit lactic tạo thành ít nhất. Nồng độ tiếp giống 3 và 4% thì lượng axit lactic tạo thành nhiều nhất nhưng ở nồng độ 4% thì thấp hơn so với 3%. Điều này có thể được giải thích là do ở 4% vi khuẩn chủ yếu sử dụng đường để tạo sinh khối do đó lượng axit lactic tạo thành ít hơn. Đối với nồng độ 2, 3, 4% thì hàm lượng axit lactic đạt cực đại sau khoảng 48 giờ, sau đó không đổi hoặc giảm một chút còn mẫu lên men tự nhiên và nồng độ 1% thì hàm lượng axit tạo thành tăng dần . Như vậy trong quá trình muối chua cải bẹ, nồng độ tiếp giống thích hợp là 3% so với nguyên liệu ban đầu (hàm lượng tế bào là 3.108 tế bào /1g nguyên liệu).III.3.4. Quy trình công nghệ muối chua rau quả Từ những kết quả nghiên cứu ở trên, chúng tôi đưa ra quy trình công nghệ muối chua rau quả , được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau : Nguyên liệu Lựa chọn, rửa sạch, để ráo Pha dịch (muối 6%; đường 2%; nước 100%) Chủng vi khuẩn thuần khiết Đun dịch (60 - 700C) Xếp vại Nhân giống Rót dung dịch Để nguội (nhiệt độ thường) 3% Nén vỉ, đậy kín Lên men Sản phẩm III.3.5. Ứng dụng trong một số sản phẩm rau quả khác Chúng tôi tiến hành nghiên cứu trên nguyên liệu là rau cải bẹ, sau khi đã rút ra quy trình công nghệ như trên chúng tôi áp dụng trên một số sản phẩm rau quả khác như su hào, dưa chuột, cà chua, su hào, cà pháo. Chúng tôi tiến hành muối chua mỗi loại nguyên liệu theo phương pháp lên men tự nhiên và muối theo quy trình như đối với dưa cải bẹ. Tiến hành lên men cho tới khi sản phẩm đạt được độ chua cần thiết. Giữa mẫu lên men tự nhiên và lên men có bổ sung chủng vi khuẩn có sự khác nhau nhiều đặc biệt là thời gian cần thiết để tạo sản phẩm và các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm. Kết quả được thể hiện ở bảng 14 và 15 sau: Bảng 14: Thời gian lên men cần thiết để tạo sản phẩm Nguyên liệu Thời gian , ngày Dưa cải bẹ Dưa chuột Cà chua Su hào Cà pháo Lên men tự nhiên 4 5-6 15-17 13-15 4-5 Muối theo quy trình trên 2 3-4 8-9 7-8 3 Bảng 15 : Các chỉ tiêu cảm quan của sản phẩm Nguyên liệu Các chỉ tiêu cảm quan Sản phẩm Độ sánh của nước Màu sắc Mùi vị Trạng thái Cải bẹ Muối chua tự nhiên Vàng xỉn, không đều Chua, mùi lạ Kém dòn Sánh, nhớt và có váng Muối có chủng Vàng sang, đều Thơm, chua dịu Dòn Sánh, không nhớt Dưa chuột Muối chua tự nhiên Vàng xanh Thơm, chua Kém dòn Nhớt, có váng Muối có chủng Vàng Thơm, chua Dòn Không nhớt, không váng Cà pháo Muối chua tự nhiên Vàng Chua, thơm Dòn Có váng Muối có chủng Vàng sáng, đều Chua, thơm Dòn Sánh, không váng Su hào Muối chua tự nhiên Vàng nhạt Chua, không thơm Dòn Không nhớt, có váng Muối có chủng Vàng đều Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt, không váng Cà chua Muối chua tự nhiên Xanh đen Chua Có váng, nhớt Muối có chủng Vàng hồng Thơm, chua Dòn Sánh, không nhớt Kết quả cho thấy, khi áp dụng quy trình muối chua như đối với cải bẹ thì có sự khác biệt lớn so với muối chua tự nhiên, đặc biệt là rút ngắn được thời gian lên men. Đối với các loại rau như cải bẹ, loại quả có kích thước nhỏ như cà pháo, dưa chuột thì sự chênh lệch về thời gian không nhiều. Nhưng đối với các loại củ quả, có kích thước lớn thì muối có bổ sung chủng có thể giảm thời gian lên men 5-6 ngày,trong công nghiệp đây là một vấn đề quan trọng. Khi muối có bổ sung chủng thì sản phẩm cho chất lượng cảm quan tốt hơn như màu vàng hơn, đồng đều hơn, hương thơm đặc trưng và đặc biệt nước không nhớt và không có váng trong khi đó muối chua tự nhiên thường xuất hiện váng sau 2-3 ngày muối. III.4. Nghiên cứu một số phương pháp thích hợp bảo quản sản phẩm Để bảo quản các sản phẩm dưa muối, chúng tôi đã sử dụng hai loại bao bì khác nhau là bao bì thủy tinh và bao bì PE. III.4.1. Bảo quản bằng bao bì thủy tinh Dưa sau khi muối 48 giờ, đã đạt được độ chua cần thiết, được rửa sạch, để ráo và xếp vào lọ thủy tinh, rót dịch bảo quản, sau đó được thanh trùng ở các chế độ khác nhau. Các bước thực hiện có thể được tóm tắt theo sơ đồ sau : Dịch bảo quản Dưa sản phẩm Đun sôi Rửa sạch Để ráo Lọc Xếp lọ Ghép nắp Thanh trùng Ở đây chúng tôi khảo sát các nhiệt độ và thời gian thanh trùng khác nhau và tiến hành kiểm tra hàm lượng vi sinh vật còn lại trong dưa sản phẩm ngay sau khi thanh trùng. Bảng 16: Ảnh hưởng của chế độ thanh trùng đến hàm lượng vi sinh vật trong dưa sản phẩm Nhiệt độ Thời gian, phút Hàm lượng vi sinh vật, tế bàox 106/ml 600C 650C 700C 5 35. 13,5 7,5 10 21,3 9,7 5,2 15 11 5,8 3,15 Mẫu kiểm chứng 120. Từ số liệu ở bảng trên, ta thấy hàm lượng vi sinh vật giảm một cách đáng kể sau khi thanh trùng, đặc biệt đối với các mẫu thanh trùng ở nhiệt độ 700C. Chúng tôi tiếp tục tiến hành theo dõi sự biến đổi cảm quan của các mẫu dưa. Sau hai tuần bảo quản, giữa các mẫu dưa hầu như không có sự khác biệt về màu sắc dưa sản phẩm, độ giòn, độ trong của dịch, tuy nhiên các mẫu thanh trùng ở nhiệt độ 700C có mùi nồng hơn so với các mẫu thanh trùng ở chế độ nhẹ hơn. Sang đến tuần bảo quản thứ bốn đã bắt đầu xuất hiện sự biến đổi cảm quan của các mẫu dưa, kết quả được thể hiện ở bảng 13 : chúng tối ký hiệu các mẫu dưa thí nghiệm như sau : 60-5 có nghĩa là nhiệt độ thanh trùng là 600C và thời gian thanh trùng là 5 phút, các mẫu khác có ký hiệu tương tự. Bảng 17 : Thay đổi cảm quan của các mẫu dưa trong quá trình bảo quản (sau bốn tuần bảo quản) Mẫu Các giá trị cảm quan Màu sắc, mùi vị của dưa Màu sắc độ trong của nước Trạng thái dưa 60-5 Vàng xỉn, vị chua, mùi thối Đục, có mốc và váng Kém dòn 60-10 Vàng xỉn, vị chua, mùi thối Đục, có mốc và váng Kém dòn 60-15 Vàng, vị chua, Đục Dòn 65-5 Vàng xỉn, vị chua, mùi thối Đục, có mốc Kém dòn 65-10 Vàng, vị chua dịu Hơi đục Dòn 65-15 Vàng sáng, vị chua dịu, mùi thơm Trong, mùinồng, chua Dòn 70-5 Vàng sáng, vị chua dịu, mùi thơm Trong, mùi thơm Dòn 70-10 Vàng sáng, chua dịu, mùi hơi nồng Trong, mùinồng Dòn 70-15 Vàng sáng, chua dịu, mùi nồng Trong, mùi nồng Dòn Qua bảng trên, ta thấy nước dưa của các mẫu thanh trùng ở chế độ nhiệt 600C (5, 10, 15 phút), 650C (5, 10 phút) đã bắt đầu bị vẩn đục, dưa không còn giữ được màu vàng sáng như trước nữa. Lúc này vi sinh vật bắt đầu hoạt động mạnh làm cho dưa có màu vàng xỉn, đôi chỗ có màu đen, dưa không còn mùi thơm đặc trưng nữa mà có mùi thối do dưa bị hỏng, nước dưa thì vẩn đục và bắt đầu xuất hiện váng và nấm mốc phát triển. Mùi nồng của các mẫu dưa thanh trùng ở 700C trong thời gian 10, 15 phút và mẫu thanh trùng ở 650C trong thời gian15 phút giảm đi sau ba tuần bảo quản nhưng so sánh các chỉ tiêu cảm quan của các mẫu này với mẫu thanh trùng ở nhiệt độ 700C trong 5 phút, chúng tôi kết luận chế độ thanh trùng 700C trong thời gian 5 phút là thích hợp nhất đối với bao bì thủy tinh. III.4.2. Bảo quản bằng bao bì PE Trên thế giới hiện nay, để bảo quản các sản phẩm rau quả muối chua người ta sử dụng nhiều bao bì PE. Vì nó có ưu điểm là vận chuyển đơn giản, giá thành rẻ, còn làm tăng giá trị cảm quan cho sản phẩm. Nhưng ở Việt Nam để bảo quản các sản phẩm muối chua người ta sử dụng chủ yếu là bao bì thủy tinh, còn loại bao bì PE vẫn chưa được sử dụng nhiều. Chính vì thế chúng tôi muốn khảo sát xem khả năng bảo quản sản phẩm rau quả muối chua của loại bao bì này. Nhưng do điều kiện thí nghiệm đặc biệt là thời gian nên chúng tôi chỉ khảo sát sơ bộ một số điều kiện như chế độ và thời gian hút chân không thích hợp cho sản phẩm dưa cải bẹ. Chúng tôi tiến hành hút chân không ở ba mức độ khác nhau đó là: Độ hút chân không 94%, 96% và 98%, thời gian hút chân không là 2, 3 và 4 phút. Độ hút chân không 94% có nghĩa là lượng không khí được hút ra khỏi bao bì là 94%, tức là lượng không khí còn lại trong bao bì là 6%. Kết quả cho thấy độ hút chân không 96% trong thời gian 2 phút là tốt nhất. Còn khi hút ở 94% thì lượng không khí còn lại trong bao bì nhiều sẽ tạo bọt còn khi hút ở 98% thì bao bì sẽ bị nhăn rúm lại, làm giảm giá trị cảm quan của sản phẩm. Đối với bao bì PE thì khi bảo quản ngoài ánh sáng ở nhiệt độ thường do bao bì có khả năng hấp thụ ánh sáng nên chỉ sau 2 tuần bảo quản màu của sản phẩm đã bị nhạt. Còn bảo quản trong điều kiện bóng tối thì kết quả cho thấy sau 4 tuần bảo quản màu sắc tự nhiên của sản phẩm vẫn giữ được. Chúng tôi vẫn đang tiếp tục nghiên cứu phương pháp bảo quản thích hợp đối với loại bao bì này. KẾT LUẬN 1/ Đánh giá được một số chỉ tiêu nguyên liệu của một số loại rau quả như : cải bẹ, cà pháo, cà chua, dưa chuột. 2/ Đã phân lập được 2 chủng vi khuẩn lactic từ môi trường rau cải bẹ muối chua tự nhiên, xác định được tính chất và phân loại sơ bộ chúng. 3/ Từ hai chủng phân lập được và một chủng Lactococcus lactis lên men tạo axit lactic từ rỉ đường mía Việt Nam của Viện công nghiệp thực phẩm chọn ra được một chủng thích hợp nhất cho quá trình muối chua dưa cải bẹ : chủng TL6. 3/ Ứng dụng chủng Lc.TL6 trong quá trình muối chua cải bẹ - Chọn được những điều kiện thích hợp cho quá trình nhân giống như : + Môi trường nhân giống : nước chiết rau cải bẹ + Nồng độ nhân giống : 4% + Nhiệt độ : 30-350C + Nồng độ muối bổ sung trong quá trình nhân giống : 4% - Phương pháp xử lý nguyên liệu : Nhiệt độ dịch dùng muối là 60-700C - Nồng độ tiếp giống thích hợp cho quá trình muối chua là : 3% - Đưa ra một quy trình công nghệ cho quá trình muối chua dưa cải bẹ - Áp dụng quy trình trên trong một số sản phẩm như cà pháo, su hào, dưa chuôt, cà chua. 4/ Chọn được phương pháp bảo quản thích hợp cho sản phẩm rau quả muối chua: - Bao bì thủy tinh thì chế độ thanh trùng 700C trong thời gian 5 phút - Bao bì PE thì chế độ hút chân không thích hợp là 96% trong thời gian 2 phút. Triển vọng và đề nghị Do thời gian còn hạn chế nên chúng tôi mới đạt được một số kết quả như trên, chúng tôi xin đưa ra một số triển vọng của đề tài: - Có thể sử dụng chủng vi khuẩn Lc.TL6 và quy trình công nghệ trên để sản xuất các sản phẩm rau quả muối chua ở quy mô công nghiệp. - Tiếp tục nghiên cứu về quá trình trình bảo quản, đặc biệt là bao bì PE. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ thanh trùng cũng như nồng độ chất bảo quản đến thời gian bảo quản đối với bao bì PE. - Nghiên cứu tiếp phương pháp tạo ra chế phẩm vi khuẩn lactic (dạng khô hoặc dưới dạng sữa) để sử dụng trực tiếp trong quá trình muối chua các sản phẩm rau quả.