Khóa luận Khảo sát thành phần hóa học của cây cành giao Euphorbia tirucalli L. thu hái ở tỉnh Bình Thuận

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA CÂY CÀNH GIAO EUPHORBIA TIRUCALLI L. THU HÁI Ở TỈNH BÌNH THUẬN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HÓA HỌC BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ  GVHD: ThS. Phạm Đức Dũng ThS. Dương Thúc Huy SVTH: Trần Thị Ngọc Nhung MSSV: K38.201.078 LỜI CẢM ƠN Với tất cả lòng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn tới Thầy Phạm Đức Dũng, Thầy đã truyền đạt nhiều kiến thức cùng với những kinh nghiệm giúp em hoàn thành khóa luận. Thầy Dương Thúc Huy đã dẫn dắt và giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo học và hoàn thành khóa luận. Các bạn Lê Thị Kim Dung, Hoàng Khánh An, Hạng Tái Xuân Hòa đã cùng đồng hành, động viên và giúp em vượt qua nhiều khó khăn. Ngoài ra, em cũng xin gửi lời cảm ơn tới bạn Nguyễn Hoàng Lâm, Ngô Thị Tuyết Nhung đã quan tâm, chia sẻ và nhiệt tình giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập. Cuối cùng em xin cảm ơn tất cả các bạn sinh viên phòng hợp chất thiên nhiên khoa Hóa trường Đại Học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã cộng tác và giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu. i MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii DANH MỤC CÁC CHỮ KÍ HIỆU VÀ VIẾT TẮT iv DANH MỤC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU v DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ vi LỜI MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................................... 2 1.1.SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀNH GIAO ......................................................................... 2 1.1.1. Tên gọi và phân bố ............................................................................................ 2 1.1.2. Mô tả cây ........................................................................................................... 2 1.2. DƯỢC TÍNH .......................................................................................................... 3 1.3. ĐỘC TÍNH ............................................................................................................. 5 1.4. ỨNG DỤNG CỦA CÂY CÀNH GIAO ................................................................. 5 1.4.1. Ứng dụng trong y học cổ truyền ....................................................................... 5 1.4.2. Ứng dụng khác .................................................................................................. 6 1.5. NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC ......................................................... 6 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM ................................................................................... 11 2.1. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ ....................................................................................... 11 2.1.1. Hóa chất .......................................................................................................... 11 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................................ 11 2.2. NGUYÊN LIỆU ................................................................................................... 12 2.2.1. Thu hái nguyên liệu ........................................................................................ 12 2.2.2. Xử lí mẫu nguyên liệu ..................................................................................... 12 2.3. KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT .................... 12 2.3.1 Khảo sát phân đoạn HA.1.6 và HA.1.7............................................................ 13 2.3.2 Cô lập hợp chất G.C1 ....................................................................................... 13 2.3.3 Cô lập hợp chất G.N1 ...................................................................................... 14 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................... 16 3.1. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.N1 ...................................................... 16 3.2. KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C1 ...................................................... 19 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .................................................................. 22 4.1. KẾT LUẬN ........................................................................................................... 22 4.2. ĐỀ XUẤT ............................................................................................................. 22 ii TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 23 PHỤ LỤC iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 13C-NMR : Carbon Nuclear Magnetic Resonance 1H-NMR : Proton Nuclear Magnetic Resonance AcOH : Acetic acid C : Chloroform d : Mũi đôi (Doublet) DMSO : Dimethyl sulfoxide EA : Ethyl acetate H : n-hexane HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Coherence HR-ESI-MS : Hight Resolution- Electro Spray Ionization- Mass Spectrometry HSQC : Heteronuclear Single Quantum Correlation J : Hằng số tương tác spin-spin m : Mũi đa (Multiplet) m/z : Mass to charge ratio Transfer Me : Methanol NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance) ppm : Part per million s : Mũi đơn (Singlet) t : Mũi ba (Triplet) UV : Tia cực tím (ultra violet) iv DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU  HÌNH ẢNH Hình 1.1. Cây cành giao ............................................................................ 2 Hình 1.2. Các hợp chất cô lập được từ cây cành giao ............................... 7 Hình 3.1. Công thức cấu tạo và tương quan HMBC của G.N1 .............. 17 Hình 3.2. Công thức cấu tạo và tương quan HMBC của G.C1 ............... 20 Hình 4.1. Hai hợp chất cô lập được từ cao ethyl acetate ......................... 22  SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1. Quá trình ly trích và cô lập từ cây cành giao .......................... 15  BẢNG BIỂU Bảng 1.1. Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây ............................ 3 Bảng 1.2. Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây ............................... 4 Bảng 2.1. Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate ....................................... 13 Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của hợp chất G.N1 .............................................. 18 Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của hợp chất G.C1 .............................................. 21 v DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC PHỔ Phụ lục 1. Phổ 1H-NMR của hợp chất G.N1 trong dung môi acetone-d6 Phụ lục 2. Phổ 13C-NMR của hợp chất G.N1 trong dung môi acetone-d6 Phụ lục 3. Phổ HSQC của hợp chất G.N1 trong dung môi acetone-d6 Phụ lục 4. Phổ HMBC của hợp chất G.N1 trong dung môi acetone-d6 Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của hợp chất G.C1 trong dung môi acetone-d6 Phụ lục 6. Phổ 13C-NMR của hợp chất G.C1 trong dung môi acetone-d6 Phụ lục 7. Phổ HMBC của hợp chất G.C1 trong dung môi acetone-d6 Phụ lục 8. Phổ MS của hợp chất G.C1 vi LỜI MỞ ĐẦU Cây cành giao tên khoa học là Euphorbia tirucalli L. thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiacea). Nhiều nước trên thế giới như Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Malaysia sử dụng cành giao để chữa các căn bệnh như: viêm mũi, đau răng, mụn cóc, vàng da, đau nhức, côn trùng đốt, chấn thươngvà cả ung thư. Cây cành giao mọc hoang tại nhiều vùng ở Việt Nam và thường được sử dụng để chữa trị viêm xoang. Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L. tương đối ít, cho thấy thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene, diterpene, polyphenolCác hợp chất polyphenol có trong cây thuộc khung anthocyanin và tannin. Nhựa của Euphorbia tirucalli L. cũng được nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene và một số tannin (Fuerstenberger, G. và cộng sự, 1985; Fuerstenberger, G., 1977). Tuy nằm trong từ điển cây thuốc Nam nhưng hiện nay chưa có nghiên cứu hóa sinh học về cây cành giao được thực hiện ở Việt Nam. Những nghiên cứu trước đây về Euphorbia tirucalli L. cho thấy cây cành giao là loại cây tiềm năng cho nghiên cứu hóa sinh học. Nhận thấy được những ứng dụng quý giá của loài Euphorbia tirucalli L., chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L. với mong muốn đóng góp một phần vào việc phát triển nghiên cứu và sử dụng những hợp chất từ loài cây này. 1 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 SƠ LƯỢC VỀ CÂY CÀNH GIAO 1.1.1 Tên gọi và phân bố Cây cành giao Euphorbia tirucalli L. thuộc chi Euphorbia là một trong 8.000 loài trong họ Euphorbiaceae. Đây là một loài đặc hữu của vùng nhiệt đới.[7] Cây cành giao dễ dàng phát triển trên tất cả các châu lục có khí hậu nhiệt đới hoặc khô và ấm áp bao gồm châu Phi, Châu Á và Nam Mỹ. Ở Việt Nam, cây giao còn có tên gọi khác như: san hô xanh, xương cá, cây nọc rắn, cây xương khô Cây thường được trồng làm hàng rào và còn để trang trí. 1.1.2 Mô tả cây Cây cành giao Euphorbia tirucalli L. có thể mọc như một cây bụi nhỏ và cũng có thể phát triển cao từ 4-12 m với đường kính thân cây khoảng 15-20 cm. Nhánh của cây thường xanh, mọng nước, dày khoảng 7 mm, mọc thành cụm, có độ dài không đều, mọc tua tủa ra các phía. Lá nhỏ, hẹp, rụng sớm, thường chỉ có cành nhánh trơ trọi, nhánh khi bẻ ra thấy nhiều mủ màu trắng đục như sữa.[16] Hình 1.1. Cây cành giao 2 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG 1.2 DƯỢC TÍNH Euphorbia tirucalli L. với thành phần hóa học đa dạng bao gồm các dẫn xuất isoeuphorol triterpenoic, taraxasterol, tirucallol, phorbol, ingenane, togliane và acid diterpenic. Một vài nghiên cứu cho thấy các hoạt tính sinh học của cây cành giao như diệt nhuyễn thể, diệt ấu trùng, kháng virus và gây độc tế bào, chống lại các khối u.[17] Một số các hoạt tính sinh học được tóm tắt trong bảng 1.1. Bảng 1.1: Hoạt tính trên nhựa cây và cao chiết của cây Hoạt tính Nguồn Tài liệu trích dẫn Kháng virus Mủ cây Ramesh 2009[18] Avelar 2011[2] Betancur-Galvis 2002[3] Kháng ung thư và điều trị AIDS Cao chiết cây Dias 2006[4] Kháng viêm Mủ cây Santana 2014[19] Miễn dịch Cao chiết cây Valadares 2006[21] Kháng khuẩn Cao chiết cây Lirio 1998[13] Kháng oxi hóa và chức năng bảo vệ gan Cao chiết cây Jyothi 2008[10] Chất diệt côn trùng và sinh vật gây hại: Brevicoryne brassicae, Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus, Biomphalaria gabrata, Lymneae natalensis Cao chiết cây Mwine J., Van Damme 2011[16] 3 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG Bảng 1.2 Đa dạng hóa học trên các bộ phận của cây cành giao[16] Hợp chất hóa học Nguồn (bộ phận) Tài liệu trích dẫn 4-Deoxyphorbol di-ester Mủ cây Kinghorn 1979 Campesterol (9), sitosterol (10), stigmasterol (11), β- isofucosterol (12), cycloartenol (sterol) Toàn cây Uchida và cộng sự 2010 Cycloeuphordenol (16) (triterpene) Mủ cây Khan 2010 Cyclotirucanenol (14) (triterpene) Mủ cây Khan và Ahmed 1988 Diterpene ester Mủ cây Khan và Malik 1990 Euphol (18) và β-amyrin (19) (triterpenoid) Toàn cây Uchida và cộng sự 2010 Euphorbin A (polyphenol) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991 Euphorcinol (17) (pentacyclic triterpene) Vỏ thân cây Khan 1989 Euphorbol Mủ cây Furstenberger và Hecker 1977 Serine protease Mủ cây Lynn và Clevett 1985 Steroid Mủ cây Nielson và cộng sự 1979 Taraxerane triterpene (20) Vỏ thân cây Rasool 1989 Tirucalicine (8) (diterpene) Mủ cây Khan 2010 Tirucallin A (22) (tannin) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991 Tirucallin B và Euphorbin F (dimer) Thân cây Yoshida và Yokoyama 1991 Trimethylellagic acid Mủ cây Chatterjee và cộng sự 1977 4 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG 1.3 ĐỘC TÍNH Mặc dù có nhiều công dụng với hoạt tính sinh học đa dạng nhưng mủ của Euphorbia tirucalli rất độc. Cây cành giao có nhiều diterpenoid loại phorbol được cô lập tuy không gây chết người nhưng làm tổn thương nặng da và mắt. Nhựa của cây giao có thể làm phồng da và xung huyết da, gây nôn mửa với liều lớn nhưng nó lại là thuốc tẩy với liều nhỏ và áp dụng đối với đau răng, đau tai, thấp khớp, mụn cóc, ho, thần kinh và bọ cạp cắn.[8] Mủ của cây Euphorbia tirucalli L. đã được nghiên cứu và cho thấy có tính năng diệt côn trùng, chống sâu bệnh như rầy (Brevicoryne brassicae) (Mwine và Van Damme, 2010), muỗi (Aedes aegypti và Culex quinquefasciatus) (Rahuman và cộng sự, 2008), vi sinh vật như vi khuẩn (Staphylocococcus aureus) (Lirio và cộng sự, 1998) và động vật thân mềm (Lymneae natalensis) (Vassiliades, 1984) và Biomphalaria gabrata (Tiwari, 2006).[16] Sileshi và cộng sự (2009) đã báo cáo rằng Euphorbia tirucalli L. đứng đầu trong số các loài cây được sử dụng cho việc kiểm soát các nguy hại từ mối.[1] 1.4 ỨNG DỤNG CỦA CÂY GIAO 1.4.1 Trong y học cổ truyền Theo Schmelzer, Gurib-Fakim (2008) và Van Damme (1989) thì ở Đông Phi, mủ của cành giao được sử dụng để chống bệnh liệt dương, mụn cóc, động kinh, đau răng, trĩ, rắn cắn. Ở bán đảo Malaysia, rễ hoặc thân cành giao được dùng để đắp chữa trị cho loét mũi, trĩ và các chỗ sưng. Các mảnh rễ trộn với dầu dừa chữa đau dạ dày. Ở Ấn Độ, Kumar (1999) ghi lại rằng cành giao là loại cây không thể thiếu trong vườn nhà và sử dụng như là một phương thuốc cho các bệnh như: phì lá lách, hen suyễn, chướng cổ, bệnh phong, huyết trắng, khó tiêu, vàng da, đau bụng, các khối u, sỏi bàng quang. Duke (1983) và Van Damme (1989) đề cập rằng tại Brazil, cành giao được sử dụng chống lại bệnh ung thư, u dạng ung thư, ung thư biểu mô, bướu thịt, các khối u và mụn cóc mặc dù vẫn còn tranh cãi về cơ sở khoa học về hợp chất chống ung thư của cây. Ở Malabar (Ấn Độ) và Moluccas, mủ được sử dụng như thuốc gây nôn và trị 5 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG giang mai. Trong khi ở Indonesia, dịch của rễ được sử dụng trị đau nhức xương trong khi thuốc đắp của rễ hoặc lá cây được sử dụng điều trị loét mũi, trĩ. Nước sắc từ cây dùng để trị bệnh phong và tê liệt tay chân sau khi sinh con (Duke, 1983). Ở Java, mủ được sử dụng để chữa trị các bệnh về da và gãy xương.[16] 1.4.2 Ứng dụng khác - Làm cây cảnh. - Nguồn năng lượng thay thế: nhựa cây chứa lượng lớn triterpenoid 30C có thể thực hiện cắt mạch để cho xăng có chỉ số octane cao.[16] - Nguồn cao su: nhựa cây chứa nhiều terpene và resin có thể chuyển hóa thành cao su với giá thành thấp.[16] - Nông lâm nghiệp: với đặc tính chống hạn, cây được sử dụng ở các vùng đất bán hạn hán để bảo vệ đất. 1.5 NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC Euphorbia tirucalli L. có chứa chất mủ màu trắng như sữa trong toàn cây khi cắt ngang. Mủ cây có thể chiếm tới 28% trọng lượng khô, trong đó gồm 21-27% các hợp chất tan trong nước, 59-63% là nhựa-chất tan và 12-14% các hợp chất như cao su. Thành phần hóa học của các bộ phận cây khác nhau, được minh họa trong bảng 1.2[16] Cho đến nay, số lượng nghiên cứu về thành phần hóa học của Euphorbia tirucalli L. tương đối ít và thành phần hóa học chính chủ yếu là các hợp chất phytosterol, tritepene, diterpene, polyphenol(Uchida Hidenobu, Y. H. và cộng sự, 2009; Lin, S.-J.và cộng sự, 2001; Yoshida, T. và cộng sự, 1991; Baslas, R. K., 1983)[12][20][22]. Nhựa của Euphorbia tirucalli L. cũng được nghiên cứu riêng cho thấy thành phần chính gồm các diterpene thuộc khung sườn ingenane và tigliane (Fuerstenberger, G. cộng sự, 1985; Fuerstenberger, G., 1977).[8] 6 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG Năm 1977, Fiirstenberger G. và Hecker E. cô lập được 4 hợp chất từ mủ của cây Euphorbia tirucalli L. Đó là các hợp chất: 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1), phorbol (2), 3,5,20-tri-O-acetylingenol (3); ingenol (4).[7][8] Năm 1990, Takashi Yoshida và Koh-ichi Yokoyama công bố ba hợp chất polyphenol từ cây cành giao là tirucallin A (22), tirucallin B (23) và euphorbin F (24).[22] Lin S.-J. (2001) đã cô lập được 14 hợp chất, đó là: 3,3',4-tri-O- methyl-4-O- rutinosyl ellagic acid (26), 1-O-galloyl-β-D-glucoside (27), 1,2,3-tri-O-Galloyl-β-D- glucoside, pedunculagin (28), casuariin (29), corilagin (30), 2,3-(S)- hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside (31), putranjivain A (32), putranjivain B (33), gallic acid (34), quercitrin (35), rutin (36), 5-desgalloylstarchyurin (37) và 3,3' - di-O-methyl gallic acid.[12] HO O HHO OAc OAc HH OAc CH2OH HO O HHO OH OH HH H H CH2OH O HO HO HO H H H CH2OAc O AcO HO AcO H CH2OH H O HHO OH OH H H CH2OH H O HHO OH OH H H 4-Deoxyphorbol (5) 4-Deoxy-4α-phorbol (6) 12,13,20-tri-O-acetylphorbol (1) Phorbol (2) 3,5,20-tri-O-acetylingenol (3) Ingenol (4) H O H OH O O HH OH O C3H7 O 12-O-[(2Z,4E)-2,4,6-decatrienoyl]- 4-Deoxyphorbol-13- acetate (7) MeO H OAc AcO OAc O O Tirucalicine (8) Hình 1.3. Các hợp chất cô lập từ cây cành giao 7 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG HO H H H H β-Sitosterol (10) �Isofucosterol (12) HO H H H H Stigmasterol (11) HO H H H H HO H H H H Campesterol (9) HO H H HO H H H HO H H HO H H H Cycloartenol (13) Cyclotirucanenol (14) 24-Metylenecycloartanol (15) Cycloeuphordenol (16) H OH H H H HO H H Euphorcinol (17) HO H HH Euphol (18) β-Amyrin (19) Taraxerane (20) Glutinol (21) H H H HO H H H H O O OO O OHHO OH OHHO HO OH OH OH OH HO HO O OH OH HO O O OHOH O OHHO OH OHHO OH OH OH O O OO O O O O O O O O CO CO O HO H O OH HO OH OH OH OH OH OH OHHOOHHO OH HO HO HO HO OH OH OH OH HO OH OH HO HO OH CO CO O HO H O OH OH OH HO b a O O OO O O OO O O O O O O O O O O Tirucallin A (22) Euphorbin F (23) Hình 1.3. Các hợp chất cô lập từ cây cành giao (tiếp) 8 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG O O O H H O O O O O O O O O O O O O OH OHHOOHO HO OH OH OHOH HO HO OH OH OHHO OH OH OOO O O OO O OH HO HO HO HO HO O HO OH OH O OH OH OH OH OH OH O O O O O MeO MeO OMeO O O O H HO OH OH OH OH Tellimagrandin II (25) 3,3',4-tri-O-methyl-4'-O-rutinosyl ellagic acid (26)Tirucallin B (24) O O OH OH OH OH HO OH HO 1-O-Galloyl-β-D-glucoside (27) CO OCH2 OCOO OH HO HO HO HO OH O O CO CO HO HO OH HO OH OH Pedunculagin (28) O O O O HO HH O OO O H HO OH OH OH OH OH OH OH OHHOOHHO HO Casuariin (29) HO HO HO O O O HO OH O O O O HO OH OH OH OH OH Corilagin (30) O O CH2OH OHOC O CO HO OH OHHO OHHO OH 2,3-(S)-hexahydroxydiphenoyl-D-glucopyranoside (31) Hình 1.3. Các hợp chất cô lập từ cây cành giao (tiếp) 9 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG O O O OH HO HO OH O O HO HO O O H H O O O HO H OH HOOHHO OH HO O O H O HO HO OH O Putranjivain B (33) OHHOHO OH HO OH O O O CO O CH2 O CO CO O OHO HO OH OH CO O O HO OH H OOC OH OH OH HO Putranjivain A (32) COOH OHHO OH Gallic acid (34) OOHO OH OHO OH OH OH Me OH O Quercitrin (35) C C H O CH2 O H H O H OH HO OH OH HO H OH OH OH HO HO HO HO OH CO C O O O O 5-desgalloylstarchyurin ((37) OHO OH OH OH O Rutin (36) O OH OHO HO O O OHHO HO H3C OH Hình 1.3. Các hợp chất cô lập từ cây cành giao (tiếp) 10 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG CHƯƠNG 2. NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ 2.1.1 Hóa chất - Dung môi gồm: hexane, ethyl acetate, acetic acid, chloroform, acetone, methanol, buthanol và nước cất. - Thuốc thử để hiện hình các vết hữu cơ trên bản mỏng: vanillin/H2SO4. - Sắc ký lớp mỏng 25DC-Aflufolien 20x20, Kiesel gel 60F254, Merck. - Sắc ký cột thường dùng silica gel 60, 0,04-0,06 mm, Merck. 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ - Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu. - Các cột sắc ký. - Máy cô quay chân không. - Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm. - Cân điện tử. - Các thiết bị ghi phổ: phổ 1H-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 500 MHz và phổ 13C-NMR ghi trên máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker ở tần số 125 MHz. - Tất cả phổ NMR được ghi tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ Chí Minh, số 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh. 11 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG 2.2 NGUYÊN LIỆU 2.2.1 Thu hái nguyên liệu Mẫu cây dùng trong nghiên cứu là thân cây cành giao Euphorbia tirucalli L. được thu hái tại huyện Hàm Thuận Bắc, tỉnh Bình Thuận, vào tháng 3 năm 2015. 2.2.2 Xử lý mẫu nguyên liệu Mẫu nguyên liệu được rửa sạch, loại bỏ phần sâu bệnh, phơi khô rồi xay thành bột mịn. Sau đó tiến hành đun hoàn lưu với ethanol và phân lập các hợp chất. 2.3 KHẢO SÁT CÁC PHÂN ĐOẠN VÀ CÔ LẬP CÁC HỢP CHẤT Bột cây 3.5 kg được chia làm hai phần, lần lượt đun hoàn lưu với ethanol trong vòng 7 giờ, lọc, cô quay thu hồi dung môi. Phần dịch thu được trong quá trình cô quay thu hồi dung môi để lắng, lọc riêng phần tủa ethanol thô (250.4 g) và phần dịch ethanol thô còn lại Et1 (290.3 g). Tiếp tục hòa phần tủa ethanol thô với ethanol đun nóng, thu được phần dịch Et2 (101.2 g) và phần tủa (149.2 g). Cao ethanol Et1, Et2 được chiết lỏng-lỏng lần lượt với các dung môi n-hexane, ethyl acetate và butanol thu được các cao tương ứng như minh họa trong sơ đồ 2.1. Tiến hành sắc ký cột trên cao ethyl acetate EA1 và EA2, sau đó sắc ký cột nhiều lần trên những phân đoạn được chọn để cô lập các hợp chất. Toàn bộ quá trình được theo dõi bằng sắc ký bản mỏng với thuốc thử hiện hình là dung dịch vanillin/H2SO4, soi đèn UV. Sắc ký cột cao ethyl acetate - EA1, EA2 trên silica gel pha thường sử dụng hệ dung môi H: EA với độ phân cực tăng dần từ 50% đến 100% ethyl acetate. Dựa trên kết quả sắc ký cột, phần EA1 thu được tám phân đoạn (HA.1.1- HA.1.8), phần cao EA2 thu được tám phân đoạn (HA.2.1- HA.2.8). 12 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG Bảng 2.1: Kết quả sắc ký cột cao ethyl acetate trên silica gel thường Phân đoạn Tên EA (1) EA (2) 1 HA.1.1 (1.58 g) HA.2.1 (0.37 g) 2 HA.1.2 (2.76 g) HA.2.2 (3.14 g) 3 HA.1.3 (1.15 g) HA.2.3 (2.12 g) 4 HA.1.4 (2.48 g) HA.2.4 (4.21 g) 5 HA.1.5 (2.35 g) HA.2.5 (2.69 g) 6 HA.1.6 (2.5 g) HA.2.6 (3.15 g) 7 HA.1.7 (1.95 g) HA.2.7 (1.84 g) 8 HA.1.8 (0.24 g) HA.2.8 (0.89 g) 2.3.1 Khảo sát phân đoạn HA.1.6 và HA.1.7 Thực hiện sắc ký cột phân đoạn HA.1.6 (2.5 g) và phân đoạn HA.1.7 (1.95 g) trên silica gel pha thường với hệ dung môi giải ly H:EA, dịch giải ly thu được khảo sát bằng sắc kí lớp mỏng, những lọ cho các vết giống nhau được gom thành một phân đoạn, kết quả HA.1.6 thu được 12 phân đoạn (HA.1.6.1-HA.1.6.12) và HA.1.7 thu được 11 phân đoạn (HA.1.7.1-HA.1.7.11) 2.3.2 Cô lập hợp chất G.C1 Phân đoạn HA.1.6.5 (2.5 g) cho vết màu cam rõ nên tiếp tục được khảo sát bằng sắc kí cột trên pha thường với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1:0.3). 13 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG Phân đoạn HA.1.7.3 (1.95 g) cũng cho vết màu cam với vị trí xuất hiện trên bản mỏng giống với phân đoạn HA.1.6.5 nên được khảo sát song song với cùng hệ dung môi. Thực hiện chạy sắc kí cột silica gel pha thường trên phân đoạn HA.1.6.5 và phân đoạn HA.1.7.3, khảo sát bằng sắc kí bản mỏng cho vết màu cam khá rõ ở phân đoạn HA.1.6.5.4 và HA.1.7.3.7. Kết hợp hai phân đoạn này thu được 16.9 mg, tiếp tục thực hiện sắc kí cột với hệ dung môi H:EA:EtOH (5:0.6:0.2) thu được hợp chất G.C1 (3.5 mg). Qui trình cô lập được tóm tắt trong sơ đồ 2.1. 2.3.3 Cô lập hợp chất G.N1 Hợp chất G.N1 được cô lập từ phân đoạn HA.1.7.11 (507.0 mg). Phân đoạn HA.1.7.11 được khảo sát với hệ dung môi H:EA:Ac:AcOH (4:0.8:0.6:0.3) thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn HA.1.7.11.5 (233.3 mg) được thực hiện sắc kí cột silica gel pha thường, giải ly với hệ dung môi H:EA:AcOH (3:3:0.3) thu được G.N1 (5.1 mg). Qui trình cô lập được tóm tắt trong sơ đồ 2.1. 14 Bột cành giao khô (3.5kg) Đun hoàn lưu với ethanol, lọc, cô quay thu hồi dung môi. Et1 290.3 g Phần cao tủa ethanol 250.4 g Cao H1 94.2 g Cao EA1 61.8 g Cao Bu1 27 g Cao tủa ethanol 149.2 g HA1.1-5 + HA1.8 10.56 g HA1.6 2.5 g HA1.7 1.95 g Cao H2 50.0 g Cao EA2 32.0 g Cao Bu2 10.5 g G.C1 (3.5 mg) G.N1 (5.1 mg) Hệ dung môi A: H:EA:AcOH (4:1:0.3) Hệ dung môi B: H:EA:EtOH (5:0.6:0.2) Hệ dung môi C: H:EA:Ac:AcOH (4:0.8:0.6:0.3) Hệ dung môi D: H:EA:AcOH (3:3:0.3) SKC/A SKC/C SKC/B SKC/D Sơ đồ 2.1. Qui trình ly trích và cô lập các chất từ cây cành giao 16.9 mg HA1.7.11.5 Et2 101.2 g HA1.6.1-4+ HA1.6.6-12 HA1.6.5 HA1.6.5.4 HA1.7.11 (507 mg) HA1.7.3 90.1 mg HA1.7.3.7 15 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.N1 - Chất bột màu trắng. - Dữ liệu phổ 1H-NMR (500MHz, acetone-d6) và 13C-NMR ( 125MHz, acetone-d6) được trình bày trong bảng 3.1. - Phổ 1H-NMR được trình bày ở phụ lục 1. - Phổ 13C-NMR được trình bày ở phụ lục 2. - Phổ HSQC được trình bày ở phụ lục 3. - Phổ HMBC được trình bày ở phụ lục 4.  Biện luận cấu trúc của hợp chất G.N1: Phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của cặp proton olefin ghép trans với nhau δH 5.88 (1H, dd, J1=15.5 Hz, J2=4.5 Hz, H-8) và δH 5.83 (1H, d, J= 15.5 Hz, H-7) và một proton olefin tại δH 5.79 (1H, m, H-5), một nhóm methyl liên kết trực tiếp với nối đôi δH 1.88 (3H, d, J=2 Hz). Phân tích sự chẻ mũi của H-5 và H3-13 chứng tỏ chúng phải ở lân cận nhau và được củng cố bởi tương quan HMBC của H-5 và C-13. Ngoài ra phổ 1H-NMR còn cho thấy hai nhóm methyl mũi đơn tại δH 1.04 và tại δH 1.00, một nhóm oxymethine tại δH 4.34 (1H, m) và hai proton của nhóm methylene không tương đương δH 2.42 (1H, d, J= 16.5 Hz) và δH 2.10 (1H, d, J= 14.5 Hz) Phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của một carbon carbonyl δC 197.6, ba carbon alkene tại δC 126.9, 129.4, 137.1, một carbon Csp3 liên kết với oxygen δC 67.9, ba nhóm methyl tại δC 19.2, 23.4, 24.2 và 24.4, một nhóm methylene tại δC 50.5 và các carbon khác. Kết hợp phổ HMBC, phát hiện hai tín hiệu carbon tứ cấp bị thiếu trên phổ 13C-NMR tại δC 164.0 và 79.5. 16 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG Trong phổ HMBC, H-7, H-8 cho tương quan với C-1 (δC 79.5) và C-9 (δC 67.9), ngược lại H-9 cho tương quan với C-7 và C-8 giúp xác định vị trí của chúng trong cấu trúc của G.N1. Trong phổ HMBC, H-5 tương quan với C-1, C-3 và C-4, H3-13 tương quan với C-1, C-5, C-6 và cho tương quan xa với C-4. Mặt khác, H3-11, H3-12 tương quan với C-1, C-2 và C-3, H2-3 cho tương quan với C-1, C-2 và C-4 giúp hoàn thiện cấu trúc của nhân A. Với hai tâm lập thể ở C-1 và C-9, để xác định cấu hình tuyệt đối của G.N1, chúng tôi đã tiến hành phân tích các dữ kiện phổ của hợp chất G.N1 kết hợp so sánh với dữ kiện phổ của hợp chất vomifoliol[9] và corchoionol C[23] được công bố. Tuy nhiên, những dữ kiện này vẫn chưa đủ cơ sở để xác định tâm lập thể của hợp chất G.N1. Do đó cấu trúc của G.N1 được đề nghị như sau. O OH 4 5 6 1 2 3 7 8 9 OH 10 13 12 11 H H O OH 5 13 7 8 9 OH 10 13 12 11 HH A Hình 3.1 Công thức cấu tạo và một số tương quan HMBC của G.N1. 17 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG Bảng 3.1: Dữ liệu phổ1H-NMR, 13C-NMR của G.N1, vomifoliol và corchoionol C. O OH H 4 5 6 1 2 3 7 8 9 OH 10 13 12 11 H H G.N1 (Acetone–d6) O OH H OH H H Vomifoliol (CDCl3) O OH H OH H H Corchoionol C (CD3OD) N δH (ppm) J (Hz) δC (ppm) δH (ppm) J (Hz) δC (ppm) δH (ppm) J (Hz) δC (ppm) 1 - 79.5 - 78.9 - 80.0 2 - 41.9 - 41.0 - 42.5 3 2.42 (d, 16.5) 50.4 2.45 (d, 16.9) 49.6 2.51 (d, 17.0) 50.8 2.10 (d, 14.5) 2.25 (d, 16.9) 2.15 (d, 17.0) 4 - 197.6 - 195.5 - 201.8 5 5.79 (m) 126.9 5.90 (m) 127.9 5.83(m) 127.2 6 - 164.0 - 162.2 - 167.5 7 5.83 (d, 15.5) 129.4 5.81 (m) 129.0 5.83 (m) 130.1 8 5.88 (dd, 15.5, 4.5) 137.1 5.84 (m) 135.7 5.83 (m) 136.9 9 4.34 (m) 67.9 4.41 (m) 68.1 4.32 (q, 6.6) 68.8 10 1.20 (d, 6.5) 23.4 1.29 (d, 6.4) 23.7 1.24 (d, 6.6) 23.9 11 1.04 (s) 24.4 1.01 (s) 24.0 1.03 (s) 23.5 12 1.00 (s) 24.2 1.08 (s) 23.0 1.01 (s) 24.5 13 1.88 (d, 2.0) 19.2 1.89 (s) 18.8 1.92 (d, 1.3) 19.6 18 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG 3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT G.C1 - Chất bột màu trắng. - Dữ liệu phổ 1H-NMR (500MHz, acetone-d6) và 13C-NMR ( 125MHz, acetone-d6) được trình bày trong bảng 3.2. - Phổ 1H-NMR được trình bày ở phụ lục 5. - Phổ 13C-NMR được trình bày ở phụ lục 6. - Phổ HMBC được trình bày ở phụ lục 7. - Phổ MS được trình bày ở phụ lục 8.  Biện luận cấu trúc của hợp chất G.C1: Phổ 1H-NMR cho thấy sự hiện diện của bốn proton thơm tại δH 8.15 (dd, J1=8.5 Hz, J2=2 Hz), 7.2 (m, H-6), 7.21(m, H-7), 7.52 (dd, J1=7 Hz, J2=1.5 Hz, H- 8) ghép cặp lẫn nhau tương ứng với một nhân benzene mang hai nhóm thế ở vị trí 1,2; một proton alkene tại δH 8.03 (d, J=2.5 Hz), một nhóm –NH tại δH 10.93. Phổ 13C-NMR cho thấy sự hiện diện của chín tín hiệu carbon, gồm có một carbon amide tại δC 165.5, năm carbon methine tại δC 111.9, 120.8, 121.0, 122.3 và 131.6, cùng ba carbon tứ cấp khác. Phân tích sự ghép cặp của H-4 và H-5 chứng tỏ chúng lân cận nhau và được tái khẳng định bởi tương quan HMBC của H-4 với C-2 (δC 165.5), C-3 (δC 107.7), C-9 (136.4) và C-10 (δC 126.4), của H-5 với C-9 và C-3 (tương quan 4J). Ngoài ra, H-6 cho tương quan HMBC với C-8 (δC 111.9), H-7 cho tương quan HMBC với C-9, H-8 cho tương quan với C-10 giúp xác định vị trí của các proton H-6, H-7 và H-8. Độ dịch chuyển hóa học của C-9 (δC 136.4) giúp xác định vị trí này phải liên kết với dị tố nitrogen. Những dữ liệu phổ trên không đủ cơ sở để xác định nhóm thế tại vị trí C-3. So sánh dữ kiện phổ của G.C1 và các hợp chất: 3-hydroxyquinolin-2(1H)-one (A),[5] 3-benzamido-1H-quinolin-2-one (B),[3] 3-amino-1H-quinolin-2-one (C),[3] 3- 19 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG carboxycoumarin (D)[6] giúp xác định vị trí C-3 không thể mang nhóm thế -OH, - NH, -NH2, -COOH. Ngoài ra khối phổ cho mũi ion giả phân tử tại m/z 287.0539 giúp đề nghị công thức G.C1 phải tồn tại ở dạng đối xứng. Tuy nhiên, dữ liệu khối phổ vẫn chưa giúp khẳng định cấu trúc của hợp chất. Vì vậy, hợp chất G.C1 được đề nghị cấu trúc mô tả trong hình: N H O H NO 1 3 5 6 7 8 2 4 9 10 N H O H NO H H H H H Hình 3.2 Công thức cấu tạo và một số tương quan HMBC của G.C1. 20 N H O 1 5 7 9 10 G.C1 Acetone-d6 N H OH O 1 5 7 9 10 A DMSO-d6 N H N O 1 5 7 9 10 O H 1' 3' 5' 6' B CDCl3-DMSO-d6 N H NH2 O 1 5 7 9 10 C CDCl3–DMSO-d6 O COOH O 1 5 7 9 10 D DMSO-d6 N δH (ppm) J (Hz) δH (ppm) J (Hz) δH (ppm) J (Hz) δH (ppm) J (Hz) δH (ppm) J (Hz) 1 10.94 (s) 12.01 (s) 9.36 (s) 11.79 (s) - 2 - - - - 3 - - - - 4 8.03 (d, 2.5) 7.08 (s) 8.72 (s) 6.72 (s) 8.74 (s) 5 8.15 (dd, 8.5, 2.0) 7.49 (d, 7.9) 7.64-7.48 (m) 7.32 (d, 7.5) 7.9 (dd, 7.7, 1.5) 6 7.20 (m) 7.27 (m) 7.4-7.31 (m) 7.02 (t, 7.20, 1.50) 7.39 (t, 7.5) 7 7.21 (m) 7.12 (ddd, 7.9, 6.8, 1.7) 7.4-7.31 (m) 7.11 (t, 7.50, 1.50) 7.72(ddd, 8.2, 7.5, 1.5) 8 7.52 (m) 7.27 (m) 7.16.7.27 (m) 7.19 (d, 7.8) 7.43 (d, 8.2) 9 - - - - - 10 - - - - - 11 9.46 (s) 12.36 (s) 5.44 (s) 1’ - 2’ 7.91 (dd, 7.5, 1.8) 3’ 7.64-7.48 (m) 4’ 7.64-7.48 (m) 5’ 7.64-7.48 (m) 6’ 7.91 (dd, 7.5, 1.8) 7’ - Bảng 3.1 Dữ kiện phổ 1H-NMR của G.C1, 3-hydroxyquinolin-2(1H)-one (A), 3-benzamido-1H-quinolin-2-one (B), 3- amino-1H-quinolin-2-one (C) và 3-carboxycoumarin (D) 21 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP SV: TRẦN THỊ NGỌC NHUNG CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1 KẾT LUẬN Từ cây cành giao thu hái ở Bình Thuận, tiến hành điều chế thu được cao ethanol thô. Lấy dịch chiết cô quay thu hồi dung môi dưới áp suất thấp. Thu được phần dịch cân nặng 290.3 g và phần tủa 250.4 g. Tiến hành sắc ký cột trên phần dịch bằng hệ dung môi hexane: ethyl acetate với độ phân cực tăng dần thu được các phân đoạn cao tương ứng từ HA.1.1 đến HA.1.8 Tiến hành sắc ký cột trên phân đoạn cao HA.1.6, HA.1.7 và sử dụng các phương pháp phổ nghiệm hiện đại xác định được cấu trúc của hai hợp chất G.N1 và G.C1. O OH H 4 5 6 1 2 3 7 8 9 OH 10 13 12 11 H H N H O H NO 1 3 5 6 7 8 2 4 9 10 G.N1 G.C1 Hình 4.1 Hai hợp chất cô lập được từ cao ethyl acetate 4.2 ĐỀ XUẤT Vì điều kiện về thời gian và vật chất không cho phép, nên trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi chỉ khảo sát trên phân đoạn cao EA1. Trong thời gian sắp tới, nếu có điều kiện chúng tôi sẽ khảo sát trên các phân đoạn cao còn lại. Đồng thời chúng tôi sẽ tiến hành đo phổ của hợp chất G.N1 trong cùng dung môi với hợp chất vomifoliol và corchoionol C để xác định tâm lập thể của hợp chất G.N1 và thử nghiệm một số hoạt tính sinh học ở các hợp chất đã cô lập được. 22 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Avelar B.A., Lelis F.J.N., Avelar R.S., Weber M., Souza-Fagundes E.M., Lopes M.T.P., Martins-Filho O.A., Brito-Melo G.E.A. (2011), “The crude latex of Euphorbia tirucalli modulates the cytokine response of leukocytes, especially CD4+T lymphocytes”, Revista Brasileira de Farmacognosia, 21(4), 662-667. [2]. Betancur-Galvis L.A., Morales G.E., Forero J.E., Roldan J. (2002), “Cytotoxic and antiviral activities of Colombian medicinal plant extracts of the Euphorbia genu”, Mem Inst Oswaldo Cruz, 97, 541-546. [3]. Cecilia J.G., Alicia H.C., Rafael C. (2002), “An improved method for the synthesis of 3-amino-1H-quinolin-2-one”, Synthetic communications Vol. 32,19, 2959–2963. [4]. Dias J.M.M., Chaves C.P. (2006), “Combination of active fractions from the plants Euphorbia tirucalli L. and Ficus carica L. and method of treating cancer and AIDS”, PCT Int. Appl, WO 2006007676 A1 20060126. [5]. Duplantiner A.J., Stacey L.B., Michael J.B., Kris A.B., Boris A.C., James T.D., Hu L.Y., Ayman El-Kattan, Larry C.J., Liu S., Lu J., Noha M., Mahmoud N.M., Scot M., Mary A.P., Subas M.S., Susan S., Stefanus J.S., Christine A.S., Victoria A.W, Zhang L. (2009), “Discovery, SAR, and Pharmacokinetics of a Novel 3- Hydroxyquinolin-2(1H)-one Series of Potent D-Amino Acid Oxidase (DAAO) Inhibitors”, J. Med. Chem. 2009, 52, 3576–3585. [6]. Francesco F., Oriana P., Ferdinando P. (2003), “One-Pot Synthesis of 3- Carboxycoumarins via Consecutive Knoevenagel and Pinner Reactions in Water”, Synthesis. 2003,15, 2331–2334. [7]. Fuerstenberger G., Hecker E. (1977), “New highly irritant euphorbia factors from latex of Euphorbia tirucalli L.”, Experientia, 33(8), 986-988. [8]. Fuerstenberger G., Hecker E. (1985), “On the active principles of the spurge family (Euphorbiaceae). XI. [1] The skin irritant and tumor promoting diterpene 23 esters of Euphorbia tirucalli L. originating from South Africa”, Zeitschrift fuer Naturforschung, C: Journal of Biosciences , 40C(9-10), 631-646. [9]. Hammami S., Jannet H.B., Bergaoui A., Ciavatta L., Cimino G., Mighri Z. (2004), “Isolation and structure elucidation of a flavanone, a flavanone glycoside and vomifoliol from Echiochilon Fruticosum growing in Tunisia”, Molecules, 9, 602-608. [10]. Jyothi T.M., Shankariah M.M., Prabhu K., Lakshminarasu S., Srinivasa G.M., Ramachandra S.S.( 2008), “Hepatoprotective and Antioxidant Activity of E.tirucalli”, Iran J Pharmacol Ther, 7, 25-30. [11]. Kumar A., Prasad M., Mishra D., Srivastav S.K., Srivastav A.K. (2010), “Toxicity of aqueous extract of Euphorbia tirucalli latex on catfish, Heteropneustes fossilis”, Ecotoxicology and Environmental Safety,73, 1671–1673. [12]. Lin S-J., Yeh C-H., Yang L-M., Liu P-C., Hsu F-L. (2001), “Phenolic Compounds from Formosan Euphorbia tirucalli”, Journal of the Chinese Chemical Society, 48(1), 105-108. [13]. Lirio L., Hermano M., Fontanilla M. (1998), “Note Antibacterial Activity of Medicinal Plants from the Philippines”, Pharmaceutical Biology, 36(5), 357-359. [14]. Medeiros de Araujo K., de Lima A., Silva J.N., Rodrigues L.L., Amorim A.G.N., Quelemes P.V., dos Santos R.C., Rocha J.A., de Andrades E.O., Leite J.R.S.A., Mancini – Filho J. và Trindade R.A. (2014), “Identification of Phenolic Compounds and Evaluation of Antioxidant and Antimicrobial Properties of Euphorbia Tirucalli L.”, Antioxidants, 3, 159-175. [15]. Muthukumar R., Chidambaram R., Ramesh V. (2014), “Biosynthesis of silver nanoparticles from E. tirucalli and to check its antimicrobial activity”, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences, 5(2), 589-596. [16]. Mwine J., Van Damme P. (2011), “Euphorbia tirucalli L. (Euphorbiaceae) – The miracle tree: Current status of available knowledge”, Scientific Research and Essays, 6(23), 4905-4914. 24 [17]. Patil S.P, Magdum C.K. (2012), “The inhibitory effect of some Indian plant extracts on the aniline hydroxylase”. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 5(2), 129-131. [18]. Ramesh C.K., Prabha M.N., Deepak S. A., Madhusudhan K.N. (2009), “Screening of antiviral property against tobamoviruses in latex of Euphorbia tirucalli L., BioTechnology: An Indian Journal, 3(1), 1-3. [19]. Santana S.S., Gennari-Cardoso M.L., Carvalho F.C., Roque-Barreira M.C., Santiago A.S., Alvim F.C., Pirovani C.P. (2014), “Eutirucallin, a RIP-2 type lectin from the latex of Euphorbia tirucalli L. presents proinflammatory properties”, Plos One, 9(2), 88422. [20]. Uchida H., Yamashita H., Kajikawa M., Ohyama K., Osamu Nakayachi O., Sugiyama R., Yamato K.T., Muranaka T., Fukuzawa H., Takemura M., Ohyama K. (2009), “Cloning and characterization of a squalene synthase gene from a petroleum plant, Euphorbia tirucalli L.”, Planta, 229(6), 1243-1252. [21]. Valadares M.C., Carrucha S.G., Accorsi W., Queiroz M.L. (2006), “Euphorbia tirucalli L. modulates myelopoiesis and enhances the resistance of tumor bearing mice”, Int Immunopharmacol, 6, 294-299. [22]. Yoshida T., Yokoyama K., Namba O., Okuda T. (1991), “Tannins and related polyphenols of euphorbiaceous plants: VII.Tirucallins A, B and euphorbin F, monomeric and dimeric ellagitannins from Euphorbia tirucalli L.”, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 39, 1137-1143. [23]. Yoshikawa M., Shimada H., Saka M., Yoshizumi S., Yamahara J., Matsuda H. (1997), “Medicinal foodstuff. V. Moroheiya. (1): Absolute stereostructures of cochionosides A, B, and C, histamine release inhibitor from the leaves of Vietnamese Corchorus olitorius L. (Tilaceae)”, Chem. Pharm. Bull., 45(3), 464- 469. 25 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Phổ 1H -N M R của hợp chất G .N 1 trong dung m ôi acetone-d 6 -20-100102030405060708090100110120130140150160170180190200210220230 f1 (ppm) 19 .2 43 23 .4 20 24 .2 72 24 .4 52 41 .8 37 50 .4 52 67 .8 80 12 6. 91 1 12 9. 34 0 12 9. 38 6 13 7. 12 5 19 7. 55 9 4 8 7 5 9 3 2 13 12 10 11 Phụ lục 2. Phổ 13C-N M R của hợp chất G .N 1 trong dung m ôi acetone-d 6 -1012345678910111213 f2 (ppm) 0 50 100 150 200 f1 (p pm ) 8 7 5 9 3a 3b 13 10 11 12 4 8 5 7 9 3 13 11 10 12 Phụ lục 3. Phổ H SQ C của hợp chất G .N 1 trong dung m ôi acetone-d 6 -10123456789101112131415 f2 (ppm) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 f1 (p pm ) GN1-ACETONE-HMBC 4 8 7 5 9 3 2 1312 11 10 9 3a 3b 7 8 5 10 11 12 Phụ lục 4. Phổ H M BC của hợp chất G .N 1 trong dung m ôi acetone-d 6 6.46.66.87.07.27.47.67.88.08.28.48.68.89.09.29.49.69.810.010.210.410.610.811.011.211.4 f1 (ppm) 2 .0 1 1. 00 0. 99 1. 00 0. 77 7. 18 3 7. 18 9 7. 19 4 7. 19 8 7. 20 4 7. 20 7 7. 21 8 7. 49 8 7. 51 2 8. 02 9 8. 03 4 8. 14 8 8. 16 5 10 .9 39 GC1-ACETONE-1H 1 7 6245 7.857.907.958.008.058.108.158.208.25 f1 (ppm) 0. 99 1. 00 8. 02 9 8. 03 4 8. 14 8 8. 16 5 7.07.17.27.37.47.57.6 f1 (ppm) 2. 01 1. 00 7. 18 3 7. 18 9 7. 19 4 7. 19 8 7. 20 4 7. 20 7 7. 21 8 7. 49 8 7. 51 2 Phụ lục 5. Phổ 1H -N M R của hợp chất G .C1 trong dung m ôi A cetone-d 6 Phụ lục 5. Phổ 1H -N M R của hợp chất G .C1 trong dung m ôi acetone-d 6 110115120125130135140145150155160165170 f1 (ppm) 11 1. 87 5 12 1. 06 1 12 2. 29 4 12 6. 36 0 13 1. 77 8 13 6. 44 8 16 5. 52 0 2 10 7 9 5 8 4 Phụ lục 6. Phổ 13C-N M R của hợp chất G .C1 trong dung m ôi acetone-d 6 5.56.06.57.07.58.08.59.09.510.010.511.0 f2 (ppm) 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 f1 (p pm ) GC1-ACETONE-HMBC 1 5 4 8 67 2 9 4 10 7 5 8 Phụ lục 7. Phổ H M BC của hợp chất G .C1 trong dung m ôi acetone-d 6