Đề tài : Phương pháp PCR

Đề tài: PHƯƠNG PHÁP PCR BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA THỦY SẢN GVHD : LÊ THỊ PHƯƠNG HỒNG 1 Thành viên nhóm Nguyễn Thị Huỳnh Nga 08141029 Phan Thị Bích Tuyền 08141063 Nguyễn Minh Quân 08141123 Mai Thị Nga 08141105 Mục lục I. Giới thiệu II. Nguyên tắc PCR III. Điều kiện phản ứng PCR IV. Quy trình phản ứng PCR 1.Giai đoạn biến tính 2.Giai đoạn bắt mồi 3.Giai đoạn kéo dài V. Ý nghĩa và các ứng dụng PCR VII. Các hạn chế Tài liệu tham khảo GIỚI THIỆU PCR ( Polymerase Chain Reaction ) là phản ứng chuỗi trùng hợp hay còn gọi là "phản ứng khuếch đại gen“. Trong ngành thủy sản việc áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện ra các mầm bệnh do virus gây ra như bệnh đốm trắng,bệnh đầu vàng, hội chứng Taura… trên tôm. II. Nguyên tắc PCR PCR là phương pháp in vitro để tổng hợp một đoạn DNA đặc thù nhờ công hiệu của 2 mồi gắn vào 2 sợi đơn của đoạn DNA đích với sự tham gia của DNA polymerase. Đoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.  II. Nguyên tắc PCR  Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn: III. Điều kiện phản ứng PCR Ðể thử nghiệm PCR có thể chạy được, cần phải có đầy đủ các thành phần sau : Hình : Thực nghiệm PCR 1. Nước Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt giới hạn …. 2. Dung dịch đệm cho phản ứng PCR: Thành phần dung dịch đệm thường phụ thuộc vào loại enzyme DNA polymerase sử dụng trong PCR, dung dịch đệm thường chứa muối đệm Tris HCl 10 mM, KCl 50 mM và MgCl2 1.5 mM Nồng độ MgCl2 có thể dao động từ 0.5-5 mM. Chính ion Mg2+ gắn kết dNTP với DNA polymerase, tăng khả năng bám nối của mồi. 3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs): Deoxyadenosine 5’ triphosphate 3. Deoxynucleotide triphosphat (dNTPs): Nồng độ khoảng chừng 100 mM cho mỗi nucleotide: dATP, dCTP, dGTP, dTTP . Nồng độ thấp khoảng 10 – 100 mM thì Taq polymerase có độ chính xác cao hơn. 4. Mồi (primer) Mồi là những đoạn DNA sợi đơn ngắn và cần thiết cho việc xúc tiến phản ứng dây chuyền tổng hợp DNA. Các mồi này có chiều ngược nhau, bao gồm: Mồi xuôi (forward primer) Mồi ngược (reverse primer). 5.Enzyme DNA polymerase (Taq) Là enzyme xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotide  A, T, G, C vào mạch DNA mới tổng hợp . Enzyme sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I về sau sử dụng Taq polymerase vì nó không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính và xúc tác tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng,có thể chịu nhiệt độ 90 oC lặp lại nhiều lần mà không mất khả năng tổng hợp DNA 6. DNA mẫu (DNA template) Có thể là DNA kép, đơn, hoặc RNA được tách chiết từ các đối tượng nghiên cứu. DNA mẫu có độ nguyên vẹn cao tránh lẫn tạp chất. Lượng DNA được sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (từ 1mg xuống còn 100µg) vì thế người ta sử dụng polymerase cho hiệu quả cao . III. Quy trình phản ứng PCR. Trong phản ứng PCR nhiệt độ là vô cùng quan trọng và kèm theo là yếu tố thời gian. Phản ứng PCR được thực hiện qua 3 giai đoạn trong một chu kỳ: 1. Giai đoạn biến tính: Sợi DNA mạch khuôn bị biến tính tách thành 2 sợi đơn ở nhiệt độ 940C trong vòng 30 giây đến 1 phút . Sự biến tính DNA diễn ra với sự có mặt của hai đoạn mồi và các dNTP. 2.Giai đoạn bắt cặp: Nhiệt độ được hạ thấp xuống từ 50 – 650C tốt nhất là 55oC trong khoảng thời gian 1 – 2 phút . Thời gian kéo dài phụ thuộc hoạt độ enzyme DNA polymerase và chiều dài sản phẩm. 3. Giai đoạn kéo dài: Nhiệt độ lúc này được nâng lên 720C trong vòng 30 giây đến 1 phút . Nhờ tác dụng của men Taq polymerase các Nu có sẵn trong ống nghiệm gắn vào các mồi theo nguyên tắc bổ sung => Một bản sao DNA mới đã được hình thành . 3. Giai đoạn kéo dài: Sơ đồ phản ứng PCR qua nhiều chu kỳ Hình: Nhiệt độ của các chu kỳ phản ứng PCR V. Ý nghĩa và các ứng dụng a. Phương pháp này có ý nghĩa lớn vì nhiều lý do: Độ tinh sach của mẫu không cần cao Dễ thực hiện Rẽ tiền và thời gian thực hiện ngắn Độ chính xác cao đáng tin cậy b. Các ứng dụng chủ yếu của PCR gồm: Phát hiện đột biến Phục hồi các gen đã tồn tại hàng triệu năm Chọn giống vật nuôi, cây trồng Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm Xác định mầm bệnh từ động vật thủy sản như bệnh tôm: MBV, WSSV, YHV, TSV…và bệnh trên cá: VNN… VI. Các hạn chế Do phương pháp có độ nhạy cao và khuếch đại nucleic acid nên dễ bị ảnh hưởng dẫn đến lỗi trong thao tác và đòi hỏi sự thận trọng trong quá trình thực hiện. Ba vấn đề lớn khi dùng PCR: Kích thước và trình tự cần giới hạn Sự ngoại nhiễm Các sai sót gây ra do Taq polymerase VII. Kết luận Ngày nay kĩ thuật PCR đang được áp dụng rộng rãi góp phần không nhỏ cho sự phát triển của y học nói chung,cho ngành thủy sản nói riêng. Tuy nhiên bên cạnh những ưu điểm của kỹ thuật này thì cần phải khắc phục những hạn chế để giảm giá thành, mang lại kết quả cao hơn trong việc chuẩn đoán các mầm bệnh mới gây hại cho động – thực vật và con người. Tài liệu tham khảo Bùi Trang Việt – Lê Thị Phương Hồng. 2006. Sinh học di truyền và phân tử, phần II. Sinh học phân tử. Đỗ Hiếu Liêm, 2007 . Sinh hóa đại cương. Các wed: www.drthuthuy.com/reseach/HBVGenotype.html vi.wikipedia.org/wiki/PCR www.sinhhocvietnam.com www.tailieu.com BÀI THUYẾT TRÌNH CỦA NHÓM