Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học cao Etyl acetat của cây nam sâm đứng Boerhaavia erecta L. họ bông phấn (Nyctaginaceae)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA BỘ MÔN HÓA HỮU CƠ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CAO ETYL ACETAT CỦA CÂY NAM SÂM ĐỨNG BOERHAAVIA ERECTA L. HỌ BÔNG PHẤN (NYCTAGINACEAE) GVHD: GS. TS. NGUYỄN KIM PHI PHỤNG SVTH: NGUYỄN THỊ MỸ HƯƠNG LỚP: 4C HỆ: CỬ NHÂN NGOÀI SƯ PHẠM MSSV: 35106019 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH- THÁNG 5, NĂM 2013 MỤC LỤC MỤC LỤC ........................................................................................ 2 LỜI CẢM ƠN .................................................................................. 3 LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................. 4 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................. 5 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ........................................................... 6 1.1. ĐẶC TÍNH THỰC VẬT ....................................................................... 6 1.2. NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH CỦA CHI BOERHAAVIA ............ 8 CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ ............................ 19 2.1. THU HÁI VÀ XỬ LÝ MẪU ............................................................... 20 2.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO .............................................................. 20 2.3. TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY NAM SÂM ĐỨNG ..................................................................................... 21 2.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC ................................................................................................. 23 CHƯƠNG 3:KẾT LUẬN .............................................................. 30 3.1. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ ................................................. 30 3.2. CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO ...................................... 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................ 32 LỜI CẢM ƠN Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  Cô GS. TS. Nguyễn Kim Phi Phụng đã tận tình hướng dẫn, động viên, truyền đạt những kiến thức quý báu và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp em hoàn thành tốt khóa luận này. Cô là một người thầy tận tụy, một tấm gương nghiên cứu khoa học, cô không những trang bị cho em kiến thức chuyên môn mà cả những hành trang, kỹ năng cho con đường tương lai sau này.  Chị NCS Đỗ Thị Mỹ Liên- là người chị- đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ, động viên, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu mà chị tích lũy được trong quá trình nghiên cứu giúp em hoàn thành tốt khóa luận. Chị đã truyền tinh thần nghiên cứu khoa học, sự ham học hỏi và giúp em định hướng cho những bước đi sau này.  Thầy NCS Dương Thúc Huy đã cho em kiến thức và cơ hội được học tập, hoàn thành khóa luận tại Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ- Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. HCM.  Các thầy cô Trường Đại học sư phạm TP. HCM đã giảng dạy và truyền thụ cho em nhiều kiến thức khoa học.  Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên cùng làm việc, học tập tại Phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ- Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. HCM đã nhiệt tình giúp đỡ, động viên em trong suốt quá trình làm khóa luận.  Và cuối cùng là ba mẹ đã ủng hộ, tiếp sức và là nguồn động viên lớn lao trên suốt con đường học tập của em. LỜI MỞ ĐẦU Từ xa xưa con người đã sử dụng nhiều loại cây cỏ hoặc các hợp chất trích ly từ cây cỏ để làm hương liệu, gia vị thực phẩm, màu tự nhiên,đặc biệt là sử dụng để làm thuốc chữa bệnh. Trong y học cổ truyền có nhiều bài thuốc giá trị mà cho đến nay chúng ta chỉ mới khám phá được một phần. Có đến 80% các hoạt chất đã và đang sử dụng làm thuốc trong y học hiện đại là các chất có nguồn gốc tự nhiên, các chất tổng hợp và bán tổng hợp đều dựa trên cấu trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên. Vì vậy, việc nghiên cứu, tìm kiếm các thuốc mới từ nguồn gốc tự nhiên hiện nay đang rất được quan tâm. Chi Boerhaavia, họ Bông phấn (Nyctaginaceae), có khoảng hơn 40 loài, trong đó ở Việt Nam, theo tài liệu đã tìm thấy khoảng 3 loài. Một số loài cây thuộc chi Boerhaavia đã được sử dụng trong y học cổ truyền của nhiều nước trên thế giới để chữa trị rất nhiều loại bệnh như viêm nhiễm, kháng u bướu, kháng tế bào ung thư, kháng virút, Các nghiên cứu hóa – dược cho thấy chi Boerhaavia chứa rất nhiều loại hợp chất hữu cơ có hoạt tính sinh học hấp dẫn như triterpen, steroid, glycoside, flavonoid, alkaloid, ... Tuy nhiên, các cây thuộc chi Boerhaavia rất giống nhau về hình dáng bên ngoài và lại chưa được nghiên cứu và áp dụng vào thực tế ở Việt Nam. Cây Boerhaavia erecta L. là một loài cây được phân bố rộng rãi ở nước ta, đây là loài cây chịu hạn rất dễ sống và sự phát tán cũng như sự sinh sôi nảy nở rất dễ dàng. Với những hoạt tính rất hấp dẫn cũng như sự thuận lợi khi nuôi trồng thì quả thật đây là nguồn dược liệu rất quý giá. Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu thành phần hóa học cây Nam sâm đứng Boerhavia erecta L. thu hái ở Thủ Đức bằng cách cô lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất hữu cơ có trong cây; tiến hành so sánh đặc tính hóa thực vật của cây này với các cây cùng chi. Hy vọng rằng kết quả nghiên cứu sẽ mang lại những hiểu biết mới về mặt hóa – dược của cây Boerhaavia erecta L. và làm tăng giá trị ứng dụng của cây vào thực tế cuộc sống. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT br: rộng (broad) C: cloroform d: mũi đôi (doublet) dd: mũi đôi - đôi (doublet-doublet) DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer EA: etyl acetat ED: eter dầu hỏa H: hexan HSQC: tương quan H-C qua 1 nối (Heteronuclear Single Quantum Correlation) HMBC: tương quan H-C qua 2, 3 nối (Heteronuclear Multiple Bond Coherence) M: metanol N: nước NMR: phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) s: mũi đơn (singlet) CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. ĐẶC TÍNH THỰC VẬT 1.1.1. Tổng quan về chi Boerhaavia Chi Boerhaavia[17] có khoảng hơn 40 loài, bao gồm cả cây lâu năm và cây hằng năm. Cây mọc thẳng đứng, nghiêng hoặc bò sát mặt đất, được phân bố rộng rãi ở những vùng có khí hậu nhiệt đới, cận nhiệt đới và một số nước vùng ôn đới. Chúng được tìm thấy ở Úc, Trung Quốc, Ai Cập, Pakistan, Sudan, Sri Lanka, Nam Phi, Mỹ và một vài nước Trung Đông . Trong đó, ở Việt Nam chỉ mới xác định được 3 loài thuộc chi Boerhaavia đó là Boerhaavia diffusa Linn (Nam sâm bò), Boerhaavia erecta L. (Nam sâm đứng), và Boerhaavia chinensis (Nam sâm Trung Quốc)[3]. Boerhaavia tetrandra Boerhaavia linearifolia Boerhaavia wrightii Boerhaavia coccinea Boerhaavia triquetra Boerhaavia erecta Boerhaavia diffusa Boerhaavia coulteri Boerhaavia gracillima Boerhaavia herbstii Boerhaavia intermedia Boerhaavia purpurascens Boerhaavia pterocarpa Boerhaavia repens Boerhaavia chinensis Hình 1.1: Một số cây thuộc chi Boerhaavia 1.1.2. Mô tả thực vật cây Boerhaavia erecta L.[3, 20] Cây Nam sâm đứng có tên khoa học là Boerhaavia erecta L. là loại cây thảo mộc thuộc chi Boerhaavia, họ Bông phấn (Nyctaginaceae) (họ Bốn giờ), nhóm Hai lá mầm, thuộc ngành Cây hạt kín. Nam sâm đứng là loại cỏ mảnh, cao 40-80 cm, mọc thẳng đứng hoặc có thể rủ xuống ở nách chồi, có lông mịn ở chót. Lá hình trứng hoặc dạng elip, phiến lá xoan tròn dài đến thon, đáy tròn hay cắt ngang, kích thước 2-3,5× 1-2,5 cm, mặt dưới lá trắng như có bột và có tuyến, mặt phía trên xanh, cuống dài 1-4 cm. Chùm tụ tán dài; nhánh chót mang tụ tán 3 hoa; cọng hoa 15-20 mm; bao hoa trắng, hồng hay đỏ, dài 1,5-2 mm; tiểu nhụy 1-2 thùy. Hoa quả hình chùy lật ngược, cao 4 mm, có 5 cánh to, hạt nhiều. Hình 1.2: Hoa, lá và rễ của Boerhaavia erecta L. Cây nam sâm đứng được phân bố ở vùng có khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Là loài liên nhiệt đới, mọc hoang khắp nơi ở vườn, sân, bờ đường hay bãi cỏ Ở Việt Nam cây mọc nhiều ở vùng Bình Thuận, Ninh Thuận, Ninh Hòa, Phú Yên, là những vùng đất cát, khô cằn. 1.2. NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH CỦA CHI BOERHAAVIA Cho đến nay, các nghiên cứu và ứng dụng vào y học chỉ tập trung chủ yếu vào loài cây cùng chi là Nam sâm bò (Boerhaavia diffusa L.), còn cây Boerhaavia erecta mặc dù cũng đã được sử dụng làm thuốc ở nhiều nơi trên thế giới, nhưng những nghiên cứu cụ thể về dược tính của cây này thì còn rất ít. Thân lá cây Boerhaavia diffusa đã được người dân ở một số nước như Ấn Độ, Sri Lanka, Việt Nam để nấu ăn như rau. Lá cây có tác dụng hoạt huyết giải độc. Rễ cây có tác dụng tăng lượng nước tiểu nhưng với liều cao có thể gây nôn mửa và ra nhiều mồ hôi; cây còn có tác dụng trấn tĩnh (về mặt thần kinh). Rễ cây được dùng để chữa các bệnh như gãy xương (Nepan) (dùng toàn cây hay kết hợp với các loại cây khác); chữa rắn cắn và thấp khớp (Sri Lanka); ở Đông Phi dùng để chữa bỏng và chữa áp xe; ở Brasil và một số nơi khác người ta dùng cây này để chữa các bệnh về gan và lá lách, bệnh về túi mật, các bệnh về thận và chữa viêm nhiễm bên trong. Ở Ấn Độ người ta dùng cây làm thuốc chữa rất nhiều bệnh[18] như chữa đau bao tử, trừ giun sán, thuốc hạ sốt, chữa phong, chữa bệnh lậu, chứng khó tiêu, chứng phù nề, vàng da, thiếu máu, điều hòa kinh nguyệt. Rễ cây được dùng làm thuốc lợi tiểu và nhuận tràng với liều dùng 15 g/ngày, ngày dùng hai lần. Có nơi dùng chữa ho dưới dạng thuốc bột, thuốc sắc hoặc thuốc pha uống như trà (10 g/1 lít nước sôi), nếu pha rượu thì chỉ dùng 2-5 g bột rễ mỗi ngày. Có rất nhiều các nghiên cứu dược lý về cây Boerhaavia diffusa L. đã được thực hiện trên thế giới cụ thể như: nghiên cứu về khả năng chữa bỏng[12]; khả năng lợi tiểu và điều hòa huyết áp[24,59]; khả năng nhuận tràng[40]; khả năng chống co giật[6]; khả năng chống nhiễm độc gan[52]; dùng để chữa các triệu chứng của bệnh thận[38,58]; các bệnh về gan, túi mật và đường tiểu[15,16]; khả năng miễn dịch và kháng khuẩn[9,10,37,41,44,56,60]; khả năng chống co thắt[21]; khả năng giảm đường huyết của cao nước của lá[42,47]. Năm 2003, ở Ấn Độ, Rupjyoti Bharali và cộng sự[53] tiến hành nghiên cứu khả năng ngăn ngừa ung thư da trên chuột của dịch chiết thân lá của cây Boerhaavia diffusa ban đầu đã cho thấy rằng dịch chiết thân lá của cây có khả năng ngăn ngừa sự hình thành các tác nhân gây ung thư da. Năm 2007, đã có các nghiên cứu trên chuột về khả năng chống stress của dịch chiết metanol của cây[35,51] và nhận thấy cao metanol có khả năng chống stress, các nghiên cứu đi sâu tiếp tục được tiến hành. Ngoài ra người ta cũng đã nghiên cứu trên chuột khả năng làm giảm đau[28] của dịch chiết lá tươi của cây. Năm 2008, ở Nigeria, C.O.Ojowundu và cộng sự[19] tiến hành nghiên cứu về các chất dinh dưỡng có trong cây Boerhaavia diffusa L. và báo cáo cho thấy hàm lượng các vitamin và các khoáng chất trong cây cao (Bảng 1.2 và 1.3). Ngoài ra báo cáo còn cho thấy cây Boerhaavia diffusa L. có khả năng chống oxy hóa và giảm stress cao. Năm 2009, Tillán Hood và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu để xác định tác dụng của dịch nước chiết xuất từ Boerhaavia erecta L. đến chức năng bảo vệ gan trên cơ thể chuột. Kết quả cho thấy dịch chiết của cây có khả năng chống lại sự tổn thương gan trên cơ thể chuột gây ra bởi carbon tetracloride[31]. Năm 2010, ở Ấn Độ, Rajeswari và Krishnakumari tiến hành nghiên cứu để xác định tổng lượng phenol và flavonoid trong dịch chiết xuất methanol của lá cây Boerhavia erecta L., đây là những hợp chất quan trọng đóng vai trò là chất chống oxy hóa, chống ung thư, Kết quả nghiên cứu cho thấy trong lá cây có một lượng đáng kể phenol và flavonoid[45]. Bảng 1.1: Tổng hàm lượng phenol và flavonoid Thành phần thực vật Hàm lượng (mg/100 mg) Tổng lượng phenol 85.90 ± 1.97 Tổng lượng flavonoid 11.39 ± 0.86 Ở nước ta, tuy trong dân gian, cây Nam sâm bò đã được sử dụng để chữa hen suyễn, phù thũng, thiếu máu, ho và làm thuốc nhuận tràng[2], nhưng vẫn chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính của cây mọc ở Việt Nam. 1.2. NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1. Hàm lượng các thành phần, các vitamin và khoáng chất trong cây Nam sâm bò ở Nigeria[19] Bảng 1.2: Hàm lượng các thành phần có trong cây Nam sâm bò Bảng 1.3: Hàm lượng các vitamin có trong cây Nam sâm bò Loại vitamin Hàm lượng (mg/100g) Vitamin C 44.80 ± 5.78 Vitamin B3 97.00 ± 8.01 Vitamin B2 22.00 ± 4.25 Bảng 1.4: Hàm lượng các khoáng chất có trong cây Nam sâm bò Khoáng chất Hàm lượng (mg/100gr) Natri 162.50 ± 4.56 Kali 0.91 ± 0.07 Calci 174.0 ± 2.73 Sắt 0.012 ± 0.001 Thành phần Hàm lượng (%) Protein 2.26 ± 0.02 Chất béo 1.61 ± 0.06 Carbohydrat 10.56 ± 0.12 Chất xơ 2.40 ± 0.03 Độ ẩm 82.22 ± 4.16 Tro 0.96 ± 0.01 Magie 8.68 ± 0.06 Mangan 0.43 ± 0.02 Iod 0.02 ± 0.00 Nhôm 0.46 ± 0.03 Đồng Không phát hiện Kẽm Không phát hiện 1.2.2. Cấu trúc hóa học của một số hợp chất cô lập được từ chi Boerhavia.  Steroid HO H 1 2 3 44 55 66 7 88 9 10 11 1122 14 13 15 1166 17 1188 1199 2200 2211 2222 2233 24 2255 26 227 28 2299 HO HO H O OH OH OH HO H β-Sitosterol[32,49] Campesterol[32] Ecdysone[32] O H 22 223 O HO HO OH OH O H 1 22 33 4 55 6 77 8 99 1100 11 1122 14 13 15 1166 17 18 1199 220 21 22 23 2244 2255 226 22 7 28 29 O HO HO OH OH β-Sitosterol 3-O-β-D-glucopyranoside (Daucosterol)[32,49] β-Stigmasterol 3-O-β-D-glucopyranoside[32]  Triterpen  Flavonoid Boerhavilanostenyl benzoate[11] Boerhavisterol[11] Ursolic acid[32,49] O H O O O O HO OH OHO HO COOHH Boeravinone A[8,27,34] Boeravinone C[8,27,34] Boeravinone B[8,27,34] O O O A OH H33C HO OCH33 BCD 11 2 3 4 667aa8 9 10 1111 1122 11aa 4aa 1111aa 1122aa 66aa O O O OH HO H3C OH O O OH H OH H33CO H33C OH O O O OOH H33C HO OH OCH3 O O HO H3C OH O OH OH O O OH H3C HO O OH O Boeravinone D[8,27,34] Boeravinone F[8,27,34] Boeravinone E[8,27,34] HO H 2222 2233 O H O HO HO OH OH Stigmasterol[32] Campesterol 3-O-β-D-glucopyranoside[32] O O OOH H3C HO OH O O HO OH O OH O O HO OH O OH Boeravinone J[4] Coccineone B[4,7,11,21] Coccineon A[7] Boeravinone G[22] Boeravinone I[4] Boeravinone H[22] O O OOH H3CO OH OCH3 O O OOH H3CO H33C OH OCH33 O O OH OH H3C H3CO OH O 10-Demethylboeravinone C[21] Coccineone D[7] Coccineone E[4,7,21] H3CO OH O O H OH O OH HO OH O O H OH O OH O O OH H OH O H3CO H3CO 6-O-Demethylboerhavinone H[11,21] 9-O-Methyl-10- hydroxycoccineone B[21] Diffusarotenoid[11] O O OH OH OOH H3C H33CO O O H33CO HO OH O OH O O HO H3C OH O OH O O 5,7-Dihydroxy-3',4'-dimethoxy-6,8- dimethylflavone[11] 4',3,7-Trihydroxy-3'- methylflavone[11 3',3,5-Trihydroxy-7- methoxyflavone[11] O CH3 HO H3C OH O OCH33 OCH3 1 2 3 4455 66 77 8 1'' 2'' 3'' 44'' 55'' 6'' O O HO OH OH CH33 O OH OOH H3CO OH 2'-O-Methylabronisoflavone[21] Eupalitin[11,50] Kaempferol[27] OHO H33C OH O OCH3 OH3CO OH OH OH H3CO O O O OH OH HO OH O O O OH HO OH OH33CHO HO OH O OH OH OH O O O O OH HO OH OH33CHO HO OH O OH OH OH O H3CO Kaempferol 3-O-robinobioside [11,27]] 6-Methoxykaempferol 3-O-robinobioside[30] O OOOH H3CO H3CO OH O HO HO O OH OHO HO OH OH O O O OH HO OH OH OH33CHO HO OH O OH OH OH O Eupalitin 3-O-β-D- galactopyranosyl-(1-2)-β-D- glucopyranoside[11, 30] Quercetin 3-O-robinobioside[11,27] OHO OH OH OH OH HO O OH OH OH OH Procyanidin B2 OHO OH OH OH HO O OH OH OH OH HO Procyanidin B1  Alkaloid[26,32,36] Các alkaloid chiếm hàm lượng lớn trong cây nam sâm bò (2%). Gồm các chất Punarnavine-1, Punarnavine-2, Hypoxanthine-9-L-arabinofuranoside, Punarnavoside , Neobetanin-5-β-D-glucopyranoside và Amarantin. OHO OH O OH OH OH O O OOH H3CO H33CO OH O HO HO OH OH O OOOH H3CO H3CO OH O OH HO O OH O OH HO OH OH Quercetin [11,27] Eupalitin 3-O-β-D- galactopyranoside[11,30,49,50] Eupalitin 3-O-β-D- galactopyranosyl-(1-2)-β-D- galactopyranoside[11,30] N N COOH HOOC COOH O HO O HO HO OH O HO HOOC OH O Amarantin N N COOH HOOC COOH O HO O HO HO OH OH Neobetanin 5-β-D-glucopyranoside  Lignan[11,36] Năm 1991, Lami và cộng sự đã cô lập được từ rễ cây nam sâm bò hai hợp chất lignan là liriodendrin và syringaresinol mono-β-D- glycoside. O OH O OH O HO HO OH O OH Punarnavoside[8,11,27] Syringaresinol-mono-β-D-glucose O OH OCH33 OH OCH33H33CO O OCH33 O HO HO OH OH H O OH OCH33 OH OCH33H33CO HO OCH33 H Syringaresinol O OH OCH3 O OCH3H3CO O OCH3 O HO HO OH OH O HO OH OH CH2OH H Lidriodendrin Borhavine (Dihydroisofuroxanthone) O O OH CH3CH3 OCH3 O O OCH3  Carbohydrate[11,36]: Fructose, Galactose, Glucose, Xylose, Sucrose.  Xanthone[11,36]  Amino acid[27]: Cystine, glycine, histidine, lisine, methionine, phenylalanine, proline, tryptophan, alanine, acid aspartic, acid glutamic, leucine, serine, threonine, tyrosine, valine.  Các acid béo[11,49,61] CH3―(CH2)14―COOH : Acid hexadecanoic (Acid palmitic) CH3―(CH2)16―COOH : Acid octadecanoic (Acid stearic) CH3―(CH2)18―COOH : Acid eicosanoic ( Acid arachidic) CH3―(CH2)20―COOH : Acid docosanoic (Acid behenic) CH3―(CH2)7―CH=CH―(CH2)7―COOH : Acid 9-octadecenoic (Acid oleic) CHƯƠNG 2: NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ Bột thân lá khô (3.8 kg) Cao metanol thô (245 g) Phần thân lá tươi Cao eter dầu hỏa (38.1 g) Cao etyl acetat (25.1 g) Cao metanol còn lại (160 g) - Ngâm dầm với metanol - Lọc, cô quay thu hồi dung môi Trích lỏng- lỏng với ete dầu hỏa và etyl acetat Phơi khô, xay nhuyễn - Tiến hành sắc ký cột với hệ dung môi phân cực tăng dần H:EA (8:2 - 0:10), EA:M (10:0 - 5:5). - Cô quay, thu hồi dung môi. - Sử dụng sắc ký lớp mỏng để kiểm tra và gom các phân đoạn. EA.A (3.9 g) EA.B (4.5 g) EA.C (2.3 g) EA.D (7.1 g) EA.E (2.1 g) EA.F (3.5 g) C:M:N (8:2:0.1) EA.F2 (0.4 g) EA.F3 (0.72 g) EA.F4 (0.45 g) EA.F5 (0.83 g) EA.F1 (0.58g) Sơ đồ 2.1: quy trình điều chế các loại cao 2.1. THU HÁI VÀ XỬ LÝ MẪU Mẫu cây tươi Nam sâm đứng được thu hái tại Thủ Đức vào tháng 9 năm 2009. Cây đã được nhận danh tên khoa học là Boerhaavia erecta L. bởi Dược sĩ Phan Đức Bình, Phó Tổng biên tập Tạp chí Thuốc và Sức Khỏe, Hội Dược học Việt Nam. Sau khi thu hái, cây được rửa sạch, sấy khô, xay nhuyễn thu được bột khô (3.8 kg). 2.2. ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột cây khô phần thân lá (3.8 kg) được trích kiệt bằng metanol theo phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, lọc, cô quay thu hồi dung môi, thu được cao metanol thô (245 g). Từ cao metanol thô, tiến hành trích lỏng- lỏng lần lượt với ete dầu hòa và etyl acetat thu được cao eter dầu hỏa (38.1 g), cao etyl acetat (25.1 g) và phần cao metanol còn lại (160.0 g). Quy trình điều chế các loại cao được trình bày trong sơ đồ 2.1 Bảng 2.1: Khối lượng và thu suất các loại cao thu được so với cao metanol ban đầu Loại cao (ký hiệu ) Trọng lượng (g) Thu suất (%) Eter dầu hỏa (ED) Etyl acetat (EA) Metanol (M) 38.1 25.1 160 15.55 10.24 65.31 Tổng cộng 223.2 91.10 2.3. TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ TRONG CÂY NAM SÂM ĐỨNG 2.3.1. Sắc ký cột trên cao etyl acetat của sơ đồ 2.1 Thực hiện sắc ký cột trên cao etyl acetat (25.1 g) với silica gel pha thường bằng hệ dung môi phân cực tăng dần từ hệ hexan: etyl acetat (8:2 – 0:10), etyl acetat: metanol (10:0 – 5:5) thu được 6 phân đoạn được trình bày trong sơ đồ 2.1. 2.3.2. Sắc ký cột trên phân đoạn EA.F của cao etyl acetat Phân đoạn EA.F (3.5 g) của cao etyl acetat được sắc ký cột silica gel, giải ly bằng hệ dung môi phân cực cloroform: metanol: nước (8:2:0.1). Kết quả sắc ký lớp mỏng cho thấy phân đoạn EA.F1 và EA.F3 có các vết chính rõ, đẹp. Do đó được chọn để sắc ký cột. Các phân đoạn còn lại sẽ được tiếp tục khảo sát sau. 2.3.2.1. Sắc ký cột trên phân đoạn EA.F1 của cao etyl acetat Phân đoạn F1 của cao etyl acetat (580 mg) được sắc ký cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi cloroform: metanol: nước (8:2:0.1), kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 2.2. Bảng 2.2: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn EA-F1 Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi giải ly Trọng lượng cao (mg) Nhận xét (bằng sắc ký lớp mỏng) F1-1 1 - 15 C:M:N (8:2:0.1) 68 Vết dài. Không khảo sát F1-2 15 - 23 C:M:N (8:2:0.1) 110 Một vết chính. Sẽ khảo sát sau F1-3 24 - 39 C:M:N (8:2:0.1) 180 Cô lập được EREC-EA25 F1-4 39- 51 C:M:N (8:2:0.1) 135 Nhiều vết. Không khảo sát Hợp chất EREC-EA25 (10 mg) có dạng tinh thể hình kim, màu vàng, tan trong metanol. 2.3.2.1. Sắc ký cột trên phân đoạn EA.F1 của cao etyl acetat Phân đoạn F3 của cao etyl acetat (720 mg) được sắc ký cột silica gel nhiều lần, giải ly bằng hệ dung môi cloroform: metanol: nước (8:2:0.1), kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3: Kết quả sắc ký cột silica gel trên phân đoạn EA-F3 Phân đoạn Số thứ tự lọ Dung môi giải ly Trọng lượng cao (mg) Nhận xét (bằng sắc ký lớp mỏng) F3-1 1 - 10 C:M:N (8:2:0.1) 100 Vết dài. Không khảo sát F3-2 11 - 27 C:M:N (8:2:0.1) 135 Cô lập được EREC-EA26 F3-3 28 - 40 C:M:N (8:2:0.1) 87 Một vết chính. Sẽ khảo sát sau F3-4 41 - 52 C:M:N (8:2:0.1) 145 Nhiều vết. Không khảo sát F3-5 53 - 67 C:M:N (8:2:0.1) 180 Một vết chính. Sẽ khảo sát sau Hợp chất EREC-EA26 (8 mg) có dạng bột, vô định hình màu vàng, tan trong metanol. 2.4. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC 2.4.1. Khảo sát cấu trúc hóa học của của hợp chất 1 (EREC- EA25)  Hợp chất 1 thu được từ phân đoạn EA.F của cao etyl acetat, có đặc điểm sau: - Hợp chất 1 có dạng tinh thể hình kim, màu vàng, tan trong dung môi metanol. - Nhiệt độ nóng chảy: 231- 232 0C. - Sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung môi cloroform: metanol: nước (8: 2: 0.1) hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 30%, sấy bản ở 1000C cho một vết màu vàng có giá trị Rf= 0.5; và hiện hình bằng dung dịch FeCl3/ ancol, sấy nhẹ cho một vết màu xanh đen. - Phổ 1H-NMR (CD3OD) (Phụ lục 1, 1A, 1B), phổ 13C-NMR (CD3OD) (Phụ lục 2), phổ HSQC (Phụ lục 3), phổ HMBC (Phụ lục 4, 4A, 4B, 4C) được trình bày trong bảng 2.4.  Biện luận cấu trúc: Hợp chất 1 có sắc ký lớp mỏng khi hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 cho một vết màu vàng, hiện hình bằng dung dịch FeCl3/ ancol, cho màu xanh đen, nên hợp chất 1 có thể là một flavon.  Phổ 1H-NMR có năm tín hiệu proton nằm trong vùng từ trường δH 6.5-8 ppm, là tín hiệu của proton gắn với vòng thơm. - Tín hiệu mũi đôi tại δH 6.21 (1H, d, J = 1.5 Hz) và mũi đơn tại δH 6.39 (1H, s) thể hiện 2 proton ghép cặp meta của vòng A là H-6 và H-8. - Hai tín hiệu mũi đôi tại δH 7.71 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2’), δH 6,84 (1H, d, J = 8.5, H-5’) và một mũi đôi-đôi tại δH 7.59 (1H, dd, J = 6.5; 2.0, H-6’) của hệ thống ghép ABX cho biết rằng có nhóm thế tại vị trí 3’ và 4’ trên vòng B. - Phổ 1H-NMR còn có 1 mũi đôi tại δH 5.24 (1H, d, J = 7.5) là tín hiệu của proton anomer H-1’’, kết hợp với các tín hiệu trong vùng từ trường δH 3.2- 3.8 ppm cho biết có sự hiện diện của một đơn vị đường.  Phổ 13C-NMR cho thấy hợp chất 1 có 21 carbon. - Có 15 tín hiệu carbon nằm trong trường thấp (>90ppm). Trong đó có 14 carbon thơm của phần aglycon trong vùng từ trường δC 90-170 ppm, một carbon carbonyl >C=O tại δC 179.6 (C-4), một carbon acetal δC 104.5 (C- 1”). Các tín hiệu còn lại nằm trong vùng trường cao (60-80 ppm) củng cố nhận định hợp chất có mang một đơn vị đường. - Carbon metylen –CH2– mang oxy tại δC 62.7 ppm là C-6 của đường glucose. - Tín hiệu carbon tứ cấp tại δC 135.7 ppm là tín hiệu đặc trưng của C-3 của khung flavonol. - Phổ HMBC cho thấy tín hiệu tương quan của proton anomer C-1’’ của đơn vị đường với C-3 của khung flavonol ở δC 135.7 ppm, chứng tỏ flavonol này có mang nhóm đường ở C-3. Phân tích các dữ liệu phổ nghiệm của hợp chất 1 và so sánh với số liệu phổ nghiệm của hợp chất quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside[ 5,13,33,43] được trình bày trong bảng 2.4, cho thấy sự tương đồng. Vậy, cấu trúc của hợp chất 1 được đề nghị là quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside. Bảng 2.4: Phổ 1H, 13C-NMR và HMBC của hợp chất 1. Vị trí Loại carbon EREC-EA25 Quercetin 3-O-β-D- glucopyranoside δH ppm (J, Hz) δC ppm HMBC (1H→13C) δH ppm (J, Hz) δC ppm 2 >C= - 159.1 - - 159.0 3 >C= - 135.8 - - 135.0 4 >C= - 179.6 - - 179.4 5 >C= - 163.1 - - 163.0 6 =CH- 6.21 (d, 1.5) 100.0 5, 7, 8, 10 6.20 (d, 1.9) 99.0 7 >C= - 166.1 - - 166.2 8 =CH- 6.39 (s) 94.8 6, 7, 9, 10 6.38 (d, 1.9) 94.7 9 >C= - 158.5 - - 158.5 10 >C= - 105.8 - - 105.6 1’ >C= - 123.2 - - 123.0 2’ =CH- 7.71 (d, 1.5) 117.7 2, 3’, 4’, 6’ 7.7 (d, 2.0) 116.0 3’ >C= - 145.9 - - 145.9 4’ >C= - 149.9 - - 149.8 5’ =CH- 6.84 (d, 8.5) 116.1 3’, 4’, 6’ 6.87 (d, 8.5) 117.5 6’ =CH- 7.59 (dd, 6.5, 2.0) 123.2 2, 2’, 4’ 7.62 (dd, 8.5,2.0) 123.1 1’’ >CH- 5.24 (d, 7.5) 104.5 3, 3’’ 5.20 (d, 7.2) 104.0 2’’ >CH- 3.48 (dd) 75.8 1’’, 3’’ 3.06 (m) 73.7 3’’ >CH- 3.43 (dd) 78.2 2’’, 4’’ 3.30 (m) 76.1 4’’ >CH- 3.35 (dd) 71.3 6’’ 3.36 (m) 71.2 5’’ >CH- 3.22 (m) 78.4 4’’ 3.21 (m) 76.4 6’’ -CH2-a 3.71 (dd, 11.5, 2) 62.7 4’’ 3.72 (m) 61.5 6’’ -CH2-b 3.57 (dd, 5.5, 12) 62.7 5’’ 3.40 (m) OO HO OH H H H H H OH OH 2 O H HO H HO H H OHH OH 3 45 6 1' 7 8 9 10 O 2' 3' 4' 5' 6" 1" 2"5" 3" 4" 6' 2.4.2. Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất 2 (EREC- EA26)  Hợp chất 2 thu được từ phân đoạn EA.F của cao etyl acetat, có đặc điểm sau: - Hợp chất có dạng bột vô định hình màu vàng, tan trong dung môi metanol. - Sắc ký lớp mỏng giải ly bằng hệ dung môi cloroform: metanol: nước (8: 2: 0.1) hiện hình bằng dung dịch acid H2SO4 30%, sấy bản ở 1100C cho một vết màu vàng có giá trị Rf= 0.4; và hiện hình bằng dung dịch FeCl3/ ancol, sấy nhẹ cho một vết màu xanh đen. - Phổ 1H-NMR (CD3OD) (Phụ lục 5, 5A, 5B, 5C), phổ 13C-NMR (CD3OD) (Phụ lục 6, 6A), phổ DEPT-NMR (Phụ lục 7), phổ HSQC (Phụ lục 8, 8A), phổ HMBC (Phụ lục 9, 9A, 9B, 9C, 9D) được trình bày trong bảng 2.5.  Biện luận cấu trúc:  Phổ 1H-NMR của 2 tương tự với phổ của hợp chất 1, cũng chia ra hai vùng tín hiệu rõ rệt. - Trong vùng từ trường δH 6.5-8.0 ppm, có sự khác biệt ở cấu trúc nhân thơm của vòng B. Phổ 1H-NMR của 2 xuất hiện hai tín hiệu mũi đôi, ghép cặp orto với nhau tại δH 8.08 (2H, d, J = 8.5 Hz) và 6.92 (2H, d, J = 9 Hz) lần lượt là tín hiệu của proton H-2’, 6’ và H-3’, 5’. Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside Trong vùng từ trường δH 3.0-5.0 ppm xuất hiện thêm các tín hiệu khác. Tín hiệu ở δH 4.53 (1H, d, J = 1.5) là tín hiệu của proton anomer thứ hai H-1’’’, ngoài ra tại δH 1.14 (3H, d, J = 6.5 Hz) là tín hiệu đặc trưng của proton nhóm metyl H-6’’’ của đường rhamnopyranose. Từ đây, có thể xác định hợp chất 2 có thêm một đơn vị đường α-L-rhamnopyranose.  Phổ 13C-NMR kết hợp phổ DEPT-NMR cho thấy hợp chất có 27 carbon. Ngoài tín hiệu tương tự như phổ 13C-NMR của hợp chất 1, hợp chất 2 còn xuất hiện thêm một carbon acetal δC 101.0 (C-1’’’), bốn carbon metin mang oxy trong vùng δC 65-80 ppm (C-2’’’; C-3’’’; C-4’’’; C-5’’’), và một carbon metyl bão hòa δC 16.5 ppm (C-6”’). Đây là tín hiệu đặc trưng của phần đường L-rhamnose. - Tín hiệu của –CH2– xuất hiện tại δC 67.2 ppm, kết hợp với phổ HMBC cho thấy proton anomer thứ hai H-1”’ cho tương quan với C-6” chứng tỏ đơn vị đường thứ hai gắn với đơn vị đường thứ nhất qua cầu nối 1-6. So sánh số liệu phổ nghiệm của hợp chất 2 với hợp chất 1 và với kaempferol 3-O-β-D-rutinoside[14,43,57] được trình bày trong bảng 2.3 cho thấy sự tương đồng. Vậy cấu trúc của EREC- EA26 được đề nghị là kaempferol 3-O-β-D-rutinoside. Bảng 2.5: Phổ 1H, 13C-NMR và HMBC của hợp chất 2. Vị trí Loại carbon EREC-EA26 Kaempferol 3-O-β- D-rutinoside δH ppm (J, Hz) δC ppm HMBC (1H→13C) δH ppm (J, Hz) δC ppm 2 >C= - 158.1 - - 156.4 3 >C= - 134.1 - - 133.1 4 >C= - 178.1 - - 177.2 5 >C= - 161.1 - - 161.1 6 =CH- 6.24 (d, 2.0) 98.6 5, 7, 8, 10 6.2 (br, s) 98.7 7 >C= - 164.6 - - 164.0 8 =CH- 6.43 (d, 2.0) 93.6 6, 7, 9, 10 6.4(br, s) 93.7 9 >C= - 157.2 - - 156.7 10 >C= - 104.3 - - 103.7 1’ >C= - 121.4 - - 120.7 2’,6’ =CH- 8.08 (d, 8.5) 134.1 2’, 3’, 4’,5’, 6’ 7.98 (d, 8.7) 130.7 3’,5’ =CH- 6.92 (d, 9.0) 131.0 1’, 3’, 4’, 5’ 6.88 (d, 8.7) 115.0 4’ >C= - 160.1 - - 159.8 1” >CH- 5.14 (d, 7.0) 103.2 3, 2’’ 5.3 (d, 6.9) 101.3 2” >CH- - 74.4 - - 74.1 3” >CH- - 75.9 1’’, 5’’ - 76.3 4” >CH- 3.28 (d, 5.0) 68.3 3’’ - 69.8 5” >CH- - 76.8 - - 75.6 6” -CH2-a 3.83 (d, 9.5) 67.2 4’’, 1’’’ - 66.8 6” -CH2-b 3.37 ( d, 0.5) - - 1”’ >CH- 5.14 (d, 1.5) 101.0 6’’, 2’’’ 4.39 (br,s) 100.7 2’” >CH- 3.66 (dd, 3.5, 1.5) 70.7 3’’’ - 70.2 3’” >CH- 3.55 (dd, 9.0, 3.5) 71.0 4’’’ - 70.5 4’” >CH- 3.30 (d, 6.0) 72.5 2’’’ - 71.7 5’” >CH- 68.3 - - 68.1 6’” -CH3 1.14 (d, 6.5) 16.5 4’’’, 5’’’ 1.1 (d, 6.4) 17.6 O O HO OH H H H H H H OH 2 O HO HO OH 3 45 6 1' 7 8 9 10 O 2' 3' 4' 5' 6" 1" 2"5" 3" 4" 6' O OH O HO HO H3C 1"' 2"' 3"' 4'" 5"' 6"' Kaempferol 3-O-β-D-rutinoside CHƯƠNG 3:KẾT LUẬN Quá trình nghiên cứu cây Nam sâm đứng Berhaavia erecta L. thuộc họ bông phấn (Nyctaginaceae), thu hái tại Thủ Đức, đã thu được kết quả sau: 3.1. CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT HỮU CƠ Phần thân lá cây Nam sâm đứng tươi sau khi phơi khô, được điều chế thành cao metanol bằng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ thường. Kế đó, sử dụng phương pháp trích lỏng- lỏng để phân chia cao metanol thành các loại cao khác nhau. Thu suất của các cao so với cao metanol ban đầu: cao ete dầu hỏa (15.55%), cao etyl acetat (10,24%) và cao metanol còn lại (65,31%). Cao etyl acetat được lựa chọn để nghiên cứu trong khóa luận này. Từ cao etyl acetat, bằng phương pháp sắc ký cột silica gel đã tách được thành 6 phân đoạn. Phân đoạn EA.F đã được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu. Từ phân đoạn EA.F đã cô lập được 2 hợp chất, ký hiệu là EREC- EA25 và EREC- EA26. Sử dụng các phương pháp hóa lý hiện đại NMR (một chiều và hai chiều), kết hợp so sánh với các tài liệu tham khảo, đã xác định được cấu trúc các hợp chất hữu cơ cô lập được như sau: - EREC- EA25 là quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside. - EREC- EA26 là kaempferol 3-O-β-D-rutinoside. O O OH OH OH HO O HOHO OH HO O O O OH OH HO O O HOHO OH OHHO HO O O Quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside Kaempferol 3-O-β-D-rutinoside. 3.2. CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Vì điều kiện thời gian và vật chất hạn chế, nên trong phạm vi của bài khóa luận này, chỉ khảo sát một phân đoạn của cao etyl acetat. Trong thời gian tới, chúng tôi sẽ tiếp tục tiến hành khảo sát thành phần hóa học và thử hoạt tính sinh học trên các phân đoạn cao còn lại của cao etyl acetat và các loại cao khác. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1]. Phan Đức Bình (2004), Tạp chí Thuốc v Sức khỏe, số 273, trang 16. [2]. Võ Văn Chi (1996), Từ điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y Học, TP. HCM, trang 1029-1030. [3]. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Tập 1, NXB Trẻ, trang 717. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI [4]. Abdelhakim Ahmed-Belkacem, Sira Macalou, Francesca Borrelli, Raffaele Capasso, Ernesto Fattorusso, Orazio Taglialatela-Scafati, and Attilio Di Pietro, (2007), Nonprenylated rotenoids, a new class of potent breast cancer resistance protein inhibitors, J. Med. Chem., 50(8), 1933-1938. [5]. Abdul Khaliq Dardass, (1999), Spectroscopic and chemical studies on the chemical constituents of Salvia triloba and related plant species, 141-145. [6]. Adesina S.K. (1979), Anticonvulsant properties of the roots of Boerhaavia diffusa. Quarterly Journal of Crude Drug Research, 17, 84-86. [7]. Alberdan S. Santos, Luiz C. Caetano and Antơnio E. G. Sant’Ana, (1998), A 12a-Hydroxyrotenoid from Boerhaavia coccinea, Phytochemistry, 49(1), 255-258. [8]. Ahmad Najam, Akhilesh K. Singh, and H. N. Verma, (2008), Ancient and modern medicinal potent of Boerhaavia diffusa and Clerodendrum aculeatum, Research in Environment and Life Sciences, 1(1), 1-4. [9]. Awasthi L.P., Chaudhury B., Verma H.N. (1984). Prevention of plant virus diseases by Boerhaavia diffusa inhibitor. International Journal of Tropical Plant Diseases 2, 41–44. [10]. Awasthi L.P., Kluge, S., Verma, H.N. (1989). Characteristics of antiviral agents induced by Boerhaavia diffusa glycoprotein in host plants. Indian Journal of Virology 3, 156–169. [11]. Babita Agrawal, Sunanda Das and Archana Pandey, (2011), Boerhaavia diffusa Linn: A review on its phytochemical and pharmacological profile, Asian Journal of Applied Sciences, 4(7), 663-684. [12]. Bhalla T.N., Gupta M.B., Sheth, P.K., Bhargava, K.P. (1968). Antiinflammatory activity of Boerhaavia diffusa. Indian Journal of Physicology and Pharmacology 12, 37. [13]. Butsarakham Supudompol, Sumphan Wongseripipatana and Kittisak Likhitwitayawuid, (2005), Chemical constituents of Breynia glauca leaves. [14]. Cailean Clarkson, Dan Stærk, Steen Honore´ Hansen, and Jerzy W. Jaroszewski, (2005), Hyphenation of Solid-Phase Extraction with Liquid Chromatography and Nuclear Magnetic. Resonance: Application of HPLC-DAD- SPE-NMR to Identification of Constituents of Kanahia laniflora. [15]. Chakraborti K.K. and Handa S.S. (1989). Antihepatotoxic investigations of Boerhaavia diffusa L. Indian Drugs 27, 161-166. [16]. Chandan B.K., Sharma A.K., Anand, K.K. (1991). Boerhaavia diffusa, A study of its hepatoprotective activity. Journal of Ethnopharmacology 31 (3) ,299– 307. [17]. Chopra G.L. (1969). Angiosperms. Systematics and Life Cycle. S. Nagin & Co., Jalandhar, Punjab, India, 361–365. [18]. Chopra R.N., Ghosh S., Dey P., Ghosh B.N. (1923). Pharmacology and therapeutics of Boerhaavia diffusa (punarnava). Indian Medical Gazette 68, 203– 208. [19]. C.O. Ujowundu, C.U. Igwe, V.H.A. Enemor, L.A. Nwaogu, O.E. Okafor, (2008). Nutritive and anti-nutritive properties of Boerhaavia diffusa L. and Commelina nudiflora leaves. Pakistan Journal of Nutrition 7 (1), 90-92. [20]. Fu-San Chou, Ho-Yih Liu and Chiou-Rong Sheue. (2004), Boerhaavia erecta L. (Nyctaginaceae), A new adventive plant in Taiwan, Taiwania , 49(1), 39-43 [21]. Francesca Borelli, Valeria Ascione, Raffaele Capasso, Angelo A. Izzo, Ernesto Fattorusso, Orazio Taglialatela-Scafati (2006), Spasmolytic effects of nonprenylated rotenoid constituents of Boerhaavia diffusa roots, J. Nat. Prod., 69, 903-906. [22]. Francesca Borelli, Valeria Ascione, Raffaele Capasso, Angelo A. Izzo, Ernesto Fattorusso, Orazio Taglialatela-Scafati et al. (2005), Isolation of new rotenoids from Boerhaavia diffusa and evaluation of their effect on intestinal motility, Planta Med., 71, 928-932. [23]. Fu-San Chou, Ho-Yih Liu and Chiou-Rong Sheue , (2004), Boerhavia erecta L. (Nyctaginaceae), A New Adventive Plant in Taiwan. [24]. Gaitonde B.B., Kulkarni H.J., Nabar S.D. (1974). Diuretic activity of punarnava (Boerhaavia diffusa). Bulletins of the Haffkine Institute (Bombay, India), 2, 24. [25]. Gilda Erosa-Rejón, Luis M. Peña-Rodríguez and Olov Sterner, (2010), Isolation of kaempferol-3-rutinoside from the leaf extract of Sideroxylon foetidissimum SUBSP. Gaumeri. [26]. Gopal T. K., Harish G., D Chamundeeswari, C. Umamaheswara Reddy. (2010), In-vitro anti-oxidant activity of roots of Boerhaavia diffusa Linn. Reseach Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 1(4), 782-788. [27]. Gulshan Chaudhary and Prem Kumar Dantu, (2011), Review: Morphological, phytochemical and pharmacological, studies on Boerhaavia diffusa L. Journal of Medicinal Plants Research, 5(11), 2125-2130. [28]. Hiruma-Lima C.A., Grazioso J.S., Bighetti E.J., Germonsen Robineou, Souza Brito A. R. (2000), The juice of fresh leaves of Boerhaavia diffusa L. (Nyctaginaceae) markedly reduces pain in mice. J Ethnopharmacol, 71, 267-274. [29]. Ilina Krasteva and Stefan Nikolov, (2007), FLAVONOIDS IN Astragalus corniculatus. [30]. Jianxin Li, Huiying Li, Shigetoshi Kadota, and Tsuneo Namba, (1996), Effects on cultured neonatal mouse calvaria of the flavonoids isolated from Boerhaavia repens, Journal of Natural Products, 59(11), 1015-1018. [31]. Juana I. Tilln Capĩ I; Viviana Bueno Pavĩn II; Carmen Carillo Domínguez III; Sara Aguero Fernndez IV; Odalys Valds Martínez V, (2009), Actividad hepatoprotectora del extracto acuoso seco de Boerhaavia erecta L. (tostĩn) en ratas, 14(3): 29-36. [32]. Kadota S., Lami, N., Tezuka Y., and Kikuchi T., (1989), Constituents of the roots of Boerhaavia diffusa Linn. I. Examination of sterols and structures of new rotenoids (boeravinones A and B). Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 37(12), 3214–3220. [33]. Kiran Iqbal, (2004), Phytochemical studies on Duranta repens Linn and Ehretia obtusifolia hochst, 200-221. [34]. Mandeep Kaur, Rajesh Kumar Goel, (2011), Anti-convulsant activity of Boerhaavia diffusa: plausible role of calcium channel antagonism, Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, (2011), 1-7. [35]. M.A. Chude, O.E. Orisakwe, O.J. Afonne, K.S. Gamanial, O.H. Vongtau, E. Obi, (2001), Hypoglycaemic effect of aqueous extract of Boerhaavia diffusa leaves. Indian Journal of Pharmacology, 33, 215-216. [36]. Meera Sumanth, S.S.Mustafa, (2007), Antistress, Adaptogenic and Immunopotentiating activitives roots of Boerhaavia diffusa in mice. International Journal of Pharmacology, 3 (5), 416-420. [37]. Mehrotra S., Mishra K.P., Maurya R., Srimal R.C., Singh V.K., (2002), Immunomodulation by ethanolic extract of Boerhaavia diffusa roots. Int Immunopharmacol, 2 (7), 987-996. [38]. Mishra J.P., (1980), Studies on the effect of indigenous drug Boerhaavia diffusa on kidney regeneration. Indian Journal of Pharmacy 12, 59. [39]. Mohammad Abdul Motaleb, (2010), Approaches to Conservation of Medicinal Plants and Traditional Knowledge. [40]. Mudgal V., (1975), Studies on medicinal properties of Convolvulus pluricaulis and Boerhaavia diffusa. Planta Medica 28, 62–68. [41]. Mungantiwar A.A., Nair A.M., Saraf M.N., Shinde U.A., Dikshit V.J., Thakur V.S., Sainis K.B., (1999), Studies on the immunomodulatory effects of Boerhaavia diffusa alkaloid fraction. Ethnopharmacol, 65 (2), 125-131. [42]. Mungantiwar A.A., Nair A.M., Saraf M.N., (1997), Adaptogenic activity of aqueous extract of the roots of Boerhaavia diffusa Linn. Indian Drugs, 34, 184. [43]. Ning Song, Wei Xu, Hongfeng Guan, Xiaoqiu Liu , Yibo Wang, Xiaoling Nie, Several flavonoids from Capsella bursa-pastoris (L.) Medic. [44]. Olukoya D.K., Tdika N., Odugbemi T., (1993), Antibacterial activity of some medicinal plants from Nigeria. Journal of Ethnopharmacology, 39, 69–72. [45]. P. Rajeswari and S. Krishnakumari, (2010), Boerhaavia erecta- A potential source for phytochemicals and antidioxidants, Journal of Pharmaceutical, 2(11), 728-733. [46]. P. V. Leyon, C. C. Lini, G. Kuttan, (2005), Inhibitory effect of Boerhaavia diffusa on experimental metastasis by B16F10 melanoma in C57BL/6 mice. Life Sciences, 76, 1339-1349. [47]. Pari L., Amarnath Satheesh M., (2004), Antidiabetic activity of Boerhaavia diffusa L., effect on hepatic key enzymes in experimental diabetes. J. Ethnopharmacol, 91 (1), 109-113. [48]. Peter C.H. Hollmana, John M.P. van Trijpa, Michel N.C.P. Buysmana, (1997), Relative bioavailability of the antioxidant navonoid quercetin from various foods in man. [49]. Rakhi Srivastava, Daman Saluja, Bilikere S. Dwarakanath, and Madhu Chopra, (2011), Original article: Inhibition of human cervical cancer cell growth by ethanolic extract of Boerhaavia diffusa Linn. (Punarnava) root. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine, 1-13. [50]. Rahul Pandey, Rakesh Maurya, Geetu Singh, B. Sathiamoorthy, Sita Naik. (2005), Immunosuppressive properties of flavonoids isolated from Boerhaavia diffusa Linn. International Immunopharmacology, 5, 541-553. [51]. Ramabhimaiah S., Stalin D., Kalaskar N.J., (1984), Pharmacological investigations of the water soluble fraction of the methanol extracts of Boerhaavia diffusa roots. Indian Drugs, 21 (8), 343-344. [52]. Rawat A.K.S., Mehrotra S., Tripathi S.K., Shama U. (1997). Hepatoprotective activity in punarnava – a popular Indian ethnomedicine. Journal of Ethnopharmacology, 56 (1), 61–68. [53]. Rupjyoti Bharali, Mohamed R.H, Azad, Jawahira Tabassum, (2003), Chemopreventive action of Boerhavia diffusa on DBMA-induce skin carcinogenenis in mice. Indian J Physiol Pharmacol, 47 (4), 459-464. [54]. Sahu A N, Damiki L, Nilanjan G, Dubey S, (2008), Phytopharmacological review of Boerhaavia diffusa Linn. (Punarnava). Pharmacognosy Reviews– Supplement, 2(4), 14-22. [55]. Shih-Huei Chen and Ming-Jou Wu, (2007), A Taxonomical Study of the Genus Boerhavia (Nyctaginaceae) in Taiwan. [56]. Shukla N., (2002), Study of genetic variation for economic traits and antimicrobial activity of Boerhaavia diffusa Linn. Ph.D. thesis, Lucknow University, Uttar Pradesh, India. [57]. Si Hyung Park, Hui Kim and Dong Young Rhyu, (2007), Flavonoids from the Stems of Eastern Picklypear Opuntia humifusa, Cactaceae. [58]. Singh R.H., Udupa K.N., (1972), Studies on the Indian indigenous drug punarnava (Boerhaavia diffusa Linn.). Part IV, Preliminary controlled clinical trial [59]. Singh R.P., Shokala K.P., Pandey B.L., Singh R.G., Usha Singh. R., (1992), Recent approach in clinical and experimental evaluation of diuretic action of Purnarnava (Boerhaavia diffusa L.) with special effect to nephrotic syndrome. J. Ind. Med. Res., 11, 29-36. [60]. Verma H.N., Awasthi L.P., (1979), Antiviral activity of Boerhaavia diffusa root extract and physical properties of virus inhibitor. Canadian Journal of Botany 57, 926–932. [61]. Thaminum Ansari and Kavitha, (2011), Biochemical studies on the curative Efficacy of Boerhaavia diffusa on the toxic influence of acetaminophen in rats. Asian Journal of Biochemical and Pharmaceutical Research, 4(1), 41-48. PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1- PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 1A- PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 1B- PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 2- PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 3- PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 4- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 4A- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 1 P HỤ LỤC 4B- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 4C- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 1 PHỤ LỤC 5- PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 5A- PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 5B- PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 5C- PHỔ 1H-NMR CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 6- PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 6A- PHỔ 13C-NMR CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 7- PHỔ DEPT-NMR CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 8- PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 8A- PHỔ HSQC CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 9- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 9A- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 9B- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 9C- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 2 PHỤ LỤC 9D- PHỔ HMBC CỦA HỢP CHẤT 2