Đề tài Xác định giới tính bằng kỹ thuật multiplex pcr trên ba giống bò

một protein gắn kết DNA. Gen này giúp ngăn ngừa sự thiếu hụt tinh trùng trong quá trình sinh tinh. Tương ứng với zfy, trên NST X cũng có vùng zfx (Xp22.12) có thể liên kết chéo với zfy trên NST Y. Lúc này, người ta nghĩ nó là TDF (trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998). Tuy nhiên, những nghiên cứu tiếp sau đó cho thấy zfy không phải là TDF. Người ta phát hiện protein ZFY có biểu hiện ở tế bào giao tử (đây là những tế bào không cần biệt hoá tinh hoàn) và những trình tự bắt nguồn từ NST Y thiếu zfy được tìm thấy ở những người đàn ông XX (trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998). Koopman và ctv (1991) đã khẳng định zfx / zfy không là yếu tố biệt hoá và xác định giới tính chủ yếu ở động vật hữu nhũ mà chúng chỉ là một trong số các nhóm gen tham gia tích cực vào quá trình này. Ngày nay, người ta thường sử dụng zfy như là một chỉ thị cho NST Y trong việc sàng lọc giới tính (trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). - Gen sry ( sex determining region, Y) Năm 1959, các nhà khoa học đã khám phá NST Y có mang sry ở cả người và chuột. Năm 1966, người ta đã xác định vị trí của sry nằm trên vai ngắn của NST Y. Cuối thập niên 80, người ta đã xác định được sry nằm trên vùng 1 của vai ngắn NST Y (Yp11.3). Năm 1990, Sinclair và ctv đã phân lập gen sry từ khu vực trên (trích dẫn bởi Josso và ctv, 2003). Gen sry đóng vai trò chủ đạo cho việc xác định giới tính ở động vật hữu nhũ và người. Nhân tố này điều khiển sự biệt hoá tuyến sinh dục của phôi thành tinh hoàn chứ không phải buồng trứng. Sau đó, tinh hoàn sản xuất các hormone sinh dục đực chịu trách nhiệm cho sự thể hiện các đặc tính thứ cấp của cá thể đực (trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Hình 2.1: Sự phân bố các gen trên NST X và Y (Nguồn: Josso và ctv, 2003) Cho đến nay, sry được xem như là yếu tố đóng vai trò chủ đạo trong việc xác định giới tính ở động vật hữu nhũ và người. Ở động vật hữu nhũ, sự phát triển tinh hoàn của phôi phụ thuộc vào sự biểu hiện của gen xác định giới tính sry. Xét về mức độ hình thái học, sự hình thành các ống dẫn tinh và sự biệt hoá các tế bào Sertoli cũng như tế bào Leydig là những đặc điểm đặc trưng cho thấy sự biểu hiện gen sry trong tuyến sinh dục bình thường của một cá thể có bộ NST dị hợp XY (Parma và ctv, 1999; trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Xét về mức độ phân tử, sry là một gen thuộc họ HMG box (high mobility group) mã hoá cho họ protein có khả năng gắn kết mạnh với DNA. Chính vì vậy, sry được xem như là công tắc đóng mở di truyền cho các chương trình biệt hoá giới tính liên quan đến một số gen khác (Haqq và Donahoe, 1998). Do đó, sry hoạt động trong những dòng tế bào hỗ trợ cho sự biệt hoá giới tính để hướng sự biệt hoá của chúng thành tế bào Sertoli hơn là thành những tế bào hạt đặc thù của buồng trứng. Ở người khi cắt bỏ một đoạn giữa sry ORF (open reading frame) và trung thể thì thấy có sự giảm sút biểu hiện gen sry (ở mào niệu sinh dục) và dẫn đến sự đảo giới (Mc Elreavey và ctv, 1992; Capel và ctv, 1993; Ma và ctv, 1993; Laval và ctv, 1995; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998). Ngoài những chứng cứ trên, người ta còn xét thấy rất nhiều đặc điểm về mô học, sinh hoá và sinh học phân tử chứng minh sry là một TDF chủ yếu (Haqq và Donahoe, 1998; Delbridge và Marshall Graves, 1999; Josso và ctv, 2003). Ngoài ra, trên NST Y còn có chứa một số gen như amh (anti-mullerian hormone), wt1 (Wilm’s Tumor supressor gene), azf (Azoospermia factor),…là những gen có vai trò hỗ trợ cho quá trình biệt hoá giới tính đực của cá thể. Ngày nay, các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu các gen đó để làm rõ hơn cơ chế xác định giới tính. 2.2.2.2 Các gen trên NST X - Nhóm gen sox (SRY - liked HMG box) Đây là nhóm gen hiện diện trên NST X. Chúng có hơn 20 thành viên, ký hiệu là sox1,…, sox20. Trong đó gen sox3 và sox9 có tương tác mật thiết với gen sry trong cơ chế xác định giới tính ở động vật hữu nhũ. Ở người, sự đột biến sox9 dẫn đến chứng rối loạn tạo cơ quan sinh dục sơ khai. Theo đó, protein SOX9 được biểu hiện ở thời điểm mà mào niệu sinh dục đang phát triển để phối hợp cùng với protein SRY trong việc xác định giới tính. Những tế bào Sertoli biểu hiện protein SRY thì biểu hiện mạnh protein SOX9 (Campel và ctv, 1995; Tommerup và ctv, 1993; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998). Ở người nữ, sox3 ức chế sox9. Do đó, sự biệt hoá giới tính đực không xảy ra. Khả năng này có được do bởi các gen sox cũng có bản chất là HMG box nên có thể gắn kết DNA. Ở người nam, gen sox3 lại bị ức chế bởi protein SRY nên gen sox9 hoạt động bình thường và giúp biệt hoá giới tính đực. Chính vì vậy, sry được xem như là một tác nhân xác định giới tính gián tiếp. Tuy nhiên, bên cạnh đó cũng có giả thuyết cho rằng sry xác định giới tính trực tiếp. Do vậy, việc này vẫn còn nằm trong sự bàn cãi (Foster và Graves, 1994; trích dẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999). - Gen dax - 1 (Dosage - sensitive sex reversal - adrenal hypoplasia congeneital critical region X chromosome 1: vùng nằm trên NST X gây ra sự giảm bẩm sinh số tế bào tuyến thượng thận nên làm biến đổi giới tính) Gen dax - 1, một thành viên của nhóm yếu tố phiên mã hormone steroid liên quan đến yếu tố sinh steroid 1, chịu trách nhiệm về bệnh AHC (adrenal hypoplasia congenita). Người ta xác định dax - 1 nằm ở khu vực Xp21.3 - 22.11 mà sự nhân đôi của nó sẽ dẫn đến hiện tượng đảo giới từ nam thành nữ. Khu vực đó được gọi là DSS (dosage - sensitive sex reversal) (Muscatelli và ctv, 1994; Zanaria và ctv, 1994; trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998). Gen dax - 1 cũng tương tác với sry trong giai đoạn đầu của sự xác định giới tính ở động vật hữu nhũ. Tuy nhiên, ở nam, gen sry ức chế dax - 1 làm sự biệt hoá giới tính đực xảy ra. Khi nào biểu hiện của dax - 1 vượt qua sry thì sự đảo giới xảy ra. Còn ở nữ, dax - 1 hoạt động như là một yếu tố kháng tinh hoàn (Jimenez và Burgos, 1998; trích dẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999). 2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH Cho đến nay, đã có rất nhiều phương pháp xác định giới tính động vật. Mỗi phương pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng. Tùy vào mục đích mà ta tận dụng ưu điểm của phương pháp đó để đạt được thành công cao nhất. Sau đây là một số phương pháp xác định giới tính phôi (trích dẫn bởi Van Vliet và ctv, 1989). 2.3.1 Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST Cơ sở của phương pháp này là sự biểu hiện hoạt động của các gen trên NST X trong việc mã hoá các enzyme, làm cho nồng độ enzyme con cái (XX) cao hơn nồng độ enzyme con đực (XY). Tuy rằng để cân bằng hoạt động các gen, NST X có những sự ức chế để chỉ còn một NST X biểu hiện gen ở con cái, nhưng sự ức chế chỉ thể hiện ở một giai đoạn nhất định nào đó. Trước khi đến giai đoạn đó, nồng độ enzyme của 2 loại phôi sẽ khác nhau. Dựa trên cơ sở này, Williams và ctv (1986), Monk và ctv (1988) đã phân biệt những phôi trước khi chuyển cấy từ những con chuột siêu bài noãn. Ở phương pháp của Williams và ctv, phôi dâu (morula) đến phôi nang (blastocyst) được kiểm tra hoạt tính của enzyme liên kết NST X (glucose 6 phosphate dehydrogenase - G6PD) một cách trực tiếp. Còn với phương pháp của Monk và ctv, các tế bào đơn của phôi được phân tách từ phôi 8 tế bào và được kiểm tra hoạt tính enzyme hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) liên kết NST X. Cả hai phương pháp đều kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST sinh dưỡng như mẫu đối chứng để hạn chế sự thay đổi do biến dưỡng phôi. Kết quả được đọc dựa theo màu đậm nhạt (đậm là con đực, nhạt là con cái). Phương pháp này có một số hạn chế. Phương pháp của Williams và ctv có tính độc đối với phôi vì nhuộm màu trực tiếp lên phôi. Phương pháp của Monk và ctv cải thiện được khuyết điểm trên nhưng lại dùng hạn chế đối với phôi dâu nén hoặc phôi nang (không tách được tế bào phôi đơn). Hạn chế khác là giai đoạn bất hoạt một NST X để tạo sự cân bằng trong biểu hiện gen chưa được biết chính xác nên có thể dẫn đến chẩn đoán sai lầm. Cuối cùng, đôi khi mRNA được tạo ra và tích trữ ở đó mà chưa biểu hiện protein. Đến khi mRNA biểu hiện thành protein thì mới được đánh giá. Do vậy, hoạt tính enzyme lúc này là sự tích trữ hoạt động của bộ gen từ trước mà không phải là hoạt động của chính nó lúc đó. Vì vậy, kết quả có thể sai lệch. Tuy nhiên, phương pháp này giúp xác định một trong những chỉ tiêu đánh giá sự sống sót của phôi khi nghiên cứu ở các phương pháp khác. 2.3.2 Phản ứng miễn dịch đối với kháng nguyên chuyên biệt giới tính Năm 1971, Golberg và ctv đã báo cáo một phương pháp huyết thanh học đối với kháng nguyên H - Y (histocompatibility Y antigen – kháng nguyên Y tương thích mô). Kháng thể của kháng nguyên này được phân lập từ huyết thanh của những con cái được ghép mảnh da con đực và các con này có thể loại thải mảnh da đó. Phương pháp dựa trên kháng nguyên H – Y được tiến hành qua 2 cách: phương pháp gây độc tế bào và phương pháp miễn dịch huỳnh quang. Ở phương pháp gây độc tế bào, nếu thấy những tế bào của phôi bị dung giải khi cho vào kháng huyết thanh H - Y và bổ thể (chỉ ở một mức độ nào đó) thì đó là phôi đực. Phương pháp này dễ gây hư hại phôi đực. Với phương pháp miễn dịch huỳnh quang, phôi sẽ phản ứng với kháng thể H - Y sơ cấp trong 30 phút. Sau đó lại tiếp tục phản ứng với một kháng thể thứ cấp có gắn đuôi FITC (fluorescein isothiocyanate). Đánh giá giới tính phôi dưới kính hiển vi huỳnh quang dựa trên sự hiện diện của đuôi FITC. Khuyết điểm của phương pháp này là kháng thể thứ cấp đôi khi gắn không chuyên biệt (gắn với mảnh vỡ tế bào quanh noãn hoàng chẳng hạn). Bất lợi chính yếu của phương pháp miễn dịch là độ chính xác quá thấp vì nhiều lí do. Thứ nhất, kháng nguyên H - Y là một kháng nguyên tương đối yếu cho nên kháng thể sinh ra không thể chuyên biệt một cách đầy đủ. Kết quả gây ra phản ứng chéo giữa kháng thể với những kháng nguyên bề mặt tế bào khác. Thứ hai, sự biểu hiện kháng nguyên H - Y có thể không bị giới hạn độc nhất trên phôi đực. Thứ ba, tính chủ quan của người làm thí nghiệm trong việc phán đoán mức độ huỳnh quang của đuôi kháng thể. Ngày nay, người ta cải tiến dần phương pháp này để tăng tính ứng dụng của nó vì ưu điểm lớn nhất của nó là có thể chuyển thành dạng kit để kiểm tra nhanh trước thời điểm chuyển phôi. 2.3.3 Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính Phương pháp phân tích di truyền tế bào còn được gọi là karyotyping (in nhân) được tiến hành bằng cách tạo sinh thiết phôi để lấy một số ít tế bào, nuôi chúng trong môi trường có colcemid giúp các tế bào tiến tới nguyên phân. Sau đó, làm phồng tế bào để phân tán NST. Các NST sẽ được cố định và nhuộm bằng phẩm nhuộm vĩnh cửu rồi đem quan sát dưới kính hiển vi. NST Y được tìm thấy nhờ kích thước nhỏ bé của nó và là dị NST (King, 1984; Daiger và ctv, 1985; Picard và ctv, 1985). Phương pháp này gặp phải hai khó khăn. Một, phải có kỹ thuật cao và làm sao tạo được nhiều tế bào ở metaphase để NST dàn trãi rõ ràng. Hai, đòi hỏi quá nhiều thời gian phân tích. Để giải quyết những khó khăn này, người ta có nhiều cách nhưng tất cả các cách hoặc chỉ giảm áp lực thời gian hoặc chỉ tăng số tế bào ở metaphase nhưng lại vướng phải khó khăn còn lại. Dù có rất nhiều cản trở cho khả năng áp dụng thương mại đối với phương pháp này, nhưng do độ chính xác cao của nó nên phương pháp phân tích di truyền tế bào thường được sử dụng để khẳng định kết quả của những kỹ thuật phân biệt giới tính khác. 2.3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật này là việc lai DNA tổng số lấy từ những tế bào sinh thiết phôi cần xác định giới tính với trình tự DNA chuyên biệt cho NST Y đã đánh dấu. Kết quả lai dương tính xác định sự hiện diện của NST Y. Vì thế, phôi là phôi đực. Phương pháp này nhanh về thời gian và có thể tiến hành với một số ít tế bào cho nên không tồn tại các khó khăn như phương pháp di truyền tế bào. Đoạn dò có thể được sử dụng từ các loại bán trên thị trường hoặc chuẩn bị theo các bước sau: phân lập NST Y, phân lập trình tự chuyên biệt Y, xác định số bản sao trình tự và định vị trình tự đoạn dò trên NST Y. Khó khăn cần phải cải tiến của phương pháp này là các đoạn dò chuyên biệt Y thường là một phần chứ không toàn phần. Nghĩa là có thể lai với một số NST khác. Chính vì vậy, làm giảm độ chính xác của phương pháp này. Những sự khám phá về các gen xác định giới tính trên NST Y sẽ giúp ngày càng hiểu rõ hơn về NST này và sẽ tạo ra được đoạn dò chuyên biệt hoàn toàn để cải thiện độ chính xác của kỹ thuật này. Qua việc tìm hiểu một số phương pháp xác định giới tính, ta thấy đa số các phương pháp không mắc khuyết điểm này thì sẽ gặp phải khó khăn khác và ít có phương pháp nào phù hợp với đòi hỏi của thương mại ngày nay. Do vậy, công cuộc tìm kiếm phương pháp xác định giới tính phù hợp vẫn còn tiếp tục. 2.3.5 Phân biệt giới tính bằng kỹ thuật polymerase chain reaction (PCR) Vào năm 1985, Karl Mullis và ctv đã phát minh ra phương pháp tổng hợp DNA trong ống nghiệm. Phát minh này nhanh chóng được ứng dụng rộng rãi và đã ảnh hưởng mạnh mẽ đến sự chẩn đoán giới tính ở động vật. 2.3.5.1 Cơ sở phản ứng PCR dùng để phân biệt giới tính Phương pháp PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase) thực chất là một phương pháp tạo dòng trong ống nghiệm. Nghĩa là nhằm mục đích thu nhận một lượng lớn bản sao của một trình tự xác định. Cơ sở của phương pháp PCR chính là đặc tính hoạt động của các DNA polymerase. Các polymerase này chỉ có khả năng tổng hợp một mạch mới từ khuôn kể từ một đoạn mồi (là một trình tự DNA ngắn) đã bắt cặp sẵn với khuôn. Trong thực nghiệm, đoạn mồi là những trình tự bổ sung chuyên biệt cho đoạn DNA cần tổng hợp. Phương pháp PCR gồm 3 bước: (1) biến tính phân tử DNA; (2) bắt cặp đoạn mồi với mạch khuôn; (3) tổng hợp mạch mới. Ba bước này hợp thành một chu kỳ và chu kỳ này được lặp lại nhiều lần. Chính vì vậy, đoạn DNA mục tiêu được nhân lên rất nhiều lần và có thể được quan sát thông qua những kỹ thuật phân tách và điện di DNA (Hồ Huỳnh Thuỳ Dương , 2002). Theo Schorder và ctv (1990), việc sử dụng đoạn mồi chuyên biệt NST Y trong phản ứng PCR giúp khuếch đại đoạn trình tự DNA chuyên biệt đực. Sự hiện diện hoặc vắng mặt của sản phẩm PCR cho phép xác định giới tính của phôi. Thông thường, kèm với sự khuếch đại trình tự chuyên biệt NST Y, người ta nhân bản đồng thời một trình tự trên NST sinh dưỡng (Chen và ctv, 2004) hoặc một trình tự trên NST X (Alves và ctv, 2003) để làm yếu tố kiểm soát sự hiện diện của vật liệu và các điều kiện phù hợp cho phản ứng nhân bản. Theo Bondioli và ctv (1989), yêu cầu của một trình tự DNA đặc hiệu cho việc xác định giới tính của các phôi cần phải có: - Trình tự DNA phải lặp lại, mục đích là làm tăng tối đa lượng nguyên liệu dùng cho phản ứng nhân bản. - Trình tự lặp lại phải là trình tự đặc hiệu cho con đực. 2.3.5.2 Một số công trình xác định giới tính bằng PCR Sau hơn một thập niên phát triển, kỹ thuật xác định giới tính bằng PCR đã ngày càng chứng tỏ ưu thế nhanh, nhạy và phù hợp với thương mại. Những đặc điểm ấy được thể hiện qua nhiều công trình được cải tiến của nhiều tác giả khác nhau. Vào 1990, Schorder và ctv công bố công trình xác định giới tính phôi bò giai đoạn 6 - 7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR. Đầu tiên, tác giả thiết lập phản ứng bằng cách sử dụng các tế bào bạch cầu. Sau đó, qui trình được áp dụng trên các mẫu sinh thiết có từ 1 - 3 tế bào thu nhận từ phôi. Kết quả xác định giới tính bằng PCR được so sánh với phương pháp nhuộm NST và phương pháp lai tại chỗ. Kết quả cho thấy phương pháp PCR cho hiệu quả phân tích cao hơn so với 2 phương pháp còn lại. Vào 1994, Bredbacka và ctv nghiên cứu qui trình xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR. Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai đoạn phôi dâu và lấy đi 2 - 8 tế bào từ phôi để thực hiện việc xác định giới tính. Trong nghiên cứu, các tác giả chỉ sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho giới tính đực mà không sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung của 2 giới để kiểm tra hiệu quả nhân bản của phản ứng. Các tác giả cho rằng việc sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung này là không cần thiết nếu như đã thực hiện việc kiểm tra sự hiện diện của mẫu sinh thiết trước khi thực hiện phản ứng PCR. Tuy nhiên, một số phản ứng cho kết quả không rõ ràng. Với mục tiêu chính là phát triển một phương pháp xác định giới tính nhanh cho một vài loài thú hữu nhũ, Pomp và ctv (1995) đã xác định chính xác 209 phôi heo con được thu thập từ 21 con nái tơ sau 10 - 11 ngày giao phối bằng kỹ thuật PCR. Toàn bộ qui trình từ lúc nhập phôi đến lúc cho kết quả chỉ mất 6 giờ, cải thiện hơn rất nhiều so với các phương pháp khác. Gen được khuếch đại là sry và cặp gen được dùng làm đối chứng cho phản ứng là zfy / zfx. Sau đó, ông đã áp dụng phương pháp xác định giới tính này trên các loài hữu nhũ khác như: ngựa, mèo, chó, bò, dê,… và người nhưng kết quả không được chính xác và không đáng tin cậy như trên heo. Vào 1999, Kitiyanant và ctv đã phân biệt giới tính từ một tế bào được tách từ phôi giai đoạn 2 tế bào bằng 2 phương pháp: karyotyping và PCR. Kết quả cho thấy PCR có tỷ lệ thành công cao hơn so với karyotyping rất nhiều (100% so với 56%) và thời gian tiến hành thì ngắn hơn một nửa (3 giờ so với 8 giờ). Cũng vào năm này, Chen và ctv đã khẳng định độ nhạy và độ chính xác của phản ứng PCR xác định giới tính khi dùng 10 pg DNA, 100% thành công trên tế bào phôi của các giống Holstein, Jussay và Swiss. Những kết quả này đã chứng minh được ưu thế của phương pháp dùng PCR để phân biệt giới tính trong ứng dụng thương mại. Bắt kịp với nhịp phát triển thương mại trong chẩn đoán giới tính phôi trước khi chuyển cấy, hãng Takara Bio (Nhật Bản) đã cho ra đời bộ kit chẩn đoán giới tính bò mang tên Cycleave PCRTM Bovine sexing kit (Takara bio Inc, 2005). Nguyên tắc hoạt động của bộ kit này là dựa trên sự khuếch đại đoạn gen Amelogenin theo kiểu real - time PCR. Phương pháp này rất nhạy và nhanh, chỉ tốn 40 phút là hoàn thành quá trình chẩn đoán. Để khẳng định khả năng áp dụng một qui trình PCR chẩn đoán giới tính trên nhiều giống bò khác nhau, năm 2003, Alves và ctv đã tiến hành phân biệt giới tính trên 2 nhóm giống bò Bos indicus và Bos taurus. Kết quả là qui trình này đã thành công 100% khi áp dụng trên cả 2 nhóm giống. Ở Việt Nam, một số công trình xác định giới tính bằng kỹ thuật PCR đã và đang được tiến hành. Đại diện là những công trình sau. Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Lan đã xác định giới tính heo nhà (Sus scrofa domestica) bằng cách khuếch đại đoạn DNA dài 166 bp đặc hiệu cho giới tính đực và đoạn 447 bp đặc hiệu cho cả hai giới tính. DNA mẫu được ly trích từ gan, bạch cầu, trứng, tinh dịch. Kết quả cho thấy qui trình đã phân biệt được một số mẫu nhưng có một vài mẫu heo cái lại có kết quả giống như heo đực. Năm 2003, Huỳnh Thị Lệ Duyên ứng dụng qui trình xác định giới tính bằng PCR của Nguyễn Thị Thu Lan (2002) để xác định giới tính phôi. Kết quả là đã xác định giới tính của một phôi heo, nhưng một phôi khác thì không cho tín hiệu. Ngoài ra, trung tâm Công Nghệ Sinh Học Phôi Việt Nam cũng đang thực hiện nhiều công trình xác định giới tính phôi bằng kỹ thuật PCR trên bò, dê, cừu, sao la,… Các dẫn liệu ở Việt Nam cho thấy chưa có nghiên cứu về phân biệt giới tính ở các giống khác nhau trên bò. PHẦN III. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU (1) Ly trích DNA từ mẫu cơ và lông, trong đó so sánh một số yếu tố có thể ảnh hưởng đến chất lượng và số lượng DNA. - So sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA ly trích từ mẫu cơ và lông (gồm gốc lông và ngọn lông). - So sánh lượng DNA ly trích từ hai vị trí của lông: ngọn lông và gốc lông. (2) Thử nghiệm chu trình nhiệt và nguồn cung cấp Taq polymerase. - So sánh hai chu trình nhiệt. - Thử nghiệm ba nguồn cung cấp Taq polymerase. (3) Xác định giới tính ba giống bò dựa trên qui trình PCR tìm được. (4) So sánh hai mức độ làm khô DNA từ mẫu cơ trong quá trình thu hồi DNA lên phản ứng PCR. (5) So sánh hiệu quả PCR khi tiến hành trên DNA từ cơ và từ lông của cả ba giống. 3.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH Đề tài được tiến hành từ ngày 14-02-2005 đến ngày 06-07-2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. 3.3 VẬT LIỆU 3.3.1 Nguồn mẫu chiết xuất DNA Mẫu cơ vân và lông đuôi các giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan được lấy từ lò mổ tập trung của huyện Dĩ An - Bình Dương. 3.3.2 Đoạn mồi Theo Alves và ctv (2003), trên cánh dài của NST Y ở bò có trình tự chuyên biệt cho giống đực dài 3216 bp. Trình tự này chứa đoạn lặp lại với sự tương đồng rộng rãi giữa các giống bò. Từ trình tự lặp lại đó, thiết kế ra đoạn mồi RIV và đoạn mồi UIV nhằm khuếch đại đoạn DNA dài 655 bp qua PCR. Ngoài ra, để kiểm chứng kết quả chính xác hay không, dựa vào trình tự chuyên biệt cho gen thụ thể androgen liên kết NST X. Từ trình tự chuyên biệt này, người ta thiết kế hai đoạn mồi BTANRP1 (BTA1) và BTANRP2 (BTA2) nhằm khuếch đại đoạn DNA dài 370 bp. Band 370 bp phải hiện diện trên gel sau khi điện di như là sản phẩm đặc trưng chung cho cả bò đực lẫn bò cái. Hai cặp mồi này được cung cấp bởi hãng IDT (Intergrated DNA Technologies). Bảng 3.1 Trình tự các đoạn mồi (Alves và ctv, 2003) Đoạn mồi Trình tự DNA mục tiêu nằm trên RIV 5’ GTT TTA TTA TCC CAG CAA G 3’ NST Y UIV 5’ TAT TCC TTT GGG GAG CA 3’ NST Y BTA1 5’ CCA ACT TTC CCT TCT TTC CC 3’ NST X BTA2 5’ ATG GCC CAA AAG AAC ATT CA 3’ NST X 3.4 PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 3.4.1 Lấy và bảo quản mẫu - Mẫu cơ: cắt một lượng nhỏ (5g) cơ vân bò vừa được giết mổ; chứa mẫu trong túi ni lông 5*10 cm; trữ mẫu trong thùng đá, mang về phòng thí nghiệm; trữ ở -70oC. - Mẫu lông: lông đuôi bò được thu nhặt có cả phần gốc lẫn phần ngọn; rửa sạch dưới vòi nước máy; cắt thành 2 phần: phần gốc và phần ngọn lông; mỗi phần được trữ trong túi ni lông 10*20 cm ở -70oC. 3.4.2 Ly trích DNA 3.4.2.1 Ly trích DNA từ cơ * Qui trình ly trích Sau khi rã đông mẫu cơ ở nhiệt độ phòng, ly trích DNA theo dẫn liệu của Lê Thị Thu Phương (2004). - Phá vỡ tế bào Lấy khoảng 0,1 g cơ vân cho vào eppendorf 1,5 ml; dùng chày nghiền nhuyễn mẫu. Cho vào 60 μl dung dịch đệm ly trích và 3 μl proteinase K, ủ hỗn hợp ở 55oC trong 1 giờ. - Tinh sạch DNA Thêm 375 μl sodium acetate 0,2 M vào hỗn hợp trên; vortex trong 10 giây. Cho vào 200 μl hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1); vortex nhẹ; ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC. - Thu hồi DNA Lấy phần dịch nổi và chuyển vào tube 1,5 ml khác; cho thêm 1 ml ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều; ủ ở -20oC trong 2 giờ. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn, làm ráo. Cho vào 180 μl TE 1X, vortex ; ủ ở 55oC trong 15 phút. Thêm 20 μl sodium acetate 2 M, trộn đều; tiếp tục cho vào 500 μl ethanol tuyệt đối lạnh, trộn đều; ủ ở -20oC trong 15 phút. Ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, bỏ phần nổi, lấy cặn. Rửa cặn bằng 1 ml ethanol 70 %; ly tâm 12000 vòng / phút trong 2 phút ở 10oC, lấy cặn. Làm khô cặn trong tủ ấm ở 55oC. Hoà tan cặn bằng 200 μl TE 1X, ủ 55oC qua đêm; vortex cho tan cặn. Sản phẩm DNA sau khi ly trích được trữ ở -20oC hoặc sử dụng ngay. DNA được kiểm tra độ tinh sạch bằng cách đo mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm và 280 nm bằng quang phổ kế (model HP 8453). Hàm lượng DNA được ước lượng theo công thức DNA (ng / μl) = 62,9*OD260nm – 36*OD280nm. Mẫu được pha loãng 100 lần theo tỷ lệ 10 μl DNA gốc: 990 μl H2O cất khi đo OD. Các mẫu DNA ly trích từ cơ có tỷ số OD260 nm / OD280 nm (tỷ số OD) trên 1,6 được sử dụng để tìm qui trình PCR phù hợp cho xác định giới tính. * Thí nghiệm ảnh hưởng của mức độ phơi khô cặn Trong quá trình thử nghiệm qui trình PCR để xác định giới tính, chúng tôi nhận thấy nếu làm quá khô DNA sau khi tủa trong cồn tuyệt đối thì PCR sẽ không cho hiệu quả cao (không xác định được chính xác giới tính đực cái). Chính vì vậy, chúng tôi đã bố trí thí nghiệm thu hồi DNA mẫu cơ với mức độ làm khô DNA là yếu tố thí nghiệm. Thí nghiệm được tiến hành trên 11 mẫu cơ (3 mẫu ta Vàng, 6 mẫu lai Sind, 2 mẫu sữa Hà Lan). Thí nghiệm gồm các bước: (1) ly trích DNA từ 0,2 g cơ vân với lượng dung dịch đệm ly trích và proteinase K gấp đôi; (2) tinh sạch DNA với lượng hóa chất gấp đôi lượng đã dùng theo dẫn liệu của Lê Thị Thu phương (2004); (3) chia dịch nổi thành 2 phần đều nhau trước khi tủa DNA trong cồn tuyệt đối lạnh; (4) phơi khô 11 mẫu theo mức độ I và 11 mẫu theo mức độ II. Hiệu quả của hai mức độ phơi khô DNA này sẽ được kiểm tra thông qua ba chỉ tiêu. Đó là tỷ số OD, hàm lượng DNA thu hồi và kết quả phân biệt giới tính bằng phản ứng PCR (theo qui trình PCR tối ưu đã được xác định). Bảng 3.2 Mức độ phơi khô cặn DNA Mức độ Biểu hiện cặn DNA Thời gian và nhiệt độ phơi(*) I Cặn chuyển từ trắng đục sang trong và hơi bầy nhầy 10 – 15 phút ở 55oC II Vết cặn bị mờ đi, không quan sát rõ vị trí cặn trên thành eppendorf Hơn 20 phút ở 55oC (*) Thời gian chỉ có tính chất tham khảo, căn cứ chính yếu là biểu hiện cặn. 3.4.2.2 Ly trích DNA từ lông * Phương pháp ly trích Trước khi ly trích, mẫu lông (ngọn lông và gốc lông) được xử lý. Cân 0,15 g lông cho vào cối sành vô trùng. Đổ N2 lỏng vào cối; dùng chày sành vô trùng nghiền lông thành dạng bột. Chuyển nhanh chóng bột lông từ cối vào eppendorf 1,5 ml. Đặt eppendorf chứa bột lông trong N2 lỏng hoặc trữ ở tủ -70oC ngay sau đó. DNA từ lông sẽ được ly trích theo qui trình của Sauer và ctv (2000). Mỗi eppendorf chứa bột lông được cho thêm 20 µl dung dịch đệm. Thêm 1 µl proteinase K (20 mg / ml) vào hỗn hợp trên rồi ủ hỗn hợp ở 55oC trong 30 phút. Bất hoạt proteinase K bằng cách ủ hỗn hợp ở 100oC trong 5 phút. Sau khi đã trích được DNA từ lông, tiến hành tinh sạch và thu hồi DNA theo qui trình như trên mẫu cơ. DNA từ mẫu lông cũng được kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang với độ pha loãng là 10. * Thí nghiệm so sánh DNA ly trích từ cơ và lông Để so sánh độ tinh sạch và hàm lượng DNA ly trích được từ cơ và lông, thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố được tiến hành trên 10 mẫu DNA lông (gồm cả gốc lông và ngọn lông) và 54 mẫu DNA cơ. Chỉ tiêu quan sát là tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi. * Thí nghiệm so sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố trên hai đối tượng gốc lông và ngọn lông của cả ba giống. Số mẫu được kiểm tra là 5 mẫu cho mỗi loại. Chỉ tiêu theo dõi là tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi. 3.4.3 Multiplex PCR xác định giới tính 3.4.3.1 Xây dựng qui trình PCR xác định giới tính bò Để tìm được qui trình PCR xác định giới tính phù hợp, chúng tôi thử nghiệm hai chu trình nhiệt và so sánh Taq polymerase (Taq) từ ba nguồn cung cấp khác nhau. Bảng 3.3 Thành phần hoá chất PCR Tên hoá chất Nồng độ cuối PCR buffer 1X MgCl2 1,5 mM RIV / UIV 0,5 µM BTA1 / BTA2 0,4 µM dNTP 200 µM / mỗi loại Taq tuỳ theo nồng độ bố trí DNA 5 ng / µl H2O cất vừa đủ 30 µl * Thí nghiệm so sánh hai chu trình nhiệt So sánh hai chu trình nhiệt để đánh giá hiệu quả tạo sản phẩm PCR chuyên biệt. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. Hai chu trình nhiệt khác nhau chủ yếu ở thời gian của giai đoạn 2. Bảng 3.4 Sự khác nhau chủ yếu giữa hai chu trình nhiệt Giai đoạn Diễn giải Chu trình I (Alves và ctv, 2003) Chu trình II (điều chỉnh) 1 { Biến tính { 94oC trong 5 phút 94oC trong 5 phút 2 Chạy 35 chu kỳ 94oC trong 45 giây 55oC trong 45 giây 72oC trong 45 giây 94oC trong 1 phút 55oC trong 1 phút 72oC trong 1 phút 3 Kéo dài cuối cùng 72oC trong 7 phút 72oC trong 7 phút DNA được sử dụng trong thí nghiệm này là DNA cơ của giống ta Vàng. Taq dùng trong PCR được sản xuất bởi hãng ABgene với nồng độ 1,5 UI trong 30µl phản ứng. Chỉ tiêu để đánh giá chu trình là hiệu quả PCR xác định giới tính. * Thí nghiệm so sánh ba loại Taq polymerase Dựa trên cơ sở chu trình nhiệt tìm ra được, bố trí thí nghiệm để so sánh hiệu quả của Taq ở nồng độ 1,5 UI do ba hãng Promega, Bio-rad, và ABgene sản xuất. Sự khác nhau chủ yếu của ba loại Taq này là ở thành phần PCR buffer. Bảng 3.5 Thành phần chủ yếu của ba loại PCR buffer Hãng sản xuất Tên sản phẩm Thành phần PCR buffer 10X Promega Taq DNA polymerase in storage buffer B Tris – HCl 100 mM; KCl 500 mM và Triton® X-100 0,1% Bio-rad iTaqTMDNA Polymerase Tris – HCl 200 mM; KCl 500 mM ABgene Taq DNA Polymerase Tris – HCl 750 mM; (NH4)2SO4 200mM; Tween®20 0,1% Đây là thí nghiệm một yếu tố được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với đối tượng được dùng là DNA cơ của giống ta Vàng. Chỉ tiêu được theo dõi là hiệu quả PCR trong phân biệt giới tính đực cái. 3.4.3.2 Áp dụng qui trình PCR để xác định giới tính bò Sau khi có được qui trình PCR phù hợp (gồm chu trình nhiệt và thành phần hoá chất), chúng tôi tiến hành xác định giới tính ba giống bò khác nhau để xác định hiệu quả của qui trình đồng thời kiểm tra một số yếu tố ảnh hưởng có liên quan. Chỉ tiêu được theo dõi trong các thí nghiệm này là hiệu quả PCR xác định giới tính. * Thí nghiệm áp dụng qui trình PCR trên DNA từ cơ của ba giống bò Kiểm tra hiệu quả xác định giới tính của qui trình này với DNA cơ của ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan. Thí nghiệm được bố trí kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. * Thí nghiệm áp dụng qui trình PCR với DNA từ lông Dựa vào qui trình PCR trên nguồn DNA từ cơ, tiến hành xác định giới tính trên nguồn DNA từ lông. Kết quả này được so sánh với kết quả PCR khi sử dụng nguồn DNA từ cơ. Thí nghiệm bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên một yếu tố. 3.4.4 Điện di và quan sát sản phẩm PCR Sản phẩm PCR từ các thí nghiệm được điện di trên gel agarose 1,5% và quan sát dưới tia UV sau khi nhuộm ethidium bromide. 3.3.4.1 Chuẩn bị gel agarose 1,5% - Cân 0,225 g agarose hoà tan trong 15 ml TBE 0,5X, lắc nhẹ cho agarose phân tán đều. - Đun agarose trong lò vi ba ở 650 w, 2 phút. - Để gel nguội đến khoảng 50oC; đổ vào khuôn có gắn lược. - Chờ gel đông, rút lược ra. 3.3.4.2 Điện di sản phẩm PCR - Dùng 7,5µl sản phẩm PCR trộn với 1,5µl loading dye 6X. - Điện di gel 30 phút trong TBE 0,5X với dòng điện 100 V, 250 mA. - Vớt gel ra khỏi buồng điện di; cho vào thùng nhuộm ethidium bromide 0,1% trong 30 phút. - Đặt gel lên bàn chụp UV, quan sát kết quả. 3.5 XỬ LÝ SỐ LIỆU Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học với trắc nghiệm chi - square hoặc trắc nghiệm F trên phần mềm Statgraphics 7.0. PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 LY TRÍCH DNA 4.1.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo hai mức độ làm khô DNA cơ bò được làm khô theo hai mức độ I và II, kết quả đo OD được trình bày ở bảng 4.1. Bảng 4.1 Tỷ số OD và hàm lượng DNA thu hồi theo hai mức độ làm khô Chỉ tiêu Mức độ I (± SD) Mức độ II (± SD) Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,86 ± 0,01 1,93 ± 0,04 P = 0,15 Hàm lượng DNA (µg / µl) 0,43 ± 0,06 0,37 ± 0,04 P = 0,50 Số mẫu 11 11 Biểu đồ 4.1 So sánh DNA ly trích từ cơ thu hồi theo mức độ I và II Kết quả ở bảng 4.1 cho thấy độ tinh sạch và hàm lượng của DNA dựa vào hai cách làm khô trên khác nhau không ý nghĩa (p > 0,05). Theo Sambrook và Russell (2001), khi DNA được làm quá khô thì khả năng hoà tan của nó vào dung môi sẽ giảm đi. Ở đây, chúng tôi thay đổi thời gian làm khô (chênh lệch thời gian khoảng 10 phút). Khi ủ DNA cùng với dung môi qua đêm thì thời gian này đủ lâu để cho DNA có thể tan với khả năng tối đa của nó. Do đó, sự khác biệt về lượng DNA không rõ rệt. Chỉ tiêu hiệu quả PCR trong thí nghiệm này được khảo sát sau khi đã xây dựng được qui trình PCR phù hợp. 4.1.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông DNA ly trích từ 54 mẫu cơ được so sánh với DNA từ 10 mẫu lông về độ tinh sạch và hàm lượng DNA sau khi đo OD. Bảng 4.2 Tỷ số OD và hàm lượng DNA ly trích từ cơ và lông Chỉ tiêu DNA cơ DNA lông Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,76 ± 0,03 1,49 ± 0,1 P = 0,001 Hàm lượng DNA (µg /µl) 0,37 ± 0,03 0,03 ± 0,01 P = 0,00 Tổng số mẫu 54 10 Biểu đồ 4.2 So sánh DNA ly trích từ cơ và lông Qua kết quả ở bảng 4.2, DNA ly trích từ cơ khá tinh sạch và có hàm lượng cao hơn so với DNA ly trích từ lông một cách rất có ý nghĩa (p < 0,01). Cơ vân chứa các tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích được rất nhiều. Hơn nữa, protein của cơ dễ bị phân hủy hơn keratin ở lông nên DNA ly trích có độ tinh sạch cao hơn DNA từ lông. Tuy nhiên, muốn có được lượng DNA tinh sạch này, thường phải giết chết con vật hoặc lấy mẫu sinh thiết. Chính cản trở này đã làm cho việc ly trích DNA từ những con vật quí hiếm thêm khó khăn. Từ đó, việc tìm ra qui trình ly trích DNA từ lông là điều rất cần thiết. 4.1.3 Kết quả ly trích DNA từ gốc lông và ngọn lông Sau khi đo OD của 10 mẫu DNA lông (5 mẫu gốc lông, 5 mẫu ngọn lông), chúng tôi tính toán các giá trị thống kê (xem bảng 4.3). Bảng 4.3 Tỷ số OD và hàm lượng DNA ly trích từ gốc lông và ngọn lông Chỉ tiêu Gốc lông Ngọn lông Sai biệt thống kê Tỷ số OD 1,77 ± 0,07 1,22 ± 0,03 P = 0,001 Hàm lượng DNA (µg / µl) 0,03 ± 0,01 0,02 ± 0,01 P = 0,34 Tổng số mẫu 5 5 Biểu đồ 4.3 So sánh DNA ly trích từ ngọn lông và gốc lông Như vậy, DNA ly trích từ gốc lông có tỷ số OD trung bình 1,76, tinh sạch hơn so với DNA ly trích từ ngọn lông một cách có ý nghĩa (p < 0,01). Xét về cấu trúc của lông, mức độ keratin hoá ở gốc lông ít hơn ở ngọn lông cho nên việc tách keratin ra khỏi dung dịch DNA ly trích từ ngọn lông sẽ khó khăn hơn so với gốc lông. Kết quả cho thấy 0,15 g ngọn lông có thể cho khoảng 4,34 µg DNA (200 µl dung dịch DNA với nồng độ 0,02 µg / µl). Trong khi đó, cùng với khối lượng trên, gốc lông có thể cho 6,5 µg DNA (200 µl dung dịch DNA với nồng độ 0,03 µg / µl). Tuy vậy, sự khác biệt này không có ý nghĩa về mặt thống kê (p > 0,05). Thực ra, phần lớn tế bào ở ngọn lông là tế bào chết nên có thể mất hết DNA, vì thế lượng DNA thu thập được sẽ ít hơn so với lượng DNA thu thập từ gốc lông (nơi có rất nhiều tế bào sống). Tuy nhiên khi ly trích, chúng tôi đã dùng quá ít lông nên sự khác biệt này không rõ ràng. Như vậy, ly trích DNA từ gốc lông sẽ tốt hơn nhiều so với ly trích từ ngọn. Tuy nhiên, do nhu cầu đa dạng trong tiến hành thí nghiệm, đôi khi phải ly trích DNA từ ngọn lông của một thú sống. Do vậy, cần phải cải thiện qui trình ly trích DNA từ ngọn lông (sử dụng loại enzyme phân cắt keratin, tạo điều kiện hoạt động cho enzyme hoặc tăng lượng lông cần ly trích). 4.2 KẾT QUẢ PCR XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH 4.2.1 Kết quả xây dựng qui trình PCR 4.2.1.1 So sánh hai chu trình nhiệt Sau khi tiến hành xác định giới tính trên giống bò ta Vàng bằng hai chu trình nhiệt khác nhau, chúng tôi nhận được kết quả ở bảng 4.4. Bảng 4.4 Tỷ lệ thành công của hai chu trình nhiệt Chu trình nhiệt Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) I 5 0 0 II 9 9 100 Sai biệt thống kê P = 0,002 Kết quả xác định giới tính trên giống ta Vàng bằng Taq ABgene 1,5 UI ở chu trình nhiệt II thành công hơn rất nhiều so với chu trình nhiệt I (p < 0,01). Sự khác biệt chủ yếu giữa chu trình nhiệt II so với chu trình nhiệt I là tăng thời gian trong giai đoạn 2 lên 1 phút ở tất cả các bước (biến tính, ủ bắt cặp và kéo dài). Theo Sambrook và Russell (2001), thời gian của mỗi bước trong giai đoạn chạy chu kỳ ảnh hưởng quyết định đến năng suất sản phẩm PCR. Nếu thời gian biến tính không đủ lâu để cắt đứt hoàn toàn các liên kết hidro trong mạch đôi thì giai đoạn bắt cặp sẽ không đạt hiệu quả cao. Thời gian kéo dài chuỗi nếu ít cũng gây ra kết quả không chuyên biệt. Theo lý thuyết, tốc độ kéo dài chuỗi của Taq polymerase là 2000 nucleotide / phút. Tuy nhiên, trong thực tế, người ta thường xem loại Taq này kéo dài 1000 nucleotide trong vòng 1 phút. Theo chu trình của Alves và ctv (2003), thời gian mỗi bước trong giai đoạn 2 đều là 45 giây. Nhóm tác giả này đã xác định giới tính chính xác 100% khi tiến hành với chu trình nhiệt ấy. Nhưng khi thí nghiệm với cùng chu trình của họ, chúng tôi hoàn toàn không thu được kết quả mong muốn (chỉ được một band chuyên biệt NST X). Nhóm tác giả này sử dụng hoá chất từ hãng Invitrogene Life Technologies trong khi hoá chất dùng trong thử nghiệm này có nguồn gốc từ hãng ABgene, IDT. Có thể vì lý do đó mà có sự khác nhau giữa hai qui trình. I: chu trình nhiệt I; II: chu trình nhiệt II Hình 4.1 Sản phẩm PCR từ hai chu trình nhiệt 4.2.1.2 Thử nghiệm ba loại Taq Quá trình thử nghiệm ba loại Taq của ba hãng sản xuất Promega, Bio-rad và ABgene với chu trình nhiệt II trong xác định giới tính của bò ta Vàng đã cho kết quả ở bảng 4.5. Bảng 4.5 Tỷ lệ thành công khi PCR với ba loại Taq Loại Taq Số mẫu thực hiện Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) Promega 8 0 0 Bio-rad 6 6 100 ABgene 9 9 100 Sai biệt thống kê P < 0,001 Kết quả từ bảng 4.5 cho thấy sử dụng Taq từ Bio-rad và ABgene ở nồng độ 1,5 UI trong phản ứng PCR đã cho hiệu quả cao hơn rõ rệt so với Taq Promega nồng độ 1,5 UI (100% so với 0%). Trước khi quyết định chọn nồng độ 1,5 UI trong mỗi phản ứng, chúng tôi đã thử nghiệm rất nhiều nồng độ khác nhau của mỗi loại Taq và xét thấy ở nồng độ 1,5 UI, ba loại Taq này đều hoạt động tốt hơn các nồng độ khác. Điểm khác nhau lớn nhất giữa ba loại Taq trên là việc sử dụng Tris - HCl trong phản ứng. Theo Alves và ctv (2003), buffer PCR cần 20 mM Tris - HCl trong phản ứng xác định giới tính của bò. Thực tế, buffer PCR của Bio-rad và ABgene mới đáp ứng được điều này còn buffer của Promega chỉ có 10 mM Tris - HCl. Do đó, chúng tôi phải bổ sung thêm Tris - HCl (pH 8,3) để đạt nồng độ Tris - HCl trong buffer PCR là 20 mM. Nhưng sự bổ sung này cũng không mang lại hiệu quả. Ngoài ra, mỗi loại Taq được sản xuất ở mỗi hãng đều theo một qui cách khác nhau và như thế đều có thể ảnh hưởng đến kết quả PCR. Hình 4.2 Sản phẩm PCR từ ba loại Taq Như vậy, ta có thể sử dụng một trong hai loại Taq của hãng Bio-rad hoặc ABgene để tiến hành phản ứng. Tuy nhiên, Taq của Bio-rad (3.773.783 VNĐ / 250 UI) khi so sánh giá thành với Taq ABgene (1.798.381 VNĐ / 250 UI) thì đắt hơn gấp 2,5 lần. Chính vì vậy, chúng tôi quyết định chọn Taq ABgene để tiến hành xác định giới tính sau này. 4.2.2 Áp dụng qui trình PCR 4.2.2.1 Xác định giới tính của ba giống bò với DNA từ cơ Qui trình PCR với Taq ABgene 1,5 UI theo chu trình nhiệt II được sử dụng để xác định giới tính của ba giống bò ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan (DNA cơ). Bảng 4.6 Kết quả áp dụng PCR lên xác định giới tính của ba giống bò Giống Số mẫu tiến hành Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) Ta Vàng 9 9 100 Lai Sind 13 13 100 Sữa Hà Lan 10 10 100 Kết quả từ bảng 4.6 cho thấy qui trình PCR này áp dụng khá thành công và không có sự khác biệt đáng kể khi xác định giới tính các giống bò. Hình 4.3 Sản phẩm PCR chẩn đoán giới tính ba giống bò TV: ta Vàng; LS: lai Sind; HL: sữa Hà Lan Theo Alves và ctv (2003), khi áp dụng qui trình chẩn đoán giới tính bằng PCR lên hai nhóm giống Bos taurus (Holstein, Jersey và Simmental) và Bos indicus (Guzera, Nelore và Tebapua) thì kết quả đều thành công 100%. Như vậy, kết quả của chúng tôi khá phù hợp với kết quả của nhóm tác giả này. 4.2.2.2 Kết quả PCR với DNA từ cơ được phơi khô theo hai mức độ DNA từ cơ được làm khô theo mức độ I so với theo mức độ II không khác biệt gì về độ tinh sạch và hàm lượng DNA (xem bảng 4.1). Tuy nhiên, sau khi tiến hành PCR, tỷ lệ thành công lại khác biệt rất lớn giữa hai mức độ làm khô (bảng 4.7). Bảng 4.7 Hiệu quả PCR trên mẫu DNA làm khô theo hai mức độ Mức độ Số mẫu tiến hành Số mẫu thành công Tỷ lệ thành công (%) I 11 11 100 II 10 2 20 Sai biệt thống kê P = 0,001 Như vậy, tỷ lệ thành công khi tiến hành PCR trên mẫu DNA làm khô mức độ I (100%) cao hơn so với mẫu DNA làm khô mức độ II (20%) một cách có ý nghĩa (p < 0,01). Hình 4.4 Sản phẩm PCR từ hai mức độ làm khô DNA cơ bò đực S V Theo Svaren và ctv (1987), khi DNA được làm khô quá đáng thì nó có thể bị biến tính do mất lớp vỏ ổn định của những phân tử nước gắn kết (trích dẫn bởi Sambrook và Russell, 2001). Ở đây, đa số các mẫu được làm khô đến mức độ II có biểu hiện giảm sút độ ướt rất nghiêm trọng, vệt tủa thường bám rất chặt lên thành eppendorf và rất mờ, mới nhìn thì không xác định được vị trí vệt tủa. Có thể vì lý do đó mà DNA bị hỏng khá nhiều và không đủ làm mẫu cho phản ứng nhân bản (kết quả 2 band mờ, 1 band chuyên biệt NST X hoặc không cho band nào). Tuy nhiên, để khẳng định điều này, cần phải có nhiều nghiên cứu sâu hơn nữa về tính chất của DNA và thực hiện số mẫu nhiều hơn. 4.2.2.3 So sánh kết quả PCR trên DNA của cơ và lông Sau khi tiến hành 10 phản ứng khuếch đại DNA trên các mẫu lông ở cả ba giống, chỉ có 2 mẫu thành công, 8 mẫu còn lại không phân biệt được giới tính chính xác. Tỷ lệ thành công trên mẫu lông là 20%, ít hơn so với mẫu cơ (100%) một cách có ý nghĩa (p < 0,001). Trong đó, hai mẫu lông thành công đều là mẫu lông gốc (đạt 40%), các mẫu lông ngọn đều không thành công (0%). Hình 4.5 Kết quả PCR từ ngọn lông và gốc lông Theo Sambrook và Russell (2001), độ tinh sạch của DNA ảnh hưởng rất lớn đến hiệu quả PCR. DNA có tỷ số OD từ 1,8 – 2,0 được xem là sạch (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Ở đây, mẫu lông có tỷ số OD trung bình 1,49 (xem bảng 4.2). Tỷ số này thấp chứng tỏ lượng protein còn trong dịch DNA rất nhiều (nhất là keratin) nên ức chế phản ứng khuếch đại DNA. Mẫu lông ngọn còn có tỷ số OD trung bình thấp hơn mẫu lông gốc khá nhiều (xem bảng 4.3) nên kết quả PCR của mẫu lông gốc không thành công. Một yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến hiệu quả PCR là nồng độ DNA mẫu và những chất ức chế khác (Sambrook và Russell, 2001). Thông thường, DNA mẫu của động vật hữu nhũ được dùng khoảng 1µg trong phản ứng và có xu hướng giảm xuống còn 0,1µg (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002). Ở đây, chúng tôi sử dụng 0,15 µg DNA mẫu trong 1 phản ứng. Ở mẫu cơ, nồng độ DNA ly trích được khá cao (369,55 ng / µl) nên thường sử dụng < 1µl DNA mẫu là có thể thực hiện được phản ứng. Trong khi đó, mẫu lông có nồng độ DNA khá thấp (27,1 ng / µl) (xem bảng 4.2), nên chúng tôi phải sử dụng 3 µl - 15 µl thì mới đủ lượng DNA mẫu cho phản ứng nhân bản. Khi đó, lượng EDTA có trong TE 1X (buffer cho DNA mẫu) được đưa vào phản ứng cũng tăng theo. Tuy nhiên, nếu lượng EDTA hiện diện nhiều trong phản ứng khuếch đại DNA thì nó có thể ức chế phản ứng bằng cách bẫy bắt Mg2+ - một coenzyme của Taq polymerase và làm cô lập Mg2+ với Taq. Chính vì vậy, PCR ở mẫu lông có hiệu quả rất thấp, nhất là ngọn lông. Một kinh nghiệm được rút ra từ sự thất bại trên mẫu lông là khi pha loãng DNA mẫu sau khi tủa trong cồn tuyệt đối lạnh thì phải pha với lượng nhỏ TE 1X để có được dung dịch DNA có hàm lượng > 100 ng / µl. PHẦN V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN - DNA ly trích từ cơ tinh sạch và đạt năng suất cao hơn DNA ly trích từ lông. - DNA ly trích từ gốc lông có độ tinh sạch cao hơn DNA ly trích từ ngọn lông. - Qui trình PCR với chu trình nhiệt I (tăng thời gian của phản ứng) và Taq ABgene 1,5 UI có thể xác định giới tính thành công trên ba giống ta Vàng, lai Sind và sữa Hà Lan với tỷ lệ thành công 100%. - Mức độ làm khô DNA trong giai đoạn thu hồi DNA ảnh hưởng đến hiệu quả PCR xác định giới tính. - Sử dụng DNA ly trích từ lông trong PCR xác định giới tính cho hiệu quả thấp hơn so với sử dụng DNA ly trích từ cơ. 5.2 ĐỀ NGHỊ - Thiết lập qui trình ly trích DNA từ lông (nhất là ngọn lông) để được lượng DNA lớn và tinh sạch. - Theo dõi về thời gian và biểu hiện khô của DNA trong quá trình thu hồi DNA sau ly trích. - Áp dụng qui trình PCR xác định giới tính lên phôi bò của ba giống ta Vàng, lai Sind, sữa Hà Lan. TÀI LIỆU THAM KHẢO * Tài liệu tiếng Việt Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003. Ứng dụng kỹ thuật thụ tinh in vitro và dùng pcr xác định giới tính phôi trên heo. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002. Sinh Học Phân Tử (Khái Niệm - Phương Pháp - ứng Dụng). Tái bản lần 2, NXB Giáo Dục, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 122 – tr. 129 và tr. 190 - tr. 197. Phạm Thành Hổ, 2000. Sinh Học Đại Cương. NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 274. Nguyễn Thị Thu Lan, 2002. Thiết lập qui trình xác định giới tính heo (sus scrofa domestica) bằng kỹ thuật pcr (polymerase chain reaction). Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Phan Kim Ngọc và Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2000. Sinh Học Của Sự Sinh Sản. Tái bản lần thứ nhất, NXB Giáo Dục. Tr. 50 – tr. 64. Nguyễn Phước Nhuận, Phan Thế Đồng, Lê Thị Phương Hồng, Đỗ Hiếu Liêm, Đinh Ngọc Loan, 2003. Giáo Trình Sinh Hóa Học (Phần I). NXB Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 68 – tr. 73. Lê Thị Mỹ Phước, Nguyễn Thị Mỹ Lan, Lê Văn Bình, Bùi Thị Hồng Hạnh, 2002. Hóa Học Phục Vụ Công Nghệ Sinh Học II. Giáo trình thực tập Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Thành Phố Hồ Chí Minh. Tr. 36. Lê Thị Thu Phương, 2004. Phát hiện gen halothane, gen thụ thể estrogen và mối liên quan giữa hai gen này đến năng suất sinh sản của heo nái. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp, Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Việt Nam. Nguyễn Trọng Tiến, Nguyễn Xuân Trạch, Mai Thị Thơm, Lê Văn Ban, 2001. Giáo Trình Chăn Nuôi Trâu Bò. NXB Nông Nghiệp. Tr. 23 – tr. 30. *Tài liệu nước ngoài AIP Congress, 2002. Semiconducting photoactive biopolymers. AIP Congress, Queensland University, Australia. 20 pages. Alves A. C. B., Hossepian de Lima M. F. V., Teixera M. C., Moreira-Filho A. C., 2003. Use of primers derived from a new sequence of the bovine Y chromosome for sexing Bos taurus and Bos indicus embryos. Theriogenology 59: 1415-1419. Bondioli K. R., et al., 1989. The use of male – specific chromosomal DNA fragments to determine the sex of bovine preimplantation embryos. Theriogenology 31: 95-104. Bredbacka P., et al., 1994. Survival of biopsied and sexed bovine demi embryos. Theriogenology 41: 1023-1031. Burgoyne, 1998. The mammalian Y chromosome: a new perspective. BioEssay 20: 363-366. Chen C. M., Hu C. L., Wang C. H., Hung C. M., Wu H. K., Choo K. B., and Cheng W. T. K., 1999. Gender determination in single bovine blastomere by polymerase chain reaction amplification of sex - specific polymorphic fragments in the Amelogenin gene. Molecular reproduction and development 54: 209-214. Chen C. Y., Huang L. S., Cheng J. B., Ding N. S., Zhou L. L., and Xiao H. X., 2004. Establishing and optimizing the system for sex determination of bovine preimplantation embryos. China Journal of Agricultural Biotechnology 1(1): 13-16. Delbrigde L. M. and Marshall Graves A. J., 1999. Mammalian Y chromosome evolution and the male – specific functions of Y chromosome – borne genes. Journal of Reproduction and Fertility 4: 101-109. Eldridge E. F., 1985. Cytogenetics of livestock. Avi publishing company, Wesport, Connecticut, USA. p.115 – p. 122. Frandson D. R., 1969. Anatomy and physiology of farm animals. Lea and Febiger, Philadelphia, USA. Chapter 28, p. 386 – p. 389. Haqq M. C. and Donahoe K. P., 1998. Regulation of sex dimorphism in Mammals. Physiol. Rev. 78: 1-33. Josso N., Rey R. and Gonzalès J., 2003. Sexual differentiation. Ho Chi Minh city, Viet Nam, March 2005. Kitiyanant Y., Saikhun J., Siriaroonrat B., and Pavasuthipaisit K., 2000. Sex determination by polymerase chain reaction and karyotyping of bovine embryos at first cleavage in vitro. Science Asia 26: 9-13. Page D. C., Mosher R., Simpson E., Fisher E. M. C., Mardon G., Pollack J., Mc Gillivray B., De la chapelle A., and Brown L. G., 1987. The sex determing region of the human Y chromosome encodes a finger protein. Cell 36: 1091-1104. Pomp D., Good A. B., Geisert D. R., Corbin J. C., and Conley J. A., 1995. Sex identification in mammals with polymerase chain reaction and its use to examine sex effects on diameter of day-10 or -11 pig embryos. J. Anim., Sci. 73: 1408- 1415. Sambrook Joseph and Russell W. David, 2001. Molecular cloning (A laboratory manual). 3rd edition, Cold Spring Harbor laboratory press, New York, USA. Vol.2: p. 8.23, Vol.3: p. A8.13. Sauer S., Lechner D., Berlin K., Plancon C., Heuermann A., Lehrach H., and Gut G. I., 2000. Full flexibility genotyping of single nucleotide polymorphisms by the GOOD assay. Nucleic Acids Research Vol.28, No.23. Schoder A., Miller R. J., Thomsen D. P., Roschlau K., Avery B., poulsen H. P., Schmitt M., and Swerin M., 1990. Sex determination of bovine embryos using the polymerase chain reaction. Animal Biotechnology 1(2): 121-133. Takara Bio Inc. CycleavePCRTM Bovine Sexing Kit. Ho Chi Minh city, Viet Nam, June 2005. Van Vliet A. R., Gibbins V. M. A., and Walton S. J., 1989. Livestock embryo sexing: a review of current methods, with emphasis on Y- Specific DNA probes. Theriogenology 32(3): 421-438. PHỤ LỤC * Hoá chất dùng trong đề tài - Hoá chất ly trích DNA + Đệm ly trích cơ và lông (chỉnh pH đến 8) Tris - HCl 50 mM NaCl 20 mM EDTA (Ethylene diamine tetra - acetic acid) 1 mM SDS (Sodium dodecyl sulfate) 1 % + Proteinase K 20 mg / ml + Sodium acetate 2 M; 0,2 M + Phenol: chloroform: isoamyl alcohol 25:24:1 + Ethanol 100%; 70% + TE 1X (pH = 8) Tris - HCl 10 mM Na2EDTA 1 mM - Hoá chất PCR PCR buffer 1 X MgCl2 1,5 mM Taq polymerase tùy phản ứng dNTP 200 μM / mỗi loại H2O cất 2 lần, khử ion, vô trùng, chiếu tia UV 15 phút, pH 6,8 – 7,0 - Hoá chất điện di sản phẩm PCR + Agarose 1,5% + TBE 0,5 X (Tris borate EDTA, pH = 8,3) Tris - base 44,5 mM Acid boric 44,5 mM Na2EDTA 1,5 mM + Loading dye 6 X Bromophenol blue 0,25 % Sucrose 40 % TE 1 X vừa đủ 100 % + Ladder TAE 0,5 X (Tris acetate EDTA) 65 % Ladder 100 bp gốc 15 % Loading dye 6 X 20 % + Ethidium bromide 30 μl / 300 ml TBE 0,5 X * Dụng cụ dùng trong đề tài - Pipetman loại 100 - 1000 μl; 10 - 100 μl; 0,5 - 10 μl - Đầu tip tương ứng với các loại pipetman - Eppendorf loại 0,2 ml; 1,5 ml - Các chai lọ đựng hoá chất, vật mẫu - Kéo, kẹp, chày, cối, bao nilông… * Thiết bị được sử dụng trong đề tài - Máy vortex (IKA Works) - Máy ly tâm (Sigma, Hettich) - Máy PCR (Eppendorf) - Bộ điện di (Biorad) - Máy chụp gel (Biorad) - Tủ ấm (Memmert) - Tủ trữ mẫu, hoá chất (Reetech, Brandt, Sanyo) - Microwave (Electrolux) - Cân (explorer- OHAUS) - Tủ sấy (Jencons - PLS) - Water bath (Memmert) - Máy cất nước, khử ion (Barnstead) - Autoclave (Tommy) - Quang phổ kế (Hewlett Packard) - Máy đo pH