Đề tài Phân Lập Staphylococus Aureus Trên Máu Bệnh Nhân

y. Tất cả các bệnh phẩm khác nên cho vào môi trường chuyên chở Cary Blair với que bông tẩm bệnh phẩm. Nếu cần gửi đi xa nên hàn nắp chai môi trường chuyên chở Cary Blair bằng paraffin và cho vào một hộp có 2 lớp, chèn bông cẩn thận cho khỏi vỡ; phiếu thử nghiệm chèn vào 2 lớp của hộp. Phải gửi ngay bệnh phẩm đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 23 ] ĐỊNH DANH 1. Staphylococci 8. Brucella 2. Streptococci 9. Haemophillus influenza 3. Neisseria gonorrhoeae 10. Pseudomonas 4. Neisseria meningitidis 11. Listeria monocytogenes 5. Bacillus anthracis 12. Enterobacteriaceae trừ shigella 6. Pneumococci 13. Leptospira 7. Yersinia pestis 14. Bacteroides và các vi khuẩn kị khí liên hệ Sơ đồ 3: Qui trình phân lập và định danh các tác nhân gây gây bệnh từ máu người MÁU LẤY VÔ KHUẨN Môi trường cấy máu lỏng BHI – SPS – PABA ủ 37oC/24 giờ - 10 ngày Có vi khuẩn mọc Không có vi khuẩn mọc Cách 3 ngày cấy lại trên môi trường thioglycollate lỏng ủ Có vi khuẩn mọc Không có vi khuẩn mọc Báo cáo kết quả : “ không có vi khuẩn mọc sau khi ủ 10 ngày ”. Nhuộm Gram khảo sát hình thể vi khuẩn  Cấy lại trên môi trường thích hợp.  Làm trắc nghiệm sinh hóa.  Trắc nghiệm huyết thanh ngưng kết. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 24 ] Sơ đồ 4: Qui trình thí nghiệm sinh hóa phát hiện Staphylococcus aureus Khúm vi khuẩn trên BA Nhuộm gram: Cầu khuẩn gram (+) Catalase Catalase (-) Catalase (+) Oxidase Oxidase (-) Oxidase (+) Micrococci Định danh theo qui trình Streptococci Cấy tăng sinh trên BA Chọn khúm vi khuẩn mọc COAGULASE STAPHYLATEX COAGULASE (+) COAGULASE (-) Staphylococcus aureus Staphylococci coagulase (-) (SCN) Kháng NOUVOBIOCIN S. Saprophyticus (+) SCN khác (-) Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 25 ] 2.1. Cấy máu 2.1.1. Chỉ định cấy máu Phải chỉ định cấy máu trước các trường hợp nhiễm trùng có thể có du khuẩn huyết tạm thời (transient bacteremia) hay nhiễm trùng huyết (septicemia). Do vậy, nên chỉ định cấy máu trước các bệnh nhân có một trong các triệu chứng như: sốt, ớn lạnh, lạnh run, tiếng thổi tim (cardiac murmur) nghi ngờ viêm nội tâm mạc, có xuất huyết ở da hay niêm mạc, xuất huyết dạng sao (splinder) trên móng tay, choáng. 2.1.2. Thời điểm cấy máu Phải cấy máu trước khi bệnh nhân dùng kháng sinh hệ thống. Trong bệnh viện, bác sĩ phải cho cấy máu trước khi bắt đầu cho bệnh nhân dùng thuốc kháng sinh. Tuy nhiên trong các trường hợp bệnh nhân đang điều trị kháng sinh nhưng các triệu chứng của du khuẩn huyết hay nhiễm trùng huyết vẫn không thuyên giảm thì bác sĩ cũng nên cho chỉ định cấy máu để phát hiện tác nhân vi khuẫn gây nhiễm trùng. Thời điểm tốt nhất để cấy máu là khi bệnh nhân bị ớn lạnh hay đang lạnh run trước khi sốt, hay lúc bệnh nhân đang lên cơn sốt. Có thể cấy máu 2 lần trong vòng 1 giờ đầu. 2.1.3. Cách lấy máu để cấy Lấy máu tĩnh mạch bằng phương pháp vô trùng (sát trùng da bằng cồn 70%, chờ khô rồi mới chọc kim lấy máu). Thể tích máu được lấy để cấy chiếm 1/10 thể tích môi trường cấy máu. Thông thường lấy 3-5ml máu để cấy vào môi trường cấy máu có thể tích 50ml. Đối với trường hợp bệnh nhân là trẻ em, lấy chỉ 2-3ml cũng được. 2.1.4. Môi trường cấy máu BHI, TSB, hay Columbia Broth cho vi khuẩn hiếu khí. Để cấy yếm khí, thêm vào môi trường các chất khử như Thioglycollate, L – cystein. Để kháng đông, tốt nhất là dùng Sodium Polyanethol Sulfonate (SPS), nếu không có thì dùng citrate hay heparin. 2.2. Theo dõi cấy máu Chai cấy máu được ủ trong tủ ấm 35oC hay 37oC và theo dõi mỗi ngày trong 7 ngày xem có dấu hiệu vi khuẩn mọc hay không trong môi trường cấy máu lỏng: (1) có hạt đóng trên mặt hồng cầu, (2) đục đều hay có màng, (3) tiêu huyết, (4) đông huyết tương, (5) có gas, (6) có hạt trắng trong lớp hồng cầu hay mặt lớp hồng cầu. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 26 ] Nếu là chai cấy máu có 2 phase thì trước khi ủ và mỗi ngày sau khi quan sát mặt thạch của phase đặc xem có khúm vi khuẩn mọc hay không; nếu không có khúm vi khuẩn mọc trên phase đặc, nghiêng tráng phase lỏng tráng lên phase đặc. Bất cứ lúc nào phát hiện có dấu hiệu vi khuẩn mọc hay nghi ngờ vi khuẩn mọc, tiến hành cấy phân lập ngay, tốt nhất là trên thạch bỗ dưỡng nhất là thạch nâu có bổ sung (CAXV = Chocolae Agar Isovitex), nếu không có thì cấy trên thạch máu BA hay thạch nâu CA, đồng thời làm một phết nhuộm Gram khảo sát trực tiếp. Nếu kết quả nhuộm Gram thấy có vi khuẩn, có thể làm kháng sinh đồ trực tiếp từ chai cấy máu. Nếu trên phase đặc có vi khuẩn mọc thì tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ. Có vi khuẩn rất dễ bị ly giải sau khi mọc trên môi trường lỏng như S.pseumoniae, do đó nếu có thể thì nên làm một cấy truyền mù lên mặt thạch phân lập sau khi ủ chai cấy máu qua đêm hoặc sau 24 giờ. Sau 7 ngày theo dõi chai cấy máu, phải cấy truyền mù một lần nữa để chắc chắn trước khi trả lời cấy máu âm tính. Các vi khuẩn hay nấm thường là các tác nhân nhiễm trùng huyết hay nhiễm nấm huyết Gram (-) Gram (+) và nấm men Escherichia Coli Staphylococcus aureus Klebsiella spp. S.epidermidis Enterobacter spp. S.pyogenes (nhóm A) Proteus S.agalactiae (nhóm B) Salmonella typhi Streptococci, tiêu huyết α (viridians) Samnella ( ngoài S.typhi) Streptococcus pneumonia Pseudomonas aeruginosa E. faecalis (nhóm D) Neisseria meaningitidis Listeria monocytogenes Haemophilus influenza Clostridium perfringens Bacteroides fragilis Peptococcus spp. Brucella spp. Peptostreptococcus spp. Pseudomonas pseudomallei Candida albicans và các nấm men khác 2.3. Vấn đề vi khuẩn ngoại nhiễm Từ da:  Staphylococcus epidermidis  Propionobacterium acnes Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 27 ]  Diphtheroides. Từ môi trường xung quanh:  Clostridium spp.  Acinetobacter spp.  Bacillus spp. Loại trừ được ngoại nhiễm khi kết quả cấy máu cho thấy vi khuẩn:  Cùng phân lập được từ 2 chai mẫu cấy từ một bệnh nhân.  Cùng phân lập được từ một bệnh phẩm khác cũng trên bệnh nhân đó.  Vi khuẩn mọc nhanh.  Các dòng vi khuẩn có cùng type sinh học và đề kháng như nhau với kháng sinh. Trả lời kết quả cấy máu dương tính Tất cà các vi khuẩn mọc được trong chai cấy máu đều phải trả lời cho bác sĩ điều trị. Tham khảo với bác sĩ lâm sàng để rút kinh nghiệm trong các trường hợp ngoại nhiễm. Các vi khuẩn nghi ngờ là ngoại nhiễm, không cần thiết phải làm kháng sinh đồ và thông báo cho các bác sĩ biết sự nghi ngờ này. Bảng 3: Những vi khuẩn có thể tìm thấy trong mô và dịch của cơ thể STT Mô hay bệnh phẩm Vi khuẩn thƣờng thấy Vi khuẩn gây bệnh 1 Máu Không có (bệnh phẩm có thể bị nhiễm bởi các vi khuẩn thường sống trên da) 1. Staphylococcus aureus 2. Β Hemolytic streptococci 3. Enterococci 4. Pneumococci 5. Neisseria menigitidis 6. Neisseria gonorrhoeae 7. Các vi khuẩn đường ruột ngoại trừ Shigella 8. Các loại Pseudeomonas 9. Haemophilus influenza 10. Yersinia pestis 11. Brucella 12. Bacteroides và các vi khuẩn kỵ khí liên hệ 13. Listeria cynomotogenes 14. Bacillus Anthracis 15. Leptospira 2 Mũi, yết 1. α Hemolytic 1. Hemolytic Streptococi thường Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 28 ] hầu, cuống họng và miệng Streptococi 2. Neisseria catarrhalis 3. Staphylococci (coagulase âm). 4. Đôi khi Staphylococus aureus. 5. Haemophius haemolyticus. 6. Haemophilus 7. influenza 8. Dipthroid bacilli. 9. Non hemolutic Streptococci. 10. Pneumococci 11. Đôi khi Coliform bacilli là nhóm A, đôi khi nhóm B và C 2. Corynebacterium diptheriae 3. Bordeltella pertussis 4. Meningococci. 5. Staphylococus aureus (coagulase dương) khi có nhiều. 6. Haemophilus influenza khi có nhiều. 7. Coliform bacilli khi có nhiều. 8. Pneumococci khi có nhiều. 9. Đôi khi Yersinia pestis. 10. Vi khuẩn loại Fusospiochets 3 Đàm Giống như ở yết hầu, cuống họng và miệng 1. Pneumococci khi có nhiều 2. Klebsiella Pneumonniae. 3. Hemolytic Streptococci khi có nhiều. 4. Hemolytic Streptococci 5. Staphylococcus aureus khi có nhiều. 6. Yersinia Petis. 7. Mycobacterium tuberculosis 8. Bordeltella pertussis 9. Coliformbacilli các loại 10. Pseudeomonas các loại 11. Proteus khi có nhiều 4 Vết thương, Nhọc bọc và vết phỏng Các loại vi khuẩn thường thấy trên da 1. Diptheroid bacilli 2. Staphylococci (Coagulase âm) 3. Coliform bacilli 4. Các loại bacilli 1. Staphylococus aureus (coagulase dương). 2. Staphylococus pyogenes 3. Coliform bacilli 4. Enterococci 5. Các loại Proteus 6. Các loại Pseudomonas 7. Các loại Clostrdium 8. Bacteroides Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 29 ] 9. Cocci kỵ khí 10. Corynebacterium diptheriae hiếm thấy. 11. Bacillus anthracis hiếm thấy 5 Cơ quan bài tiết, cơ quan sinh dục, niệu đạo và âm hộ. 1. Coagulase âm Staphylococci 2. Coliform bacilli 3. Enterococci 4. Dorderlein’S bacilli 5. Mycobacterium không gây bệnh 6. Haemophius Vaginalis. 7. Bacteroides 1. Neisseria gonorrhoae 2. Treponema pallidum 3. Haemophius ducreyi 4. Haemophius Vaginalis khi có nhiều. 5. Listeria monocytogenes 6. Enterococci khi có nhiều 7. Donovania granulomatis 6 Phân 1. Escherichia coli 2. Enterococci 3. Bacteroides 4. Clostridia 5. Staphylococci 6. Các loại proteus 7. Các loại Pseudomonas 8. Các loại Klebsiella 9. Các loại Enterobacter 10. Các loại Serratia 1. Các loại Samonnela 2. Các loại Shigella 3. Các loại Arizona 4. Vibrio cholera 5. Vibri parahemolyticus 6. Escherichia coli 7. Staphylococci khi có nhiều 8. Các loại proteus khi có nhiều nhất là ở trẻ em. 9. Các loại Pseudomonas khi có nhiều nhất, nhất là ở trẻ em. 10. Các loại Providencia 11. Citrobacter 12. Đôi khi Serratia. 13. Đôi khi Enterobacter. 14. Đôi khi Klebsiella. 15. Edwardsiella tarda 7 Nước tiểu 1. Staphylococci (Coagulase âm) 2. Diptherroid bacilli 3. Coliform bacilli 4. Enterococci 5. Các loại Bacilli 6. α và β Hemolyticus streptococci. 7. Các loại Proteus 8. Lactobacilli 1. Escherichia coli. 2. Klebsiella – Enterobacter – Serratia. 3. Các loại Proteus – các loại Providecia. 4. Pseudomonas aeruginosa 5. Enterococci (Streptococus fecalis) khi có nhiều. 6. Coagulase – Possitive và negative Staphylococci. 7. Các loại Haemophius, có thể là Haemophius Vaginalis. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 30 ] 8. Hemolytic streptococci thường là nhóm B và D. 9. Neissinia gonorrhoeae 10. Mycobacterium tuberculosis. 11. Các loại Leptospira. 12. Các loại Alcaligenes. 13. Các loại Samonella. 3.1. Các thử nghiệm sinh hóa định danh 3.1.1. Thử nhiệm β-Lactamase  Nguyên tắc Những vi khuẩn có sinh ra β-lactamase sẽ làm đĩa thuốc thử chứa dài chất là Nitrocefin, là một kháng sinh thuộc họ Cephalosporin đổi màu từ vàng sang đỏ. Kết quả thử nghiệm này dễ dàng phát hiện bằng mắt thường.  Cách thực hiện Dùng kẹp sạch lấy một đĩa β-lactamase quệt trực tiếp lên khuẩn lạc của chủng vi khuẩn cần thử nghiệm. Quan sát sự đổi màu của β-lactamase.  Cách đọc kết quả: [ - ]: nếu đĩa không có sự thay đổi màu. [ +]: nếu quệt khúm vi khuẩn trên đĩa chuyển sang từ màu vàng sang màu đỏ. Ở hầu hết các vi khuẩn thì sự thay đổi màu không quá 5 phút. Tuy nhiên, một số chủng Staphylococci có thể đến 1 giờ. Vi khuẩn Kết quả Thời gian đọc KQ Tƣơng ứng với KQ Kháng sinh đồ Staphylococcus aureus [+] 1 giờ Đề kháng với Penicillin, Ampicillin, Carbenicillin, Ticarcillin. Có thể nhạy với Cephalothin, Methicillin, Oxacillin, Nafcillin và các Penicillin đề kháng Penicillinase. H. influenza [+] 1 phút Đề kháng với Ampicillin, nhạy với Cephalosporin. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 31 ] N.gonorrhoeae M.catarrhalis [+] 1 phút Kháng với Penicillin E.faecalis [+] 5 phút Kháng với Penicillin và Ampicillin Vi khuẩn yếm khí [+] 30 phút Có lẽ là Bacteroides spp. Có thể kháng với Penicillin và Cephalosporin kể cả Cefotaxime và hiếm với Cefoxitin. 3.1.2. Trắc nghiệm Catalase:  Công dụng: Chẩn đoán phân biệt khúm khuẩn Staphylococci với khúm khuẩn Pneumonocci và Steptococci.  Nguyên tắc: Tụ cầu khuẩn có enzyme catalase sẽ làm phóng thích O2 từ nước Oxy già tạo hiện tượng sủi bọt. H2O2 H2O + 1 2 O2 Kỹ thuật: (trên kính) Nhỏ một giọt nước Oxi già 30% trên một kính đựng vật sạch. Chấm khuyên cấy vô khuẩn vào khóm vi khuẩn tinh khiết muốn thử, rồi cho khuyên chạm vào giọt H2O2. Quan sát sự sủi bọt ngay tức khắc nếu là phản ứng dương. Kết quả: Giòng Catlase Staphylococci + Pneumonococci - Streptococci - Catalse Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 32 ]  Chú ý: + Tránh không được để khuyên cấy chạm vào thạch máu lấy theo hồng cầu trong thạch, vì hồng cầu này sẽ làm phản ứng dương giả. + Khuyên cấy khuẩn bằng platin sẽ cho phản ứng dương giả. 3.1.3. Khả năng tăng trưởng và lên men trên môi trường M.S.A (Chapman) Các loại Tụ cầu khuẩn đều tăng trưởng được trên môi trường MSA chứa 7,5% NaCl. Riêng gốc gây bệnh Staphylococcus aureus do có khả năng lên men được trên đường Mannitol nên sẽ tạo một vùng màu bao quang khóm vi khuẩn. 3.1.4. Trắc nghiệm Coagulase  Công dụng: Được dùng để định danh Staphylococcus aureus  Nguyên tắc: Vi khuẩn Staphylococcus aureus có enzyme coagulase có khả năng làm đông huyết tương. Loại coagulase kết dính được xác định bằng kỹ thuật trên kính. Còn loại coagulase tự do được xác định bằng kỹ thuật trong ống nghiệm kỹ thuật. Kỹ thuật “trong ống” cho kết quả chắc chắn hơn kỹ thuật “trên kính”. 3.1.5. Trắc nghiệm Novobiocin:  Công dụng: dùng định danh Staphylococcus saprophyticus.  Nguyên tắc: Staphylococcus saprophyticus kháng cự được với Novobiocin. Nếu dùng đĩa giấy tẩm 5µg nouvobiocin (phương pháp khuếch tán kháng sinh trên thạch) đường kính vùng bị chặn đối với Staphylococcus saprophyticus nhỏ hơn 16mm.  Kỹ thuật:  Cấy vi khuẩn dòng staphylococci cần phân loại lên mặt thạch T.S.A  Đặt đĩa giấy ta,63 Nouvobiocin lên trên.  Ủ 37oC trong 18 – 24 giờ. Đo đường kính vùng trưởng bị chặn. Giòng Catlase Stap.aureus + Stap.epidermidis + Stap.saprophyticus - Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 33 ] Bảng 4: Phân biệt một số loài Staphylococcus gây bệnh Môi trƣờng Chapman S.aureus S.epidermidis S.saprophyticus Tăng trưởng + + + Acid hóa Mannitol Acid (vàng) Thay đổi Thay đổi Màu sắc khóm khuẩn Xám, kem, hoặc vàng Trắng Trắng Nhạy cảm in viro với Nouvobiocin 3.1.6. Thử nghiệm SAUTlATEX (STAPHYLATEX)  Nguyên tắc: Vi khuẩn Staphylococcus aureus phân biệt được với các vi khuẩn Staphylococci Coagulase [-] khác là có protein A trên vách tế bào và có yếu tố kết cụm (clumping factor) trong khi các vi khuẩn Staphylococci Coagulase [-] không có các yếu tố này. SAUlatex, thuốc thử A phát hiện được protein A, và thuốc thử B phát hiện được yếu tố kết cụm của S. aureus. Thử nghiệm dựa trên nguyên tắc của phản ứng tụ, thực hiện được dễ dàng trên lame soi kính hiển vi, và kết quả đọc bằng mắt thường.  Thành phần thuốc thử: SAUlatex gồm các thuốc thử sau:  Thuốc thử A: là dung dịch laex dùng phát hiện protein A trên vách của vi khuẩn S. aureus mà không gặp trên các vách của vi khuẩn Staphylococci Coagulase [-] khác.  Thuốc thử B: là dung dịch thuốc thử phát hiện các yếu tố kết cụm có trên S. aureus Hộp SAUlatex chưa dùng hay sau khi dùng phải giữ trong tủ lạnh 4oC, SAUlatex bền đến 2 năm kể từ sau ngày sản xuất.  Phương pháp thực hiện thử nghiệm Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 34 ] Chuẩn bị một lame soi kính hiển vi mới, lau sạch bằng cồn, rồi sau đó lau khô. Nhớ khi cầm lame phải cầm trên cạnh lame chứ không cầm trên mặt lame. Dùng bút mỡ hay bút acetone kẻ trên lame hai ô 18 x 18mm kề nhau. Nhỏ trên góc 2 ô, mỗi ô một giọt nước muối sinh lý hay nước cất thể tích cở 10-20µl. Làm một huyền dịch vi khuẩn thử nghiệm thật đục đều trong giọt nước muối sinh lý hay nước cất này, tránh có cặn. Nhỏ lên một góc khác của ô vuông 1 giọt thuốc thử A cũng có thể tích cở 10µl. Dùng vòng cấy hay que tăm gổ sạch trộn giọt huyền dịch vi khuẩn vào giọt thuốc thử A, trộn đều trong 30 giây đến 1 phút rồi quan sát bằng mắt thường xem có hiện tượng tụ hay không. Nếu có, vi khuẩn thử nghiệm được xác định là S. aureus. Nếu không có hiện tượng tụ, nhỏ tiếp vào một giọt thuốc thử B cũng có thể tích 10µl vào ô thứ hai, rồi cũng dùng que gỗ sạch hay vòng cấy trộn tiếp trong 30 giây đến 1 phút nữa. Nếu có hiện tượng kết tụ, vi khuẩn thử nghiệm được xác định là S. aureus. Nếu vẫn không kết tụ, xác định vi khuẩn thử nghiệm là staphylococci coagulase. 3.2. Phƣơng pháp nhuộm Gram 3.2.1. Nguyên tắc Khi nhuộm vi khuẩn với thuốc màu Crystal Violet và một chất gắn màu Iodine, nếu ta tẩy màu bằng cồn 95%, có một số vi khuẩn vẫn giữ chặt màu tím của Crystal Violet, đó là nhóm Gram (+). Một số khác bị tẩy mất màu tím vì màng tế bào thiếu chất chuyên biệt dùng kết hợp với Crystal Violet, đó là nhóm Gram (-). Khi nhuộm lại với dung dịch Safranin 0,5%, nhóm Gram (+) vẫn giữ màu tím, còn nhóm Gram (-) sẽ bắt màu đỏ. 3.2.2. Dụng cụ và thuốc nhuộm:  Dụng cụ  Khuyên cấy khuẩn.  Đèn cồn.  Kính đựng vật (lame) sạch.  Bút chì mở.  Chai nhỏ giọt đựng nước muối 0,85%  Đồng hồ phút.  Thuốc nhuộm  Dung dịch Crystal Violet.  Dung dịch Iodine.  Cồn 95%.  Dung dịch Safranin 0,5% hay dung dịch Carbon Fuchsin 1/10. 3.2.3. Kỹ thuật Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 35 ]  Mẫu thử làm phiến phết Nếu là lứa cấy lỏng: tùy theo độ đục của lứa cấy, ta lấy 1 giọt nhỏ hay lấy đầy 2,3 khuyên cấy khuẩn để làm phiến phiết. Nếu là lứa cấy trên môi trường đặc: dùng khuyên cấy khuẩn chấm 1 khóm vi khuẩn riêng rẽ, làm huyền trọc trong 1 giọt nước muối trên kính, xong trải mỏng thành phiến phết. Nên phân tán đều, không dầy, để có thể quan sát được từng tế bào vi khuẩn.  Kỹ thuật làm phiến phết.  Cầm que cấy thật thẳng đứng, đầu khuyên đặt trên ngọn lửa đèn cồn và đốt đỏ đầu que cấy.  Để nguội lấy 1 khuyên cấy đầy bệnh phẩm.  Đặt khuyên bệnh phẩm vào giữa tấm kính, cho áp suất vào mặt kính, phết đều trên kính thành những hình bầu dục với diện tích 1,5 x 2,5cm.  Đốt đỏ đầu que cấy để khử khuẩn.  Lưu định phiến phết  Phiến phết phải được để khô tự nhiên trong không khí, hoặc hơ nhẹ trên ngọn đèn. Sau đó, lưu định phiến phết bằng cách đưa nhanh tấm kính qua lại trên ngọn lửa độ 4 – 5 lần, để mặt có phiến phết ở phía trên. Không được hơ quá nóng sẽ làm các tế bào co lại.  Để nguội trước khi nhuộm và khoanh vùng bệnh phẩm bằng nút chì mở dễ tìm.  Kỹ thuật nhuộm  Phủ dung dịch Crystal Violet lên phiếm phết, để 1 phút. Rửa nước và nghiêng kính cho ráo.  Phủ dung dịch Iodine:  Lần I để 30 giây, đổ bỏ.  Lần II để 30 giây, đổ bỏ.  Phủ cồn 95% lên phiến phết, để 30 giây. Rửa nước và nghiêng kính cho ráo. Quan sát phiến phết, nếu còn những vết màu tim đậm phải tẩy màu lần nữa.  Nhuộm lại với dung dịch Safranin trong 30 giây.  Rửa nước, để khô và khảo sát với vật kính dầu. 3.2.4. Kết quả Theo phương pháp nhuộm Gram, vi khuẩn được phân biệt thành 2 nhóm:  Vi khuẩn Gram (+): giữ màu tím của Crystal Violet.  Vi khuẩn Gram (-): giữ màu đỏ của Safranin. 3.3. Kĩ thuật làm kháng sinh đồ Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 36 ] 3.3.1. Nguyên tắc Thuốc kháng sinh thấm trên đĩa, khuếch tán ra môi trường xung quanh ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn. Đường kính vùng bị chặn diễn đạt tính cảm ứng của vi khuẩn đối với thuốc kháng sinh, trường hợp không có vùng bị chặn, vì khuẩn kháng lại thuốc kháng sinh. 3.3.2. Chuẫn bị  Đĩa kháng sinh Là những đĩa giấy có đường kính 6mm được tẩm một dung dịch thuốc kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn. Đĩa kháng sinh phải được giữ ở tủ lạnh, có kèm theo chất làm khan nước, chống ẩm sức nóng và sự ngoại nhiễm làm hỏng đĩa.  Môi trường Môi trường tiêu chuẩn là MHA (Mueller Hinton Agar) pH: 7,4. Với các vi khuẩn khó tính phải cho thêm 5% máu. Môi trường được đổ vào hộp Petri với bề dày của thạch là 4mm. Bảo quản ở tủ lạnh và không được dùng sau 7 ngày. Trước khi dùng, phải lấy ra khỏi tủ lạnh và để cho đến khi đạt được nhiệt độ phòng.  Dung dịch chuẩn độ đục. Là dung dịch muối BaSO4  Dung dịch dự trữ A  BaCl2.2H2O 11,7g  ED qsb 1000ml  Dung dịch dự trữ B  H2SO4 1%  Dung dịch chuẩn độ đục  Dung dịch A 0,5ml  Dung dịch B 99,5ml  Vi khuẩn thử nghiệm Vi khuẩn sau khi đã được cấy thuần khiết, cấy vào ống 2-5ml môi trường TSB (BHI) ủ 37oC trong 2-8 giờ để đạt được độ đục chuẩn của muối Barium Sulfate. 3.3.3. Kỹ thuật Các bước thực hiện:  Chọn khúm vi khuẩn.  Làm huyền dịch vi khuẩn trong nước muối hấp vô khuẩn hay môi trường lỏng.  Sau khi so với độ đục chuẩn. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 37 ]  Dùng que gòn vô trùng nhúng vào huyền dịch vi khuẩn đã chuẩn bị và ép kiệt nước trên thành ống.  Trải đều vi khuẩn trên môi trường thạch. Thạch trên chuẩn thường dùng Mucller Hinton (MHA).  Dùng kẹp vô trùng lấy các đĩa kháng sinh gắn trên mặt thạch, mỗi hộp đặt khoãng 7-8 đĩa.  Ủ 37oC và đọc kết quả sau 24 giờ.  Đo đường kính vòng khuẩn.  Đọc kết quả bằng cách so với bảng chuẫn. Bảng 5: Một Số Tiêu Chuẩn Biện Luận Đường Kính Vòng Vô Khuẩn Và Điểm Gây Nồng Độ Ức Chế Tối Thiểu (MIC) Của Enterrobactorlaceae Đĩa Kháng Sinh Mã (Code) Hàm Lƣợng Đƣờng kính vòng vi khuẩn đo bằng mm tròn Kháng Trung gian Nhạy Amikacin Ak 30µg ≤ 14 15-16 ≥ 17 Ampicillin Am 10µg ≤ 13 14-16 ≥ 17 Amoxlcallin Ax 10µg ≤ 13 14-16 ≥ 17 Amoxlcallin/clavuanic acid Ac 20/10µg ≤ 13 14-17 ≥ 18 CEPHALOSPORIN và CEPHEM khác Cephalexin Cp µg - 15-17 ≥ 18 Cefamandole Cd 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18 Cefepime Cm 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18 Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 38 ] Cefoperazone Cf 75µg ≤ 15 16-20 ≥ 21 Cefuroxime Ct 30µg ≤ 14 15-22 ≥ 23 Cefutriaxone Cx 30µg ≤ 13 14-20 ≥ 21 Ceftazidime Cz 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18 Cefuroxime acetil Cu 30µg ≤ 14 15-22 ≥ 23 Cefaclor Cr 30µg ≤ 14 15-17 ≥ 18 Imipenem Im 10µg ≤ 13 14-15 ≥ 16 Gentamicin Ge 10µg ≤ 12 13-14 ≥ 15 Kanamycin Kn 30µg ≤ 13 14-17 ≥ 18 Netilmicin Ni 30µg ≤ 12 13-14 ≥ 15 Tobramycin Tb 10µg ≤ 12 13-14 ≥ 13 Streptomycin Sm 10µg ≤ 11 12-14 ≥ 15 Tetracycline Te 30µg ≤ 14 15-18 ≥ 19 Doxyciline Dx 30µg ≤ 12 13-15 ≥ 16 Ciprofloxacin Ci 5µg ≤ 15 16-20 ≥ 21 Norfloxacin Nr 10µg ≤ 12 13-16 ≥ 17 Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 39 ] Ofloxacin Of 5µg ≤ 12 13-15 ≥ 16 Nalidixic acid Ng 30µg ≤ 13 14-18 ≥ 19 Trirnethoprim/sulfamethoxazole Bt 1,25/23,75µg ≤ 10 11-15 ≥ 16 Vancomycin Va 30µg ≥ 15 Chloramphenicol Cl 30µg ≤ 12 13-17 ≥ 18 Nitrofurantoin Fr 300µg ≤ 14 15-16 ≥ 17 Penicicllin ( dùng Oxacllin) Ox 1µg - - ≥ 20 Clindamycin cL 2µg ≤ 14 15-20 ≥ 21 Erythromycin Er 15µg ≤13 14-22 ≥ 23 Hình 2.1: Đĩa kháng sinh Hình 2.2: Môi trƣờng MHA Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 40 ] 4.1. Cách pha chế một số môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Môi trường là những thức ăn để nuôi cấy vi khuẩn. Môi trường phong phú đối với vi khuẩn là môi trường giúp cho các vi khuẩn tăng trưởng mạnh và nhanh. Muốn được như thế, môi trường phải hội đủ các điều kiện sau đây:  Giàu chất dinh dưỡng thích hợp: nito, carbon, protid, acid amine, muối khoáng, yếu tố tăng trưởng.  Điều kiện vật lý thuận lợi: nhiệt độ, pH, áp lực thẩm thấu. Có nhiều cách phân loại môi trường. Theo dinh dưỡng và cách sử dụng, môi trường được chia làm 6 nhóm:  Môi trường dinh dưỡng cơ bản.  Môi trường bổ.  Môi trường chuyên chở.  Môi trường phong phú.  Môi trường phân lập.  Môi trường định danh hay môi trường sinh hóa. 4.1.1. Môi trƣờng dinh dƣỡng cơ bản. Điều chế nước thịt Nước thịt tốt, phải trong. Muốn đạt được kết quả này cần phải có những điều kiện:  Chọn thịt bò tơ.  Lọc hết mỡ gân.  Thịt không bị đông ở tủ lạnh.  Xay thật nhỏ.  Cân và thêm nước cho đúng.  Để ở tủ lạnh từ 17-20 giờ. Dụng cụ Dao, thớt, máy xay thịt, nồi đựng thịt (bằng inox, không rỉ), giá múc thịt, nước lọc, ống đong nước, vải lọc, giấy lọc, phểu. Cách làm 1kg thịt bò lọc hết mỡ, gân, cắt miếng nhỏ, đem xay nhuyễn. Cho thịt vào nồi, đong nước (đã để lạnh một đêm) theo tỉ lệ:  Thịt xay nhuyễn 500g  Nước cất 1000ml  Men (nếu có) 2 ống. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 41 ] Khuấy đều, đậy nắp nồi. để vào tủ lạnh 17-24 giờ. Ngày hôm sau, lấy ra, đun từ từ lên 100oC, để sôi 30 phút. Lắng 5 phút, lọc. Nên lọc qua vải ướt và 2 lớp giấy lọc để tránh màng mở trên mặt. Trước khi lọc, nhét ít bông thâm nước vào lổ trên của ống phễu để giấy lọc không bị rách. Cho vào chai hấp 121oC trong 15 phút. 4.1.1.1. Canh thang Là môi trường căn bản của vi khuẩn học, màu vàng nhạt. Thành phần gồm có: nước thịt, peptone, và NaCl.  Nước thịt 600ml  Peptone Martin 500ml  NaCl 0,5g Đun sôi cho tan, điều chỉnh PH 7,4 bằng NaOH 10%, hấp 121oC trong 30 phút. Ngày hôm sau gạn lấy nước trong, lọc qua giấy lọc ướt nhiều lần, phân phối vào ống nghiệm hay cầu bình, hấp 110oC trong 10 phút. 4.1.1.2. Thạch thường  Nước thịt 500ml  Peptone Martin 500ml  NaCl 0,5g  Thạch 20g Cho thạch vào hỗn hợp nước thịt, pepetone bột, muối, đun sôi cho tan đều, chỉnh pH = 7,4. Cho vào một bình thành thẳng đứng đem hấp 121oC trong 30 phút. Ngày hôm sau cắt bỏ phần cặn ở dưới, lấy phần thạch trong còn lại cắt nhỏ, đun sôi, lọc qua vải hay bông gòn khi còn nóng, phân phối vào ống nghiệm 19x150, 7ml mỗi ống. Hấp 110 o C trong 15 phút, lấy ra để nằm nghiêng. 4.1.2. Môi trƣờng bổ. Thạch máu Là môi trường căn bản dùng phân lập và nuôi cấy các vi khuẩn khó tính.  Cao thịt bò 10g  Peptone 10g  NaCl 5g  Thạch sợi 20g  pH = 7,4 Cân các thành phần, hòa tan với 1 lít nước cât đun sôi, điều chỉnh pH = 7, 3. Hấp khử khuẩn 121oC trong 15 phút. Lấy ra để môi trường nguội 50oC, cho thêm 5% máu tươi (cừu, thỏ, người). Trộn đều phân phối ra hộp Petri vô khuẩn. Để nguội, lật ngược hộp thạch cất vào tủ ủ 37oC. Hôm sau lấy ra loại bỏ những hộp thạch ngoại nhiễm, những hộp còn lại cất vào tủ lạnh để dùng dần. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 42 ] Môi trường T.S.A (Trypticase Soy Agar)  Trypticase peptone 15g  Phytone peptone 5g  NaCl 5g  Thạch sợi 15g  pH =7,3 Cân 40g bột TSA hòa trong 1 lít nước cất, đun sôi cho tan. Hấp 121oC trong 15 phút. Môi trường BHI  Dịch tũy bò con (Calf-Brain) 200g  Tim bò 250g  Peptone 10g  NaCl 5g  Disodium Phosphate (Na2HPO4) 2 ,5g Hòa tan 37g môi trường khô vào 1 lít nước cất. Hấp khử khuẩnn121oC trong 15 phút. 4.1.3. Môi trƣờng chuyên chở Môi trường Cary Blair Dùng để chuyên chở hầu hết các loại bệnh phẩm.  Sodium thioglycollate 1,5g  Disodium Phosphate 1,1g  NaCl 5g  Thạch 5g Hòa hỗn hợp trên vào 991ml nước cất đun sôi, khuấy cho tan. Để nguội 50oC, cho thêm 9ml dung dịch calcium chloride 1%, khuấy đều trong 2 phút. Điều chỉnh pH = 8,4 với NaOH.N hay HCl.N. Phân phối vào chai đặc biệt, mỗi chai 7ml. Sau đó hấp 110 o C trong 15 phút. 4.1.4. Môi trƣờng phong phú hóa Môi trường Tetrathionate lỏng Dùng làm tăng sinh số lượng vi khuẩn Samonella shigella trong phân. Tetrathionate căn bản  Proteose peptone 5g  Bacto-bile salts 1g  Sodium thiosulfate 30g  Calcium carbonate 10g Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 43 ] Dung dịch Iodine  Iodine 6g  Potassium Iodine 5g  ED 20g Cân 46g môi trường khô tetrathionate hòa tan vào 1 lít nước cât, đun sôi. Để nguội lại 45oC, cho thêm 20ml dung dịch Iodine, trộn đều phân phối vào ống nghiệm vô khuẩn, mỗi ống 10ml. Không đun nóng sau khi thêm Iodine. Tetrathionate căn bản giữ ở tủ lạnh để lâu được nhiều ngày. Sau khi cho thêm Iodine vào môi trường chì dùng trong 1 ngày. 4.1.5. Môi trƣờng phân lập Môi trường thạch MC (Mac Conkey Agar) Dùng phân lập các vi khuẩn đường ruột ngăn chặn vi khuẩn Gram dương mọc  Peptone 17g  Proteose peptone 3g  Lactose 10g  Bile Salt N:3 1,5g  NaCl 5g  Agar 13,5g  Neuture red 0,03g  pH = 8 Cân 50g môi trường MC khô hòa tan vào 1000ml nước cất. Đun sôi cho tan, điều chỉnh pH = 7,2, khử khuẩn 121oC trong 15 phút. Lấy ra để nguội khoảng 50oC phân phối vào hộp Petri vô khuẩn chờ môi trường đặc lại, lật ngược hộp thạch để vào tủ 37oC. 4.1.6. Các môi trƣờng sinh hóa khác Môi trường Chapman Dùng định danh tụ cầu khuẩn  Proteose peptone 10g  Beef Extract 1g  Mannitol 10g  NaCl 75g  Agar 20g  Phenol Red 0,025g Cân các chất theo công thức. Hòa tan vào 1 lít nước cất đun sôi cho tan. Điều chỉnh pH = 7,4 phân phối vào ống nghiệm 16 x 125ml, mỗi ống 3ml. hấp khử trùng 121 o C trong 15 phút. Lấy ra để nghiêng. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 44 ] Môi trường căn bản Decacboxylase (Decacboxylase medium base)  Peptone 5g  Yeast Extract 3g  Dextrose 1g  Brom cresol purple 0,02g (2ml dung dịch 1%)  pH = 6,5 Cân 9g hỗn hợp trên hòa tan vào 1 lít nước cất. Đun sôi cho tan, thêm L.Lysine, L.Arginine, L.Ornithine theo tỉ lệ 0,5%. Đun sôi điều chỉnh pH = 6,5 → phân phối vào ống nghiệm 19 x 150mm, mỗi ống 5ml môi trường. Hấp 121oC trong 15 phút. 4.2. Yêu cầu pha chế  Cân đúng chính xác từng thành phần.  Tránh lây nhiễm từ môi trường bên ngoài.  Các môi trường sau khi pha chế, cần phải cất giữ trong tủ lạnh. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 45 ] Phần 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 46 ] 1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA và MC MC BA Không thấy xuất hiện khuẩn lạc Hình dạng Tròn, lồi Màu sắc Trắng đục Hình thức Đứng theo theo từng chùm, hình dạng giống chùm nho Biện luận Mục đích chính của việc cấy máu trên môi trường MC và BA:  Xem hình dạng khuẩn lạc.  Xác định cầu khuẩn hay trực khuẩn. Hình 3.1: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng MC và BA 2. Nhuộm GRAM Sau khi tiến hành các bước nhuộm Gram mẫu theo qui định, ta tiến hành soi mẫu dưới kính hiển vi điện tử 100x. Kết quả: Vi khuẩn có hình dạng tròn, lồi, bắt màu thuốc nhuộm. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 47 ] → Cầu khuẩn Gram (+) Hình 3.2: Hình ảnh khuẩn lạc dƣới kính hiển vi quang trƣờng 100x 3. Định danh Staphylococcus aureus Thử nghiệm Kết quả Catalse (+) Oxidase (-) SAULATEX (+) Hình 3.3: Thử nghiệm Catalse (+) và Oxidase (-) Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 48 ] Hình 3.4: Dung dịch thuốc thử SAUlatex và thử nghiệm SAUlatex (+) 4. Kết quả kháng sinh đồ mẫu máu Hình 3.5: Kết quả kháng sinh đồ trên đĩa Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 49 ] Bảng 6: Tổng kết số liệu kháng sinh đồ trên 5 đĩa Đĩa Kháng Sinh Mã (Code) Hàm Lƣợng Đƣờng kính vòng vi khuẩn đo bằng mm tròn Kháng (R) Trung gian (I) Nhạy (S) Amikacin Ak 30µg 30 Ampicillin Am 10µg 1,5 Amoxlcallin Ax 10µg 17 Amoxlcallin/clavuanic acid Ac 20/10µg 30 CEPHALOSPORIN và CEPHEM khác Cephalexin Cp µg 21 Cefepime Cm 30µg 26 Cefoperazone Cf 75µg 28 Cefuroxime Ct 30µg 23 Cefutriaxone Cx 30µg 23 Ceftazidime Cz 30µg 9 Cefuroxime acetil Cu 30µg 23 Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 50 ] Cefaclor Cr 30µg 23 Imipenem Im 10µg 27 Gentamicin Ge 10µg 27 Kanamycin Kn 30µg 23 Netilmicin Ni 30µg 29 Tobramycin Tb 10µg 25 Tetracycline Te 30µg 33 Doxyciline Dx 30µg 34 Ciprofloxacin Ci 5µg 31 Norfloxacin Nr 10µg 30 Ofloxacin Of 5µg 31 Nalidixic acid Ng 30µg 2 Trirnethoprim/sulfamethoxazole Bt 1,25/23,75µg 3.2 Chloramphenicol Cl 30µg 26 Penicicllin Pn 10 units 0,7 Clindamycin cL 2µg 23 Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 51 ] Erythromycin Er 15µg 1,2 Piperacillin Pt 100µg 26 Pefloxacin Pf 5µg 30 Neomicin Ne 30µg 25 Colistin Co 10µg 0,4 Levofloxacin Lv 5µg 39 Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 52 ] Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 53 ] Bệnh viện Đa Khoa Khu Vực Hồng Ngự là một bệnh viện có uy tín và trách nhiệm cao trong công tác y tế phục vụ nhu cầu đảm bảo sức khỏe cho người dân. Bệnh viện có một cơ sở trang thiết bị đầy đủ và hiện đại phục vụ tốt cho công tác y tế, bên cạnh đó với một đội ngũ các cán bộ y tế có trách nhiệm và năng lực cao, Bệnh Viện Đa Khoa Khu Vực Hồng Ngự luôn là một trong những bệnh viện có hiệu quả và đạt được nhiều thành công lớn, và luôn là chổ dựa vững chắc cho người dân. Trong quá trình thực tập và trực tiếp tham gia làm việc tại phòng Vi Sinh là khoảng thời gian giúp em có được những bài học kinh nghiệm và bổ ích, và cũng giúp em củng cố lại những kiến thức mà thầy cô đã truyền đạt trên giảng đường cho em, đồng thời cũng giúp em biết chúng áp dụng vào thực tế như thế nào. Ngoài ra, thời gian làm việc tại phòng Vi sinh cũng giúp cho em tìm hiểu được tác phong làm việc, về kỷ luật làm việc, cách giao tiếp và quan hệ giữa các cô chú cán bộ trong môi trường làm việc chuyên nghiệp. Qua thời gian thực tập tại phòng Vi sinh – Khoa Xét Nghiệm Chẩn Đoán Hình Ảnh, đã giúp em nắm được những phương pháp và cách tiếp nhận, phân tích mẫu, đặc biệt là:  Thu nhận và xử lí mẫu từ các bệnh nhân.  Xử lí mẫu lấy từ các bệnh nhân ở các Khoa của bệnh viện.  Nâng cao khả năng thực hành xử lí các vi sinh vật gây bệnh.  Tìm hiểu và vận dụng được nhiều các phản ứng sinh hóa mới.  Có thêm những kiến thức mới về kha năng kháng kháng sinh của vi sinh vật gây bệnh. Sau quá trình thực tập, em có nhận xét như sau:  Bệnh viện Đa Khoa Khu Vực Hồng Ngự là Bệnh viện có cơ sở vật chất hiện đại, với mặt bằng rộng và cách bố trí phòng ban một cách hợp lí, giúp thuận tiện cho công việc.  Bệnh viện có một bộ máy quản lí đứng đầu là Ban giám đốc đầy năng lực, nội quy chặt chẽ cùng với lượng cán bộ công nhân viên có trình độ chuyên môn cao, đầy kinh nghiệm và nhiệt tình trong công việc.  Phòng vi sinh có đầy đủ các dụng cụ và thiết bị trong công tác phân tích và xử lí bệnh phẩm.  Các cô chú trong khoa luôn luôn hướng dẫn và giúp đỡ nhiệt tình.  Bệnh viện luôn luôn có những định hướng mới đầy thành công, luôn luôn tìm tòi và tạo ra những phương pháp tối ưu hóa trong việc khám và chữa bệnh cho nhân dân.  Bệnh viện luôn luôn có sự quan tâm chăm sóc đến đời sống và sinh hoạt của các cán bộ công chức làm việc, ngoài ra còn tham gia nhiều công tác xã hội khác. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 54 ]  Vấn đề an toàn lao động luôn được chú trọng ưu tiên hang đầu, nhất là công tác phòng cháy chữa cháy, với các trang thiết bị đầy đủ và thường xuyên có các lớp tập huấn phòng cháy chữa cháy cho các cán bộ Bệnh viện.  Luôn đảm bào cho sức khỏe cho các cán bộ và nhân viên Bệnh viện, luôn luôn mở nhiều hoạt động thể thao và văn hóa cho toàn thể. Thời gian thực tập có hạn, nên việc có những thiếu sót trong bài báo cáo là điều không thể tránh khỏi. Vì thế mong các thầy cô trong khoa cũng như các cô chú cán bộ của phòng Xét Nghiệm Vi sinh giúp đỡ và đóng góp ý kiến để cho bài báo cáo được hoàn thiện hơn. Cuối cùng, em xin chúc Ban giám đốc Bệnh viện Đa Khoa Khu Vực Hổng Ngự, các cô chú cán bộ công chức, và các thầy cô luôn có được sức khỏe, hoàn thành công tác và có nhiều thành tựu trong tương lai. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 55 ] Tài liệu tham khảo [1]. Vi sinh vật Y học, 2007 – Bộ môn Vi Sinh, Trường Đại Học Y Hà Nội – Nhà xuất bản Y Học. [2]. Vi Sinh Y Học Thực Hành – Trường Đại Học Y Dược TPHCM – Khoa Điều Dưỡng – Kỹ Thuật Y – Bộ Môn Xét Nghiệm – Năm xuất bản 2002. [3]. Vi Khuẩn học – Trường Đại Học Y Dược TPHCM – Khoa Y – Bộ môn Vi Sinh – Năm xuất bản 2002. [4]. Phương Pháp Phân Tích Vi Sinh Vật Trong Nước, Thực Phẩm và Mỹ Phẩm – Trần Linh Phước – NXB Giáo Dục 2009. [5]. Cẩm Nang Các Kỹ Thuật Xét Nghiệm Vi Sinh Lâm Sàng Dùng Cho Các Phòng Thí Nghiệm Bệnh Viện – Trường Đại Học Y Dược TPHCM – TS. Bs. Phạm Hùng Vân – Năm xuất bản 2002. [6]. Daksgaad A, et al. J Clin Microbio 1999; 37(3): 734 – 741. [7]. Medical Microbiology & Immunology, Examination & Board Review – Warren Levinson Ernest Jawetz – Mc Graw Hill International editions – Health Professions Series – 2002. [8]. PGSTS Nguyễn Hùng Tiến, PGSTS Bùi Minh Đức, PGSTS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật thực phẩm kĩ thuật kiễm tra và chỉ tiêu đánh giá an toàn thực phẩm. [9]. Ths Phạm Minh Nhựt, Giáo trình phân tích đánh giá chất lượng thực phẩm – Đại Học Kỹ Thuật Công nghệ TPHCM, 2010. Internet [9]. [10]. http//www.pdb.org/pdb/explore.do?structureId=3SEB. [11]. www.healthinfotranslations.org/pdfDocs/MRSA_VIET.pdf [12]. [13]. www.yduocngaynay.com [14]. www.google.com.vn Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 56 ] NHẬT KÍ THỰC TẬP Tuần số: 01 Công việc thực hiện Ngƣời hƣớng dẫn Thứ Ngày Hai 12/3 Sáng:  Nộp giấy giới thiệu tại phòng Hành chính- Tổ Chức.  Tham quan phòng xét nghiệm vi sinh. Chiều:  Bổ sung hồ sơ thực tập. Tối:  Cấy dịch âm đạo của sản phụ. KTV Nguyễn Thanh Vũ Ba 13/3 Sáng:  Thu mẫu máu từ người bệnh.  Xử lí thông tin người bệnh.  Xem vi khuẩn lao. Chiều:  Thu nhận số liệu của địa điểm thực tập CN. Nguyễn Văn Tâm. Tư 14/3 Sáng:  Thu thập số liệu mẫu.  Kiểm tra mẫu.  Kiểm tra vi sinh vật mọc trên đĩa (mẫu lấy từ các bệnh nhân).  Đun môi trường  Quan sát quá trình thực hiện kháng sinh đồ từ mẫu dịch bệnh. Chiều:  Quan sát quy trình xác định Staphylococus Aureus trên mẫu dịch bệnh. CN. Nguyễn Văn Tâm. Năm 15/3 Sáng:  Đọc kết quả mức độ kháng khuẩn Staphylococus Aureus.  Đo đường kính kháng khuẩn. Chiều:  Vệ sinh dụng cụ. CN. Nguyễn Văn Tâm. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 57 ]  Lắc môi trường 2 pha.  Kiểm tra mẫu. Sáu 16/3 Sáng:  Cấy vi sinh vật vào môi trường BA và MC. Chiều:  Chuẩn bị môi trường, đun môi trường.  Cấy mẫu dịch sản phụ. Tối:  Cấy dịch âm hộ ở sản phụ.  Thu nhận mẫu máu. CN.Nguyễn Văn Tâm KTV.Nguyễn Thanh Vũ Bảy 17/3 Sáng:  Kiểm tra mẫu.  Đun môi trường MC và MHA. Chiều:  Cấy mẫu dịch vào môi trường MC và BA CN.Nguyễn Văn Tâm CN 18/3 Tuần số: 02 Công việc thực hiện Ngƣời hƣớng dẫn Thứ Ngày Hai 19/3 Sáng:  Xem kết quả cấy mẫu.  Nhận xét kết quả.  Làm phiến đồ nhuộm Gram  Đọc kết quả trên kính hiển vi.  Làm kháng sinh đồ cho mẫu. Chiều:  Kiểm tra mẫu.  Phụ việc cho phòng xét nghiệm. CN. Nguyễn Văn Tâm Ba 20/3 Sáng:  Kiểm tra mẫu.  Thử nghiệm nhuộm Gram trên mẫu máu. Chiều:  Kiểm tra kết quả cấy mẫu dịch và máu.  Tổng hợp tài liệu có lien quan CN. Nguyễn Văn Tâm Tư 21/3 Sáng:  Xem kết quả mẫu cấy. Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 58 ]  Đọc kháng sinh đồ mẫu dịch và mẫu máu. Chiều:  Tổng hợp tài liệu báo cáo.  Cấy mẫu dịch ở tử cung của sản phụ. CN. Nguyễn Văn Tâm Năm 22/3 Sáng:  Đọc kết quả mẫu cấy. Chiều:  Tăng sinh mẫu máu.  Cấy chuyền. CN. Nguyễn Văn Tâm Sáu 23/3 Sáng:  Cấy mẫu.  Kiểm tra mẫu tăng sinh.  Làm các thử nghiệm sinh hóa. Chiều:  Đun môi trường MC và MHI  Làm kháng sinh đồ. CN. Nguyễn Văn Tâm Bảy 24/3 Sáng:  Đọc kết quả kháng sinh đồ.  Kiểm tra kết quả các thử nghiệm sinh hóa.  Kiểm tra mẫu cấy máu. CN. Nguyễn Văn Tâm CN 25/3 Tuần số: 02 Công việc thực hiện Ngƣời hƣớng dẫn Thứ Ngày Hai 26/3 Sáng:  Đọc kết quả kháng sinh đổ.  Xem xét kết quả các thí nghiệm sinh hóa nhóm trực khuẩn Gram (-). Chiều:  Công việc trống. CN. Nguyễn Văn Tâm Ba 27/3 Sáng:  Thu nhận kết quả. Chiều:  Tổng kết số liệu. CN. Nguyễn Văn Tâm Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 59 ] Tư 28/3  Thực hiện báo cáo thực tập CN. Nguyễn Văn Tâm Năm 29/3  In báo cáo thực tập.  Nộp báo cáo thực tập cho phòng Tổ Chức Hành Chính, Trường Khoa và Cán bộ hướng dẫn CN. Nguyễn Văn Tâm Sáu 30/3 Bảy 31/3 CN 01/4 Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 60 ] MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC HÌNH DANH MỤC BẢNG – SƠ ĐỒ LỜI MỞ ĐẦU PHẦN 1: TỔNG QUAN CHƢƠNG I: ĐÔI NÉT VỀ BỆNH VIỆN ĐA KHOA KHU VỰC HỒNG NGỰ 1.1. Lịch Sử Hình Thành Bệnh Viện ......................................................................... 4 1.2. Ban Lãnh Đạo .................................................................................................... 6 1.3. Khoa Xét Nghiệm .............................................................................................. 8 1.4. Cán Bộ Công Nhân Viên Khoa Chẩn Đoán Hình Ảnh – Xét Nghiệm ................ 8 1.5. Chức năng – Nhiệm Vụ ..................................................................................... 8 1.6. Các Thiết Bị Khoa Chẩn Đoán Hình Ảnh – Xét Nghiệm.................................... 8 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN VỀ VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS 2.1. Tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ................................................................... 13 2.1.1. Lịch sử phát hiện............................................................................................. 13 2.1.2. Đặc điểm phân loại ......................................................................................... 13 2.1.3. Đặc điểm sinh hóa........................................................................................... 14 2.1.4. Đặc điểm vi khuẩn học.................................................................................... 14 2.1.5. Hệ gen tụ cầu vàng Staphylococcus aureus ..................................................... 16 2.2. Nội độc tố ruột staphylococcal enterotoxin B ..................................................... 16 2.2.1. Cấu trúc phân tử staphylococcal enterotoxin B................................................ 16 2.2.2. Cơ chế gây độc của staphylococcal enterotoxin B ........................................... 17 2.3. Thực trạng nhiễm Staphylococcus aureus ở Việt Nam ....................................... 17 2.4. Phòng ngừa, điều trị và xử lí bệnh ...................................................................... 17 2.4.1. Phòng ngừa ..................................................................................................... 17 2.4.2. Điều trị............................................................................................................ 18 2.4.3. Xử lí bệnh ....................................................................................................... 18 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 61 ] 1.1. Phương pháp lấy và gửi bệnh phẩm ................................................................... 21 1.1.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm .................................................................... 21 1.1.2. Đối tượng thí nghiệm ...................................................................................... 21 1.2. Cách lấy bệnh phẩm ........................................................................................... 21 1.3. Cách gửi bệnh phẩm .......................................................................................... 22 2.1. Cấy máu ............................................................................................................ 25 2.1.1. Chỉ định cấy máu ............................................................................................ 25 2.1.2. Thời điểm cấy máu ......................................................................................... 25 2.1.3. Cách lấy máu để cấy ....................................................................................... 25 2.1.4. Môi trường cấy máu ........................................................................................ 25 2.2. Theo dõi cấy máu............................................................................................... 25 2.3. Vấn đề vi khuẩn ngoại nhiễm ............................................................................. 26 3.1. Các thử nghiệm sinh hóa định danh ................................................................... 30 3.1.1. Thử nhiệm β-Lactamase .................................................................................. 30 3.1.2. Trắc nghiệm Catalase ...................................................................................... 31 3.1.3. Khả năng tăng trưởng và lên men .................................................................... 32 trên môi trường M.S.A (Chapman) 3.1.4. Trắc nghiệm Coagulase ................................................................................... 32 3.1.5. Trắc nghiệm Novobiocin................................................................................. 32 3.1.6. Thử nghiệm SAUTlATEX (STAPHYLATEX) ............................................... 33 3.2. Phương pháp nhuộm Gram ................................................................................ 34 3.2.1. Nguyên tắc ...................................................................................................... 34 3.2.2. Dụng cụ và thuốc nhuộm ................................................................................ 34 3.2.3. Kỹ thuật .......................................................................................................... 34 3.2.4. Kết quả ........................................................................................................... 35 3.3. Kĩ thuật làm kháng sinh đồ ................................................................................ 35 3.3.1. Nguyên tắc ...................................................................................................... 36 3.3.2. Chuẫn bị ......................................................................................................... 36 3.3.3. Kỹ thuật .......................................................................................................... 36 4.1. Cách pha chế một số môi trường nuôi cấy vi khuẩn ........................................... 40 Bài Thu Hoạch Người hướng dẫn: CN. Nguyễn Văn Tâm SVTT: Nguyễn Thái Trương [ 62 ] 4.1.1. Môi trường dinh dưỡng cơ bản ........................................................................ 40 4.1.2. Môi trường bổ ................................................................................................. 41 4.1.3. Môi trường chuyên chở ................................................................................... 42 4.1.4. Môi trường phong phú hóa .............................................................................. 42 4.1.5. Môi trường phân lập ....................................................................................... 43 4.1.6. Các môi trường sinh hóa khác ......................................................................... 43 4.2. Yêu cầu pha chế ................................................................................................. 44 PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Hình dạng khuẩn lạc trên môi trường BA và MC .................................................. 46 2. Nhuộm Gram ........................................................................................................ 46 3. Định danh Staphylococcus aureus ........................................................................ 47 4. Kết quả kháng sinh đồ mẫu máu ........................................................................... 48 Tài liệu tham khảo .................................................................................................. 55 Internet.................................................................................................................... 55 NHẬT KÍ THỰC TẬP ........................................................................................... 56 MỤC LỤC ............................................................................................................... 60