Khóa luận Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur TP hồ Chí Minh sản xuất

Phần 1. MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Vi nấm (Fungi) và độc tố vi nấm (Mycotoxin) là vấn đề rất quan trọng trong công tác bảo quản nông sản, thực phẩm và trong y tế. Gần 400 độc tố vi nấm được phát hiện cho đến nay [18], trong đó, aflatoxin là độc tố được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất. Aflatoxin là tên gọi một nhóm chất độc, sản phẩm của quá trình trao đổi chất của một số loài nấm mà chủ yếu là loài Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus…. Trong đó, phổ biến nhất và độc nhất là aflatoxin B1, G1, B2 và G2, có thể gây bệnh ở mức vi lượng. Đối với động vật nuôi (gà, vịt, lợn…), aflatoxin gây bệnh nhiễm độc Aflatoxicosis, rất phổ biến, đặc biệt các nước nhiệt đới. Bệnh làm vật nuôi kém phát triển, sức sản xuất giảm, dễ mẫn cảm với các bệnh truyền nhiễm, bị ung thư và thậm chí bị chết. Do đó, hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi bị ảnh hưởng nghiêm trọng, chịu nhiều tổn thất lớn. Đối với người, đáng chú ý là khả năng gây ung thư gan và dị tật thai do aflatoxin nhiễm từ sữa mẹ truyền cho con. Aflatoxin có ảnh hưởng nghiêm trọng như vậy nhưng lại rất khó để loại bỏ vì aflatoxin hiện diện ở khắp nơi trong môi trường lại khó bị phân huỷ bởi nhiệt. Do vậy, việc nghiên cứu tìm ra các phương pháp phân tích tối ưu nhằm phát hiện aflatoxin trong thực phẩm và nguyên liệu thực phẩm là điều cần thiết. Quy trình phân tích aflatoxin thường phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch, cô đặc, cùng với việc định tính và định lượng aflatoxin bằng các phương pháp như: sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng (TLC), sắc kí lỏng cao áp (HPLC) dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Trước những khó khăn trên, sắc kí ái lực miễn dịch (immuno-affinity chromatography-IAC) ra đời, sử dụng trong công đoạn tinh sạch và cô đặc mẫu đồng thời, dựa trên nguyên lí gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tạo khả năng chọn lọc cao mà các phương pháp khác không có được; quy trình chiết và tinh chế aflatoxin của phương pháp IAC lại đơn giản đã đáp ứng được nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích. Trong số các aflatoxin, aflatoxin B1 được chú ý nhiều nhất do sự hiện diện rộng khắp nhất cũng như do tính độc ngắn hạn và dài hạn của aflatoxin B1 cao hơn nhiều so với các aflatoxin khác. Từ những cơ sở trên, viện Pasteur Tp. Hồ Chí Minh đã tiến hành thực hiện đề tài Sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt aflatoxin B1. Giá (cột) sắc kí ái lực tạo nên đã cho hiệu quả cao trong phân tích định lượng aflatoxin B1. Bên cạnh đó, aflatoxin G1 là độc tố vi nấm chỉ đứng sau aflatoxin B1 về độc tính, cũng có khả năng gây hại cao cho người và vật nuôi, hơn nữa cấu trúc hoá học lại khá tương đồng với aflatoxin B1 nên cũng là một đối tượng quan trọng cần tiến hành nghiên cứu. Được sự phân công của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, sự hướng dẫn của PGS. TSKH Nguyễn Lê Trang - Viện Pasteur, Tp. Hồ Chí Minh và TS. Nguyễn Ngọc Hải, tôi tiến hành đề tài “Đánh giá khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch do Viện Pasteur Tp.HCM sản xuất”. Mục đích Khảo sát khả năng bắt aflatoxin G1 của cột ái lực miễn dịch. Yêu cầu Xác định các đặc tính của cột ái lực miễn dịch trong việc bắt aflatoxin G1: Độ nhạy của cột Độ lặp lại của cột Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đại cương về aflatoxin 2.1.1 Lịch sử phát hiện Năm 1960 ở Anh, một vụ dịch bệnh xảy ra làm chết 100.000 gà tây con, khi mổ xác thấy có xuất huyết hoại tử ở gan kèm tổn thương ở thận mà nguyên nhân không được biết rõ. Do đó, người ta gọi là bệnh “X” của gà tây. Sau đó, những vụ tương tự cũng được quan sát thấy trên vịt con ở Áo, gà giò ở Tây Ban Nha, cá hồi ở Mỹ, trĩ con ở Uganda…Các nhà bác học đã nhanh chóng tìm ra mối liên hệ giữa các vụ ngộ độc đó với việc cho ăn khô dầu đậu phộng và họ cũng thấy rằng bệnh này không những xảy ra đối với gia cầm mà còn với cả gia súc, đặc biệt là heo, bê, cừu… Với những cố gắng phát hiện nguồn độc tố trên các thực phẩm có liên quan, các nhà bác học đã quan sát và phân lập được loài vi nấm Aspergillus flavus trên các hạt đậu mốc và lúa mì mốc. Việc tinh chế các độc tố từ các loại hạt bị nhiễm nấm Aspergillus cho ra một loại hợp chất mà trong bản báo cáo của Forgacs và Carl xuất bản năm 1962, người ta gọi là aflatoxin (A: Aspergillus, fla: flavus và toxin có nghĩa là chất độc). Đến nay, aflatoxin được biết là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp qua con đường polyketide của một số loài nấm thuộc chủng Aspergillus flavus (khoảng 50% chủng), Aspergillus parasiticus (100% chủng) (Klick và Pitt, 1988)[4], Aspergillus nomius; ngoài ra còn có Penicillium spp, Rhizopus spp nhưng ít có vai trò gây bệnh trong thực tế. Ở A. flavus và A. parasiticus, con đường sinh tổng hợp aflatoxin liên quan ít nhất 16 phản ứng enzyme được mã hóa bởi 25 gen tập trung thành nhóm trong một vùng DNA 70 kilobase trên nhiễm sắc thể [19]. (1) (2) Hình 2.1: A. flavus (1) [20] và A. parasiticus (2) [21]. Việc khám phá ra aflatoxin đã kích thích các nhà khoa học nhiều ngành tập trung nghiên cứu về tất cả các mặt của aflatoxin và ảnh hưởng của nó tới sức khoẻ của con người và động vật. 2.1.2 Phân loại Có thể nói Sargeant (1962) là người có công xác định các độc tố này. Chúng là các chất có cấu trúc hoá học rất gần nhau và có khung hoá học giống với dẫn xuất của cumarin nên gọi là flavacumarin. Phân tử aflatoxin gồm một gốc cumarin, 2 nhân furan và 1 vòng lacton [11]. Hiện người ta biết có đến 20 loại aflatoxin (Quinn, 1998)[4]. Các aflatoxin được sản xuất trong tự nhiên gồm 4 loại, kí hiệu AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 (được gọi tên do tính chất phát huỳnh quang dưới tia UV: B: Blue; G: Green). Aflatoxin nhóm B và nhóm G khác nhau ở chỗ nhóm B chỉ có 1 nhóm chức lacton trong khi nhóm G có 2 chức lacton. F: Vòng furan C: Vòng cumarin L: Vòng lactone P: Vòng pentenone Hình 2.2: Cấu trúc hoá học của AFB1 và AFG1. Các loại aflatoxin khác là do sự chuyển hoá của các aflatoxin trên trong nấm và trong cơ thể động vật. AFB2 và AFG2 là dẫn xuất hydro hoá của AFB1 và AFG1. AFB2a và AFG2a là dẫn xuất hemiacetal của AFB1 và AFG1. AFM1 và AFM2 là dẫn xuất của AFB1 và AFB2 tìm thấy trong sữa, thận và gan động vật. Ngoài ra: AFGM1, AFGM2, AFM2a, AFGM2a, AFB3 (parasiticol), dihydroaflatoxin B3, Ro (aflatoxicol), dihydoaflatoxicol, AFP1, AFQ1… Hình 2.3 : Cấu trúc hoá học của các aflatoxin. 2.1.3 Tính chất hóa lí Aflatoxin dễ bị huỷ bởi những chất kiềm, nhưng tương đối bền với nhiệt. Ở nhiệt độ cao hơn 100oC chỉ khử được phần nào aflatoxin. Aflatoxin ít tan trong nước, tan trong các dung môi phân cực như: chloroform, acetonitril, aceton, methanol… Aflatoxin không tan trong những dung môi hòa tan chất béo như n-hexan, ether ethylic, ether dầu hoả… Hầu hết các loại aflatoxin đều phát huỳnh quang ở khoảng bước sóng 440 nm khi kích thích bởi ánh sáng có độ dài sóng khoảng 365 nm [10]. Các đặc tính lí hóa được trình bày trong phụ lục 1. 2.1.4 Tác động sinh học Aflatoxin là chất độc nguy hiểm đối với các loài gia súc, gia cầm và con người. Tuy nhiên, mức độ độc hoàn toàn khác nhau, phụ thuộc vào giống loài, lứa tuổi, giới tính, đường xâm nhập, trạng thái sức khoẻ của cơ thể, môi trường và hàm lượng chất độc ăn phải. Hấp thu qua đường tiêu hoá là giai đoạn đầu tiên của sự xâm nhập AFB1 vào cơ thể với 3 kiểu hấp thu qua niêm mạc ruột: khuyếch tán, hoà tan trong lipid và vận chuyển nhờ protein mang. Sau đó, AFB1 được vận chuyển trong hệ tuần hoàn nhờ liên kết với các tế bào máu hoặc protein huyết tương (90% ở dạng liên kết với albumin). Sau khi vào gan qua hệ thống tĩnh mạch cửa, AFB1 tập trung chủ yếu ở gan [11]. Tại đây, AFB1 có sự chuyển hóa phức tạp: Hình 2.4: Các sản phẩm chuyển hoá cuả AFB1 [13]. Các chất chuyển hóa được cơ thể cố gắng bài thải, như: AFM1 và AFM2 qua sữa; AFP1 và AFQ1 qua nước tiểu. Đáng kể, dưới xúc tác của hệ enzyme monooxygenase trong cytochrome P450 (CYP 450) rất phong phú ở tế bào gan, chất tạo thành là AFB1-8,9-epoxide được coi như chất biến dưỡng có hoạt tính rất cao, có thể gắn với các đaị phân tử (DNA, RNA và protein) làm rối loạn hoạt động bình thường của tế bào (Swenson, 1975). 2.1.4.1 Độc tính cấp của aflatoxin Nhiễm độc cấp tính khi ăn phải một lượng lớn aflatoxin. Thú non mẫn cảm hơn thú trưởng thành, gia cầm mẫn cảm hơn gia súc, được biểu hiện theo thứ tự sau: Vịt > gà tây > ngỗng > ngan > gà > chó > heo > bò > ngựa > cừu (Allcroft, 1962) [11]. Tính gây độc cấp thể hiện qua liều gây chết 50% (LD50). Bảng 2.1: LD50 của AFB1 cho uống một lần duy nhất trên động vật (Ciegler, 1975) [2] Loài động vật (Xếp theo thứ tự mẫn cảm) LD50 (mg/ kg thể trọng) Vịt con 0,3-0,6 Heo 0,6 Cá hồi 0,8 Chó 1,0 Chuột lang 1,4-2,0 Cừu 2,0 Khỉ 2,2 Chuột cống 5,5-17,9 Gà 6,3 Chuột bạch 9,0 Theo bảng trên và bảng xếp loại các độc chất dựa vào liều LD50 trên động vật (xem phụ lục 2), có thể thấy aflatoxin thuộc nhóm độc tố cực độc. Triệu chứng nhiễm độc thể hiện qua sự tổn thương ở gan và triệu chứng thần kinh như nằm liệt và co giật. Chết có thể xảy ra đột ngột sau một thời gian ngắn, thường dưới 72 giờ. Giải phẫu bệnh cho thấy hoại tử và chảy máu ở nhu mô gan, viêm tiểu cầu thận cấp, tụ máu ở phổi [11]. Nguyên nhân gây chết là do gan bị huỷ hoại rất nhanh (necrosis) theo cơ chế phân tử: Hình 2.5: Cơ chế tác dụng của AFB1 ở mức tế bào gan (Cliford and Rees, 1967) [5] Ở đây, nhóm Dialdehyd phản ứng với nhóm amin của protein để tạo thành kiềm Shiff (Shiff’s base). Các kiềm Shiff có thể ức chế sinh tổng hợp DNA, RNA dẫn đến ngăn cản tổng hợp protein làm cho hoạt động ở gan bị rối loạn tạo nên tình trạng nhiễm độc cấp tính. Như vậy, AFG1 cũng có thể tạo thành kiềm Shiff do cũng mang liên kết đôi ở vị trí 8,9 ở đầu cùng trên vòng furan. Liên kết này được bão hoà trong cấu trúc của AFB2 và AFG2, do đó, không thể trực tiếp tạo thành kiềm Shiff nên mang tính độc ít hơn so với AFB1 và AFG1[5]. 2.1.4.2 Độc tính mãn Thường xảy ra nhiều hơn so với nhiễm độc cấp tính và có tác động dài hơn do cơ thể có thể chịu đựng được một mức nào đó trong khẩu phần. Khi có sự nhiễm độc mãn tính, các triệu chứng thấy được là kém ăn và chậm lớn; gan chịu ảnh hưởng nhiều nhất: gan tụ huyết, xuất huyết. Khi kiểm tra vi thể thì xuất hiện sự thoái hoá tế bào biểu mô, thoái hoá mỡ gan, tế bào lympho bị thâm nhiễm. Nhiễm độc kéo dài sẽ gây đột biến, ung thư gan. Nếu nhiễm aflatoxin trong thời kì mang thai, thai sẽ bị tật, chết hoặc sinh quái thai (Nguyễn Lê Trang, 2003) [2]. Năm 1988, IARC đã xếp AFB1 vào danh sách những tác nhân gây ung thư cho người, đặc biệt là ung thư gan [22]. Nếu hấp thu 2,5 mg aflatoxin trong 89 ngày sẽ thấy xuất hiện ung thư gan sau một năm. Tại Việt Nam đã có công trình nghiên cứu tìm aflatoxin trong dịch cổ trướng bệnh nhân ung thư nguyên phát đều có hàm lượng từ 1,1 – 3,5 ppb [13]. Cơ chế phân tử của nhiễm độc mãn tính: Hình 2.6: AFB1-8,9-epoxide gắn vào DNA (Smela và ctv, 2001) [14]. AFB1-8,9-epoxide gắn kết đồng trị lên DNA ở vị trí N7 của một guanine. Do cầu nối glycoside mất ổn định, nhóm purine có thể bị tách khỏi DNA. Hoặc khả năng khác là vòng imidazole trong cấu trúc purine bị mở ra thành cấu trúc formamidopyrimidine (AFB1-FAPY) ổn định và tồn tại trong điều kiện sinh học. Các điểm đột biến do AFB1 thường nhận thấy là sự đảo chuyển GCà TA (dị hoán). Điểm nóng của đột biến đã được phát hiện là ở vị trí thứ ba trong đơn vị mã (codon) 249 của gen p53. Gen này mã hoá cho một phosphoprotein có hoạt tính tăng cường hoặc kiềm chế phiên mã của một số gen có chức năng kiểm soát chu trình nhân lên của tế bào, để ngăn ngừa tế bào tăng sinh thành tổ chức bất thường, có thể dẫn đến hình thành u. Khi cấu trúc DNA bị biến đổi, tế bào phản ứng lại bằng cách thể hiện nhiều phosphoprotein p53 để ức chế sự sao chép của DNA bị biến đổi. Nếu thời gian sửa chữa lại DNA kịp thời (do một số enzyme) trước khi DNA biến đổi được sao chép, bảo tồn di truyền được ổn định. Các chất độc di truyền tác động trực tiếp hay gián tiếp đều làm tăng mức protein p53 tế bào. Khi AFB1 tác động vào gen p53 làm protein p53 bị biến đổi, mất hoạt tính, hậu quả là tế bào tăng trưởng không kiểm soát dẫn đến hình thành khối u (Bennett và Klich, 2003) [14]. Liên quan giữa nhiễm siêu vi viêm gan B (HBV), ung thư tế bào gan và vai trò của p53 cũng đã được khảo sát và nghiên cứu nhiều. Với bệnh nhân trong nước tiểu có AFB1-N7-Gua, tỉ lệ phát ung thư tế bào gan cao hơn 3 lần so với trường hợp âm tính. Với bệnh nhân có kháng nguyên bề mặt HbsAg trong huyết thanh, tỉ lệ này là 6 lần cao hơn bệnh nhân âm tính HbsAg. Và nếu xuất hiện cả AFB1-N7-Gua và HbsAg, tỉ lệ này cao gấp 60 lần [14]. 2.1.5 Sự hiện diện của aflatoxin trong thực phẩm Theo tài liệu của FAO, không có thực phẩm nào được xem như an toàn tuyệt đối khỏi sự nhiễm độc tố vi nấm, và sự nhiễm độc tố này xảy ra ở mọi giai đoạn từ lúc cây trồng còn ở ngoài đồng đến khi thu hoạch, chế biến, bảo quản và vận chuyển. Và theo ước tính của FAO, hơn 25% sản phẩm nông nghiệp trên thế giới bị nhiễm độc tố vi nấm [4]. Hầu hết các số liệu liên quan cho thấy sự nhiễm aflatoxin thường xảy ra nhất ở đậu phộng và các sản phẩm từ đậu phộng, bắp và các loại hạt khác như gạo, lúa mì, đậu nành, hạt bông vải… Theo Carlos A. Muro-Cacho (2004), sự tiêu thụ aflatoxin của con người từ 0 – 30000 ng/kg/ngày, trung bình từ 10 – 200 ng/kg/ngày [15]. Nước ta có điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm thích hợp cho sự phát triển vi nấm và sản sinh độc tố trong thực phẩm, nhất là aflatoxin. Do đó, vấn đề an toàn thực phẩm được đặt ra nhằm hạn chế những thiệt hại về kinh tế (gây chết đàn vịt, gà, lợn…) cũng như bảo đảm an toàn thực phẩm cho người, vì những dạng chuyển hóa của aflatoxin còn độc tính vẫn có thể hiện diện trong gan, sữa, trứng, là những thức ăn hằng ngày của người. 2.1.6 Giới hạn về hàm lượng aflatoxin trong thực phẩm và thức ăn gia súc Aflatoxin hiện diện trong thực phẩm như là một sự nhiễm bẩn tự nhiên nên con người không thể kiểm soát để ngăn chặn chúng. Dựa vào nhiều yếu tố như: số liệu giám sát, sự phân bố aflatoxin trong thực phẩm, dữ liệu về độc chất học, phương pháp phân tích và tiêu chuẩn cho phép của các quốc gia có quan hệ mua bán với nhau mà từng quốc gia, từng khu vực trên thế giới ra các quy định giới hạn hàm lượng aflatoxin tổng cộng tối đa cho phép trong các loại thực phẩm và thức ăn gia súc khác nhau. Bảng 2.2: Quy định hạn chế mức nhiễm aflatoxinB1 trong thực phẩm ở Pháp [14] Loaị thực phẩm Đối tượng sử dụng Giới hạn (ppb) Sữa nước Trẻ em < 3 tuổi 0,03 Sữa bột Trẻ em < 3 tuổi 0,3 Sữa nước Thông dụng 0,05 Sữa bột Thông dụng 0,5 Dầu ăn và các chất béo 5 Thực phẩm Trẻ em và thiếu niên 1 Thực phẩm Các loaị 10 Ở Việt Nam, giới hạn về hàm lượng aflatoxin cho phép có trong thực phẩm hiện đang áp dụng theo Danh mục tiêu chuẩn vệ sinh đối với lương thực, thực phẩm ban hành kèm theo quyết định số 867/1998 / QĐ-BYT. Bảng 2.3: Giới hạn nhiễm độc tố vi nấm trong thực phẩm ở Việt Nam STT Tên độc tố vi nấm Sản phẩm Giới hạn nhiễm tối đa cho phép (ppm) 1 Aflatoxin tổng số hoặc B1 Thức ăn 10 2 Aflatoxin M1 Sữa 0.5 3 Các độc tố vi nấm khác Thức ăn 35 Bảng 2.4: Hàm lượng tối đa aflatoxin trong thức ăn hỗn hợp cho gia súc, gia cầm. Loại vật nuôi AFB1 (ppb) AFT tổng (ppb) Gà con từ 1-28 ngày tuổi 20 30 Nhóm gà còn lại 30 50 Vịt con từ 1-28 ngày tuổi Không có 10 Nhóm vịt còn lại 10 20 Lợn con theo mẹ từ 1-28 ngày tuổi 10 30 Nhóm lợn còn lại 100 200 Bò nuôi lấy sữa 20 50 (Ban hành theo quyết định số 104/2001 QD-BNN của Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn ngày 31-10-2001). Các phương pháp phân tích aflatoxin 2.2.1 Phương pháp sinh vật học Phương pháp này đã được sử dụng đầu tiên, chủ yếu dựa vào tính mẫn cảm của một số loài sinh vật được thử nghiệm với aflatoxin. Đây là phương pháp định tính hay bán định lượng, không chuyên biệt đối với từng độc tố nhưng đơn giản và dễ thực hiện. Thử nghiệm độc tính trên phôi gà (Chicken Embryo Bioassay): Chiết mẫu bằng chloroform cô đặc có nồng độ khoảng 200-300 ng/ml, sau đó tiêm vào buồng khí hoặc lòng đỏ của trứng gà Leghorn trắng đã thụ tính và ấp trong 5 ngày, phôi gà sẽ chết trong vòng 2 ngày nếu có aflatoxin. Thử nghiệm này đã được đưa vào tiêu chuẩn AOAC [10]. Ngoài ra, độc tính của aflatoxin còn được thử nghiệm trên vịt con mới sinh, ấu trùng của loài giáp xác, tế bào động thực vật nuôi cấy, trên vi khuẩn Bacillus megaterium, trên cá hồi…[10] 2.2.2 Phương pháp phân tích hóa lí Các phương pháp này dùng phát hiện và định lượng aflatoxin nhanh, chính xác và có tính chuyên biệt cao hơn so với phương pháp sinh học; hiện nay được dùng chủ yếu trong các phòng thí nghiệm. Các giai đoạn cơ bản: Lấy mẫu Chiết aflatoxin Tinh chế aflatoxin Cô đặc mẫu Phát hiện và định lượng aflatoxin Lấy mẫu Mục đích: Lấy mẫu đại diện cho lô hàng hay đối tượng khảo sát. Thông thường, tuỳ theo loại thực phẩm và khối lượng thực phẩm cần phân tích, việc lấy mẫu được thực hiện từ nhiều vị trí khác nhau với những lượng khác nhau. Các mẫu này được tiến hành đồng nhất và từ mẫu đồng nhất này, một lượng thích hợp sẽ được trích ra để tiến hành phân tích aflatoxin, thường từ 20-100g tuỳ thuộc vào loại thực phẩm và hàm lượng aflatoxin cao hay thấp trong mẫu. Chiết aflatoxin Mục đích: Tách aflatoxin cần tìm từ khối mẫu gồm nhiều chất phức tạp. Sự lựa chọn dung môi cho việc chiết mẫu tuỳ thuộc vào tính chất hóa học của aflatoxin cũng như tính chất của các thành phần khác. Đối với mẫu có thành phần béo từ 5% trở lên, sử dụng các dung môi: hexane, petrolium ether, ethyl dioxide, pentane hoặc isooctane nhằm tách chất béo trước khi tiến hành chiết aflatoxin. Chiết aflatoxin: do aflatoxin tan được trong các dung môi hơi phân cực và không tan trong những dung môi phân cực cao, nên chúng thường được chiết với các dung môi hữu cơ như dichloromethane, benzene, acetonitril, acetone, chloroform, hay methanol. Thông thường, hỗn hợp dung môi hoặc những dung môi với một lượng nhỏ nước và acid được thấy là hữu hiệu nhất. Trong khi độ hoà tan của aflatoxin trong nước thấp, dung môi có nước có thể thấm vào các mô ưa nước làm cho sự chiết tách hữu hiệu hơn. Quá trình này có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng bằng cách lắc thông thường trong 30 phút hoặc dùng máy xay tốc độ cao trong 1-3 phút. Một số phương pháp chiết: Chiết bằng dung môi chloroform-Phương pháp EEC (European Economic Community) Chiết bằng dung môi methanol - Phương pháp BF (Best Food) - Phương pháp VICAM Làm sạch mẫu Mục đích: Loại bỏ các hợp chất khác có thể hiện diện cùng aflatoxin trong dịch chiết mẫu để tránh ảnh hưởng đến việc xác định aflatoxin cũng như việc tạp chất sẽ làm bẩn cột, mất thời gian rửa cột và làm giảm tuổi thọ của cột. Các kĩ thuật làm sạch Tủa các tạp chất không mong muốn: thường dùng để làm sạch các dịch chiết có nguồn gốc thực vật. Các hoạt chất dùng là các muối kim loại nặng, ví dụ Pb(CH3 COO)2, AgNO3, Zn(CH3 COO)2, CuCO3… Phương pháp chiết pha lỏng-lỏng: thực hiện trong phễu chiết bằng cách chuyển aflatoxin từ dung môi chiết (acetone hay methanol) vào dung môi khác (ví dụ như chloroform). Loại tạp bằng sắc kí hấp phụ: Kĩ thuật này hiện nay đã được phát triển và dùng rất nhiều do ưu điểm dễ sử dụng và hiệu quả loại tạp rất tốt trên nhiều loại mẫu khác nhau. Ví dụ, cột chiết xuất pha rắn SPE (solid-phase extraction) được chế tạo sẵn chứa các chất nhồi LC-CN có khả năng bắt tốt các aflatoxin ở hàm lượng thấp. Thể tích đưa vào cột rất ít (1-3ml), khả năng loại tạp rất cao, thích hợp cho phân tích bằng HPLC [12]. Tuy vậy, với những giá rắn từ các chất không phân cực như: C18, C8, C2, cyclohexyl, phenyl, florisil…liên kết với aflatoxin hoặc với các tạp chất theo cơ chế kỵ nước không có tính chọn lọc, phân giải kém trong nhiều trường hợp, và không lý tưởng khi aflatoxin chiếm tỉ lệ nhỏ so với tạp chất [14]. Cô đặc mẫu Chất chiết sau khi được làm sạch thường được cô đặc bằng cách cho bốc hơi trong máy cô quay (Rotary Evaporator) dưới áp suất thấp hoặc dùng nồi chưng cách thủy dưới luồng khí nitơ nhẹ. Cặn được hòa tan vào một lượng thể tích nhỏ trước khi qua giai đọan xác định. Phát hiện và xác định hàm lượng Các phương pháp sắc kí thường được sử dụng, dựa trên nguyên tắc phân tách giữa 2 pha: pha tĩnh và pha động (lỏng hoặc khí) khi cho chất cần tách qua lớp sắc kí. Pha tĩnh có tính liên kết với aflatoxin làm chậm sự di chuyển của các chất (do các đặc điểm lí hóa khác nhau) nên tạo ra sự phân biệt giữa chúng. Bảng 2.5: Các phương pháp sắc kí trong phân tích aflatoxin. Phương pháp sắc kí Nguyên tắc Ưu điểm Nhược điểm Sắc kí cột nhỏ (Minicolumn) Cột thủy tinh hay PE có Ø= 5-6 mm, dài khoảng 20 cm được nhồi các lớp chất có tính hấp phụ độc tố: alumina, silicagel và florisil. Calcium sunphate có tính giữ nước được nhồi ở hai phía đầu. Cho mẫu chiết vào cột, chảy qua cột nhờ trọng lực. Lớp chất hấp phụ sẽ giữ AFT lại và ta phát hiện được khi cho cột chiếu dưới đèn UV λ= 365 nm, có vết huỳnh quang màu xanh tím ở lớp florisil. So sánh với một cột chuẩn chứa lượng AFT đã biết, ta có thể đánh giá mẫu chứa AFT ít hay nhiều hơn so với chuẩn. tốn ít thời gian: 15-30 phút. không cần thiết bị phức tạp, đắt tiền. có thể dùng tiện lợi trên hiện trường thích hợp ở các nước đang phát triển là phương pháp bán định lượng nhanh nhằm đánh giá sơ bộ. kém nhạy, mức phát hiện khá cao: 20 ppb. Không phân biệt các AFT khác nhau. Sắc kí lớp mỏng (TLC) (TLC Pha tĩnh là một lớp mỏng chất có tính hấp phụ, thường là silicagel, được phết lên một bản mỏng (nhôm hoặc nhựa). Pha động là dung môi chứa chất cần khảo sát được cho chạy qua lớp mỏng chất hấp phụ nhờ lực mao quản. Dịch chiết được chấm lên bản mỏng thành các đốm với thể tích thường là 2, 5, 10 µl; đốm chuẩn cũng được nhỏ lên cùng bản mỏng. Sau đó, bản mỏng được cho vào dung môi khai triển để các đơn chất trong hỗn hợp có thể tách rời nhau khi di chuyển bằng lực mao quản. Việc phát hiện và định lượng tiến hành dưới tia UV có λ= 365nm. Dùng máy densitometer hay mắt để so sánh cường độ sáng của các đốm mẫu và đốm chuẩn, từ đó suy ra nồng độ aflatoxin trong mẫu. tương đối đơn giản thường sử dụng nhất ở các nước đang phát triển và trong các phòng thí nghiệm. khá rẻ tiền so với HPLC. Độ nhạy khá cao: 0,5-5 ppb. kĩ thuật TLC 2 chiều cho kết quả rất tốt và mức phát hiện cũng thấp, có thể so sánh với HPLC. mang tính bán định lượng. kết quả phụ thuộc vào người phân tích. độ chính xác không cao do lệ thuộc vào mắt người đọc. Densitometer cho độ chính xác cao hơn nhưng không thông dụng cho các phòng thí nghiệm địa phương. sai số khoảng 30%. Sắc kí lỏng cao áp (HPLC) Vì AFT có độ phân cực thấp nên thích hợp cho HPLC pha đảo. Cột sắc kí pha tĩnh có độ phân cực thấp sẽ có ái lực lớn với AFT, sẽ giữ hết AFT trên cột, dung môi pha động có độ phân cực cao sẽ tách lần lượt các AFT ra khỏi cột theo thứ tự độ phân cực của các AFT giảm dần. Việc tạo dẫn xuất trước qua cột với TFA hay sau qua cột với I2 (hoặc Br2) làm tăng khả năng phát hiện và định lượng. Sử dụng đầu dò hùynh quang với λExc.= 365 nm và λEm. = 435 nm. Dựa vào thời gian lưu để định tính; dựa vào diện tích các peak của mẫu và chuẩn để xác định nồng độ AFT trong mẫu. tự động hóa nhiều thao tác. khả năng phân giải và phát hiện cao, độ nhạy: 0,1 ppb cho kết quả định lượng tốt. thiết bị đắt tiền. tốn thời gian dung môi, hợp chất chlor gây ô nhiễm môi trường. cần dung môi siêu tinh khiết. 2.2.3 Phương pháp miễn dịch học Phương pháp này dựa trên nguyên lí kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể. Vì aflatoxin là một phân tử nhỏ (hapten) nên nhiều phương pháp miễn dịch học thông thường (chẳng hạn “ELISA kẹp” (sandwich ELISA)) tỏ ra không hiệu quả. Để phát hiện aflatoxin, một phương pháp được sử dụng khá phổ biến hiện nay là phương pháp ELISA cạnh tranh (competitive ELISA), hoạt động theo quy tắc: AFT cần xác định cạnh tranh với một lượng cố định (AFT – enzyme) để liên kết đặc hiệu vào kháng thể đã được gắn trên pha rắn (polystyrene). Sau đó, các AFT - enzyme bị giữ lại được xác định bằng cách thêm vào một cơ chất có tính đổi màu khi phản ứng với enzyme. Cường độ màu tạo ra được đo bằng quang phổ kế, máy đọc (Elisa reader) hoặc bằng mắt. Nồng độ AFT - enzyme càng thấp thì nồng độ AFT trong mẫu càng cao. Thông thường, người ta tạo một đường chuẩn (standard curve) và kết quả tính toán dựa trên kết quả đo lường cường độ màu của mẫu. Phương pháp này nhằm sàng lọc cùng một lúc nhiều mẫu. Ưu điểm của phương pháp là thực hiện dễ dàng; việc phân tích nhiều mẫu cùng lúc sẽ làm giảm chi phí cho xét nghiệm. Tuy nhiên, độ nhạy và khả năng lặp lại của phương pháp còn kém. Do đó, một phương pháp khác ra đời: phương pháp dùng sắc kí ái lực miễn dịch (Immunoaffinity Chromatography) để đồng thời cô đặc và tinh chế aflatoxin của mẫu cần thử nghiệm. 2.3 Sắc kí ái lực miễn dịch Qui trình phân tích aflatoxin của các phương pháp đề cập trên phải qua nhiều giai đoạn chiết xuất, làm sạch và cô đặc. Việc định tính và định lượng aflatoxin dễ bị sai số do phải qua nhiều thao tác, tăng thất thoát trong các công đoạn. Hơn nữa, với nhu cầu ngày càng lớn của công nghệ thực phẩm, yêu cầu về chất lượng cuộc sống ngày càng tăng, qui định về tiêu chuẩn an toàn thực phẩm ngày càng trở nên nghiêm ngặt; đặc biệt, trong giao dịch quốc tế, với nhu cầu về độ tin cậy cao trong các kết quả phân tích, thì một kĩ thuật sắc kí mới ra đời, đó là sắc kí ái lực miễn dịch (IAC), sử dụng kháng thể đặc hiệu với aflatoxin(s) mang nhiều ưu điểm mà các phương pháp hóa lí không có được: Mang tính chọn lọc, có khả năng loại trừ các tạp chất để đạt kết quả xét nghiệm đáng tin cậy. Ưu điểm này được xem là tiến bộ nhất. Tỉ lệ thu hồi aflatoxin có tính thuyết phục rất cao. Rất đơn giản Thời gian phân tích nhanh Sử dụng ít dung môi hữu cơ (chloroform...) nên thân thiện với môi trường. Việc cô đặc và tinh chế aflatoxin xảy ra đồng thời. Aflatoxin tinh chế không kèm theo tạp chất như với các cột hoạt động theo qui tắc lí hóa. Giá ái lực miễn dịch giữ hoạt tính ổn định ít nhất là 1 năm. Việc đọc kết quả dễ dàng, ít bị nhầm lẫn cho kết quả dương tính giả. Bên cạnh đó, AFB1 là aflatoxin phổ biến nhất, có tính độc cao nhất và luôn xuất hiện trong bất kì quy định về mức nhiễm aflatoxin trong thực phẩm nào. Do vậy, kháng thể dùng trong sắc kí ái lực cần có tính đặc hiệu cao nhất đối với AFB1. Từ những cơ sở trên, việc sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt AFB1 đã được thực hiện và hoàn thành tại Viện Pasteur Tp.Hồ Chí Minh gồm những bước: Tạo huyết thanh thỏ kháng aflatoxin B1 Tinh chế kháng thể Cộng hợp kháng thể lên giá thể (Xem chi tiết ở phụ lục 3). Tạo huyết thanh thỏ kháng AFB1 Với bản chất là hapten, không có đặc tính sinh đáp ứng miễn dịch, không tạo kháng thể được nên aflatoxin phải cộng hợp với một protein giá, là albumin huyết thanh bò (BSA). Sự cộng hợp có thể là: Dạng (H2N – protein): vị trí cộng hợp ở phía vòng dihydrofuran. Khi đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúc phía vòng cyclopentenone của AFB1. Dạng (AFB1 – O – carboxymethyl oxim – protein): vị trí cộng hợp ở phía vòng cyclopentenone. Khi đó, kháng thể sẽ đặc hiệu với cấu trúc phía vòng dihydrofuran của AFB1, và chính ở vị trí này xảy ra phản ứng tạo độc. Do đó, sử dụng dạng cộng hợp này để tạo kháng thể. AFB1 - BSA conjugate được tiêm vào thỏ để gây miễn dịch trên thỏ. Khi đó, kháng thể tạo thành sẽ là Kháng thể chống AFB1-BSA Kháng thể chống AFB1 (IgGAFB1) Kháng thể chống BSA. Kháng thể khác. Tinh chế kháng thể chống AFB1 Cho huyết thanh thỏ chứa hỗn hợp các kháng thể thu được qua cột sắc kí ái lực miễn dịch với thành phần như sau: Giá thể rắn (solid support hay matrix, chromatographic bed material): gel CNBr-activated Sepharose 4B. Ligand: BSA. Khi đó, chỉ có các kháng thể chống AFB1 đi qua cột còn các loại kháng thể còn lại bị giữ lại do tương tác kháng nguyên – kháng thể của BSA. Cộng hợp IgGAFB1 lên polymer CNBr-activated Sepharose 4B. Cột được qua thử nghiệm trên AFB1 đã cho kết quả 100% về khả năng thu hồi, tính lặp lại cao…cho thấy: sử dụng cột ái lực miễn dịch sản xuất tại Việt nam với tính hiệu quả cao và giá thành thấp hơn so với nhập ngoại sẽ đầy hứa hẹn trong tương lai. Sự đơn giản của quy trình chiết và tinh chế aflatoxin, sử dụng cột IAC: Chiết mẫu với dung môi MeOH/H2O, lọc qua giấy lọc. Dịch lọc được hòa loãng với nước rồi cho qua cột IAC, rửa cột với nước. Khi đó chỉ còn aflatoxin gắn vào kháng thể trên cột để sau đó được rửa giải bằng dung môi MeOH. AFT trong dịch rửa giải có thể được định lượng bằng phương pháp huỳnh quang hay TLC, hay được khẳng định trên HPLC. Hình 2.7: Nguyên lí hoạt động của cột ái lực miễn dịch (IAC). Tuy nhiên, việc phân tích AFB1 bằng IAC cũng không thể bỏ qua AFG1, một aflatoxin mà có lẽ độc tính và tác hại cúa nó chỉ đứng sau AFB1 mà thôi. Vì AFB1 và AFG1 có sự giống nhau về cấu trúc ở vòng dihydrofuran nên phản ứng chéo có thể xảy ra là điều dễ hiểu khi dùng IAC bắt AFG1. Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH Thời gian và địa điểm thực hiện Thời gian: Từ 1/3/2005 – 1/8/2005 Địa điểm: Phòng Hoá miễn dịch - Viện Pasteur – Tp. Hồ Chí Minh. Vật liệu 3.2.1 Đối tượng nghiên cứu Cột IAC 2,5 (nồng độ kháng thể kháng AFB1 gắn lên cột bằng 2,5mg/ml gel) có khả năng bắt giữ AFB1 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất. Cột: cột nhựa có kích thước 0,4 x 10cm. Gel: CN-Br activated sepharose 4B gắn kháng thể kháng AFB1 đặc hiệu (IgG-BSA). Lượng gel đóng trong cột là 0,1-0,15ml, được giữ trong đệm Tris-HCl 1M, pH = 7,4. Cột được bảo quản trong tủ lạnh (4 - 8oC). Hoá chất Aflatoxin G1 chuẩn (A0138 – Sigma). Methanol (CH3OH - MeOH) Chloroform (CHCl3) Dung dịch Br2 0.003% NaCl Tween 20 Hóa chất tẩy rửa Nước cất 2 lần khử ion Dụng cụ Ống nghiệm Pipetman Eppendorf Bình Erlen Giấy lọc thường Lọc thuỷ tinh Thiết bị sử dụng Máy quang phổ (U – 3310 Spectrophotometer – Hitachi). Máy đo huỳnh quang (Vicam – Series – 4 Fluorometer, USA) được thiết kế đặc biệt cho việc sử dụng cột IAC. Máy khuấy từ đứng (Stuart Scientific Stirrer SS10 – Made in UK). Máy lắc (Vortex), cân điện tử, tủ lạnh, thiết bị làm khô dưới luồng N2 nhẹ. Tủ hút Phương pháp nghiên cứu Aflatoxin là chất độc. Do đó, trong suốt quà trình thao tác, dù với dạng bột hay dung môi, người thao tác cần lưu ý: Mang găng tay, áo blouse, khấu trang khi tiếp xúc với aflatoxin. Bề mặt nơi làm việc phải được che phủ bằng các vật liệu chỉ dùng một lần. Các dụng cụ thủy tinh sau khi thao tác xong phải rửa bằng các chất oxi hóa mạnh (chất tẩy hay hỗn hợp sulfochromic). Phải luôn pha mới dung môi vì nó không ổn định. Dung môi phải được giữ trong những thiết bị không thấm nước, đục, tránh ánh sáng và để trong tủ lạnh. Để tránh thất thoát aflatoxin do bị hấp thu, tất cả thiết bị thủy tinh dùng trong thao tác phải được ngâm trong dung dịch acid loãng (HCl-1N) vài giờ, sau đó rửa và làm khô. Các phương pháp phục vụ cho nghiên cứu Quy trình tạo giá ái lực miễn dịch Dung dịch H2O, NaN3 0,05% PBS, NaN3 0,05% Đệm carbonate: -NaHCO3 0,1 M -NaCl 0,5 M -Thimerosal 0,01% Tris – HCl 0,1 M NaCl 0,5 M pH = 8 CH3COONa 0,1 M NaCl 0,5 M pH = 4 Tris – HCl 0,1 M NaCl 0,5 M NaN3 0,05% pH = 7,4 HCl 1 nM pH = 3 Chuẩn bị protein Kháng thể IgG dưới dạng tủa trong ammonium sulphate. Thẩm tích tủa trong dung dịch (1): 1 (lit) x 2 lần. Thẩm tích tủa trong dung dịch (2): 1 (lit) x 2 lần. Xác định nồng độ IgG bằng quang phổ kế ở λ= 280 nm. Thẩm tích trong dung dịch (3) qua đêm. Chuẩn bị gel CNBr – activated Sepharose 4B (Amersham Pharmacia BiotechAB). 1 g gel khô trương phồng thành 3,5 ml gel. Rửa gel với dung dịch (7), thể tích 200 ml dung dịch/ g gel. Cộng hợp IgG vào Sepharose Cho dung dịch IgG vào gel đã rửa (từ 2,5 đến 10 mg IgG/ ml gel), để 2 giờ ở nhiệt độ phòng hay qua đêm ở 4oC. Lấy dịch nổi đo hấp phụ quang ở λ= 280 nm. Rửa lại với đệm (3). Bất hoạt nhóm -C N+ còn lại với đệm (4) trong 1 giờ. Rửa với đệm (5). Lần cuối rửa với dung dịch (6) ở 4oC - 8oC. Nén cột Rửa frit và cột bằng ethanol. Nén miếng frit vào đáy của cột. Cho gel đã cộng hợp IgG vào cột. Cho dung dịch (6) vào cột. Bảo quản ở 4oC. Phương pháp quang phổ kế để xác định nồng độ AFG1(theo Nollet, 1992) Nguyên tắc: Photon ánh sáng ở vùng tử ngoại do đèn nguồn phát khi qua bộ tạo ánh sáng đơn sắc sẽ chỉ cho qua ánh sáng với bước sóng nhất định, và khi qua dung dịch trong cốc sẽ gây ra sự thay đổi năng lượng của các điện tử. Khi phân tử hấp thụ năng lượng ánh sáng này, các điện tử sẽ chuyển lên mức năng lượng cao hơn. Tuy nhiên, chỉ có điện tử ở các hợp chất có nối đôi hay/và ba mới hấp thụ ánh sáng ở vùng tử ngoại. Tiếp đến, bộ nhận tín hiệu, bộ khuyếch đại tín hiệu và đồng hồ đo sẽ phân tích cho 2 chỉ tiêu: Mật độ quang (OD) Độ thấu quang (T- transmittance) Cực đại hấp thụ (λmax) là bước sóng mà ở đó chất cho độ hấp thụ lớn nhất. Và ở mỗi cực đại hấp thụ, chất lại có hệ số hấp thụ mol nhất định (Σ) [6]. Nồng độ của chất phân tích được tính theo công thức OD360: giá trị hấp thụ ở cực đại hấp thụ (λmax) M: trọng lượng phân tử chất cần phân tích Đèn nguồn Bộ tạo ánh sáng đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Bộ khuyếch đại tín hiệu Đồng hồ đo Hình 3.1: Sơ đồ hoạt động của máy quang phổ tử ngoại Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn và xác định nồng độ Mục đích: Pha loãng dung dịch AFG1 chuẩn, cần thiết cho những lượng mẫu rất ít sẽ dùng ở các thí nghiệm sau. Tiến hành: Chuẩn AFG1 1mg Pha thành dung dịch AFG1 có nồng độ 250 ppm (1 mg / 4 ml CHCl3) Lấy 280 µl AFG1/CHCl3 (250 ppm) pha trong 720 µl CHCl3 thành 1 ml dịch pha Thêm tiếp 9 ml CHCl3vào Đo OD360 Mẫu trắng: dung dịch CHCl3. Cách thực hiện: Cho 2 cóng chứa đầy dung môi CHCl3 vào quang phổ kế, sau đó lấy cóng bên ngoài ra, thay dung môi bằng dung dịch AFG1 đã pha vào đầy cóng, cho cóng vào lại quang phổ kế. Sau đó đọc kết quả ở ánh sáng λ = 360 nm. Tính µg AFG1/ml với λ = 360 nm, M=360 và Σ= 19500. 3.3.1.3 Quy trình chiết xuất, cô đặc và tinh chế AFG1 trên cột IAC Sử dụng quy trình của hãng Vicam (Mỹ). Để cột cân bằng ở nhiệt độ phòng 15oC. Rửa cột bằng 15 ml nước. Với mẫu, quy trình được tiến hành 30 g mẫu + 6 g NaCl + 150 ml MeOH 80% Lắc 30 phút Lọc qua giấy lọc thường Cho 20 ml dịch lọc vào bình chính xác. Thêm nước cho đủ 60 ml Lọc qua lọc thuỷ tinh Cho 15 ml dịch lọc vào cột Rửa cột bằng 10 - 15 ml dịch rửa (62 ml nước + 8 ml MeOH + 70 µl Tween 20) Rửa cột bằng 10 ml nước. Rửa giải bằng 1ml MeOH Cho tác dụng với 1ml dung dịch Br2 0.003% Đọc kết quả bằng huỳnh quang kế 3.3.1.4 Phương pháp dùng huỳnh quang kế đo lường hàm lượng aflatoxin Nguyên tắc: Các phân tử hấp thụ các photon ánh sáng thích hợp để chuyển từ trạng thái cơ bản lên trạng thái kích thích. Ngược lại, các phân tử đã ở trạng thái kích thích có thể trở về trạng thái cơ bản bằng cách giải phóng năng lượng hấp thụ dưới dạng photon, tức là tự phát ra ánh sáng, gọi là sự phát quang (luminescene). Cường độ và bước sóng của ánh sáng phát ra có thể đo lường được [6]. Nguồn sáng Bộ tạo ánh sáng kích thích đơn sắc Cốc đựng mẫu đo Bộ nhận tín hiệu Bộ khuyếch đại tín hiệu Đồng hồ đo Khe sáng vào Khe sáng ra Bộ tạo ánh sáng bức xạ đơn sắc Hình 3.2: Sơ đồ hoạt động của huỳnh quang kế Mỗi chất được đặc trưng bởi 2 hằng số: Cực đại kích thích (λEx.) là bước sóng mà khi bị kích thích tại bước sóng này, chất cho cường độ phát quang tương đối (Itđ) là lớn nhất. Cực đại bức xạ (λEm.) là bước sóng mà ở đó chất cho Itđ lớn nhất. Ở nồng độ loãng, Itđ tỉ lệ với nồng độ của chất trong dung dịch. Tiến hành: Chuẩn bị huỳnh quang kế: mở máy trước 15-20 phút. Sau đó, cho tuần tự 3 ống chuẩn của máy (màu đỏ, xanh, vàng) vào để chuẩn máy. Chuẩn bị dung dịch cần đo: mẫu hoặc chuẩn AFG1 được chuẩn bị theo quy trình 3.3.1.3. Đo lượng AFG1: Cuvet (cốc đựng mẫu đo) chứa 1 ml dịch giải hấp và 1 ml dung dịch Br2 0,003% (làm tăng khả năng phát huỳnh quang của AFG1) được cho vào huỳnh quang kế, đậy nắp lại. Sau 1 phút, máy sẽ tự động tính và hiển thị kết quả cho biết hàm lượng AFT. Xây dựng đường chuẩn cho AFG1 bằng huỳnh quang kế Mục đích: Khảo sát sự tương quan tuyến tính giữa lượng AFG1 và cường độ sáng trên máy huỳnh quang. Thực hiện: Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,25 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl3 với nồng độ được xác định bằng quang phổ kế (3.3.1.2). Bố trí các nồng độ AFG1 theo bảng Bảng 3.1: Bố trí các nồng độ AFG1 chuẩn để xây dựng đường chuẩn. Lượng AFG1 chuẩn (ng) Dung dịch AFG1 (0,25 ng/µl) (µl) MeOH (µl) Dung dịch Br2 (µl) 5 10 20 40 50 20 40 80 160 200 980 960 920 840 800 1000 1000 1000 1000 1000 Đo trên huỳnh quang kế với các nồng độ AFG1 trên (thể tích đo là 2 ml). Xây dựng đường chuẩn với phần mềm M. Excel 2003. Khảo sát các chỉ tiêu Độ nhạy của cột Mục đích: khảo sát khả năng bắt giữ AFG1 ở mức thấp nhất của cột IAC. Thực hiện: Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,025 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl3 với nồng độ được xác định bằng quang phổ kế (3.3.1.2). Bố trí thí nghiệm theo bảng Bảng 3.2: Bố trí thí nghiệm để khảo sát độ nhạy. Lượng AFG1 chuẩn (ng) Thể tích các thành phần cho qua cột Dung dịch AFG1 (µl) MeOH (µl) Nước cất (ml) 1 40 1960 8 2 80 1920 8 4 160 1840 8 Cho lượng AFG1 chuẩn với nồng độ 0,025 ng/µl và hàm lượng giảm dần 4 ppb, 2 ppb và 1 ppb qua cột IAC và chiết tách theo quy trình 3.3.1.3. Mỗi hàm lượng thực hiện lặp lại trên 3 cột. Hàm lượng AFG1 tối thiểu sau khi qua cột IAC được xác định bằng phương pháp huỳnh quang kế. Độ lặp lại của cột Mục đích : khảo sát độ đồng đều của các cột IAC (khả năng bắt giữ của các cột có như nhau không). Thực hiện: Thử nghiệm khả năng lặp lại của cột khi bắt AFG1 ở 2 nồng độ 5 ppb và 20 ppb. Ở mỗi nồng độ, chọn ngẫu nhiên 10 cột trong lô cột đã sản xuất. Chuẩn bị dung dịch AFG1 chuẩn/ MeOH (0,25 ng/µl) từ dung dịch AFG1 chuẩn/CHCl3 với nồng độ được xác định bằng quang phổ kế (3.3.1.2). Cho dung dịch AFG1 qua cột tương ứng với 4 ppb và 19 ppb và chiết tách theo quy trình 3.3.1.3 Hàm lượng AFG1 được xác định bằng phương pháp huỳnh quang kế. Phương pháp xử lí số liệu Số liệu được thu thập và xử lí bằng phần mềm Excel 2003. Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Cột IAC 2,5 do Viện Pasteur Tp. HCM sản xuất Cột có đặc điểm Cột nhựa có kích thước 0,4 x 10 cm. Nồng độ kháng thể kháng AFB1gắn lên cột bằng 2,5 mg/ml gel CNBr - activated sepharose 4B, có khả năng bắt giữ AFB1. Hình 4.1: Cột IAC Nồng độ dung dịch AFG1 chuẩn xác định bằng quang phổ kế Với giá trị OD360= 4 nhận được từ huỳnh quang kế, ta có nồng độ của dung dịch AFG1 chuẩn thuộc 280 µl lấy ra từ dung dịch mẹ ban đầu: (µg/ml) hay (ppm) Đường chuẩn AFG1 dựa trên huỳnh quang kế Kết quả được trình bày qua bảng 4.1 và được minh họa qua biểu đồ 4.1 Bảng 4.1: Kết quả xây dựng đường chuẩn AFG1 dựa trên hùynh quang kế Lượng AFG1 (ng) r Kết quả đo bằng hùynh quang kế (ng) SD CV% (1) (2) (3) (4) (5) TB 5 5 4,6 3,8 5,2 4,5 3,6 4,34 0,65 14,9 10 5 8,4 9,1 9,8 8,2 9,3 8,96 0,66 7,3 20 5 18 18 18 19 19 18,4 0,55 3 40 5 37 41 38 41 39 39,2 1,79 4,6 50 5 42 46 48 50 49 47 3,16 6,7 (r: số lần lặp lại; TB: trung bình) Biểu đồ 4.1: Mối tương quan giữa lượng AFG1 và cường độ phát huỳnh quang. Từ bảng và đồ thị có nhận xét: Độ lệch chuẩn (SD) nói lên mức độ chênh lệch giữa các số liệu; số liệu càng rời rạc thì SD càng lớn [8]. Ở bảng 4.1, SD biến thiên từ 0,55 - 3,16 và có thể thấy, với lượng AFG1 càng lớn thì SD càng tăng tương ứng với mức độ sai số xảy ra càng cao. Các sai số có thể là thao tác hút bằng micropipet không chuẩn xác, sự thất thoát AFG1 trong quá trình thực hiện… Hệ số biến thiên (CV%) nhằm đánh giá độ chính xác và tính khách quan của các số liệu thu thập được [8]. Ở bảng 4.1, CV% nhỏ hơn 20% (3% - 14,9%) nên đạt mức chấp nhận trong phân tích [7]. Đồ thị đã thể hiện được mối liên hệ tuyến tính giữa lượng AFG1 và cường độ phát huỳnh quang qua phương trình y = 0,966x – 0,583 với R2 = 0,998. 4.4 Độ nhạy của cột Cho lượng AFG1 với nồng độ 7,38 ppm và hàm lượng giảm dần 4 ppb, 2 ppb, 1 ppb qua cột IAC và chiết tách theo quy trình, mỗi hàm lượng lặp lại trên 3 cột, ta thu được kết quả: Bảng 4.2: Kết quả về độ nhạy của cột đối với AFG1 Lượng AFG1 cho vào cột (ppb) Lượng AFG1 thu hồi (ppb) Lượng thu hồi trung bình (ppb) CV% 4 3,5 3,0 3,4 3,3 8,02 2 1,8 1,9 1,9 1,87 3,09 1 0,8 0,7 0,8 0,77 7,53 Nhận xét: Bảng 4.2, với CV% từ 3,09-8,02 tức nhỏ hơn 20% cho thấy tính chính xác và khách quan có thể chấp nhận của số liệu [7]. Từ đó suy ra, khả năng bắt giữ và phát hiện AFG1 của cột IAC và huỳnh quang kế ở hàm lượng thấp nhất 1 ppb. Kết quả này tương đương với kết quả đối với AFB1, cũng như với việc sử dụng phương pháp chiết tách hóa học và phân tích bằng TLC (Lê Anh Phụng, 2002). Kết quả này một lần nữa khẳng định ưu điểm của IAC có thể phục vụ tốt cho việc phân tích AFT ở mức vi lượng; và cùng với huỳnh quang kế, việc phân tích trở nên ít tốn thời gian hơn (đọc kết quả trực tiếp trên huỳnh quang kế chỉ mất 1 phút) và không dùng hóa chất độc hại nên thân thiện với môi trường hơn. Độ lặp lại của cột Thử nghiệm khả năng lặp lại của cột khi bắt AFG1 ở nồng độ 4 ppb, 19 ppb , 10 cột lặp lại cho mỗi nồng độ, ta thu được kết quả: Bảng 4.3: Kết quả về độ lặp lại của cột đối với AFG1 ở lượng 4 ppb Lượng AFG1 cho vào cột (ppb) Lượng AFG1 thu hồi (ppb) 4 3,5 4 3,4 4 3,9 4 3,4 4 4,2 4 3,7 4 3,7 4 3,6 4 3,7 4 3,2 Trung bình 3,63 SD 0,28 CV% 7,8 Bảng 4.4: Kết quả về độ lặp lại của cột đối với AFG1 ở lượng 19 ppb Lượng AFG1 cho vào cột (ppb) Lượng AFG1 thu hồi (ppb) 19 16 19 17 19 16 19 15 19 15 19 15 19 16 19 15 19 14 19 14 Trung bình 15,3 SD 1,23 CV% 8,03 Nhận xét: Bảng 4.3 và bảng 4.4 cho thấy ít có sự chênh lệch về kết quả khảo sát của các cột khác nhau (10 cột) với cùng một lượng AFG1 cho vào mỗi cột IAC (SD= 0,28 và 1,23 tương ứng với lượng AFG1 4 ng và 19 ng). Khả năng bắt giữ AFG1 tương đối đồng đều, thể hiện qua hệ số biến thiên thấp (CV% < 20%, CV% = 7,8% và 8,03% tương ứng với lượng AFG1 4 ng và 19 ng). Từ kết quả thu được khi thí nghiệm được bố trí tương tự với AFB1, CV% = 13,17% và 9,19% tương ứng với 5 ng và 20 ng lượng AFB1[2], cũng thấp hơn 20%, chứng tỏ cột IAC do Viện Pasteur sản xuất thể hiện độ đồng đều chấp nhận được trong phân tích. Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - Cột IAC tạo thành có kích thước 0,4 x 10 cm với nồng độ kháng thể kháng AFB1 là 2,5 mg/ml gel CNBr - activated sepharose 4B, có khả năng bắt giữ AFB1 và AFG1. - Độ nhạy của cột IAC: 1 ppb. - Độ lặp lại của cột IAC: CV = 7,8% với lượng 4 ng AFG1 CV = 8,03% với lượng 19 ng AFG1. Đề nghị Khảo sát các chỉ tiêu đánh giá khác của cột như: dung tích cột, hiệu suất thu hồi để có thể kết lưận thuyết phục về khả năng bắt AFG1 của cột IAC. Do có sự tương đồng về cấu trúc ở vòng difuran giữa AFB1, AFG1 và AFM1, là vị trí đặc hiệu miễn dịch của AFB1, do tính độc cũng như khả năng hiện diện trong sản phẩm sữa, cần thiết khảo sát các chỉ tiêu đánh giá đối với AFM1. Phần 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT 1. Dương Ngọc Diễm, 2003. Tạo kháng thể kháng ochratoxin và giá ái lực bắt Ochratoxin. Khóa luận tốt nghiệp, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 2. Bùi Thị Mỹ Duyên, 2004. Khảo sát các đặc tính của cột sắc kí ái lực miễn dịch dùng trong định lượng Aflatoxin B1 do Viện Pasteur TP. HCM sản xuất. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 3. Bùi Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000. Vi nấm dùng trong Công Nghệ Sinh Học. Nhà xuất bản Khoa học và Kĩ thuật, Hà Nội. 201 trang. 4. Trần Minh Đức, 2002. Khảo sát tình hình nhiễm Aflatoxin B1 trên thức ăn hỗn hợp cho heo tại thị xã Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 5. Đậu Ngọc Hào và Lê Thị Ngọc Diệp, 2003. Nấm mộc và độc tố aflatoxin trong thức ăn chăn nuôi. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội. 210 trang. 6. Đặng Văn Hòa, 1993. Giáo trình kiểm nghiệm thuốc, trường Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam 7. Đặng Văn Giáp, 1997. Phân tích dữ liệu khoa học bằng chương trình MS – Excel. Nhà xuất bản Giáo dục. 8. Nguyễn Ngọc Kiểng, 2000. Toán – Thống kê sinh vật, lý thuyết xác suất. Trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam 9. Đỗ Ngọc Liên, 2004. Thực hành hóa sinh miễn dịch. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Hà Nội, 316 trang. 10. Lâm Thị Nhạn, 2001. Cải tiến kĩ thuật định lượng Aflatoxin trong thực phẩm. Luận án thạc sĩ khoa học, chuyên nghành hóa phân tích, Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên, Đại Học Quốc Gia, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 11. Lê Anh Phụng, 2001. Bệnh nhiễm độc Aflatoxin và các phương pháp phát hiện Aflatoxin. Chuyên đề cấp tiến sĩ, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 12. Trịnh Việt Anh Tài, 2002. Đánh giá hiệu quả thu hồi Aflatoxin của cột ái lực miễn dịch do phân viện công nghệ sau thu hoạch Tp. HCM chế tạo. Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn nuôi – Thú y, trường Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 13. Châu Vĩnh Thị, 2001. Khảo sát tình hình nhiễm vi nấm sinh độc tố & độc tố aflatoxin trên một số thành phẩm đông dược Việt Nam lưu hành tại Tp Hồ Chí Minh. Luận văn thạc sĩ dược học, chuyên nghành Kiểm nghiệm - Độc chất, trường Đại học Y Dược, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. 14. Nguyễn Lê Trang, 2003. Aflatoxin B1: sản xuất giá ái lực miễn dịch bắt các aflatoxin(s). Thuyết minh đề tài nghiên cứu Khoa học Công nghệ cấp bộ, phòng Miễn dịch, viện Pasteur, TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam. TIẾNG ANH Carlos A. Muro-Cacho et al, 2004. Mycotoxins: Mechanisms of toxicity and Methods of Detection for identifying exposed individuals. Journal of Land Use, Vol. 19:2, spring, 2004. Fun sun Chun, 1983. Immunoassays for analysis of Mycotoxins. Journal of Food Protection, Vol. 47, No. 7, Pages 562-569 (July 1984). M. O. Moss, 1998. Recent study of mycotoxins. Journal of Applied Microbiology Symposium Supplement 1998, 84, 62S-76S. Maryann E. Smela et al, 2001. The chemistry and biology of aflatoxin B1: from mutational spectrometry to carcinogenesis. Carcinogenesis vol.22 no.4 pp.535-545, 2001. Yu et al, 2004. Clustered Pathway Genes in Aflatoxin Biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology, March 2004, p. 1253-1262, Vol 70, No. 3.