Đề tài Quy trình sản xuất enzyme pectinase và ứng dụng trong làm nước quả

ế phẩm pectinase dùng trong sản xuất phải có những yêu cầu sau: Chế phẩm không được làm giảm chất lượng của vang, không được gây ảnh hưởng xấu đến hương vị và màu sắc của sản phẩm; nghĩa là chế phẩm phải được làm sạch tới mức tối đa khỏi các tạp chất có ảnh hưởng xấu đến chất lượng vang. Chế phẩm được đưa vào dịch hay bã nghiền để tăng cường quá trình sơ chế quả, tăng nhanh và làm trong dịch, nâng cao tốc độ lọc, tăng hiệu suất chung và đặc biệt là hiệu suất của phần tự chảy có chất lượng cao. Để tăng nhanh và tốt quá trình làm trong dịch thì tương quan hoạt độ của các enzym chính như endo – PMG là 55,0.102 đơn vị/mg protein chứa trong chế phẩm, còn enzym Cx là 57,5 đơn vị/mg protein trong 1 lít dung dịch. Trong trường hợp này không cần có mặt PE. Nhưng nếu hoạt độ của endo – PMG ở trong chế phẩm là 31,0.102 đơn vị/mg protein thì cần có mặt PE với hoạt độ là 4,1 đơn vị/mg protein. Trong sản xuất vang nho giữa hàm lượng enzym endo – PMG va Cx phải có sự tương quan nhất định. Khi chế phẩm có hoạt độ endo – PMG là 28,2.102 đơn vị/mg protein và Cx là 28,7 đơn vị/mgP quá trình làm trong sẽ xảy ra nhanh hơn khi có hoạt độ endo – PMG là 25,4.102 đơn vi/mg P và Cx là 55,0 đơn vị/mgP. Chế phẩm pectinase cũng phải tăng độ ổn định của vang nghĩa là phải chứa enzym proteinase với hoạt độ không thấp hơn 120 đơn vị/g theo globulin và 140 đơn vị/g theo anbumin. Để tránh gây tổn thất các chất màu cùa vang đỏ và tránh xuất hiện màu tối trong vang trắng thì hoạt độ của các enzym oxy hoá trong chế phẩm không được vượt quá 0,1 đơn vị/mg axit ascorbic trong một phút trên một gam chế phẩm. Chế phẩm pectinase dùng trong vang quả phải bảo toàn được hoạt độ trong điều kiện có chứa rượu (10-12%) và phải tác dụng có hiệu quả trong điều kiện có độ pH nhất định. Để xử lý dịch hoặc bã nghiền ở trạng thái dòng có thể dùng chế phẩm pectinase có hoạt độ cao (12000đv/g) hoặc dùng chế phẩm pectinase không tan. Chẳng hạn trong sản xuất vang nho, khi sử dụng chế phẩm pectawamorin PM10x, người ta thấy có thể tăng hiệu suất dịch tự chảy lên 32%. Trung bình thể tích của phần dịch tự chảy có thể tăng được 10%, còn hiệu suất chung của dịch tăng lên 1 – 2%. Hoặc khi ép bã nghiền nho trắng đã được xử lý bằng pectinol thì thấy quá trình ép tiến hành nhanh hơn. Hiệu suất dịch khi đó tăng lên 9,6%. Vậy dùng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng tốc độ làm trong và tốc độ lọc của dịch. Khi sử dụng chế phẩm pectinase, các polime của dịch như protein, pectin … sẽ thủy phân làm giảm độ nhớt do đó làm tăng tốc độ lọc. Trong 1 giờ dịch thu được từ bã nghiền của nho có xử lý bằng chế phẩm pectinase sẽ qua lọc 7 lần nhanh hơn từ bã không được xử lý. Khi dịch không được xử lý bằng enzym thì trong quá trình lắng, các hạt vẩn đục lớn và nhỏ sẽ bị kết tủa xuống. Khi sử dụng enzym thì các chất cao phân tử của dịch sẽ bị thủy phân từng phần, độ nhớt bị giảm, kết quả là tốc độ làm trong đều tăng. Sử dụng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng chất lượng của dịch quả và của vang. Trong quá trình xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase, thành phần hóa học của bã thay đổi rất đáng kể mà trước tiên là hàm lượng chất phenol. Người ta thấy rằng khi xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng hàm lượng catesin ở trong dịch. Khi đó quá trình trích ly sẽ vượt lên trước quá trình oxy hoá catesin ngay cả khi nhiệt độ tăng. Điều này rất quan trọng, vì các hợp chất phenol đặc biệt là catesin có các nhóm hydroxil ở vị trí octo thường có họat tính của vitamin P. Như vậy xử lý bã nghiền bằng chế phẩm pectinase sẽ làm tăng giá trị sinh học của dịch quả và vang. Không những vậy vang được pha chế từ dịch và bã nghiền có xử lý bã bằng chế phẩm pectinase sẽ chín nhanh hơn do đó cần chiết sớm hơn. Người ta cho thấy rằng chế phẩm thu được từ nấm mốc, Botrylis cinerea gây ảnh hưởng rất tốt đến chất lượng của vang, vang có hương thơm mạnh và dịu do hàm lượng glyxerin và ester ở trong vang cao. Khi chế biến nước quả có thịt quả, người ta thường sử dụng chế phẩm enzym bao gồm pectintrancelinutase, hemicellulase, cellulase. Trong đó, enzym pectintrancelinutase đóng vai trò quan trọng nhất. Trong hỗn hợp chế phẩm enzym trên, tuyệt đối không được có mặt enzym polygalacturonase, đặc biệt không được chứa enzym endopolygalacturonase. Những enzym này thường làm giảm độ nhớt của nước quả và phá vỡ độ đồng nhất của nước quả. CHƯƠNG 2: CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT ENZYME PECTINEASE Nguồn gốc thu nhận Từ vi sinh vật : Nếu ở thực vật người ta chỉ thấy có một loại enzyme thì ở vi sinh vật là một loại enzyme rất phong phú.Vi sinh vật phân giải pectine hầu như có mặt ở các đại diện nấm mốc, nấm men, vi khuẩn như: Nấm mốc: Asp.niger, Asp.oryase, Asp.terreus, Asp.saito, Asp.japonicus… Nấm men: sac.ellipsoideus, sac.fragilis, sac.ludwigii … Vi khuẩn: Bac.polymixa, Bac.felseneus, Clostridium roseum… Phương pháp nuôi cấy bề mặt Quy trình sản xuất Môi trường Dụng cụ nuôi cấy Hấp khử trùng Hấp khử trùng Để nguội Để nguội Phối vào dụng cụ Cấy vào môi trường Nhân giống Giống vi sinh vật Nuôi cấy trong 36h Thu nhận enzyme thô Thuyết minh quy trình: Môi trường nuôi cấy Là môi trường rắn, gồm các thành phần tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh, bột đậu tương… pha thêm muối khoáng. Môi trường rắn thường dùng nhất là cám, đặt biệt trong cám mì có tương đối đầy đủ các chất dinh dưỡng và khi làm ẩm sẽ tạo ra cấu trúc cần thiết cho nấm mốc phát triển, sinh ra nhiều enzyme. Có thể bổ sung những thành phần giàu pectin như bã củ cải đường, bột cà rốt làm chất cảm ứng để thu được hàm lượng pectinase cao. Bên cạnh đó, chúng ta cần bổ sung thêm trấu để tạo môi trường thoáng khí tốt, giúp cho sự phát triển của nấm. Vậy môi trường hoàn chỉnh để nuôi cấy gồm có: 70% cám mì + 23% trấu + 5% chất cảm ứng + chất dd khác ( mầm mạ, nước khoai tây, … để cung cấp thêm nguồn Nitơ, Photphat, Kali, … ). Môi trường rắn cần được làm ẩm đến khoảng 60%, nếu độ ẩm quá cao thì nhiều loại vi khuẩn phát triển gây tạp nhiễm, nếu độ ẩm quá thấp sẽ làm môi trường nhanh khô, sinh bào tử mạnh. Nuôi cấy: Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá. Dụng cụ: Dụng cụ và môi trường cần được khử trùng ở 1210C/1atm/30 phút để tránh tạp nhiễm. Để nguội, phối vào dụng cụ: Môi trường được trải mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2 – 2,5cm và để nguội đến 300C thì tiến hành cấy giống. Giống Sử dụng nấm mốc.Nấm mốc được nhân và nuôi cấy trong môi trường vô trùng để tránh nhiễm tạp.giống được nhân theo phương pháp bề mặt và cũng trên môi trường trên để giống quen với điều kiện sản xuất. Khi nhân giống thường để cho nấm mốc mọc già đến khi sinh ra nhiều bào tử, bào tử được thu theo phương pháp tách bào tử khỏi môi trường và chứa trong các bình có nút kín. Tỉ lệ nhân giống vào khoảng 0,2 – 2%. Mỗi gam bào tử mốc có thể cấy vào 10kg môi trường. Nuôi cấy Các khay có môi trường đã cấy mốc được đặt vào phòng nuôi có sẵn các giá.Phòng nuôi có thể điều chỉnh được nhiệt độ, độ ẩm và được thổi gió.Nhiệt độ thích hợp với đa số mốc là 30-320C.Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C thì nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài như vậy sẽ làm giảm khả năng sinh tổng hợp Enzyme. Qúa trình nuôi cấy nấm mốc trên bề mặt môi truờng được chia thành 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Khoảng 10 – 14h đầu: giai đoạn này có những thay đổi sau: Bào tử nấm bắt đầu hình thành có màu trắng hoặc màu sữa. Bắt đầu hình thành enzym, không đòi hỏi phải thông khí nhiều chỉ cần làm thoáng khoảng 2 – 3 thể tích không khí / thể tích phòng / giờ. Khối môi trường còn rời rạc, các thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi. Giai đoạn 2: kéo dài khoảng 14 – 18h: giai đoạn này có những thay đổi sau: Mốc phát triển nhanh, hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát bằng mắt thường, lúc đầu là lớp lông tơ màu trắng – xám và ngày càng rõ, làm môi trường kết bánh lại, độ ẩm môi trường giảm dần.Các chất dinh dưỡng trong môi trường tiêu hao nhanh để phục vụ cho các quá trình trao đổi chất trong tế bào và giống hô hấp mạnh tỏa ra môi trường chung quanh 80 – 90kcal/giờ. Làm nhiệt độ môi trường tăng lên 400 - 450C. Thời kì này cần phải thông khí mạnh tới 60 thể tích khí/1thể tích phòng/giờ để cung cấp O2 cho mốc thở và đuổi CO2 ra khởi môi trường, đồng thời làm giảm nhiệt độ buồng nuôi. Nhiệt độ buồng nuôi ở giai đoạn này cần giữ ở 28 - 300 C và độ ầm trong phòng khoảng 90%. Các loại Enzyme được hình thành trong giai đoạn này, pectinase được hình thành nhiều nhất vì có cơ chất cảm ứng. Giai đoạn 3: kéo dài trong khoảng 10 – 20h: giai đoạn này có những biến đổi Quá trình trao đổi chất yếu dần vì do đó mức độ giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại. Lượng nhiệt tạo ra giảm, khoảng 15 – 30kcal/kg/giờ.Thông khí không quá 20 – 25 thể tích không khí/thể tích phòng/giờ, giữ nhiệt độ buồng nuôi duy trì ở 300 C. Tùy thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzyme tạo thành tối đa, Enzyme vẫn được hình thành ở giai đoạn này. Môi trường sau khi nuôi cấy được sấy khô tới độ ẩm dưới 12%, nghiền nhỏ, đựng trong các bao polyetylen hoặc giấy chống ẩm.Sản phẩm này là chế phẩm enzyme thô. Tách và làm sạch Phương pháp thu nhận Có 2 loại enzyme: nội bào và ngoại bào, mỗi enzyme đòi hỏi phải có phương pháp tách và thu nhận riêng: Enzyme ngoại bào: (gồm pectinase) do vi sinh vật tiết ra trong môi trường nuôi cấy ngoài tế bào, thường hoà tan trong nước do đó dễ trích ly và tinh sạch. Enzyme nội bào: là enzyme được sản xuất ra bên trong tế bào vi sinh vật và không được tiết ra môi trường bên ngoài. Những tế bào vi sinh vật sau khi được nuôi cấy sẽ được tách ra và phá vỡ tế bào. Mục đích của việc này là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào gồm cả enzyme nội bào. Hỗn hợp thu được sẽ đem ly tâm tách tạp chất và những chất có phân tử lượng lớn; còn enzyme sẽ được kết tủa bằng cồn hay muối. Enzyme sau đó sẽ được đem tinh sạch. Enzyme nội bào Enzyme ngoại bào Khó tách Dễ tách Phài phá vỡ thành tế bào Không cần phá vỡ thành tế bào Thường lẫn chung zới các chất khác của tế bào sau khi bị phá vỡ (acid nucleic, chất nguyên sinh, lipid…) KHông lẫn chung với các thành phần nội bào, nếu có chỉ là một vài enzyme ngoại bào khac Chỉ bần vững trong môi trường nội bào Bền cững hơn Phương pháp tinh sạch khó thực hiện, quy trình công nghệ phức tạp, giá thành đắt Phương pháp tinh sạch dễ và rẻ hơn Từ môi trường nuôi cấy bề mặt Để chiết rút enzyme từ môi trường rắn người ta dùng nước, các dung dịch muối trung tính, các dung môi hữu cơ (cồn, axeton).Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy dùng nước trong mục đích này có kết quả tốt và dể được dùng rộng rãi trong sản xuất.Theo phương pháp khuếch tán bằng nước có thể chiết được lượng enzyme trên 90 – 95% và trong nước chiết không chứa các tạp chất không tan. Nước thường dung khuếch tán ở nhiệt độ 25 – 280C. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoăc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu nâu sẫm, khá trong, chứa 10 – 15% chất khô hòa tan và được làm lạnh kịp thời xuống 10 – 120C. Phương pháp tách chiết và làm sach enzyme được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay là phương pháp kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ (etanol, izopropanol và axeton). Các dung môi hữu cơ này làm giãm hằng có điện môi của môi trường. như ta đã biết, lực hút tĩnh điện tỉ lệ nghịch với hằng số điện mới. Vì vậy các enzyme, các chất protein cũng như các chất có phân tử thấp trong hệ dung dịch nước – dung môi hữu cơ sẽ tủa và lắng xuống.Độ hòa tan của enzyme vào dung dịch cồn – nước phụ thuộc vào nồng độ cồn, nhiệt độ, lực hút ion của dung dịch và tính chất protein của enzyme. Để tránh mất họat tính của enzyme tất cả phải được làm lạnh xuống 3 – 5*C. Khi trộn phải khuấy mạnh, khi các enzyme kết tủa và lắng xuống dưới cần tách ly ngay.  Sơ đồ tinh sạch Enzyme từ canh trường nấm mốc. Từ môi trường nuôi cấy bề sâu Phương pháp hiếu khí Sự tích tụ enzyme trong môi trường được bắt đầu khi sự phát triển của vi sinh vật gần đạt đến pha ổn định, khi môi trường bị acid hoá mạnh và khi lượng phospho vô cơ được sử dụng hoàn toàn, pH của môi trường nuôi cấy thường đạt từ 6-7.2 là thích hợp. Đối với nấm mốc, pH kìm hãm sự tổng hợp sinh khối và sự tích luỹ enzyme pectinase.Khi pH dịch về phía acid, ngay cả khi pH nằm trong khoảng 4.5-5.0, tuy sự tạo thành sinh khối không bị ảnh hưởng nhưng sự tạo thành enzyme pectinase bị kìm hãm.Vật liệu gieo cấy có thể là sợi nấm 24, 32 và 48h tuổi và với hàm lượng từ 2-10%.Đối với A.niger và A.awamori, vật liệu gieo cấy là sợi nấm được ủ sơ bộ trong môi trường dinh dưỡng cho đến khi bắt đầu nứt nanh bào tử, thời gian ủ sơ bộ thường là 38-42h.Lượng sợi nấm đem gieo cấy thường là 2%. Trong quá trình nuôi cấy, hàm lượng các chất hoà tan trong môi trường giảm từ 6% xuống còn 1.5-1.8%Để thu chế phẩm khô, cần tách sợi nấm ra khỏi canh trường lỏng. Cô đặc chân không canh trường lỏng đến khi hàm lượng chất khô đạt 5-8% rồi sấy khô trên thiết bị sấy phun. Điều kiện sấy phun là nhiệt độ chất tải nhiệt đi vào phải đạt 165-180 độ C và đi ra đạt 60-70 độ C. Thời gian lưu của chế phẩm enzyme trong thiết bị sấy phun phải không quá 7 giây và nhiệt độ chế phẩm sau khi sấy phải không quá 40 độ C. Chế phẩm thu được cần phải đóng gói kín để tránh hút ẩm. Phương pháp yếm khí Môi trường: bã củ cải 2%; (NH4)2HPO4 0.75%; KH2PO4 0.1%; CaCO3 0.3%; nước chiết ngô 0.5%Clostridium pectinofermentants 15 có khả năng tổng hợp pectinase một cách mạnh mẽ ở pha tăng trưởng của quá trình sinh trưởng và tăng đồng thời với sự tích luỹ sinh khối. Sự tích luỹ enzyme sẽ tối đa tương ứng với pha ổn định của sự sinh trưởng qua 55-60h, pH ban đầu của môi trường dinh dưỡng là 6.5-7.0. Vật liệu gieo cấy ban đầu được chuẩn bị ở trạng thái canh trường chứa bào tử và được cấy với lượng 4% theo thể tích. Quá trình nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 35%Cl.felsineum cũng có thể được nuôi cấy yếm khí để thu pectinase. Thành phần môi trường gồm có: lactose 2%; pectin củ cải 1%; (NH4)2HPO4 0.4%; K2HPO4 0.7%; KH2PO4 0.3%; NaCl 0.1%; MgSO4 0.025%; FeSO4 dạng vết; CaCO3 0.5%; dịch nấm men tự phân 0.05%; ascorbic acid 0.5%Có thể tiến hành thu chế phẩm từ dịch lọc canh trường bằng cách kết tủa enzyme với dung môi hữu cơ hoặc với muối ammonium sulfat. Nếu kết tủa bằng dung môi hữu cơ, pH của dung dịch đã xử lý là 6.5-6.8.Nếu kết tủa bằng 2-2.5 thể tích aceton thì hoạt độ enzyme trong kết tủa đạt 93-95% so với hoạt độ ban đầu.Khi kết tủa ammonium sulfat có độ bão hoà bằng 0.2 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectinesterase và pectintranseliminase, khi độ bão hoà là 0.9-1.0 thì sẽ thu được chế phẩm chỉ chứa pectintrenseliminase và exopolygalacturonase. Phương pháp tinh sạch Có rất nhiều kỹ thuật và phương pháp tinh sạch khác nhau để tinh sạch enzyme. Các kỹ thuật này được áp dụng chủ yếu dựa vào tính chất của phân tử protein như kích thước, khối lượng phân tử, khả năng tích điện, ... Mỗi kỹ thuật tinh sạch đều có ưu và nhược điểm riêng trong việc chiết tách các loại protein-enzyme khác nhau. Trong khuôn khổ của luận văn này, chúng tôi xin giới thiệu một số kỹ thuật cơ bản và thường được áp dụng trong tinh sạch pectinase Giới thiệu chung Các dạng chế phẩm enzyme: Chế phẩm thô: chế phẩm thô từ canh trường lỏng và chế phẩm thô từ canh trường bề mặt. Chế phẩm kỹ thuật: là chế phẩm được tinh chế sơ bộ, trong đó một số protein và enzyme tạp đã được tách ra. Trong chế phẩm kỹ thuật thường chứa một vài enzyme chủ yếu. Chế phẩm tinh khiết: là chế phẩm trong đó chỉ chứa một loại enzyme nhất định với hàm lượng cao. Thường tinh sạch enzyme từ các chế phẩm enzyme thô. Chế phẩm thô thường chứa những thành phần cơ bản sau: Nước –chiếm khối lượng lớn nhất. Protein không có hoạt tính sinh học. Các tạp chất từ tế bào (nếu là nguồn động, thực vật), từ môi trường nuôi cấy (nếu là nguồn VSV). Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học cao). Quá trình tinh sạch enzyme là quá trình loại bỏ ba phần đầu, chỉ nhận sản phẩm cuối là enzyme mong muốn (trong đó phần lớn enzyme tạp đã được loại bỏ). Việc loại ba thành phần đầu không thể cùng thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn, ta sẽ loại bỏ được một phần không phải là enzyme mong muốn ra khỏi hỗn hợp, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo.Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme: Khối lượng chế phẩm enzyme được giảm dần qua từng bước tinh sạch. Tăng hoạt tính enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình sử dụng sau này. Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm. Tạo những chế phẩm tinh khiết nhằm mục đích nghiên cứu hoặc ứng dụng trong y học.. Tóm tắt quá trình tinh sạch Phương pháp kết tủa Kết tủa bằng cách thay đổi lực ion. Nguyên tắc Enzyme hòa tan trong dung dịch dựa vào sự cân bằng giữa lực tĩnh điện và tương tác kỵ nước. Sự kết tủa enzyme xảy ra khi ta thêm muối trung tính vào dung dịch với nồng độ thích hợp. Khi đó, enzyme kết tủa thuận nghịch và có thể thu lại dung dịch enzyme bằng cách tách (ly tâm) và hòa tan lại kết tủa. Ngoài ra, trong một số trường hợp, khi bổ sung muối còn có tác dụng làm bền enzyme, chống lại sự biến tính và phân hủy hoặc nhiễm vi sinh vật Tác nhân kết tủa Để kết tủa enzyme có thể sử dụng nhiều loại muối khác nhau. Trong thực tế, ammonium sulfate được dùng phổ biến nhất vì muối này có độ hòa tan cao trong nước, đạt được lực ion cao và giá thành rẻ. Tỷ trọng của dung dịch bão hoà khoảng 1.235 g/mL, thuận lợi cho quá trình ly tâm để tách kết tủa. Các yếu tố ảnh hưởng Nồng độ muối:ở nồng độ thấp, sự có mặt của muối làm bền nhóm mang điện trong phân tử enzyme và làm tăng tính tan của enzyme. Khi nồng độ muối tăng thì độ tan của protein cũng tăng. Nếu tiếp tục tăng nồng độ muối thì độ tan của enzyme sẽ giảm và enzyme bắt đầu kết tủa vì khi thêm muối vào dung dịch, một số phân tử nước sẽ solvat phân tử muối Tính chất ion: sự ảnh hưởng của muối đến quá trình kết tủa được xác định qua tính chất của các ion, trong đó điện tích ion là yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Hiệu quả ảnh hưởng của các ion âm giảm dần theo trật tự sau: phosphate, sulphate, acetate, chloride… Những ion dương hóa trị một có ảnh hưởng mạnh hơn ion dương hóa trị hai. Hiệu quả ảnh hưởng xếp theo thứ tự giảm dần của các ion dương như sau: NH4+ , K+ , Na+. Thành phần, nồng độ dịch protein, nhiệt độ quá trình cũng có ảnh hưởng đến sự kết tủa protein. Nhiệt độ càng cao thì tính tan của protein càng giảm Phương pháp tiến hành Nồng độ muối tối ưu cần sử dụng thay đổi tùy theo từng trường hợp và được xác định bằng thực nghiệm. Khi thực hiện thí nghiệm, cần tiến hành bổ sung ammonium sulphate chậm và khuấy đều. Kết tủa có thể tách ra bằng ly tâm hay lọc. Phương pháp lọc chỉ được áp dụng khi tỷ trọng của protein kết tủa gần bằng với tỷ trọng trong dung dịch. Trong một số trường hợp, có thể sử dụng phương pháp kết tủa phân đoạn để tinh sạch protein. Người ta bổ sung ammonium sulfate vào dịch trích đến nồng độ mà protein mong muốn không tủa, các kết tủa xuất hiện sẽ được tách bỏ. Sau đó bổ sung muối vào dịch để đạt đến nồng độ mà protein mong muốn kết tủa. Cuối cùng, tách và thu nhận kết tủa. Ứng dụng trong nghiên cứu tinh sạch pectinase Ammonium sulphate là tác nhân thường gặp nhất trong nghiên cứu tinh sạch enzyme nói chung và đặc biệt trong tinh sạch enzyme pectinase (Afifi A.F. và cộng sự, 1988; Miyazaki Y., 1990; Jaffar M. B. và cộng sự, 1993, Guo Chung-Teng và cộng sự, 2001). Ammonium sulphate có ưu điểm nổi bật là nguyên liệu rẻ tiền, phổ biến và ít có khả năng gây biến tích bất thuận nghịch enzyme. Vì thế, đây thường là tác nhân kết tủa được nhà sản xuất ưu tiên lựa chọn. Nồng độ ammonium sulphate tối ưu cho tinh sạch enzyme thường nằm trong khoảng từ 60-80% tuỳ vào từng loại enzyme cụ thể. Kết tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ Nguyên tắc Quá trình kết tủa enzyme dựa trên sự thay đổi hằng số điện môi của môi trường. Lực đẩy và lực hút tỉ lệ nghịch với hằng số điện môi của môi trường. Vì vậy, khi bổ sung các dung môi có hằng số điện môi nhỏ (ethanol, acetone...), chúng sẽ làm giảm hằng số điện môi của môi trường, từ đó làm giảm khả năng solvat hóa của các phân tử nước đối với phân tử enzyme trong dung dịch. Do vậy, tính tan của enzyme giảm và enzyme bị kết tủa. Hiện tượng kết tủa xảy ra tốt hơn và cần ít dung môi hơn khi pH dung dịch gần với pI của enzyme. Dung môi Protein có thể kết tủa bằng dung môi hữu cơ tan trong nước, như ethanol, acetone, methanol, isopropanol. Trong đó, acetone và ethanol là hai dung môi phổ biến nhất trong việc kết tủa protein. Dung môi sử dụng phải an toàn, không độc và có nhiệt độ bốc cháy lớn hơn 20oC. Các yếu tố ảnh hưởng Kích thước của protein cũng ảnh hưởng đến sự kết tủa. Những protein có kích thước lớn sẽ tủa ở nồng độ dung môi thấp hơn so với protein có kích thước nhỏ Sự tỏa nhiệt của dung môi: khi bổ sung dung môi vào dung dịch enzyme, nhiệt độ của hỗn hợp tăng vì đây là một quá trình tỏa nhiệt. Khi nhiệt độ tăng cao, cấu hình không gian của enzyme bị thay đổi và enzyme có thể bị kết tủa bất thuận nghịch Tỷ trọng của dung môi càng nhỏ thì độ nhớt càng thấp, kết tủa càng dễ tách Độ dài mạch carbon của dung môi càng dài thì khả năng gây biến tính bất thuận nghịch càng tăng. Phương pháp thực hiện Thông thường, người ta bổ sung dung môi vào dung dịch enzyme với một tỉ lệ thể tích nhất định. Sau đó, dung dịch enzyme cần được khuấy đều và để yên trong một thời gian nhằm tạo điều kiện kết tủa thuận lợi. Khi các enzyme đã kết tủa hết thì cần phải tách ra ngay bằng quá trình ly tâm lạnh. Trong kết tủa vẫn còn một phần dung môi. Lượng dung môi này có thể tách ra bằng phương pháp bốc hơi ở áp suất chân không Kết tủa enzyme sử dụng polymer hữu cơ Nguyên tắc: Các polymer hữu cơ là dung môi có tính háo nước lớn. khi bổ sung vào dung dịch chứa protein, chúng có thể tương tác với lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein và làm giản khả năng hòa tan của protein. Nhờ đó, các phân tử protein và enzyme sẽ kết tủa và tách ra khỏi dung dịch. Các dung môi polymer hữu cơ: Thường dùng là: polyethylene glycol (PEG 6000) và polyethylene glyco (4000). Nhược điểm: Tăng độ nhớt dịch enzyme, gây khó khăn cho việc tách kết tủa ra khỏi dung dịch. Nếu sử dụng phương pháp lọc để phân riêng, thời gian lọc sẽ kéo dài, còn nếu sử dụng phương pháp ly tâm sẽ tác động lên dung dịch 1 lực ly tâm lớn. điều này rất khó thực hiện khi triển khai ở quy mô sản xuất lớn. Nếu lực ly tâm nhỏ thì có thể không thu hồi hết lượng kết tủa. Theo thực nghiệm thì độ tinh sạch của chế phẩm tăng chỉ dao động từ 1.16 đến 1.57 lần. Như vậy, nhìn chung thì hiệu quả của phuong pháp là không cao. Kỹ thuật siêu lọc Nguyên tắc: Kỹ thuật siêu lọc (Ultrafiltration) là quá trình phân riêng chọn lọc các hợp chất bằng màng lọc có kích thước siêu nhỏ với áp suất làm việc vào khoảng 0,5 – 5bar. Đường kính mao quản trung bình từ 2 đến 50 nm. Vật liệu lọc Trong phương pháp này, vật ngăn để phân riêng các cấu tử là membrane. Áp lực là động lực duy nhất của quá trình. Membrane có thể được sản xuất từ nhiều loại vật liệu khác nhau như: cellulose acetate, polyamide, polysulfone hay ceramic. Ứng dụng trong nghiên cứu tinh sạch pectinase Trong lĩnh vực tinh sạch enzyme nói chung, đặc biệt là pectinase, quá trình siêu lọc thường được áp dụng trong giai đoạn đầu của quy trình tinh sạch. Mục đích của quá trình là tách nước và các tạp chất có phân tử lượng nhỏ trong canh trường lỏng như các ion kim loại, đường sót, acid amin, peptide… (dòng permeate). Trong hầu hết các trường hợp, enzyme tinh sạch phải được giữ lại trên bề mặt vật liệu lọc (dòng retentate). Vì thế, vật liệu lọc cần phải có kích thước mao quản nhỏ hơn kích thước enzyme. Phần lớn các enzyme polygalacturonase có khối lượng phân tử trong khoảng 30-80kDa (Jayani R. S. và cộng sự, 2005). Vì vậy, để tinh sạch canh trường nuôi cấy thu nhận loại enzyme này thì cần vật liệu có kích thước nhỏ hơn 30kDa. Kích thước này không tách được các protein tạp (có khối lượng phân tử lớn hơn 30kD) bị lẫn trong canh trường. Kết quả nghiên cứu của Manachini P.L. và cộng sự (1987) khi tinh sạch endo-PGase bằng kỹ thuật siêu lọc sử dụng sợi Diaflo (kích thước 10kDa) từ canh trường nuôi cấy nấm sợi Rhizopus Stolonifer cho thấy, độ tinh sạch của chế phẩm sau tinh sạch tăng lên 2,1 lần với hiệu suất thu hồi là 89%. Một nghiên cứu khác của Gainvors A. và cộng sự (2000) có thể nâng cao độ tinh sạch pectinase lên đến 10,4 lần với hiệu suất thu hồi khoảng 83% bằng kỹ thuật siêu lọc với kích thước lỗ 30kDa. Tuy nhiên, trong một số trường hợp, việc áp dụng kỹ thuật siêu lọc không đạt hiệu quả cao do lựa chọn kích thước lỗ màng không thích hợp (Dinu D. và cộng sự, 2007). Phương pháp sắc ký Thuật ngữ sắc ký dùng để chỉ các kỹ thuật phân tích và điều chế cho phép tách biệt các hợp chất khác nhau của một hỗn hợp. Phép phân tích sắc ký này dựa vào sự di chuyển khác nhau trong một pha động của các chất hoà tan đã được gắn trên một pha tĩnh ở trạng thái rắn. Người ta thường chọn các chất có khả năng kết gắn được với các chất định phân tách làm pha tĩnh. Tương tác giữa chất hoà tan và pha tĩnh có thể là tương tác hấp phụ, tương tác trao đổi ion, tương tác kị nước, tương tác kiểu rây phân tử hoặc tương tác đặc hiệu sinh học.Dựa vào các kiểu liên kết người ta chia ra thành các kiểu sắc ký sau: Sắc ký lọc gel: (sắc ký loại trừ phân tử) phân đoạn protein theo klg. Sắc ký lọc (sắc ký loại trừ không gian, loại trừ khuếch tán hay phương pháp loại trừ phân tử) cho phép phân đoạn một số hỗn hợp protein theo khối lượng phân tử của chúng. Thực tế ngoài kích thước ra, hình dạng của phân tử cũng có ảnh hưởng.Tuy nhiên thông số này có thể bỏ qua nếu protein trong hỗn hợp là hình cầu. Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để tách enzyme, các phân tử được tách ra dựa theo kích thước và hình dạng của chúng.Pha tĩnh: các hạt gel xốp chứa đầy trong cột. Khi cho dung dịch các protein chảy qua cột thì các phân tử lớn nhất của hỗn hợp có đường kính lớn hơn lỗ của pha tĩnh, không thể khuếch tán vào bên trong hạt nên bị loại trừ và chúng sẽ đi ra khỏi cột cùng với thể tích dịch rửa bằng thể tích giữa các hạt gel (Vo).Các phân tử bé, ngược lại, sẽ khuếch tán tối đa vào torng hạt gel và thể tích dịch rửa của chúng sẽ bằng tổng thể tích pha lỏng của cột (V1).Còn các phân tử có kích thước trung gian sẽ khuếch tán hạn chế vào hạt, thể tích dịch rửa của chúng càng lớn khi quãng đường đi (của chúng) vào bên trong hạt càng dài thì kích thước của chúng càng nhỏ.Phương pháp lọc gel thường được ứng dụng để tách các phân tử nhỏ như muối vô cơ và các phân tử nước thông qua cấu trúc mạng lưới của sephadex. Thường phương pháp này chỉ làm tăng độ cô đặc nhưng giảm hiệu suất thu hồi sản phẩm do các phân tử protein bị kẹt lại giữa các hạt gel. Sắc ký trao đổi ion: liên kết ion. Nguyên tắc: Dựa trên sự tích điện của các phân tử protein. Phương pháp trao đổi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất ezyme trong quy mô công nghiệp.Tính chất tích điện của phân tử protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH, từ đó người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation.Trong sắc ký trao đổi ion, việc gắn một protein enzyme vào nhựa trao đổi ion sẽ phụ thuộc vào trạng thái ion hoá của potein, cũng như trạng thái ion hoá của nhựa trao đổi, pH, lực ion và nhiệt độ. Quá trình phân tách trên bao gồm hai giai đoạn:Hấp thụ thuận nghịch protein-enzyme cần tinh sạch (và các protein có điện tích gần giống nhau) vào nhựa trao đổi ion. Khử hấp phụ các ion đã được hấp thụ.Bằng cách thay đổi pH của dịch rửa sẽ dẫn tới sự thay đổi ion hoá và do đó thay đổi điện tích tổng của protein. Hoặc bằng cách tăng lực ion và tăng nồng độ ion đối cạnh tranh. Các protein –enzyme nào có ái lực với nhựa trao đổi ion yếu nhất sẽ bị đẩy ra trước tiên và ngược lại. Sắc ký ái lực: liên kết kỵ nước. Sắc ký hấp phụ: liên kết yếu như liên kết kỵ, nước, liên kết Van der Waals. Phương pháp thẩm tích Nguyên lý: trong quá trình tinh sạch các enzyme, để loại bỏ các phân tử hoà tan nhỏ không mong muốn khỏi dịch trích ly enzyme như là amoni sulfat sau kết tủa, dùng một muối để khử hấp thụ enzyme trong sắc ký trao đổi ion, hoặc một phối tử cạnh tranh trong sắc ký ái lực,... người ta thường dùng phương pháp thẩm tích. Thời gian nuôi Hoạt động pectinase (dvhd/1g canh trường) 30 361 32 740 34 1150 36 1300 38 887 40 288 Túi thẩm tích được cấu tạo bằng một màng bán thấm (thường bằng solephan). Túi thẩm tích có chứa dịch chiết enzyme, được đặt vào trong một dung dịch đệm không được chứa chất hoà tan cần loại bỏ. Chất hoà tan khuếch tán ra khỏi màng theo chiều Gradient nồng độ, ở trạng thái cân bằng thì nồng độ chất hoà tan bên trong túi và bên ngoài dịch đệm sẽ cân bằng nhau do đó phải dùng một thể tích lớn dung dịch đệm và thỉnh thoảng phải thay dung dịch mới.(NH4)2SO4 được cho vào túi thẩm tích, rồi đặt túi đó vào dung dịch có chứa polymer cacboxyl methyl cellulose, polyetylenglycol (PEG) là những polymer có tính háo nước. Kết tủa ái lực Kết tủa ái lực là phương pháp phân tách dựa trên sự tạo phức giữa một phối từ ái lực với protein cần tách nằm trong dịch enzyme thô, sau đó phức này sẽ được kết tủa bằng cách thêm vào một tác nhân hợp lý.Alginate là copolymer của acid guluronic và acid mannuronic, tạo kết tủa với ion Ca 2+, được dùng để liên kết với pectinase trong quá trình tinh sạch (đi từ A.niger). Nếu xử lý alginate bằng vi sóng ở nhiệt độ 75 độ C sẽ làm tăng khả năng chọn lọc, chế phẩm enzyme thu được có tỷ lệ tinh sạch 20 lần và giữ được 83% hoạt tính.  Thu chế phẩm từ ASP.NIGER 72-32 Thành phần với môi trường thích hợp để chủng Asp.Niger cho pectinase cao. Ảnh hưởng thời gian nuôi Để nghiên cứu ảnh hưởng này Asp.niger được nuôi cấy trên môi trường có độ ẩm 50% và nuôi ở nhiệt độ 30oC trong khỏang từ 30-40 giờ.Sau 2 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường.Kết quả thu được ghi ở bảng 3.Qua bảng 3 thấy sự sinh tổng hợp pectinase của chủng nấm mốc này xảy ra mạnh mẽ từ giờ thứ 32 trở đi và đạt cực đại vào giờ thứ 36.Sau đó giảm dần. Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có độ ẩm 50% ở nhiệt đô khác nhau.Sau 2 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường. Nhiệt độ nuôi (0C) Hoạt động pectinase (dvhd/1g canh trường) 28 803 30 1134 32 1351 34 1688 36 764 48 520 Bảng: Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi đến sinh tổng hợp pectinase Asp.niger 72-73 Ta thấynhiệt độ từ 30-32oC là thích hợp nhất cho sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger 72-32. Ảnh hưởng độ ầm ban đầu của môi trường nuôi cấy Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường có độ ẩm ban đầu tahy đổi từ 40-65% và nuôi ở 32oC. Sau 36 giờ xác định họat độ pectinase của canh trường Độ ẩm ban đầu Hoạt động pectinase (dvhd/1g canh trường) 40 481 45 731 50 957 55 1355 60 897 65 638 Bảng: Ảnh hưởng độ ẩm ban đầu đến nuôi đến sinh tổng hợp pectinase Asp.niger 72 -73 Qua đó ta thấy độ ẩm ban đầu của môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến sự hình thành pectinase của Asp.niger 72-32.Họat độ pectinase mạnh nhất khi môi trường nuôi cấy có độ ẩm ban đầu là 55%.Khi độ ẩm hơi tăng họat độ pectinase giảm đi 1 cách nhanh chóng, chỉ còn xấp xỉ 2/3 họăc ½ khi độ ẩm ban đầu 60-65%. Lượng nguyên liệu chứa pectin Hoạt động pectinase (dvhd/1g canh trường) MT có cà rốt MT có củ cải MT có bã táo 0 142 142 142 3 302 296 202 5 621 532 496 7 980 820 600 9 1290 1050 726 11 1650 1265 850 12 1400 1500 970 13 1150 1300 1100 14 930 1180 900 15 650 870 800 Ảnh hưởng của hàm lựơng và nguồn nguyên liệu chứa pectin khác nhau đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger &72-32 (hương pháp đồng) Lượng nguyên liệu chứa pectin (%) Hoạt động pectinase (dvhd/1g canh trường) 0 0.39 0.39 0.39 7 0.65 0.59 0.49 9 0.72 0.62 0.59 11 0.89 0.65 0.6 12 0.79 0.79 0.65 13 0.62 0.62 0.68 14 0.58 0.58 0.52 15 0.5 0.5 0.46 Ảnh hưởng của hàm lựơng và nguồn nguyên liệu chứa pectin khác nhau đến sinh tổng hợp pectinase của Asp.niger &72-32 Theo tính tóan sơ bộ cho thấy môi trường kể trên hơi thiếu nitơ.Vì vậy nghiên cứ ảnh hưởng của việc cho thêm muối (NH4)2SO4 vào môi trường. Asp.niger 72-32 được nuôi cấy trên môi trường cơ bản có chứa 11% cà rốt với hàm lượng muối amon sunfat thay đổi, nuôi ở 320C và sau 36 giờ đem xác định họat độ pectinase của canh trường. kết quả thu được ở bảng 8Qua bảng 8 nhận thấy muối amon sunfat trong môi trường có ảnh hưởng đến tổng hợp pectinase của nấm mốc trên môi trường có cà rốt 11%. Khi thêm từ 1-2.5%amon sufat họat độ pectinase của chùng Asp.niger có thể tăng từ 7- 10 Xác định hoạt tính enzyme Xác định hoạt tính pectinase có thể tiến hành bởi một trong những phương pháp sau đây: Phương pháp nhớt kế Độ nhớt của dung dịch chứa pectine sẽ thay đổi sau một thời gian bị pectinase tác dụng. Độ nhớt được đo bằng nhớt kế, thông qua thời gian dịch chuyển một thể tích nhất định dung dịch chứa pectinase.Sử dụng 9 bình tam giác, mỗi bình cho vào 50ml dung dịch pectin 0.6% vào tủ ấm 50 độ C, thời gian 15 phút, sau đó cho enzyme vào với lượng từ 0.1-0.9 ml và bổ sung nước cất cho đủ 1ml. Duy trì 9 mẫu này ở nhiệt độ 50 độ C, thời gian 1h, sau đó làm lạnh xuống 2-3 độ C, lọc qua vải 2 lần. Lấy 5ml dung dịch thì nghiệm này cho qua nhớt kế để đo độ nhớt thông qua thời gian chảy của 9 mẫu dung dịch chứa pectine đem thí nghiệm nói trên. Phương pháp đông chung(Cu-pectat) Nguyên tắc: Thủy phân pectin dưới tác dụng pectinase.Sau đó dùng CuS04 5% để kết tủa axit pectin dưới dạng đồng pectat(Cu-pectat).Hòa tan kết tủa bằng NH4OH 25%. Xác địng lượng đồng nhờ iốt. Một đơn vị họat động pectinase theo phương pháp này là một lượng emzyme có khả năng xúc thủy phân hết 1 mg pectin trong thời gian 1 giờ ở điều kiện tiêu chuẩn. Phương pháp so màu: Theo phương pháp này: Một đơn vị họat động pectinase là một lượng emzyme có khả năng xúc tác thủy phân hết 1 g pectine trong thời gian 1giờ thành acid galacturonic ở điều kiện tiêu chuẩn. CHƯƠNG 3: ỨNG DỤNG ENZYME PECTINEASA TRONG LÀM NƯỚC QUẢ Giới thiệu về ứng dụng enzyme pectinase Trong sản xuất thực phẩm, người ta sử dụng các chế phẩm pectinase duới dạng tinh khiết. Người ta không dung chế phẩm dưới dạng canh trường nấm mốc sấy khô. Tỉ lệ chế phẩm pectinase cô đặc trên lượng nguyên liệu đem chế biến vào khoảng từ 0,03- 0,05 đến 0,10%. Trong sản xuất rượu vang, cũng như trong sản xuất nước quả và các nước uống không rượu, đều có thể sử dụng pectinase một cách hiệu quả. Nhờ tác dụng của pectinase mà các quá trình ép, làm trong và dịch lọc quả rất dễ dàng, do đó làm tăng hiệu suất sản phẩm. Chẳng hạn đưa pectinase vào khâu nghiền quả, sẽ làm tăng hiệu suất nước quả sau khi ép tới 15 – 25%. Bởi lẽ khi có pectinase phân giải các chất pectinase mà dịch quả trong suốt không bị đục và lọc rất dễ dàng. Không những vậy. Enzyme pectinase còn góp phần chiết rút được các chất màu, tannin và những chất hoà tan nữa, do đó làm tăng thêm chất lượng thành phẩm. Tồn tại 3 nhóm enzyme pectinase phân giải pectin. Pectin methyl esterase Depolymease Exoenzym pectinase Pectin methyl esterase (EC.3.1,1,11): Enzyme này đã tham gia phân giải pectin thành acid pectic và methanol. Enzyme này còn có tên khác là pectiestenase (PE).Hiệu suất thuỷ phân pectin của enzyme này rất là cao, có thể đạt được 98%. Pectinesterase của nấm sợi hoạt động mạnh ở pH 3-5. Cả hai loại pectinase này bị biến tính ở nhiệt độ 800C. Ezyme pectin methyl esterase tham gia tác động vào COOH3theo cơ chế sau: Pectin depolymease: Ezyme này có trong tế bào thực vật. Tuy nhiên hiện nay người ta sản xuất enzyme này theo quy mô công nghiệp từ nấm sợi và từ vi khuẩn. Chúng được phân ra làm 4 loại như sau: Endo pectin traseliminase (EC,4.2.2.3), viết tắt là PTE – pectiliase. Endo petin acid traseliminase (EC, 4.2.2.1), viết tắt là PATE. Endo – poly galacturonase (EC, 3.2.1.15), viết tắt PMG. Endo – poly methyl galacturonase . Việc ứng dụng pectinase để thu nhận nước quả được áp dụng lần đầu tiên vào năm 1930. Từ đó đến nay việc áp dụng enzyme này đã trở nên rất phổ biến ở nhiều nước trên thế giới. Việc thu nhận nước quả từ trước đến nay chủ yếu bằng phương pháp ép. Nếu pectin còn nhiều sẽ theo nước quả và gây ra hiện tượng nước quả bị đục, có độ keo cao và rất khó lọc trong. Trong tế bào của quả nước chiếm khoảng 90-95%. Nếu ta chỉ nghiền sau đó ép thì ta chỉ có thể thu nhận được khoảng 60-70% là tối đa. Khi ta cho enzyme pectinase vào, hiệu suất ép sẽ tăng 15-30%. Nhiều trường hợp, hiệu suất ép tăng đến 50%. Liều lượng chế phẩm enzyme tinh khiết cho vào là 0,03- 0,05% hoặc chế phẩm thô là 0,5 – 2%. Nhiệt độ duy trì cho quá trình thuỷ phân là 43 – 45%.Thời gian thuỷ phân là 4 – 8h.dịch quả thu được bằng pectinase sẽ tronng hơn, khả năng lọc sẽ tốt hơn và hiệu quả kinh tế thấy rõ. Ứng dụng enzyme pectinase sản xuất nước quả Các chế phẩm enzyme Trong sản xuất nước quả và rượu vang, việc sử dụng enzym là một tiến bộ khoa học rất lớn.Các chế phẩm enzyme được sử dụng trong sản xuất nước quả và rượu vang có thể là một hỗn hợp nhiều loại enzyme và cũng có thể chỉ là một loại enzyme riêng biệt.việc sử dụng hỗn hợp enzyme hay từng loại enzyme riêng biệt phụ thuộc vàp nguyên liệu và sản phẩm cần đạt tới. Ngoài ra, việc sử dụng các loại chế phẩm enzyme như trình bày còn phụ thuộc vào công nghệ sản xuất ( các yếu tố kỹ thuật). Trong sản xuất nước quả và rượu vang, người ta thường sử dụng một trong sáu nhóm enzyme sau: Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả đục. Mục đích sử dụng nhóm chế phẩm enzyme này là làm tăng hiệu suất trích ly để thu được luợng sản phẩm lớn. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản xuất nước quả trong, không chứa pectin. Mục đích sử dụng nhóm này là làm tăng hiệu suất trích ly và thuỷ phân hoàn toàn các chất protein, pectin, làm giảm độ nhớt và làm triệt tiêu nguyên nhân làm đục nước quả. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để làm tăng khả năng đồng hoá nước quả và thịt quả, làm tăng khả năng trích ly nước quả. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để sản suất bán sản phẩm rượu vang nhằm làm tăng hiệu suất trích ly của bán sản phẩm. Nhóm chế phẩm enzyme dùng để ngăn cản quá trình oxy hoá và làm cản trở sự phát triển của vi sinh vật hiếu khí phát triển trong nước quả, trong rượu vang. Nhóm chế phẩm enzyme dùng vào mục đích chống lại đường trong sản suất siro thành phẩm. Việc sử dụng các chế phẩm enzyme phải được xem xét kỹ lưỡng trên cơ sở đặc điểm nguyên liệu trái cây cần xử lý.Trong các đặc điểm của trái cây, người ta quan tâm rất nhiều đến đặc điểm màu sắc tự nhiên của sản phẩm. Trong nhiều trường hợp, việc sử dụng enzyme phải đảm bảo giữ được màu sắc tự nhiên ban đầu hoặc tạo ra những màu sắc theo ý muốn bằng cách điều khiển những phản ứng enzyme. Theo màu sắc tự nhiên, các loại trái cây được chia làm hai loại: Trái cây có màu nhạt: táo, lê, nho trắng, chuối, cam, xoài, bưởi.. Trái cây có màu sẩm do chứa nhiều antõian: anh đào, mận đỏ, nho đỏ, mận đen, dâu.. Để xử lý quả nghiền có màu nhạt, người ta thường sử dụng một loạt các enzyme sau: Enzym endo-PmG để làm giảm độ nhớt của dịch quả. Enzyme PE làm tăng hiệu suất trích ly Enzyme khác như cellulose, hemicelluase, protease không bắt buộc. Ứng dụng chế phẩm pectinase trong sản xuất nước quả Từ các loại quả khác nhau, người ta thường chế biến thành các loại nước quả trong, nước quả đục, trước tiên phải chiết rút được dịch quả từ mô cơ bản, mô bì đôi khi mô cơ học nữa. Do đó, hiệu suất chiết rút dịch quả sẽ phụ thuộc vào khả năng thấm của tế bào, cấu tạo giải phẩu và tình chất cơ lý của nguyên liệu, độ nhớt của chính dịch quả, độ chắc của thịt quả, cũng như thành phần định tính và định lượng của pectin chứa trong dịch bào và trong thành tế bào của mô quả. Để sử dụng vào việc chế biến nước quả trong thì chế phẩm thì pectinase phaỉ có enzym endo và exo-polygalacturonse, enzym pectinestenaza.Trong chế phẩm loại này thì những enzym vừa kể trên là những enzym quyết định hiệu quả của chế phẩm.Vì endo và exo-polygalacturonse sẽ làm giảm độ nhớt của dịch quả, còn enzymPE cũng góp phần vapò tác dụng của enzym này.Enzym proteinase của chế phẩm sẽ thuỷ phân vỏ protein của vỏ nguyên sinh tế bào, kết quả là làm cho sự thoát của dịch quả dễ dàng.Sự có mặt của xenluase và hemixenlulase ở trong chế phẩm cũng tốt nhưng không bắt buộc. khi sử dụng cho các loại quả như táo, lê thì trong chế phẩm không được phép có enzyme pectinaseliminase và enzym này sẽ phân huỷ protopectin vốn gắn các tế bào riêng biệt của mô quả lại với nhau, do đó gây mủn hoá mô quả, làm tăng độ nhớt của dịch quả và kết quả là làm giảm hiệu suất dịch quả. Ngược lại, khi sử dụng cho các loại quả mọng như dâu tâythì sự có mặt trong chế phẩm enzym PTE lại cần thiết vì enzym này sẽ làm mủn hoá tế bào làm cho tính chất thoát nước của tế bào tăng lên còn độ nhớt của dịch quả lại giảm xuống. Ngoài ra, đối với các chế phẩm pectinase dùng trong sản xuất nước quả trong cũng không được phép có các enzym oxydase( ascohatoxydase, poliphenoloxydase). Trong chế biến nước quả có thịt thì các enzym PTE, hemixenlulase và xenlulase lại là những enzym quyết định hiệu quả tác dụng của chế phẩm.trong đó vai trò dẫn động là enzym PTE có tác dụng phân huỷ protopectin của mô quả. Hemixenlulase và xenlulase sẽ cùng với PTE làm cho độ đồng thể của nước quả có màu sang thì trong chế phẩm không chứa enzym oxi hoá, còn cho các nguyên liệu có carotenoid và antõian thì không chứa enzym phá huỷ các chất này. Để thu được nước quả, trong trường hợp có sử dụng enzym pectinase, người ta cũng phải nghiền nhỏ nguyên liệu quả. Bã nghiền nhânh được đem xử lý bằng enzym, sau đó mới đem ép hoặc ly tâm.Trong trường hợp có sử dụng enzyme, người ta có thê nghiền nhỏ tới mức tối đa, cốt sao thuận lợi cho tác dụng của enzym mà không sợ bị tắc nghẽn kênh dẫn dịch quả trong quá trình ép sau này. Dùng pectinase không chỉ làm tăng hiệu suất dịch quả mà còn để làm trong dịch quả. Phương pháp sử dụng enzym có hiệu quả hơn cả.Bởi lẽ nhờ tác dụng của các enzyme mà các hệ keo của nước quá sẽ bị phá huỷ hoàn toàn.Nếu như khi làm trong bằng các phương pháp khác pectin bị kết tủa một phần thì khi xử lý bằng pectinase, pectin bị phân giải hoàn toàn thành các chất hoà tan. Với phương pháp enzym, khi mang một lượng thừa chế phẩm sẽ loại trừ được trường hợp làm trong không hoàn toàn. Dịch nước quả được xử lý bằng chế phẩm pectinase thường có vị hoàn toàn hơn và ít có khuynh hướng bị đục hơn. Quá trình làm trong dịch quả dưới tác dụng của pectinase có thể chia làm 3 giai đoạn: Giai đoạn “ bất ổn định hoá” được tiêu biểu bằng sự giảm độ nhớt một cách sâu sắc và thường được gọi là trạng thái “ phá vỡ” Giai đoạn “kết lắng” bắt đầu từ trạng thái “phá vỡ” và kết thúc khi kết tủa hoàn toàn. Giai đoạn cuối cùng thường được xác định bằng sự vắng mặt các pectin kết tủa bởi ion canxi. Sử dụng enzym để sản xuất nước quả thanh trùng uống trực tiếp từ quả táo và quả vải Ngày nay, nước quả trong hoặc nước quả đục được sản xuất ở nhiều nước trên thế giới. Tùy theo hàm lượng đường và acid có trong nước quả, người ta chế biến nước quả có hàm lượng đường và acid thấp, người ta bổ sung đường và acid điều chỉnh chất lượng cuối cùng của sản phẩm. Hàm lượng pectin cao sản phẩm thường không có lợi vì khi đó độ nhớt của sản phẩm rất cao. Việc thủy phân pectin có trong dịch quả còn làm cho các sản phẩm dịch quả không bị đục.Tuy nhiên, việc xử lý pectin bằng pectinase không nên tiến hành phân giải pectin đến cùng mà cần phải giữ một lượng nhất định trong sản phẩm nước quả.Chính lượng pectin này sẽ giúp cho chất lượng nước quả tốt hơn. Trong sản xuất nước quả táo và nước quả vải, người ta sử dụng chế phẩm pectinase cho hiệu quả rất cao.Khi xử lý nước quả ở 500C trong 2 giờ, hiệu suất tách nước quả tăng 20%, ở 37- 40% sau2 -4 giờ thì tăng 20 – 25%.Các nghiên cứu và thực tế sản xuất cho thấy hiệu quả xử lý nước táo rất cao.Chính vì thế, việc ứng dụng enzyme pectinase được áp dung ở tất cả các nhà máy sản xuất nước táo trên thế giới.Trong khi xử lý nước quả bằng enzyme pectinase, người ta thường cho thêm ascorbic acid vào chống quá trình oxy hóa của nước quả táo. Bảng 3.1. Hiệu quả xử lý nước quả và bằng chế phẩm pectinas Stt Loại nước quả Hiệu suất (%) Chất khô (%) Độ acid (%) Đường (%) Pectinase (%) Chất chát (%) Điểm cảm quan 1 Nước quả từ táo Không cho chế phẩm enzyme Có chế phẩm enzyme 71,2 78,8 10,2 11,5 0,53 0,62 6,7 8,0 0,33 0,15 0,04 0,02 4,5 4,8 2 Nước quả vải Không cho chế phẩm enzyme Có cho chế phẩm enzyme 49,2 72,4 8,5 10,2 0,91 1,16 5,62 7,4 0,26 0,12 0,09 0,16 3,8 4,3 Sản xuất nước quả uống ngay từ dâu tây, anh đào và phúc bồn tử Người ta thường sản xuất cả dạng nước quả trong và nước quả đục từ các loại trái cây trên. Trong quá trình sản xuất, người ta thường cho thêm đường và điều chỉnh lại lượng acid cho phù hợp. Các loại nước quả này thường chứa nhiều pectin. Do đó, việc sử dụng các chế phẩm enzyme pectinase dễ loại bỏ khả năng gây đục cho nước quả cũng như ổn định và nâng cao chất lượng dịch quả là điều cần thiết. Người ta rửa sạch các loại quả trên bằng nước của vòi hoa sen. Sau đó, các loại nước quả được đem chà thành dạng pure. Quả nghiền được đun nóng ở nhiệt độ 40-500C được cho vào máy trộn. Tại đây nước quả được phối trộn với tỷ lệ một phần nước quả và 10 phần nước enzyme có lượng enzyme 0,03%. Riêng đối với nước dâu tây, người ta cho thêm 0,03% Vitamin C để làm chất chống oxy hóa. Hỗn hợp này được giữ ở 40C.Thời gian lưu ở nhiệt độ 400C là 4-8 giờ. Nước quả sau đó được cho qua máy ép và được đun nóng đến 450C .Tiếp đó, người ta đem nước quả ly tâm và cuối cùng là lọc qua máy ép lọc khung bản. Bảng 3.2:Hiệu quả việc xử lý nước quả dâu tây, anh đào bằng enzyme Stt Loại nước quả Hiệusuất (%) Chất Khô (%) Độ Acid (%) Đường (%) Pectin (%) Chất chát (%) Điểm cảm quan 1 Nước quả dâu tây Không cho chế phẩm enzyme Có cho chế phẩm enzyme 71,2 78,8 10,2 11,5 0,53 0,62 6,7 8,0 0,33 0,15 0,04 0,02 4,5 4,8 2 Nước quả mâm sôi Không cho chế phẩm enzyme Có cho chế phẩm enzyme 49,2 72,4 8,5 10,2 0,91 1,16 5,62 7,4 0,26 0,12 0,09 0,16 3,8 4,3 Sản xuất nước quả từ nho Nước uống từ trái nho là loại nước uống trong chứ không thuộc loại nước uống đục.Loại nước uống từ nho dạng trong thường được sản xuất nhiều ở hầu hết các nước châu Âu và châu Mỹ. Tuy nhiên hiện nay, người ta cũng sản xuất nước uống từ nhỏ dạng đục (chủ yếu là màu nho có màu đỏ).Trong đó, Ý là nước sản xuất nước uống dạng đục nhiều nhất, sau đó là Pháp, Rumani.Nho là loại quả cho nhiều dịch và chứa nhiều đường.Tuy nhiên, nước nho thường chứa nhiều thịt quả. Trong thịt quả có nhiều pectin, dễ gây đục hoặc nếu thu nhận dịch quả trong thường không cho hiệu suất cao.Chính vì thế, người ta phải xử lý nước nho bằng chế phẩm enzyme pectinase. Lượng enzyme pectinase được sử dụng trong trường hợp làm nát nho là 0,2% so với khối lượng nho. Thời gian xử lý bằng enzyme là 3 giờ ở nhiệt độ 450C, bằng phương pháp xử lý này người ta đã làm tăng hiệu suất thu nhận dịch nho từ 65,9 lên 77,3% đối với nho trắng và từ 66-82,2% đối với nho đỏ. Đối với nho trắng nghiền kỹ, khi xử lý enzyme pectinase trong thời gian 2,5-3 giờ ở nhiệt độ 40-450C, hiệu suất tăng 14-18%. Nếu tiếp tục xử lý sau giai đoạn xử lý trên thêm 4-5 giờ ở 40 – 500C, nước táo sẽ hoàn toàn trong. Ở giai đoạn làm trong dịch quả này, người ta đun nóng dịch quả lên 900C, sau đó hạ nhiệt xuống 500C và khi đó mới sử dụng enzyme để làm trong nước quả. Trong khi ở những mẫu dịch không xử lý enzyme, chu trình làm trong nước nho phải kéo dài 2 - 4 tháng. Hiệu suất thu dịch không sử dụng enzyme chỉ đạt trung bình 65%. Bảng 3.2: Hiệu quả việc xử lý nước nho bằng enzyme Stt Nước nho Chất khô (%) Hiệu suất (%) Độ acid (%) Đường (%) Chất chát (%) Cặn (%) Điểm came quan 1 Mẫu đối chứng 17,5 65,0 0,54 15,1 0,125 3,0 4,2 2 Mẫu xử lý bằng chế phẩm pectinase 19,0 70,1 0,68 16,85 0,135 Có một ít ca-pectat 4,5 Quá trình sản xuất nước nho trắng có xử lý enzyme pectinase Nho được rửa sạch, tách cuống, loại hạt bằng máy xé và chứa chúng vào các thùng kín trong thời gian 6 – 8 giờ hoặc các thùng lên men liên tục trong thời gian 3 – 4 giờ. Trong thời gian lưu trữ này, người ta cho 0,02% ascorbic acid, sau đó ép thu nhận dịch nho. Dịch nho được làm nóng ở 800C, sau đó làm nguội nhanh đến 400C, nước nho đó cho thêm 0,01% enzyme pectinase. Tiến hành quá trình thủy phân cho độ nhớt của nước nho trong suốt.Thời gian thủy phân này khoảng 6 – 8 giờ.Kết thúc quá trình thủy phân, lại đun nóng dịch quả lần thứ hai đến 800C và làm nguội đến 200C và lọc nước quả qua máy lọc ép, tiến hành rót chai và đem thanh trùng. Quá trình sản xuất nước nho đỏ có sử dụng pectinase Nho đã rữa sạch, tách cuống và đun nóng 85 – 900C trong máy gia nhiệt và ngay lập tức làm nguội đến 45 – 500C, giữ dịch nho ở nhiệt độ này trong thời gian 4 – 6 giờ trong thùng kín hoặc 3 – 4 giờ trong những thiết bị lên men liên tục. Thường cho enzyme pectinase trong giai đoạn này với liều lượng 0,03%. Sua thời gian thủy phân trên, người ta tiến hành lọc ép. Dịch lọc được cho thêm 0,03% enzyme pectinase để làm trong dịch quả. Quá trình làm trong dịch quả được thực hiện trong 6 – 8 giờ.Sau đó nước quả được lọc, rót chai và đem đi thanh trùng. Hiệu suất và chất lượng nước quả nho sản xuấ theo phương pháp xử lý pectinase. Sản xuất nước mận Người ta thường sản xuất nước quả pha đường từ mận. Mận là loại quả cho hiệu suất thu nhân nước ép rất thấp. Để thu nhận nước quả từ mận, người ta phải áp dụng phương pháp nhiệt và enzyme. Quá trình công nghệ được thực hiện như sau: Mận được rửa sạch, đun nóng với nước.Nước được cho vào khoảng 15 – 20% so với khối lượng mận.nhiệt độ được giữ ở 85 – 900C trong 5 – 20 phút tùy thuộc vào độ chín của mận. Sau đó cả khối quả qua hệ thống ép và xử lý enzyme pectinase ở 40 – 450C trong 3 – 6 giờ. Dịch quả được thu nhận bằng máy lọc ép lần nữa, đóng chai và đem thanh trùng. Phương pháp xử lý nhiệt và enzyme kết hợp đã cho ta hiệu suất đạt tới 78,9% so với hiệu suất 58,2% khi không xử lý enzyme. TÀI LIỆU THAM KHẢO Ứng Dụng Công Nghệ Sinh Học Trong Công Nghệ Thực Phẩm, giáo trình Trường Công Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM. Lương Đức phẩm, Công nghệ vi sinh vật, 1998, nhà xuất bản Nông Nghiệp. Tailieu.vn