Khóa luận Ảnh hưởng của lớp mỏng tế bào lên sự phát sinh hình thái của cây hoa anh thảo (cyclamen persicum)

920 mô. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Phần 2 VẬT LIỆU & PHƢƠNG PHÁP Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI Đề tài đƣợc tiến hành tại phòng Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng của Viện Sinh học Tây Nguyên. Thời gian tiến hành đề tài: từ tháng 1 năm 2009 đến tháng 6 năm 2009. 2.2. MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI Đề tài nhằm thiếp lập hệ thống phát sinh hình thái từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo „Cyclamen persicum‟ nuôi cấy in vitro. Muốn thiết lập đƣợc qui trình phát sinh hình thái này chúng ta cần có điều kiện tối ƣu trong quá trình nuôi cấy in vitro để tạo đƣợc các nguồn nguyên liệu theo mong muốn. Điều kiện nuôi cấy đó bao gồm điều kiện môi trƣờng nuôi cấy, điều kiện ánh sáng, điều kiện nhiệt độ, điều kiện thoáng khí Trong các điều kiện nêu trên thì điều kiện môi trƣờng nuôi cấy là quan trọng nhất, với các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật khác nhau và với những tỷ lệ khác nhau sẽ góp phần quyết định đến quá trình biệt hóa khác nhau của mô, tế bào, cơ quan thực vật trong nuôi cấy in vitro. Với thời gian nghiên cứu có hạn, trong đề tài này chúng tôi tập trung khảo sát ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đến khả năng phát sinh mô sẹo, chồi và rễ của cây hoa Anh thảo nuôi cấy in vitro. 2.3. VẬT LIỆU 2.3.1. Nguồn mẫu Nguồn mẫu đƣợc lấy tại Viện Sinh học Tây Nguyên. Sử dụng phát hoa cây Anh thảo ở giai đoạn nụ hoa khi chúng vẫn còn chƣa nở, chọn những phát hoa có đƣờng kính 5 – 6 mm, cắt thành từng lớp có chiều dày khoảng 1 – 2 mm. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Hình 3. Cây hoa Anh thảo sử dụng làm nguồn mẫu 2.3.2. Khử trùng mẫu Thao tác khử trùng ngoài phòng cấy: Các phát hoa đƣợc rửa sơ bộ dƣới vòi nƣớc, sau đó chúng đƣợc ngâm trong dung dịch nƣớc tẩy rửa Sunlight trong 15 phút. Để giảm bớt khả năng nhiễm trùng, các phát hoa đƣợc đặt dƣới vòi nƣớc chảy trong vòng 1 giờ. Thao tác khử trùng trong phòng cấy: Các phát hoa đƣợc rửa bằng cồn 70º trong vòng 30 giây, rồi rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Sau đó các phát hoa đƣợc khử trùng bằng dung dịch HgCl2 0,1% có nhỏ một vài giọt Tweens 20 (Polyoxyetilen sorbitan monolaurat) và cuối cùng rửa nhẹ nhàng 5 lần trong nƣớc vô trùng. 2.3.3. Môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng đƣợc sử dụng là MS (Murashige và Skoog, 1962). Ngoài các thành phần nhƣ khoáng đa lƣợng, vi lƣợng, vitamin còn bổ sung thêm các thành phần nhƣ: 30 g/l sucrose, 8,5 g/l agar. Môi trƣờng nuôi cấy đƣợc chứa trong các bình thủy tinh loại 100 ml và 250 ml. Thể tích môi trƣờng đối với loại bình 100 ml là 25 ml và đối với loại bình 250 ml là 40 ml. Tất cả các môi trƣờng nuôi cấy điều chỉnh đến pH = 5,7 bằng NaOH 1N hoặc HCl 10% trƣớc khi hấp khử trùng trong autoclave tại nhiệt độ 121ºC, áp suất 1 atm trong 40 phút. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 2.3.4. Điều kiện thí nghiệm Địa điểm: Các thí nghiệm nuôi cấy in vitro đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử và Chọn tạo Giống cây trồng – Viện Sinh học Tây Nguyên. Điều kiện phòng nuôi in vitro:  Nhiệt độ : 25 ± 2ºC  Quang kỳ : 12 giờ/ngày  Cƣờng độ chiếu sáng : 2500 – 3000 lux  Độ ẩm trung bình : 75 – 80 % 2.4. PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 2.4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo Mục đích thí nghiệm Khả năng tạo mô sẹo tùy thuộc vào môi trƣờng nuôi cấy, trong đó chủ yếu là các chất điều hòa sinh trƣởng. Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát môi trƣờng có chứa các loại auxin (2,4-D, IBA hoặc NAA) ở các nồng độ khác nhau lên khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu phát hoa cây Anh thảo. Mô tả thí nghiệm Các mẫu phát hoa sau khi khử trùng đƣợc cắt thành từng lát mỏng 1 – 2 mm và cấy vào môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo là môi trƣờng MS có bổ sung 2,4-D, IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2.1. Thí nghiệm gồm 15 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần và mỗi bình cấy 2 mẫu. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Bảng 2.1. Nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA và NAA) trong môi trƣờng khởi tạo mô sẹo STT Môi trƣờng Loại auxin Nồng độ (mg/l) 1 2 3 4 5 D1 D2 D3 D4 D5 2,4-D 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 6 7 8 9 10 I1 I2 I3 I4 I5 IBA 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 11 12 13 14 15 N1 N2 N3 N4 N5 NAA 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi tỷ lệ tái sinh mẫu (%), cân trọng lƣợng tƣơi (g) của mô sẹo đƣợc hình thành sau 8 tuần nuôi cấy. 2.4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo Mục đích thí nghiệm TDZ đƣợc xem là một loại cytokinin kích thích quá trình tạo mô sẹo trên mẫu. Vì vậy, trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát hiệu quả của TDZ kết hợp với 2,4-D, IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau lên khả năng cảm ứng tạo mô sẹo từ mẫu phát hoa cây Anh thảo. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Mô tả thí nghiệm Các mẫu phát hoa sau khi khử trùng đƣợc cắt thành từng lát mỏng 1 – 2 mm và cấy vào môi trƣờng cảm ứng tạo mô sẹo là môi trƣờng MS có bổ sung 0,2 mg/l TDZ kết hợp với 2,4-D, IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2.2. Thí nghiệm gồm 15 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần và mỗi bình cấy 2 mẫu. Bảng 2.2. Nồng độ TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) trong môi trƣờng khởi tạo mô sẹo STT Môi trƣờng TDZ (mg/l) Loại auxin Nồng độ (mg/l) 1 2 3 4 5 ZD1 ZD2 ZD3 ZD4 ZD5 0,2 2,4-D 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 6 7 8 9 10 ZI1 ZI2 ZI3 ZI4 ZI5 0,2 IBA 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 11 12 13 14 15 ZN1 ZN2 ZN3 ZN4 ZN5 0,2 NAA 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi tỷ lệ tái sinh mẫu (%), cân trọng lƣợng tƣơi (g) của mô sẹo đƣợc hình thành sau 8 tuần nuôi cấy. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 2.4.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4- D lên khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo in vitro Mục đích thí nghiệm Khảo sát hiệu quả của TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo của hoa Anh thảo. Mô tả thí nghiệm Mô sẹo thu đƣợc ở thí nghiệm 2 đem cấy vào môi trƣờng MS có bổ sung TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4-D tại các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2.3. Thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần và mỗi bình cấy 2 mẫu. Bảng 2.3. Nồng độ của TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D trong môi trƣờng tăng sinh mô sẹo STT Môi trƣờng TDZ (mg/l) BA (mg/l) Kinetin (mg/l) 2,4-D (mg/l) 1 2 3 4 TZD1 TZD2 TZD3 TZD4 0,2 __ __ 0,1 0,3 0,5 0,7 5 6 7 8 TBD1 TBD2 TBD3 TBD4 __ 0,5 __ 0,1 0,3 0,5 0,7 9 10 11 12 TKD1 TKD2 TKD3 TKD4 __ __ 0,5 0,1 0,3 0,5 0,7 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi tỷ lệ gia tăng, trọng lƣợng tƣơi (g) của mô sẹo đƣợc hình thành sau 6 tuần nuôi cấy. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 2.4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA lên khả năng phát sinh chồi của hoa Anh thảo in vitro Mục đích Một số cây không cần auxin hay cytokinin để hình thành chồi. Tuy nhiên trong hầu hết các trƣờng hợp cytokinin và auxin đều có ảnh hƣởng đến quá trình tạo chồi. Trong thí nghiệm này, chúng tôi khảo sát ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau lên khả năng tái sinh chồi từ mô sẹo của cây hoa Anh thảo. Mô tả thí nghiệm Các mô sẹo hình thành từ thí nghiệm 3 đƣợc cắt cùng kích thƣớc và cấy vào môi trƣờng tái sinh chồi gồm môi trƣờng MS có bổ sung BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2.4. Thí nghiệm gồm 16 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần, mỗi bình cấy 2 mẫu. Bảng 2.4. Nồng độ của BA, Kinetin kết hợp với IBA hoặc NAA trong môi trƣờng phát sinh chồi STT Môi trƣờng BA (mg/l) Kinetin (mg/l) IBA (mg/l) NAA (mg/l) 1 2 3 4 BI1 BI2 BI3 BI4 0,5 __ 0,1 0,3 0,5 0,7 __ 5 6 7 8 BN1 BN2 BN3 BN4 0,5 __ __ 0,1 0,3 0,5 0,7 9 10 11 12 KI1 KI2 KI3 KI4 __ 0,5 0,1 0,3 0,5 0,7 __ 13 14 15 16 KN1 KN2 KN3 KN4 __ 0,5 __ 0,1 0,3 0,5 0,7 Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi số lƣợng chồi trên các loại môi trƣờng sau 6 tuần nuôi cấy. 2.4.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo in vitro Mục đích Khảo sát ảnh hƣởng của BA và Kinetin tại các nồng độ khác nhau lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo. Mô tả thí nghiệm Chồi hình thành từ thí nghiệm 4 với chiều cao tƣơng đƣơng nhau đƣợc cấy vào môi trƣờng tăng sinh và kéo dài chồi gồm môi trƣờng MS có bổ sung BA và Kinetin tại các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2.5. Thí nghiệm gồm 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần, mỗi bình cấy 2 mẫu. Bảng 2.5. Nồng độ của BA và Kinetin trong môi trƣờng tăng sinh và kéo dài chồi STT Môi trƣờng BA (mg/l) Kinetin (mg/l) 1 2 3 4 5 B1 B2 B3 B4 B5 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 __ 6 7 8 9 10 K1 K2 K3 K4 K5 __ 0,1 0,3 0,5 0,7 1,0 Chỉ tiêu theo dõi Số lƣợng chồi và khả năng kéo dài chồi trên các loại môi trƣờng sau 4 tuần nuôi cấy. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 2.4.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của IBA, NAA lên sự hình thành rễ của cây hoa Anh thảo in vitro Mục đích Khảo sát ảnh hƣởng của IBA và NAA tại các nồng độ khác nhau lên khả năng hình thành rễ của cây hoa Anh thảo. Mô tả thí nghiệm Chồi hình thành từ thí nghiệm 5 đƣợc cấy vào môi trƣờng tạo rễ gồm môi trƣờng MS có bổ sung IBA hoặc NAA tại các nồng độ khác nhau nhƣ bảng 2.6. Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 4 lần, mỗi bình cấy 2 mẫu. Bảng 2.6. Nồng độ của IBA và NAA trong môi trƣờng tạo rễ STT Môi trƣờng IBA (mg/l) NAA (mg/l) 1 2 RI1 RI2 0,5 1,0 __ 3 4 RN1 RN2 __ 0,5 1,0 Chỉ tiêu theo dõi Theo dõi tỷ lệ hình thành rễ (%), số lƣợng rễ và chiều dài rễ (cm) đƣợc hình thành trên các loại môi trƣờng sau 4 tuần nuôi cấy. 2.5. PHÂN TÍCH SỐ LIỆU 2.5.1. Tính trung bình và phƣơng sai của mẫu Tất cả các số liệu sau khi đƣợc đo đạc ứng với từng chỉ tiêu theo dõi đƣợc thống kê và biểu diễn dƣới dạng trung bình mẫu ± độ lệch chuẩn. Độ lệch chuẩn cho biết mức độ phân tán của chuỗi số, khoảng 2/3 số liệu sẽ nằm trong khoảng trung bình của mẫu ± độ lệch chuẩn. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu  Trung bình mẫu n x n i 1   Với  : trung bình mẫu n : tổng số mẫu đo đạc xi : mẫu đo đạc  Phƣơng sai mẫu SD = S =   1 1 2    N XX N i i Với s2 : phƣơng sai của mẫu X1 2 : bình phƣơng của mẫu đƣợc đo 2.5.2. Vẽ biểu đồ Các số liệu đƣợc xử lý vẽ biểu đồ bằng cách sử dụng phần mềm Microsoft Excel. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu H ìn h 4 . S ơ đ ồ t ó m t ắt q u y t rì n h n h ân g iố n g h o a A n h t h ảo ( C yc la m en p er si cu m ) b ằn g p h ƣ ơ n g p h áp l ớ p m ỏ n g t ế b ào p h át h o a Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Phần 3 KẾT QUẢ & THẢO LUẬN Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo Các mẫu lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo đƣợc nuôi cấy trong vòng 8 tuần. Sau đó, chúng tôi quan sát và ghi nhận hình thái khởi tạo mô sẹo. Tỷ lệ tạo mô sẹo đƣợc thể hiện trong bảng 3.1. Bảng 3.1. Hình thái mô sẹo từ mẫu cấy lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo trong môi trƣờng bổ sung các loại auxin Môi trƣờng Loại auxin Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Trọng lƣợng tƣơi (g) D1 2,4-D 13,75 0,200 D2 80,00 0,637 D3 16,67 0,529 D4 50,00 0,265 D5 25,00 0,158 I1 IBA 0 0 I2 0 0 I3 0 0 I4 0 0 I5 0 0 N1 NAA 0 0 N2 0 0 N3 0 0 N4 0 0 N5 0 0 Trong ba loại auxin đƣợc bổ sung vào môi trƣờng, chúng tôi nhận thấy chỉ có 2,4-D có khả năng kích thích tạo mô sẹo; IBA và NAA không có phản ứng đối với sự khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào phát hoa. Tất cả các mẫu cấy trên môi trƣờng có IBA và NAA ở các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 mg/l) đều hóa nâu. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Mặc dù 2,4-D có hoạt tính rất yếu trong kích thích tạo chồi bất định và rễ bất định, nhƣng lại là loại auxin kích thích tạo mô sẹo và phôi soma rất hiệu quả. Do vậy, 2,4-D thƣờng đƣợc sử dụng trong quá trình cảm ứng tạo mô sẹo và nuôi cấy huyền phù tế bào (Thomas và cộng sự, 1996). Sau thời gian nuôi cấy trên môi trƣờng có 2,4-D, các mẫu phát hoa chuyển từ màu xanh sang màu hơi nâu. Mô sẹo hình thành từ các vết cắt và tập trung nhiều ở phần giữa. Trong thí nghiệm này, mẫu phát hoa đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng D2 cho tỷ lệ phát sinh mô sẹo nhiều nhất là 80% và trọng lƣợng tƣơi cao nhất của mô sẹo là 0,637 g. Tiếp đến là môi trƣờng D4, D5 và cuối cùng là môi trƣờng D1, D3. Trong đó, môi trƣờng D1 có tỷ lệ tái sinh mô sẹo thấp nhất (13,75%) và môi trƣờng D5 cho trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo thấp nhất (0,158 g). Điều này chứng tỏ nồng độ của các chất kích thích sinh trƣởng có vai trò quyết định đối với sự hình thành mô sẹo của hoa Anh thảo in vitro. Với kết quả trên chúng tôi nhận thấy mẫu phát hoa là thích hợp cho việc tạo mô sẹo. Môi trƣờng tối ƣu cho việc tạo mô sẹo là môi trƣờng MS bổ sung 0,3 mg/l 2,4-D (tỷ lệ tạo mô sẹo đối với mẫu phát hoa là 80%), tất cả các mô sẹo đều có màu vàng sáng và chắc (hình 5). Mô sẹo đƣợc hình thành từ phát hoa cây Anh thảo là một khối mô phát triển không có tổ chức, do sự tác động của việc gây vết thƣơng và chủ yếu là bởi nồng độ các chất kích thích sinh trƣởng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy. Kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo đã đƣợc ứng dụng thành công cả ở cây một lá mầm và cây hai lá mầm. Mô sẹo đƣợc tạo thành từ mạch tƣợng tầng, cơ quan dự trữ, trụ bì rễ, nội nhũ, lá mầm, thịt lá và mô tiền mạch. Các mô mới đƣợc hình thành nhƣ các chồi, các đỉnh ngọn, các đỉnh sinh trƣởng hoặc các đỉnh chồi hoa đƣợc sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy do chúng có hoạt động phân chia mạnh và là một cấu trúc dễ biệt hóa. Nếu trong môi trƣờng không thích hợp, chúng có thể rối loạn chức năng và phát sinh mô sẹo. Các mẫu cấy là các mô phân hóa nhƣ thân, rễ, lá, hoa, trái khi nuôi cấy dẫn đến sự giải biệt hóa, từ đó sẽ có khả năng phát sinh cơ quan. Tất cả các phần của cây đều có khả năng tạo ra quá trình phân hóa tiếp theo và tạo ra cơ quan mới. Tuy nhiên, các thân còn non cũng nhƣ các lá cây có biểu hiện phản ứng tốt nhất (Kiên, 2002). Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Trong thí nghiệm này, chúng tôi thu đƣợc kết quả tạo mô sẹo tốt ở môi trƣờng MS có bổ sung 0,3 mg/l 2,4-D. Điều này cho thấy 2,4-D thích hợp cho việc khởi tạo mô sẹo của phát hoa cây Anh thảo. Hình 5. Ảnh hƣởng của các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) ở các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 mg/l) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo. a) 2,4-D; b) IBA; c) NAA 3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo Auxin là chất điều hòa sinh trƣởng cần thiết cho quá trình hình thành mô sẹo. Tuy nhiên auxin và cytokinin có tác động bổ trợ cho nhau nên các hỗn hợp của auxin và cytokinin vẫn thƣờng đƣợc sử dụng để kích thích tạo mô sẹo. Thử nghiệm auxin và cytokinin trong nuôi cấy mô sẹo từ phát hoa cây Anh thảo sau 8 tuần thu đƣợc kết quả nhƣ sau: Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Bảng 3.2. Hình thái mô sẹo từ mẫu lớp mỏng tế bào của phát hoa cây Anh thảo trong môi trƣờng bổ sung TDZ kết hợp với các loại auxin Môi trƣờng TDZ (mg/l) Loại auxin Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Trọng lƣợng tƣơi (g) ZD1 0,2 2,4-D 88,88 0,924 ZD2 80,00 1,300 ZD3 87,50 0,970 ZD4 87,50 1,132 ZD5 88,89 2,087 ZI1 0,2 IBA 20,00 0,247 ZI2 37,50 0,293 ZI3 77,78 0,407 ZI4 87,50 0,354 ZI5 77,75 0,331 ZN1 0,2 NAA 83,33 0,239 ZN2 80,00 0,200 ZN3 25,00 0,197 ZN4 75,00 0,253 ZN5 50,00 0,199 Khi kết hợp 0,2 mg/l TDZ với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau, tỷ lệ hình thành mô sẹo và trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo là rất cao (80% - 88,89%; 0,924 – 2,087 g). Ở hai môi trƣờng ZD3 và ZD4 (môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l TZD và 0,5 mg/l, 0,7 mg/l 2,4-D) cho tỷ lệ hình thành mô sẹo nhƣ nhau (87,50%). Khi sử dụng 2,4-D ở nồng độ 0,1 mg/l (ZD1) và 1,0 mg/l (ZD5) cho tỷ lệ mô sẹo cao nhất (88,88%, 88,89%). Đặc biệt, đối với mẫu cấy phát hoa khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ZD5 (môi trƣờng MS có bổ sung 0,2 mg/l TDZ và 1,0 mg/l 2,4-D) (bảng 3.2) cho trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo cao hơn các môi trƣờng khác một cách vƣợt trội. Việc kết hợp 0,2 mg/l TDZ với IBA ở nồng độ 0,1; 0,3 mg/l hoặc NAA ở nồng độ 0,5 mg/l không thích hợp cho quá trình hình thành mô sẹo thể hiện ở chỗ tỷ lệ tạo mô sẹo trong những môi trƣờng này khá thấp (dƣới 50%) và trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo cũng thấp (dƣới 0,249 g). Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Khi giảm nồng độ IBA trong môi trƣờng nuôi cấy làm cho tỷ lệ tạo mô sẹo và trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo giảm, điều này chứng tỏ IBA ở nồng độ thấp hạn chế sự hình thành mô sẹo. Khi tăng nồng độ NAA trong môi trƣờng, tỷ lệ mô sẹo giảm đi (83,33% - 25,00%), trọng lƣợng tƣơi cũng giảm đi (0,239 g – 0,197 g) cho đến ngƣỡng 0,5 mg/l thì tăng lên (25,00 – 75,00%), (0,197 g – 0,253 g), nhƣng quá ngƣỡng 0,7 mg/l tỷ lệ mô sẹo trong môi trƣờng này lại giảm (75,00% - 50,00%) và trọng lƣợng tƣơi cũng giảm (0,253 g – 0,199 g) (biểu đồ 1). Vậy qua bảng số liệu trên ta thấy môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l TDZ kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau, IBA ở nồng độ cao và NAA ở nồng độ thấp là rất tốt cho quá trình khởi tạo mô sẹo từ phát hoa. Mô sẹo của hoa Anh thảo đƣợc tạo ra trong thí nghiệm này là mô sẹo có màu vàng nhạt, loại cứng là mô sẹo thích hợp cho quá trình biệt hóa (hình 6). Auxin tác động rõ ràng trên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này nối tiếp sau sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập nƣớc vào trong tế bào, sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Auxin có một số vai trò khác nhau trong sự sinh trƣởng và phát triển của thực vật. Chúng kích thích tế bào kéo dài và tăng trƣởng, kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mô sẹo và hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế phát triển của chồi nách và sự hình thành phôi soma trong môi trƣờng nuôi cấy mô sẹo (Mai, 2004). Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ZD1 ZD2 ZD3 ZD4 ZD5 ZI1 ZI2 ZI3 ZI4 ZI5 ZN1 ZN2 ZN3 ZN4 ZN5 Môi trường T ỷ l ệ t ạ o m ô s ẹ o ( % ) 0 0.5 1 1.5 2 2.5 T rọ n g l ư ợ n g t ư ơ i (g ) Tỷ lệ tạo callus (%) Trọng lượng tươi (g) Biểu đồ 1. So sánh ảnh hƣởng của TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) ở các nồng độ khác nhau lên sự khởi tạo mô sẹo của hoa Anh thảo Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia tế bào, trong quá trình này chúng cần thiết nhƣng chúng không có hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Cytokinin là chất bổ sung cho auxin, làm thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách rời các nhiễm sắc thể. Cytokinin kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non, chúng là chất đối kháng với sự sinh tạo rễ. Tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) cao thì mẫu có xu hƣớng tạo rễ; tỷ lệ A/C thấp, mẫu cấy có xu hƣớng phát triển về chức năng sinh tạo chồi và nếu tỷ lệ A/C gần một đơn vị thì mẫu có xu hƣớng tạo mô sẹo (Kiên, 2002). Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng kết hợp auxin và cytokinin với mục đích tạo ra mô sẹo. Cytokinin sử dụng là TDZ đƣợc cố định ở nồng độ không đổi, chỉ thay đổi nồng độ auxin (2,4-D, IBA và NAA). Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Trong nhóm cytokinin, TDZ có hoạt tính sinh học mạnh, chỉ cần sử dụng với nồng độ thấp trong môi trƣờng nuôi cấy, đặc biệt trong vi nhân giống. Mặc khác, TDZ chống lại sự phân hủy gây ra do tác nhân oxy hóa cytokinin, do đó TDZ bền vững trong môi trƣờng nuôi cấy. Tuy nhiên, khi sử dụng ở nồng độ quá thấp (0,02; 0,05 mg/l) thì không có khả năng kích thích tạo mô sẹo. TDZ ở nồng độ 0,2 mg/l cho kết quả tạo mô sẹo là tốt nhất (Lieberman, 2001). Hình 6. Ảnh hƣởng của 0,2 mg/l TDZ kết hợp với các loại auxin (2,4-D, IBA, NAA) ở các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 mg/l) lên khả năng khởi tạo mô sẹo từ lớp mỏng tế bào của phát hoa cây hoa Anh thảo. a) 2,4-D; b) IBA; c) NAA 3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của TDZ, BA hoặc Kinetin kết hợp với 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo in vitro Sau 6 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy đƣợc ảnh hƣởng của TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D lên khả năng tăng sinh mô sẹo cây hoa Anh thảo in vitro nhƣ sau: Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Bảng 3.3. Khả năng tăng sinh mô sẹo của cây hoa Anh thảo trong môi trƣờng bổ sung TDZ, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D STT Môi trƣờng TDZ (mg/l) BA (mg/l) Kinetin (mg/l) 2,4-D (mg/l) Trọng lƣợng tƣơi (g) Tỷ lệ gia tăng 1 2 3 4 TZD1 TZD2 TZD3 TZD4 0,2 __ __ 0,1 0,3 0,5 0,7 2,712 6.366 5.887 4,893 10,72 25,16 23,27 19,34 5 6 7 8 TBD1 TBD2 TBD3 TBD4 __ 0,5 __ 0,1 0,3 0,5 0,7 0,979 2,187 2,738 3,390 3,87 8,64 10,82 13,40 9 10 11 12 TKD1 TKD2 TKD3 TKD4 __ __ 0,5 0,1 0,3 0,5 0,7 1,454 1,983 2,394 2,693 5,75 7,84 9,46 10,64 Chú thích: Khối lượng mẫu ban đầu: 0,253 g. Trên môi trƣờng đƣợc bổ sung 0,2 mg/l TDZ , 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l Kinetin kết hợp với 2,4-D, kết quả cho thấy trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo cũng nhƣ tỷ lệ gia tăng mô sẹo so với mẫu cấy mô sẹo ban đầu. Khi nồng độ 2,4-D tăng từ 0,1 lên 0,3 mg/l, trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo tăng rõ rệt từ 2,712 g lên 6,366 g và khi nồng độ của auxin này tiếp tục tăng, trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo giảm từ 6,366 g xuống 4,893 g. Sinh khối mô sẹo trên hai môi trƣờng có nồng độ 2,4-D là 0,3 mg/l và 0,5 mg/l không có sự khác nhau nhiều về trọng lƣợng tƣơi, trong hai môi trƣờng này tỷ lệ tăng mô sẹo so với ban đầu là 25,16 lần và 23,27 lần (bảng 3.3). Mô sẹo hình thành ở các nồng độ 0,1 – 0,7 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,2 mg/l TDZ có màu vàng sáng, chắc (hình 7a). Trên môi trƣờng có bổ sung 0,5 mg/l BA và 2,4-D, khi tăng nồng độ 2,4-D từ 0,1 mg/l lên 0,7 mg/l, kết quả sau 6 tuần nuôi cấy cho thấy trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo tăng đều từ 0,979 g lên 3,390 g. Trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo đạt cực đại trên môi trƣờng có nồng độ 0,5 mg/l BA và 0,7 mg/l 2,4-D, trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo tăng 13,40 lần so Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu với mẫu mô sẹo ban đầu. Sinh khối mô sẹo tăng sinh trên môi trƣờng bổ sung BA và 2,4- D có màu hơi nâu, hơi mềm và có hiện tƣợng hình thành chồi (hình 7b). Trên môi trƣờng có bổ sung 0,5 mg/l Kinetin và 2,4-D, trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo tăng liên tục từ 1,454 g lên 2,693 g khi tăng liên tục nồng độ 2,4-D từ 0,1 mg/l lên 0,7 mg/l. Mô sẹo hình thành trên môi trƣờng có Kinetin và 2,4-D có màu vàng trắng (TKD2) hoặc vàng hơi nâu (TKD1, TKD3 và TKD4). Hầu hết các mô sẹo đều ở dạng cứng chắc, tuy nhiên ở nồng độ 0,1 mg/l 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/l Kinetin callus có màu nâu và mềm (hình 7c). 0.000 1.000 2.000 3.000 4.000 5.000 6.000 7.000 TZD1 TZD2 TZD3 TZD4 TBD1 TBD2 TBD3 TBD4 TKD1 TKD2 TKD3 TKD4 Môi trường Trọng lượng tươi (g) Biểu đồ 2. So sánh ảnh hƣởng của TZD, BA, Kinetin kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh mô sẹo của hoa Anh thảo Auxin đƣợc sử dụng để tạo mô sẹo với từng loại và nồng độ thay đổi khác nhau và cũng tùy thuộc vào vật liệu nuôi cấy. Trong môi trƣờng nuôi cấy, auxin kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định và gây ra sự phát sinh phôi từ tế bào soma của huyền phù tế bào. Auxin riêng rẽ không đủ kích thích sự phân chia của các tế bào nhu mô của một vài loại cây, mà còn cần tới sự kết hợp với cytokinin. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Cytokinin có hiệu quả rất rõ trên sự phân chia tế bào. Khi không có cytokinin thì pha giữa của chu trình tế bào sẽ bị kéo dài nên cytokinin cần thiết trong sự điều hòa, sinh tổng hợp protein tế bào trong sự tăng trƣởng và phát triển của tế bào. Trong nuôi cấy mô, nếu lƣợng cytokinin không đủ thì sự phân chia của nhân tế bào sẽ bị chặn lại tại một giai đoạn trong chu trình tế bào. Ngƣời ta còn cho rằng sự phân chia tế bào trong mô sẹo khi không có sự hiện diện của cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy vẫn có thể diễn ra là do tế bào đã tự tổng hợp đƣợc auxin nội sinh (Lƣợng và Tiên, 2006). Trong thí nghiệm này, chúng tôi rút ra kết luận khi sử dụng môi trƣờng bổ sung 0,2 mg/l TDZ kết hợp với 0,3 mg/l và 0,5 mg/l 2,4-D cho tỷ lệ gia tăng mô sẹo tốt nhất. Hình 7. Ảnh hƣởng của 0,2 mg/l TDZ, 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l Kinetin kết hợp với 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l) lên khả năng tăng sinh mô sẹo của hoa Anh thảo. a) TDZ; b) BA; c) Kinetin Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 3.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA lên khả năng phát sinh chồi cây hoa Anh thảo in vitro Các mẫu mô sẹo đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng có bổ sung kết hợp giữa nồng độ BA và Kinetin với IBA và NAA khác nhau. Sự cảm ứng của mẫu mô sẹo đối với khả năng phát sinh chồi sau 6 tuần nuôi cấy đƣợc chúng tôi ghi nhận nhƣ bảng 3.4. Bảng 3.4. Khả năng phát sinh chồi từ mô sẹo của cây hoa Anh thảo trong môi trƣờng bổ sung BA, Kinetin kết hợp với IBA và NAA Nghiệm thức BA (mg/l) Kinetin (mg/l) IBA (mg/l) NAA (mg/l) Số lƣợng chồi Tỷ lệ tái sinh chồi (%) BI1 0,5 __ 0,1 __ 26,20 100 BI2 0,3 24,63 100 BI3 0,5 16,73 100 BI4 0,7 39,43 100 BN1 0,5 __ __ 0,1 30,00 100 BN2 0,3 30,80 100 BN3 0,5 28,70 100 BN4 0,7 25,57 100 KI1 __ 0,5 0,1 __ 16,38 100 KI2 0,3 15,18 100 KI3 0,5 17,08 100 KI4 0,7 19,40 100 KN1 __ 0,5 __ 0,1 18,77 100 KN2 0,3 26,56 100 KN3 0,5 21,36 100 KN4 0,7 9,63 100 Qua bảng 3.4, có thể nhận thấy trên tất cả các môi trƣờng có bổ sung BA và Kinetin kết hợp với IBA và NAA đều cho khả năng tái sinh chồi tối đa (100%) từ mẫu mô sẹo hoa Anh thảo. Tuy nhiên, số lƣợng chồi trong môi trƣờng bổ sung Kinetin và IBA có phần thấp hơn các môi trƣờng khác trong thí nghiệm. Khi bổ sung 0,5 mg/l Kinetin và 0,3 mg/l, 0,5 mg/l NAA số lƣợng chồi đạt đƣợc trên mỗi mẫu cấy tƣơng đối cao (KN3: 21,36 chồi; Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu KN2: 26,56 chồi) và đặc biệt chiều cao của các chồi thu đƣợc trong hai môi trƣờng này khá cao (hình 8). Khi tăng nồng độ của NAA từ 0,1 mg/l lên 0,3 mg/l số lƣợng chồi tăng lên đáng kể, và khi giảm nồng độ NAA thì số lƣợng chồi cũng giảm liên tục. Điều này cho thấy nồng độ thích hợp trong môi trƣờng để NAA kết hợp với 0,5 mg/l BA kích thích tạo chồi là khi có sự cân bằng giữa NAA và BA (môi trƣờng KN3) hay NAA có nồng độ cao hơn (môi trƣờng KN2). Môi trƣờng MS chứa 0,5 mg/l BA kết hợp với IBA tại các nồng độ khác nhau là môi trƣờng tốt nhất để phát sinh chồi từ mô sẹo của hoa Anh thảo. Số lƣợng chồi đạt đƣợc rất cao, đặc biệt tại nồng độ 0,7 mg/l IBA (39,43 chồi) và chồi có màu xanh (hình 8a). Đối với môi trƣờng có bổ sung 0,5 mg/l BA kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau, chúng tôi cũng thu đƣợc số lƣợng chồi khá cao, đặc biệt tại nồng độ 0,3 mg/l NAA (30,80 chồi) và chồi có màu trắng (hình 8b). Khi kết hợp BA với IBA số lƣợng chồi giảm dần khi nồng độ IBA tăng dần lên, cho đến khi tăng từ 0,5 mg/l đến 0,7 mg/l IBA thì số lƣợng chồi tăng cao lại (16,73 – 39,43 chồi). Khi kết hợp BA với NAA số lƣợng chồi giảm dần khi nồng độ của NAA giảm dần, tuy nhiên số lƣợng chồi giữa hai môi trƣờng KN1 và KN2 không khác biệt mấy (KN1: 30,00 chồi, KN2: 30,80 chồi). Sau khi khám phá ra Kinetin, Skoog và Miller (1955) đã chứng minh khúc cắt lõi hay mô sẹo thuốc lá tạo rễ hay chồi tùy theo tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trƣờng nuôi cấy. Tác động của auxin và cytokinin tƣơng tác với nhau, tỷ lệ auxin và cytokinin nghiêng về phía cytokinin thƣờng kích thích sự tạo chồi. Ngoài ra hai ông cho rằng còn tác động đến quá trình phát sinh chồi thông qua sự kiểm soát các quá trình sinh tổng hợp một số loại protein liên quan đến các nhân tố tăng trƣởng khác nhƣ auxin, ethylene, thiamin. Thêm cytokinin ngoại sinh vào môi trƣờng nuôi cấy sẽ làm thay đổi gradient hormone trong mẫu, đồng thời thiết lập một gradient hormone mới. Điều này giúp phá vỡ trạng thái ngủ và kích thích sự phát triển của chồi. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Trong thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng khi kết hợp BA hoặc Kinetin với IBA, nồng độ IBA càng tăng thì số lƣợng chồi càng tăng (BI4: 39,43 chồi, KI4: 19,40 chồi). Khi kết hợp BA hoặc Kinetin với NAA, tại nồng độ 0,3 mg/l NAA số lƣợng chồi tạo thành là lớn nhất (30,80 chồi; 26,56 chồi). Nồng độ NAA càng tăng, số lƣợng chồi tạo thành lại giảm đi. Vậy, nồng độ IBA thấp và NAA cao ức chế sự phát triển số lƣợng chồi. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 BI1 BI2 BI3 BI4 BN1 BN2 BN3 BN4 KI1 KI2 KI3 KI4 KN1 KN2 KN3 KN4 Số lượng chồi Môi trường Biểu đồ 3 So sánh ảnh hƣởng của BA, Kinetin kết hợp với IBA, NAA ở các nồng độ khác nhau lên sự hình thành chồi của hoa Anh thảo Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Hình 8. Ảnh hƣởng của 0,5 mg/l BA, 0,5 mg/l Kinetin kết hợp với IBA, NAA ở các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l) lên khả năng phát sinh chồi của hoa Anh thảo. a) BA và IBA; b) BA và NAA; c) Kinetin và IBA; d) Kinetin và NAA 3.5. Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của BA và Kinetin lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo in vitro Sau 4 tuần nuôi cấy, số lƣợng chồi và sự kéo dài chồi dƣới ảnh hƣởng của BA và Kinetin tại các nồng độ khác nhau đƣợc thể hiện trong bảng 3.5. Các chồi có kích thƣớc từ 1 cm trở lên đƣợc coi là có cảm ứng kéo dài chồi. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Bảng 3.5. Khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của cây hoa Anh thảo trong môi trƣờng có bổ sung BA và Kinetin Trong thí nghiệm này, chỉ khảo sát ảnh hƣởng của môi trƣờng MS có chứa BA hoặc Kinetin ở các nồng độ khác nhau lên sự tạo chồi và chiều dài chồi mà không bổ sung thêm auxin. BA và Kinetin đƣợc sử dụng với các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1,0 mg/l) nhằm kích thích sự tái sinh chồi và chiều dài chồi của hoa Anh thảo. Sau 6 tuần nuôi cấy, chúng tôi nhận thấy ở môi trƣờng MS có bổ sung BA với nồng độ càng tăng thì số lƣợng chồi càng nhiều, số lƣợng chồi nhiều nhất là 51,83 chồi ở nồng độ 1,0 mg/l, trong khi ở môi trƣờng MS có bổ sung Kinetin, nồng độ Kinetin càng tăng thì số lƣợng chồi càng giảm, số lƣợng chồi nhiều nhất là 19,27 chồi ở nồng độ 0,1 mg/l. Nhƣ vậy, các môi trƣờng có nồng độ BA cao và Kinetin thấp (nhƣ bảng 3.5) đã có tác dụng tạo ra chồi với số lƣợng lớn. BA có khả năng kích thích tạo nhiều chồi nhƣng lại không có khả năng kích thích kéo dài chồi. Sự cảm ứng kéo dài chồi khi chồi có kích thƣớc từ 1 cm trở lên, vì vậy BA ở nồng độ 0,1 mg/l là có khả năng kéo dài chồi nhất. Bên cạnh đó, Kinetin lại kích thích kéo dài chồi mạnh. Chồi có chiều cao nhất tại nồng độ 0,7 mg/l Kinetin, nhƣng độ dài chồi không đều. Tại nồng độ 0,3 mg/l Kinetin tạo ra chồi có chiều dài 1,06 cm, chồi xanh và đồng đều hơn (hình 9). Môi trƣờng BA (mg/l) Kinetin (mg/l) Số lƣợng chồi Chiều dài chồi (cm) B1 0,1 __ 2,11 1,00 B2 0,3 25,17 0,77 B3 0,5 39,43 0,83 B4 0,7 44,10 0,48 B5 1,0 51,83 0,34 K1 __ 0,1 19,27 1,53 K2 0,3 11,90 1,06 K3 0,5 17,00 1,03 K4 0,7 10,63 1,83 K5 1,0 11,80 1,18 Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 0 10 20 30 40 50 60 B1 B2 B3 B4 B5 K1 K2 K3 K4 K5 Môi trường S ố l ư ợ n g c h ồ i 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 C h iề u d à i c h ồ i (c m ) Số lượng chồi Chiều dài chồi (cm) Biểu đồ 4. So sánh ảnh hƣởng của BA, Kinetin ở các nồng độ khác nhau lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của hoa Anh thảo Có sự khác nhau giữa các nghiệm thức kéo dài chồi khi bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy BA hoặc Kinetin. Khi trong môi trƣờng nuôi cấy chỉ chứa BA. BA là một cytokinin điển hình nên nó cũng mang các đặc tính của cytokinin. Khi đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy nhân chồi thì nó phá vỡ trạng thái hữu miên của chồi ngọn và kích thích sự hoạt động của các chồi bên (Lƣợng và Tiên, 2002). Các chồi không thể phát triển chiều cao đƣợc, trong khi số lƣợng chồi trong môi trƣờng ngày càng nhiều. Có lẽ chính các chồi nhỏ khi tăng sinh thì sử dụng dinh dƣỡng từ môi trƣờng và cạnh tranh dinh dƣỡng với các chồi cao đang phát triển hay làm chậm sự hấp thụ dinh dƣỡng của các chồi cao nên tất nhiên sẽ làm các chồi này chậm lớn (Sedlak và Paprstein, 2007). Khi trong môi trƣờng chỉ chứa Kinetin thì số lƣợng chồi tạo thành ít hơn, điều này tạo thuận lợi cho quá trình kéo dài chồi bởi các chồi không phải cạnh tranh dinh dƣỡng, do đó các chồi hấp thụ đƣợc lƣợng dinh dƣỡng cần thiết và phát triển cao. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Rõ ràng ở các nghiệm thức kéo dài chồi thì các biến đổi hình thái rất khác nhau. Tùy theo mục đích thu nhận sau nuôi cấy mà chọn nghiệm thức thích hợp. Ở đây chúng tôi chọn các chồi thu đƣợc từ môi trƣờng chứa Kinetin và tiến hành cấy chuyền sang môi trƣờng cảm ứng rễ. Hình 9. Ảnh hƣởng của BA và Kinetin ở các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7; 1 mg/l) lên khả năng tăng sinh và kéo dài chồi của hoa Anh thảo. a) BA; b) Kinetin 3.6. Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của IBA và NAA lên sự tạo rễ của cây hoa Anh thảo in vitro Auxin kích thích sự ra rễ của chồi. Rất ít có loài thực vật nào có thể ra rễ ngay trên môi trƣờng nhân chồi vì cytokinin trong môi trƣờng cản quá trình tạo rễ. Do vậy, mẫu cấy cần phải chuyển sang môi trƣờng ra rễ riêng với sự hiện diện của auxin. Một số loài auxin thƣờng đƣợc dùng cảm ứng cho sự ra rễ là NAA, IAA, IBA. Thử nghiệm ảnh hƣởng của nồng độ IBA và NAA lên sự ra rễ của chồi hoa Anh thảo thu đƣợc kết quả sau 3 tuần nhƣ bảng 3.6. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Bảng 3.6. Khả năng tạo rễ từ chồi của hoa Anh thảo trong môi trƣờng có bổ sung IBA và NAA Môi trƣờng IBA (mg/l) NAA (mg/l) Tỷ lệ ra rễ (%) Số lƣợng rễ Chiều dài rễ (cm) RN1 0,5 __ 33,33 12 0,87 RN2 1,0 46,80 13,67 0,85 RI1 __ 0,5 54,18 11,33 1,29 RI2 1,0 70,22 20 1,43 Nhìn chung, trong tất cả các môi trƣờng chồi đều có khả năng tạo rễ. Môi trƣờng bổ sung NAA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l có khả năng tạo rễ kém (dƣới 50%), số lƣợng rễ không nhiều, chiều dài rễ ngắn. Khi tăng nồng độ NAA, chúng tôi nhận thấy tỷ lệ ra rễ và số lƣợng rễ có tăng lên nhƣng chiều dài rễ ngắn lại, điều này chứng tỏ NAA ở nồng độ cao sẽ ức chế quá trình kéo dài rễ của hoa Anh thảo. Trong khi môi trƣờng bổ sung IBA ở nồng độ 0,5 mg/l và 1 mg/l cho tỷ lệ ra rễ khá cao (trên 50%) và môi trƣờng có IBA ở nồng độ 1 mg/l (môi trƣờng RI2) cho tỷ lệ ra rễ cao nhất (70,22%). Số lƣợng rễ ở môi trƣờng RI1 thấp nhất trong tất cả các nghiệm thức của thí nghiệm nhƣng lại cho rễ có chiều dài hơn. Và khi tăng nồng độ IBA lên thì cả ba chỉ tiêu theo dõi là tỷ lệ ra rễ, số lƣợng rễ và chiều dài rễ đều tăng lên. Do đó, có thể nói việc tăng nồng độ IBA sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành rễ của hoa Anh thảo. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 0 10 20 30 40 50 60 70 80 RN1 RN2 RI1 RI2 Môi trường T ỷ l ệ r a r ễ ( % ) & S ố l ư ợ n g r ễ 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 C h iề u d à i rễ ( c m ) Tỷ lệ ra rể (%) Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Biểu đồ 5. So sánh ảnh hƣởng của IBA và NAA ở các nồng độ khác nhau lên khả năng tăng sinh trƣởng rễ của hoa Anh thảo Tỷ lệ auxin và cytokinin ảnh hƣởng lớn đến quá trình phát sinh cơ quan của mẫu cấy. Tỷ lệ nghiêng về phía auxin thƣờng kích thích quá trình ra rễ của chồi. Tỷ lệ nghiêng về phía auxin thƣờng kích thích quá trình ra rễ của chồi. Trong giai đoạn đầu của quá trình ra rễ, thƣờng xuất hiện các khối mô sẹo lớn ở gốc của mẫu cấy. Các khối mô sẹo này xuất hiện từ hiện tƣợng phản biệt hóa của một số tế bào ở phần giữa hoặc lân cận của mô dẫn truyền. Khối mô sẹo này nhanh chóng phát triển mạnh thành những khối mô sẹo màu trắng, lớn bao bọc xung quanh gốc cắt trong môi trƣờng thích hợp. Giai đoạn này đòi hỏi nồng độ auxin rất cao để thúc đẩy quá trình phản biệt hóa xảy ra mạnh mẽ. Sau đó, hai quá trình xuất hiện của mầm rễ và phát triển thành rễ hoàn chỉnh đòi hỏi nhu cầu auxin thấp hơn thậm chí bằng không. Trong giai đoạn cuối, nếu có auxin sẽ làm ức chế sự sinh trƣởng của rễ. IBA là auxin dễ bị biến tính và phân hủy trong môi trƣờng nuôi cấy. Nồng độ có thể giảm đi 60% sau 30 ngày nuôi cấy. Tốc độ phân hủy của IBA tăng lên ở điều kiện sáng và trong môi trƣờng MS (Nguyễn Đức Lƣợng, 2002). Nhƣ vậy, trong khoảng thời gian ra rễ, yêu cầu giảm dần nồng độ auxin trong môi trƣờng tƣơng đƣơng với mức giảm nồng độ IBA trong môi trƣờng. Yêu cầu này phần nào giải thích IBA là hormone thích hợp cho quá trình tạo rễ của chồi. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Hình 10. Ảnh hƣởng của IBA và NAA ở các nồng độ khác nhau (0,5; 1 mg/l) lên khả năng tăng sinh trƣởng rễ của hoa Anh thảo. a) IBA; b) NAA Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Hình 11. Cấu tạo giải phẫu chồi của hoa Anh thảo Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Hình 12. Hình chụp soi nổi mẫu mẫu mô sẹo hoa Anh thảo Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Hình 13. Hình chụp soi nổi chồi hoa Anh thảo Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Phần 4 KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 4.1. KẾT LUẬN Với việc khảo sát các thông số ảnh hƣởng lên quá trình phát sinh hình thái cây hoa Anh thảo, từ giai đoạn khởi tạo mô sẹo, hình thành chồi và tạo rễ, có thể thấy để thu đƣợc sinh khối với chất lƣợng tốt cần tới sự kết hợp của nhiều yếu tố nhƣ thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật, điều kiện ánh sáng, kích thƣớc mẫu cấy Sau khi tiến hành thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy điều kiện tốt nhất cho quá trình phát sinh hình thái cây hoa Anh thảo nhƣ sau:  Giai đoạn khởi tạo mô sẹo: Sự kết hợp giữa môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l TDZ kết hợp với 1 mg/l 2,4-D cho tỷ lệ tạo mô sẹo và trọng lƣợng tƣơi của mô sẹo tốt nhất trên lớp mỏng phát hoa cây Anh thảo. Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật truyền thống nhƣ 2,4-D, IBA, NAA đơn độc ít có khả năng kích thích hình thành mô sẹo.  Giai đoạn tăng sinh mô sẹo: Nguồn mô sẹo ban đầu tạo đƣợc từ mẫu lá nếu tiếp tục đƣợc cấy chuyền thì môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l TDZ kết hợp với 0,3 mg/l 2,4-D sẽ cho hiệu quả tăng sinh tốt nhất. Điều này cho thấy TDZ và 2,4-D kết hợp với nhau thực sự tiềm năng cho quá trình khởi tạo và tăng sinh mô sẹo.  Giai đoạn hình thành chồi: Sự kết hợp giữa 0,5 mg/l BA và 0,7 mg/l IBA cho số lƣợng chồi lớn nhất. Nhƣng khi kết hợp 0,5 mg/l BA và NAA ở các nồng độ khác nhau (0,1; 0,3; 0,5; 0,7 mg/l) đều cho số lƣợng chồi nhiều và đồng đều.  Giai đoạn kéo dài chồi: Sử dụng Kinetin ở các nồng độ khác nhau là rất thích hợp cho quá trình kéo dài chồi của hoa Anh thảo. Trong đó, Kinetin ở nồng độ 0,3 mg/l cho độ dài của chồi đồng đều nhất. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 4.2. ĐỀ NGHỊ Trải qua quá trình nghiên cứu, từ những kết quả đạt đƣợc cũng nhƣ những hạn chế và để định hƣớng cho các nghiên cứu trong tƣơng lai, chúng tôi có một số đề nghị sau:  Cần khảo sát thêm ảnh hƣởng của các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật khác.  TDZ là chất điều hòa sinh trƣởng có hoạt tính mạnh. Nó vừa là cytokinin và vừa là auxin, nên cần đƣợc khảo sát thêm ở các nồng độ khác nhau cũng nhƣ kết hợp với các chất điều hòa sinh trƣởng khác để có thể sử dụng hiệu quả trong nuôi cấy mô thực vật.  Cần nghiên cứu khả năng phát sinh hình thái của hoa Anh thảo từ các bộ phận khác nhau nhƣ lá, đế hoa.  Trong giới hạn thí nghiệm này, chúng tôi chỉ thí nghiệm và tìm ra môi trƣờng tối ƣu đối với một giống hoa. Vì vậy, chúng tôi hy vọng sẽ thí nghiệm thêm nhiều giống khác nhau của hoa Anh thảo nhằm tìm ra những môi trƣờng tốt hơn giúp gia tăng tỷ lệ tạo chồi nhằm đáp ứng nhu cầu và thị hiếu ngƣời dân.  Ngoài phƣơng pháp ra rễ in vitro, chúng tôi hy vọng có thể áp dụng thêm những phƣơng thức ra rễ ex vitro nhƣ ngâm các chồi đơn trong dung dịch chất kích thích sinh trƣởng nhƣ IBA, NAA ở những nồng độ khác nhau để tìm ra nồng độ và thời gian tối ƣu nhất. Đồng thời khảo sát trên nhiều giá thể để tạo điều kiện cho cây con ra rễ tốt nhất.  Sử dụng hệ thống thủy canh ở hoa Anh thảo cũng là một hƣớng tiếp cận mới giúp chúng ta tạo ra những cây con có tỷ lệ sống cao, chất lƣợng khỏe mạnh, sạch bệnh.  Khảo sát ảnh hƣởng của các điều kiện ngoại cảnh nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm để có thể trồng, chăm sóc cây hoa Anh thảo tốt hơn. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu Phần 5 TÀI LIỆU THAM KHẢO Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. DƢƠNG CÔNG KIÊN (2002). Nuôi cấy lớp mỏng thực vật tập 1, NXB. Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, trang: 7 – 17. 2. NGUYỄN THỊ XUÂN NGUYÊN (2004). Kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào và kỹ thuật vi thủy canh (Microponic) trong việc nhân giống và nâng cao chất lƣợng cây hoa chuông và cây bi bi, khóa luận cử nhân khoa học chuyên ngành Công nghệ sinh học nông nghiệp. Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh, trang: 1 – 20. 3. NGUYỄN ĐỨC LƢỢNG và LÊ THỊ THỦY TIÊN (2002). Công nghệ tế bào, NXB. Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh. 4. VŨ VĂN VỤ (1999). Sinh lý thực vật ứng dụng. NXB. Giáo dục, trang: 6- 64. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 5. AARTIJK, J. and BLOM-BARHOON G.J. (1994). Adventitious bud formation from buld-scale explants of Lilium speciosum Thumb. in vitro. Interacting effects of NAA, IBA, wounding and temperature, J. Plant Physiol., 116: 409 – 416. 6. BAJAJ, Y.P.S. and PIERIK, R.L.M. (1974). Vegetative propagation of Freesia through callus cultures, Neth. J. Agric. Sci., 22: 153 – 159. 7. BLAKESLEY, D., LENTON, J.R. and HORGAN, R. (1986). Int. Congr. Plant Tiss, Cell Cult., 6: 375. 8. BRIGGS, B.A., MC. CULLOCH, S.M. and EDICK, L.A. (1988). Micropropagation of azaleas using Thidiazuron, Acta Hort., 226: 205 – 208. 9. COUSSON A., TOUBART P. and TRAN THANH VAN K. (1989). Control of morphogenetic pathways in thin cell layers of tobacco by pH, Can. J. Bot., 67: 650 – 654. 10. EVERS (1984). Growth and morphogenesis of shoots initials of Douglas fir, Pseudotsuga mensiesu (Mirb) Franco in vitro, Diss. Agric. Univ. Wageningen, the Neitherlands, pp. 1 – 6. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 11. FELLMAN, C.D., READ, P.E. and HOSIER, M.A. (1987). Effects of Thidiazuron and CPPU on meristem formation and shoot proliferation, Hort. Sci., 22: 1197 – 1200. 12. FIOLA, J.A., HASSAN, M. and SWARTS, H.J. (1990). Effect of TDZ, light fluence rates and kanamycin on in vitro shoot organogenesis from excised Rubus cotyledon and leaves, Plan Cell Tiss. Organ. Cult., 20: 223 – 228. 13. GILL R., GERRATH J. and SAXENA P. K. (1992). High frequency direct embryogenesis in thin cell layer cultures hybrid seed Geranium pelargonium, Canada Journal of Botany, 71: 408 – 476. 14. HUETTEMAN, C.A. and PREECE, J.E. (1993). Thidiazuron – a potent cytokinin for woody plant tissue culture, Plan Cell Tiss. Org. Cult., 33: 105 – 119. 15. KIVIHARJU E., TUOMINEN U. and TORMALA T. (1991). The effect of explant material on somatic embryogenesis of Cyclamen persicum Mill, Plant Cell, Tiss. Org. Cult., 28: 187 – 194. 16. KOZAI, T., FUJIWARA, K., HAYASHI, M. and AITKEN-CHRISTIE J. (1992). The in vitro environment and its control in micropropagation, In: Transplant production systems. Kubota, K. and Kozai, T. (Eds). Kluwer Academic Plublishers, Dordrecht, pp. 247 – 252. 17. LE, B.V. and NHUT, D.T. (2000). Thin cell layer morphogenesis in ornamental species. In: Chadha, K.L., Ravindran, P.N., Leela, S. (Eds), Biotechlology in Horticultural and Plantation Crops Malhotra Publishing House, New Dehli, pp. 678 – 698. 18. LU, C.Y. (1993). The use of thidiazuron in tissue culture, In vitro Cell Dev. Bio- Plant, 29: 92 – 96. 19. MEYER, H.J. and VAN STADEN, J. (1987). Regeneration of Acacia melanoxylon plantlet in vitro, S. Afr. J. Bot., 53: 206 – 209. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 20. MOK, M.C., MOK, D.W.S. and AMSTRONG, D.J. (1982). Cytokinin activity of N – phenyl – N – 1,2,3 – Thidiazuron – 5 – yl – urea (thidiazuron), PhytoChemistry, 21: 1191 – 1196. 21. MURASHIGE, T. and SKOOG, F. (1962). A resvised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue cultures, Physiol. Plant, 15: 475 – 497. 22. NHUT, D.T., LE, B.V., JAIMES Da SILVA, A.T. and ASWATH, C.R. (2001). Thin cell layers culture system in Lilium: regeneration and transformation perspectives, In vitro Cell. Dev. Biol (Inpress). 23. NHUT, D.T., TEIXEIRA, J.A., SILVA, D.A., LE, B.V. and TRAN THANH VAN, K. (2003). Thin cell layer morphogenesis as a powerful tool in ornamental plant micropropagation and biotechnology. In: Nhut, D.T., Le, B.V., Tran Thanh Van, K., Thorpe, T. (Eds), Thin cell layer culture system, 247 – 284. 24. PIERIK, R.L.M. and SEGERS, T.H.A. (1972). In vitro culture of midrib explants of Gerbera: adventitious root formation and callus induction, Z. Pflanzephysiol., 69: 204 – 212. 25. PIERIK, R.L.M., STEEGMANS, H.H.M and VAN DER MEYS, J. (1974). Plantlet formation in callus tissues of Anthurium adreanum Lind, Scientia Hort. Cult., 2: 193 – 198. 26. PREECE, J.E. and IMEL, M.R. (1991). Plant regeneration from leaf explants of Rhododeron R.J.M. hybrids, Sci. Hort., 48: 159 – 170. 27. PREECE, J.E. and SUTTER, E.G. (1991). Acclimatization of micropropagated plants to the greenhouse and field. In Zimmerman D. (Ed), pp. 71 – 93. 28. ROBB, S.M. (1957). The culture of excised tissue from bulb scales of Lilium speciosum, J. Exp. Bot., 8: 348 – 352. 29. STEFANIAK, B. (1994). Somatic embryogenesis and plant regeneration of Gladiolus (Gladiolus hort), Plant Cell Rep, 13: 386 – 389. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu 30. TEIXEIRA DA SILVA, J.A. and FUKAI, S. (2003). Chrysanthemum organogenesis through thin cell layer technology and plant growth regulator control, Asian J. Plant Sci. 2: 505 – 514. 31. TRAN THANH VAN, M. (1973). In vitro control of de novo flower, bud, root and callus differentiation from excised epidermal tissues, Nature, 246: 44 – 45. 32. TRAN THANH VAN, M. (1974). Methods of acceleration of growth and flowering in a few species of orchids, Amer. Orchid Soc. Bull, 43: 699 – 707. 33. TRAN THANH VAN, K. and TRINH H. (1978). Morphogenesis in thin cell layer concept, methodology and result. In: Thrope, T (ed), Frontiers of plant tissue culture, International Association for Plant Tissue Culture, pp. 37-48. 34. TRAN THANH VAN, K. (1980). Control of morphogenesis by inherent and exogenously applied factors in thin cell layer, Int. Rev. Cytol., 11: 175 – 194. 35. TRAN THANH VAN, K. (1981). Control of morphogenesis in in vitro cultures, Ann. Rev. Plant Physiol., 32: 291 – 311. 36. TRAN THANH VAN, K. and MUTAFTSCHIEV, S. (1990). Signals influencing cell elongation, cell anlargment, cell division and morphogenesis. In: Nijkam, H.J.J., Van Der Plas, L.H.W. and Aartif, J. (Eds), Progress in plant cellular and molecular biology, Kluwer Academic, pp. 514 – 519. 37. TRAN THANH VAN, K. and GENDY, C. (1996). Thin cell layer (TCL) method to programme morphogenetic patterns, Plant Tiss. Cult. Mannual, 144: 1 – 25. 38. TRAN THANH VAN, K. (2003). Thin cell layer concept. In: Nhut, D.T., Le, B.V., Tran Thanh Van, K. and Thorpe, T. (Eds), Thin cell layer culture system Regeneration and transformation applications, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht., pp. 1 – 11. 39. VAN NIEUWKERT, J.P., ZIMMERMAN, R.H. and FORDHAM, I. (1986). Thidiazuron stimulation of apple shoot proferation in vitro. HortScience, 21: 516 – 518. Khóa Luận Tốt Nghiệp – 09 Hoàng Trần Minh Thu PHỤ LỤC Thành phần môi trƣờng khoáng của Murashige và Skoog (1962) Khoáng đa lƣợng mg/l mM NH4NO3 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O KH2PO4 1650 1900 440 370 170 20,6 18,8 3,0 1,5 1,25 Khoáng vi lƣợng mg/l µM KI H3PO3 MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O NaMoO4.2H2O CuSO4.5H2O CoCl2.6H2O Na2.EDTA FeSO4.7H2O 0,83 6,20 22,30 8,60 0,25 0,025 0,025 37,30 27,80 5,0 100 100 30 1,0 0,1 0,1 100 100 Vitamin và các chất hữu cơ khác myo-Inositol Nicotinic acid Pyridoxine HCl Thiamine HCl Glycine 100 0,5 0,5 0,1 2,0 555 4 2,5 0,3 27