Khóa luận Xác định đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong các dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Hiện 4 đường dung môi phục vụ chủ yếu cho việc rửa giải gradient dung môi theo thời gian và công tác xây dựng tiêu chuẩn. injector (1) (3) (2) (4) (5) (6) (7) (8) Trang 14 Lưu ý: Tất cả các dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết và có ghi rõ trên nhãn là dùng cho HPLC hay dung môi tinh khiết phân tích. Tất cả các hóa chất dùng để pha mẫu và pha hệ đệm phải được sử dụng là hóa chất tinh khiết phân tích và phải lọc qua hệ thống lọc 0,2 – 0,45 µm nhằm mục đích tránh làm hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo ra các peak tạp trong quá trình phân tích. 1.5.5.2. Bộ phận khử khí Mục đích của bộ khử khí nhằm loại trừ các bọt nhỏ còn sót lại trong dung môi pha động. Nếu như trong quá trình phân tích mà dung môi pha động còn sót các bọt khí thì một số hiện tượng sau đây sẽ sảy ra: - Tỷ lệ pha động của các đường dung môi lấy không đúng sẽ làm cho thời gian lưu của peak thay đổi. - Trong trường hợp bọt quá nhiều, bộ khử khí không thể loại trừ hết được thì có thể Pump sẽ không hút được dung môi (bị e) khi đó áp suất không lên và máy sắc ký sẽ ngừng hoạt động. Trong bất cứ trường hợp nào nêu trên cũng cho kết quả phân tích sai. 1.5.5.3. Bơm cao áp Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký. Bơm phải tạo được áp suất cao khoảng 3000 - 6000 PSI hoặc 250 - 500 atm (1atm = 0,98 bar) và bơm phải tạo dòng liên tục. Lưu lượng bơm từ 0,1 đến 9,999 ml/phút. Hiện nay đã có nhiều loại pump có áp suất rất cao lên đến 1200 bar. Máy sắc ký lỏng của chúng ta hiện nay thường có áp suất tối đa 412 bar. Tốc độ dòng 0,1- 9,999 ml/phút. Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã được cài đặt. Hiện tại bơm có 2 pistone để thay phiên nhau đẩy dung môi liên tục. 1.5.5.4. Bộ phận tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột phân tích theo phương pháp không ngừng dòng chảy. Với dung tích của loop là 5 – 100 l. Có 2 cách lấy mẫu vào trong cột: bằng tiêm mẫu thủ công (tiêm bằng syringe) và tiêm mẫu tự động (auto sampler). Trang 15 1.5.5.5. Cột sắc ký Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao. Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột khoảng 10 – 30 cm, đường kính trong 1- 10 mm, hạt chất nhồi cỡ = 5 - 10 m. Ngoài ra còn có một số trường hợp đặc biệt về kích thước và kích cỡ hạt Với chất nhồi cột cỡ = 1,8 - 5 m có thể dùng cột ngắn 3 - 10 cm và nhỏ (đường kính trong 1 - 4,6 mm) loại cột này có hiệu năng tách cao. Chất nhồi cột tùy theo lọai cột và kiểu sắc ký (trong các dược điển USP 23, 24 có tiêu chuẩn hóa các lọai cột). Thông thường chất nhồi cột là silicagel (pha thường) hoặc là silicagel đã được Silan hóa hoặc được bao một lớp mỏng hữu cơ (pha đảo), ngoài ra người ta còn dùng các loại hạt khác như: nhôm oxid, polyme xốp, chất trao đổi ion. * Đối với một số phương pháp phân tích đòi hỏi phải có nhiệt độ cao hoặc thấp hơn nhiệt độ phòng thì cột được đặt trong thiết bị điều nhiệt. Lưu ý: tuyệt đối không đánh siêu âm vì sẽ làm hư cột. 1.5.5.6. Đầu dò Đầu dò (hay còn gọi là detector) là bộ phận phát hiện các chất khi chúng ra khỏi cột và cho các tín hiệu ghi trên sắc ký đồ để có thể định tính và định lượng. Tùy theo tính chất của các chất cần phân tích mà người ta sử dụng loại detector thích hợp và phải thoả mãn điều kiện trong một vùng nồng độ nhất định của chất phân tích. A = k.C (1.6) Trong đó: A là tín hiệu đo được C Nồng độ chất phân tích k là hằng số thực nghiệm của detector đã chọn Tín hiệu này có thể là: độ hấp thụ quang; cường độ phát xạ; cường độ điện thế; độ dẫn điện; độ dẫn nhiệt; chiết suất Trên cơ sở đó người ta chế tạo các lọai detector sau: + Detector quang phổ tử ngoại từ 200 đến 380 nm. + Detector quang phổ tử ngoại khả kiến (UV/Vis): từ 190 đến 900 nm. + Detector huỳnh quang để phát hiện các chất hữu cơ phát huỳnh quang tự nhiên cũng như các dẫn chất có huỳnh quang. Đây là loại detector có độ chọn lọc cao nhất. Trang 16 + Loại hiện đại hơn có detector Diod Array, ELSD (detector tán xạ bay hơi) các detector này có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thu cực đại của các chất . Ngoài ra còn có một số loại detector khác là: + Detector điện hóa: đo dòng, cực phổ, độ dẫn, điện lượng. + Detector chiết suất vi sai: detector khúc xạ. + Detector đo độ dẫn nhiệt, hiệu ứng nhiệt. 1.5.5.7. Bộ phận ghi tín hiệu Để ghi tín hiệu phát hiện do detector truyền sang. + Trong các máy thế hệ cũ thì sử dụng máy ghi đơn giản có thể vẽ sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích của peak, chiều cao. + Các máy thế hệ mới đều dùng phần mềm chạy trên máy tính nó có thể lưu tất cả các thông số, phổ đồ và các thông số của peak như tính đối xứng, hệ số phân giải... trong quá trình phân tích đồng thời xử lý, tính toán các thông số theo yêu cầu của người sử dụng như: nồng độ, RSD. 1.5.5.8. Thiết bị in dữ liệu Sau khi đã phân tích xong các mẫu ta sẽ in kết quả do phần mềm tính toán ra giấy để hoàn thiện hồ sơ. 1.5.6. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký Muốn có một kết quả tốt nhất ta phải tìm được các điều kiện sắc ký tốt nhất cho một hỗn hợp mẫu, các điều kiện đó bao gồm: Pha tĩnh: - Loại pha tĩnh. - Kích thước cột. Pha động: - Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ nếu là chương trình rửa giải isocratic. -Thành phần và tỷ lệ, pH, tốc độ dòng, nhiệt độ và chương trình dung môi nếu là chương trình rửa giải gradient. 1.5.6.1. Lựa chọn pha tĩnh Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích; ta lựa chọn cột sắc ký phù hợp có thể là cột pha thường, cột pha đảo hay các loại cột khác nhau. Trang 17 Thông thường ngành ta dùng 2 loại cột pha thường (NP) và cột pha đảo (RP). Ngoài ra ta có thể dùng một số loại cột khác như cột cyanopropyl, cột aminopropyl, cột diol.... Cột pha thường (NP): silicagel trung tính Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực hay ít phân cực. Trên bề mặt hoạt động của nó có chứa các nhóm – OH phân cực ưa nước. Pha động : dùng cho loại này là các dung môi không phân cực hay ít phân cực như: methanol, benzen, acetonitril, chlorofom Cột pha đảo (RP): silicagel đã alkyl hóa Pha tĩnh: loại cột này dùng để tách các chất không phân cực, ít phân cực, các chất phân cực có thể tạo cặp ion. Trên bề mặt hoạt động các nhóm – OH đã bị alkyl hóa tức là thay thế nguyên tử H bằng các mạch carbon thẳng (C8 hay C18 tương đương RP-8 hay RP-18) hay các mạch carbon vòng (phenyl- tương đương cột phenyl). Vì thế nó ít phân cực hay phân cực rất ít. Pha động : Pha động dùng trong loại này là các dung môi có phân cực như: methanol, acetonitril, nước hay các loại dung dịch đệm, hỗn hợp của các dung môi - đệm. Sự tách của chất nhồi loại cột này có độ lặp lại cao và nó được ứng dụng chủ yếu trong phân tích dược phẩm. Hiện nay chúng ta chỉ sử dụng loại này là chủ yếu. Hiện nay pha tĩnh trên nền silicagel đã có hàng trăm chất khác nhau tùy thuộc vào nhóm thế của nguyên tử H, ngoài ra còn có các lọai pha tĩnh trên nền oxid nhôm, trên nền chất hữu cơ cao phân tử, trên nền mạch carbon . 1.5.6.2. Lựa chọn pha động Dựa vào các tài liệu, dược điển, thành phần và tính chất của các chất có trong mẫu phân tích; ta lựa chọn pha động phù hợp để cho quá trình rửa giải tách hoàn toàn các chất có trong mẫu đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn của peak đã trình bày đồng thời phải có thời gian phân tích phù hợp nhằm tiết kiệm được dung môi, hóa chất, thời gian phân tích mẫu, giảm thiểu sự hoạt động của thiết bị. Pha động có thể làm thay đổi: + Độ chọn lọc α. + Thời gian lưu. + Hiệu năng tách của cột. + Độ phân giải. + Tính đối xứng của peak. Trang 18 Do đó, trong một pha tĩnh đã chọn nếu ta chọn được pha động có thành phần phù hợp thì ta sẽ có hiệu suất tách sắc ký tốt nhất đối với hỗn hợp các chất cần phân tích. Chính vì vậy pha động cần có cầu yêu cầu sau: + Pha động phải trơ với pha tĩnh. Không được làm cho pha tĩnh bị biến đổi hóa học ( ví dụ giá trị pH: 2,5 < pH < 8,5). + Pha động phải hòa tan được các chất phân tích thì mới rửa giải được chúng đặc biệt phải chú ý khi thay đổi pha động phải rửa cột bằng dung môi phù hợp để không làm tủa các chất có trong cột, hay pha động có sẵn trong cột. Ví dụ: đệm phosphat rửa ngay bằng ACN hay MeOH sẽ bị kết tủa trên cột. + Pha động phải bền vững theo thời gian: càng bền lâu càng tốt nhưng ít nhất là pha động không bị phân hủy trong suốt thời gia phân tích mẫu. + Phải có độ tinh khiết cao: dung môi cho HPLC, hoá chất tinh khiết phân tích. + Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký. + Phải phù hợp với loại detector: detector UV/Vis thì dung môi không được hấp thụ quang (ví dụ: acid acetic hấp thụ ở bước sóng thấp < 220 nm). Detector huỳnh quang thì dung môi không được phát quang. + Phải kinh tế, không quá hiếm và đắt. Trong hệ sắc ký hấp phụ pha đảo (RP - HPLC), pha động là dung môi phân cực: nước, ACN, MeOH, acid hay base hữu cơ và một vài amin hay aminoacid + Ngoài các dung môi chính thì trong thành phần pha động trong rất nhiều trường hợp tách RP- HPLC còn có thêm hỗn hợp đệm để ổn định pH. Chất tạo phức, tạo cặp ion để tạo ra sự rửa giải tốt nhất. + Khi chọn dung môi ta thường dựa vào lực rửa giải E của dung môi theo bảng sau: Bảng 1.1 Lực rửa giải của một số dung môi Dung môi Lực rửa giải E n-Hexan 0,1 Tetra chloro carbon 1,6 Toluen 2,4 Methanol 5,11 Acetonitril 5,8 Nước cất H2O 10,20 Trang 19 Việc lựa chọn điều kiện sắc ký là công việc hết sức cần thiết trong quá trình xây dựng chương trình sắc ký. Chỉ khi lựa chọn điều kiên sắc ký tốt, phù hợp thì chúng ta mới có thể định tính, định lượng được các lọai thuốc đa thành phần một cách nhanh chóng và hiệu quả cao. Tất nhiên phần lý thuyết nói rất nhiều về các phương pháp chọn điều kiện sắc ký, tuy nhiên để chọn được chương trình sắc ký tốt đòi hỏi phải có thời gian, tài liệu và một phần kinh nghiệm của những người làm sắc ký. 1.5.7. Các bước tiến hành sắc ký 1.5.7.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc Máy HPLC phải được kiểm chứng theo định kỳ để bảo đảm máy họat động tốt, cho kết quả phân tích có độ đúng, độ lặp lại, tuyến tính, tỷ lệ dung môi, tốc đô dòng, năng lượng đèn UV đúng theo yêu cầu thông số của máy do nhà sản xuất đặt ra. Đặc biệt cột sắc ký phải được kiểm tra về số đĩa lý thuyết theo định kỳ hay khi có nghi ngờ về khả năng tách và rửa đúng quy định sau mỗi lần chạy sắc ký: Ví dụ: sắc ký pha thường NP-HPLC: rửa bằng methanol; không rửa bằng nước. Còn sắc ký pha đảo RP-HPLC: khi chạy pha động có các loại muối thì phải rửa nước trước cho sạch. Tỷ lệ ACN hay methanol : Nước là 50 : 50 v/v cho sạch hết các chất còn đọng lại trong cột đồng thời để bảo vệ cột không bị mốc khi để lâu. Tuyệt đối tránh tình trạng chỉ rửa bằng nước 100% sau đó để cột một thời gian không sử dụng chắc chắn cột sẽ bị mốc, hỏng không thể dùng được. Lưu ý: nếu rửa cột không tốt thì kết quả chạy sắc ký sẽ không thể đáp ứng được các yêu cầu phân tích. 1.5.7.2. Chuẩn bị dung môi pha động Các dung môi dùng cho sắc ký là loại tinh khiết dành cho HPLC. Các hóa chất dùng phải là loại tinh khiết phân tích. Pha dung môi đúng, chính xác theo đúng tỷ lệ đã nêu, để ổn định dung môi đúng thời gian theo chuyên luận đã yêu cầu. Lọc dung môi qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm. 1.5.7.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC Mẫu thử: xử lý mẫu thử theo đúng chuyên luận, quy trình theo nguyên tắc: - Dung môi hòa tan hoạt chất phải hòa tan trong pha động, trong nhiều trường hợp dùng dung môi pha động để hòa tan mẫu. Trang 20 - Phải loại bỏ các chất không tan trong pha động hoặc không rửa giải được bằng cách lọc hay chiết . - Phải lọc và ly tâm, lọc mẫu qua màng lọc 0,2 – 0,45 μm. - Nồng độ mẫu ở mức vừa phải, không vượt quá khả năng tách của cột. Có thể gây ra nghẽn cột. Mẫu chuẩn: Pha dung dịch chuẩn có thành phần giống như mẫu thử trong cùng dung môi, riêng về nồng độ các thành phần giống như mẫu thử là tốt nhất, ngoài ra có thể dùng nồng độ khác nhưng phải nằm trong khoảng tuyến tính đã khảo sát của từng thành phần. 1.5.7.4. Cách vận hành thiết bị Mỗi máy có cách vận hành khác nhau tùy thuộc vào hãng sản xuất, phần mềm điều khiển hệ thống sắc ký HPLC. Tuy nhiên cách vận hành luôn phải theo nguyên tắc sau: - Chạy máy với dung môi pha động để đuổi hết bọt khí có trong hệ thống ống dẫn trước khi cho vào cột. - Đặt đầy đủ các điều kiện sắc ký như : * Cấu hình máy * Tỷ lệ các dung môi pha động * Bước sóng, thành phần mẫu, các thông số của quá trình phân tích yêu cầu. Trang 21 Chương 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Hóa chất và dụng cụ 2.1.1. Hóa chất 2.1.1.1. Chất chuẩn Bảng 2.1 Danh mục chất chuẩn do viện kiểm nghiệm thuốc cung cấp. STT Tên chất chuẩn Số lộ hiện hành Số lô thay thế Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Paracetamol QT009 121911 QT009 130312 99,87% 2 Ibuprofen QT026 070611 QT026 080612 99,70% 2.1.1.2. Dung môi Bảng 2.2 Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC. STT Tên dung môi Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Acetonitril Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 99,80 % 2 Methanol Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 99,80 % 3 Water Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 99,80 % 2.1.1.3. Hóa chất khác Bảng 2.3 Danh mục các loại hóa chất khác dùng trong đề tài nghiên cứu. STT Tên hóa chất Nhà sản xuất Tiêu chuẩn Hàm lượng nguyên trạng (%) 1 Chlorofom Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 99,80 % 2 Acid phosphoric Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 85,00 % 3 NaOH Merk KGaA Đức Dùng cho HPLC 99,80 % 4 Aceton Trung Quốc Thông thường Trang 22 2.1.2. Dụng cụ - Thiết bị 2.1.2.1. Thiết bị Bảng 2.4 Danh mục thiết bị - máy móc phục vụ đề tài nghiên cứu. STT Loại thiết bị Tên thiết bị Hãng sản xuất Mã số 1 Bình dựng dung môi 4 kênh Pyrex 1000 ml Germany 00330341 2 Bơm cao áp Pump Perkin Elmer Series 200 3 Bộ loại khí cho dung môi Vacuum Degasser Perkin Elmer Series 200 4 Thiết bị tiêm mẫu Syringe 100 μl Hamilton 80665 5 Thiết bị nạp mẫu Injector 20 μl USA 6 Cột sắc ký Brownlee Columns RP - 18 Perkin Elmer Brownlee Columns 07110017 7 Thiết bị ghi tín hiệu UV/Vis Detector Perkin Elmer Series 200 8 Thiết bị nhận tín hiệu và phần mềm điều khiển hệ thống Bộ PC cài đặt phần mềm Total Chrom Workstation ver 6.1.3 Intel Phần mềm do Perkin Elmer cung cấp 9 Bộ lọc dung môi dùng giấy lọc 0,45 Glassico India 10 Máy rút chân không Neuburger KNF-Germany N035AN.18 11 Giấy lọc 0,45 Membrane Filter Sterile Whatman, Japan 7141104 12 Máy lắc KS130 Basic IKA - Germany KS130B 13 Máy đánh siêu âm S100H Elmasonic Elma - Germany 101141013 14 Cân phân tích Balances and Precious Metal scales Sartorius 98648-012-13 Trang 23 15 Máy đo quang Lambda 25 UV/Vis Spectrometor Perkin Elmer 101N7062504 16 Máy lọc nước siêu sạch Water Pro PS LABCONCO 091118524 2.1.2.2. Dụng cụ - Bình định mức 1000 ml, 100ml, 50ml, 25ml, 10ml. - Pipet: 1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml. - Bình tam giác 250ml, cốc thủy tinh 100 ml, 250 ml. - Ống nhỏ giọt, bình tia, phễu lọc, cối sứ, chày sứ, giấy lọc thường. 2.2. Nội dung nghiên cứu 2.2.1. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký HPLC 2.2.1.1. Chọn thể tích vòng mẫu Độ chính xác, độ đúng, lượng mẫu cần thiết nạp vào cột sắc ký không những phụ thuộc vào thiết kế của van bơm mẫu mà còn phụ thuộc vào kỹ thuật nạp mẫu. Dựa vào khả năng thay đổi các vòng mẫu khác nhau mà có thể thay đổi được thể tích bơm mẫu vào cột. Tuy nhiên yếu tố này cũng làm chân peak sắc ký doãng ra. Nếu vòng mẫu quá dài, lượng mẫu quá lớn thì hiện tượng doãng peak xảy ra càng lớn gây ra sự chen lấn peak trong quá trình tách. Lượng mẫu được xác định bằng thể tích vòng chứa mẫu mà ta lựa chọn. Với thể tích mẫu nhỏ hơn thể tích mẫu tới hạn V0 thì khi bơm mẫu vào cột tách chiều cao hay diện tích của peak sẽ tăng tuyến tính. Đến giới hạn Vmẫu = V0 mà vẫn tiếp tục tăng thể tích mẫu thì chiều cao peak sắc ký sẽ không tăng nữa và lúc đó peak sắc ký sẽ tù, doãng chân và không sắc nét. Vì vậy việc lựa chọn thể tích cũng rất quan trọng. Nếu độ nhạy đủ để phân tích, thường dùng vòng mẫu có thể tích càng nhỏ càng tốt để tạo nên peak có độ sắc nét cao và tránh doãng peak. Trong phân tích HPLC người ta thường sử dụng các vòng mẫu 10, 20, 30, 40, 50, 100 μl trong đó vòng mẫu 20 μl thường hay được sử dụng nhất. Trong đề tài này, để định lượng Paracetamol và Ibuprofen chúng tôi chọn thể tích vòng mẫu là 20 μl phù hợp với thiết bị nạp mẫu (injector) 20 μl được trang bị trong phòng thí nghiệm. Trang 24 2.2.1.2. Chọn cột Trong đề tài nghiên cứu này, Paracetamol và Ibuprofen là những chất rất ít phân cực và dựa vào dược điển Mỹ USP 23, 24 quy định về chỉ tiêu phân tích định lượng các thành phần trong dược phẩm, nên ta phải chọn các loại cột RP – HPLC. Trên thị trường có rất nhiều hãng sản xuất cột sắc ký pha đảo C8 và C18 . Tuy nhiên cột Brownlee RP – 18 của hãng Perkin Elmer được sử dụng rộng rãi trong ngành kiểm nghiệm dược phẩm nhờ danh tiếng thương hiệu, chất lượng cột cũng như tính kinh tế so với các loại cột khác. Hiện nay, phòng thí nghiệm của ta có trang bị loại cột này và được kỹ thuật viên thường xuyên kiểm tra, đánh giá tình trạng. Vì vậy, ta chọn cột Brownlee RP – 18, kích thước hạt 5 μm, 220x4,6 mm cho phép định lượng này. 2.2.1.3. Chọn bước sóng cho detector Trong phép phân tích đồng thời, việc lựa chọn bước sóng rất quan trọng vì nó quyết định tới độ nhạy của phép phân tích. Do phương pháp phân tích là HPLC sử dụng đầu dò là detector UV-Vis cố định bước sóng, ta cần khảo sát điều kiện nhằm chọn bước sóng tối ưu để phân tích đồng thời các chất. Dựa vào tài liệu tham khảo và cực đại hấp thụ của PA và IB, ta chọn các bước sóng tiêu biểu. Sau đó tiến hành khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC lần lượt tại các bước sóng λ bằng 220 nm, 224 nm, 250 nm, 260 nm. 2.2.1.4. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC Dựa vào kết quả thực nghiệm ở mục 2.2.1.3 ta tiến hành tiêm mẫu là hỗn hợp PA và IB nồng độ 48 ppm vào hệ thống HPLC với điều kiện như sau: Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm. Pha động: C: Acetonitril (CH3CN); D: dung dịch H3PO4 0,01M. Thời gian: 0 – 5 phút, 95%C : 5%D. Nồng độ mẫu: 4,8 ppm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Detector: UV- Vis. Đặt tại các bước sóng ở mục 2.2.1.3. Thể tích vòng mẫu: 20 μl. 2.2.1.5. Khảo sát nồng độ acid phosphoric Nồng độ acid H3PO4 ảnh hưởng trực tiếp tới pH của hệ có thể ảnh hưởng lớn tới độ phân cực của dung môi nên ảnh hưởng tới khả năng tách của hệ và độ đối xứng của Trang 25 peak sắc ký. Để khảo sát sự ảnh hưởng của chúng, ta tiến hành chạy sắc ký với điều kiện sau: Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm. Pha động: C: Acetonitril (CH3CN); D: dung dịch H3PO4 0,001M; pH = 3,10. E: dung dịch H3PO4 0,005M; pH = 2,47. F: dung dịch H3PO4 0,01M; pH = 2,25. G: dung dịch H3PO4 0,05M; pH = 1,81. Thời gian: 0 – 5 phút, 95% C : 5% (D, E, F, G). Nồng độ chất phân tích: 4,8 ppm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 224 nm. Thể tích vòng mẫu: 20 μl. 2.2.1.6. Khảo sát thành phần pha động và Ki’ Tỷ lệ thành phần dung môi tạo ra pha động có ảnh hưởng lớn đến quá trình rửa giải các chất mẫu ra khỏi cột. Trong phân tích HPLC, khái niệm lực rửa giải là đặc trưng cho quá trình sắc ký. Khi tỷ lệ thành phần pha động thay đổi thì lực rửa giải của dung môi pha động thay đổi, nghĩa là làm thay đổi thời gian lưu của các chất phân tích qua đó làm thay đổi hệ số lưu của chất phân tích đó. Vì vậy để có được tỷ lệ thành phần pha động phù hợp cần tiến hành khảo sát hệ sắc ký với tỷ lệ thành phần pha động khác nhau với các điều kiện sắc ký như nhau: Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm. Pha động: C: Acetonitril (CH3CN); D: dung dịch H3PO4 0,010 M. Thời gian: 0 – 5 phút, 60%C : 40%D 70%C : 30%D 80%C : 20%D 90%C : 10%D 95%C : 05%D 96%C : 04%D 97%C : 03%D 98%C : 02%D 99%C : 01%D. Nồng độ chất phân tích: 48 ppm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 224 nm. Thể tích vòng mẫu: 20 μl Trang 26 2.2.1.7. Khảo sát tốc độ dòng Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích. Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm. Pha động: C: Acetonitril (CH3CN); D: dung dịch H3PO4 0,01M. Thời gian: 0 – 5 phút, 97%C : 3%D. Nồng độ chất phân tích: 48 ppm. Tốc độ dòng: 0,6 ml/phút; 0,7 ml/phút; 0,8 ml/phút; 0,9 ml/phút; 1 ml/phút. Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 224 nm. Thể tích vòng mẫu: 20 μl. 2.2.2. Xây dựng phương pháp định lượng hỗn hợp Paracetamol và Ibuprofen. 2.2.2.1. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng. Giới hạn phát hiện là giá trị nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường nền. Giới hạn định lượng được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Thông thường LOQ được tính như sau: Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: pha loãng từ 5 – 7 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp PA và IB nồng độ 9,6 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung môi pha động). Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC và ghi kết quả. Sắc ký đồ nào thể hiện chiều cao peak khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị. Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: LOQ = 10/3 LOD (2.1) Trang 27 2.2.2.2. Xác định khoảng nồng độ tuyến tính Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của Paracetamol, Ibuprofen và diện tích peak sắc ký, ta lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 4,8 ppm đến 480 ppm trong dung môi pha động. Sau đó tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 1.2.2, ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy. Các thông tin về đường chuẩn được trình bày trong phần phụ lục. 2.2.2.3. Khảo sát độ lặp lại của phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phương pháp, người ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp. Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp Paracetamol và Ibuprofen (có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 1.2.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR. 2.2.3. Ứng dụng quy trình phân tích các mẫu dược phẩm 2.2.3.1. Khảo sát quy trình chiết chất: Cân 10 viên mẫu thuốc, ghi lại kết quả cân. Nghiền mịn mẫu bằng chén sứ sau đó cân chính xác 0,2504 gam mẫu. Cho 0,2504 g mẫu vào bình bình tam giác có chứa 30 ml dung dịch pha động. Lắc trong 15 phút. Sau đó lọc tách phần cặn không tan và phần dung dịch. Tương tự lặp lại các bước như sơ đồ sau: Trang 28 Hình 2. 1 Quy trình khảo sát phương pháp chiết mẫu Cứ thực hiện cho đến khi chất đã chiết hoàn toàn. Thu lấy các dịch lọc có chứa chất và dịch lọc không chứa chất (làm mẫu trắng). 2.2.3.2. Xác định hệ số thu hồi của phương pháp Nhằm đánh giá và kiểm tra độ đúng của phương pháp, ta tiến hành xác định hệ số thu hồi bằng cách sau: Tiêm lặp 3 lần dung dịch chứa đồng thời PA và IB nồng độ C01, C02 xác định (C01 và C02 phải nằm trong khoảng tuyến tính). Ghi số liệu, dựa vào đường chuẩn của PA và IB tính nồng độ C1, C2 của PA và IB. Sau đó suy ra hệ số thu hồi theo công thức sau: %100.(%) oi i C C R = (2.2) 2.2.3.3. Phân tích định lượng một số mẫu dược phẩm Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại dược phẩm có chứa PA, IB và đồng thời PA, IB trong cùng một chế phẩm. Dựa vào phương pháp này ta có thể định lượng PA, IB Trang 29 hay đồng thời PA và IB trong cùng một chế phẩm. Tuy nhiên, ta không thể tránh khỏi sự ảnh hưởng của các chất khác trong các loại dược phẩm đa thành phần. Vì vậy, ta nên chọn các loại dược phẩm chỉ chứa một thành phần PA hoặc IB hay đồng thời hai thành phần PA và IB. Ngoài ra, ta cũng có thể định lượng PA và IB trong một số dược phẩm đa thành phần mà dược điển cho phép hoặc có các tài liệu chứng minh chất lạ không ảnh hưởng đến phép phân tích. Bảng 2.5 Thông tin về các mẫu thuốc được thu thập Tên mẫu Tên thuốc Thành phần chính trong một viên thuốc Nhà sản xuất – số lô HSD M01 Alaxan Paracetamol 325 mg Ibuprofen 200 mg United Pharma Việt Nam - 118691 23/05/2014 M11 Alaxan Paracetamol 325 mg Ibuprofen 200 mg United Pharma Việt Nam - 118901 24/10/2014 Tiến hành xử lý mẫu thuốc theo quy trình thực nghiệm suy ra từ mục 2.2.3.1. Thu lấy toàn bộ dịch chiết, lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau đó cho toàn bộ dịch lọc vào bình định mức 250 ml. Định mức đến vạch bằng dung môi pha động và pha loãng như sau: Bảng 2.6 Cách pha loãng mẫu trước khi tiêm vào thiết bị HPLC. Stt Mẫu thuốc Alaxan Cách pha loãng 1 M01 Rút 2,5 ml mẫu cho vào bình 25 ml, định mức đến vạch bằng dung môi pha động. 2 M11 Rút 7,5 ml mẫu cho vào bình 25 ml, định mức đến vạch bằng dung môi pha động. Tiến hành tiêm lặp 3 lần các mẫu M01, M11 vào hệ thống HPLC và ghi kết quả. Dựa vào phương trình hồi quy tính nồng độ của chất phân tích và hệ số thu hồi. 2.2.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao và diện tích peak sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta có mối quan hệ tuyến tính như sau: Hi = k1 .Ci = f(C) (2.3) Si = k2 .Ci = f(C) (2.4) Trang 30 trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của peak sắc ký của cấu tử i. Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi. k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký cũng như bản chất pha tĩnh. Dựa trên (2.3) và (2.4) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn. Các số liệu thực nghiệm được xử lý bằng phương pháp thống kê toán học với các đặc trưng sau: Giá trị trung bình: ∑ = = n i ixn x 1 1 (2.5) Độ lệch chuẩn: ( ) 1 1 2 − − = ∑ = n xx SD n i i (2.6) Độ lệch chuẩn tương đối: 100.(%) x sRSD = (2.7) Trang 31 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát theo mục 2.2.1, ta thu được kết quả như sau: 3.1.1. Chọn cột và thể tích vòng mẫu Dựa vào các tài liệu tham khảo trong mục 1.4.3 và trang thiết bị của phòng thí nghiệm cho phép ta chọn cột và thể tích vòng mẫu như sau: Cột sắc ký pha đảo RP – 18, kích thước 220x4,4 mm, kích thước hạt 5 µm. Thể tích vòng mẫu: injector 20 µl. 3.1.2. Đặt bước sóng cho detector Bước sóng λ của detector là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp. Vì thế ta phải nghiên cứu, khảo sát sao cho tín hiệu của chất phân tích tại bước sóng λ là tốt nhất. Hình 3.1 Phổ hấp thụ của PA và IB trong dung môi NaOH 0,1M [13]. Hình 3.2 Phổ hấp thụ của PA, IB và CA trong dung môi MeOH : HCl 0,1M (3:1 v/v) [11]. Trang 32 Nhận xét: PA hấp thu cực đại trong khoảng bước sóng 250 – 260 nm. IB hấp thụ cực đại trong khoảng 220 – 230 nm. Tiến hành khảo sát bước sóng trên detector đặt tại các bước sóng 220 nm, 224 nm, 250 nm, 260 nm. Tiêm hỗn hợp chứa PA và IB nồng độ 48 ppm trong dung môi pha động vào hệ thống HPLC với điều kiện như mục 2.2.1.4. Bảng 3.1 Sự phụ thuộc của chiều cao peak sắc ký vào bước sóng của detector Bước sóng detector Chiều cao peak PA IB 220 325 265 224 1510 1230 250 220 217 260 112 102 (a) (b) (c) (d) Hình 3.3 Sắc ký đồ thể hiện chiều cao peak sắc ký tại các bước sóng (a) 220 nm, (b) 224 nm, (c) 250 nm, (d) 270 nm. mV Thời gian(phút) mV mV Thời gian(phút) Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) Trang 33 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 215 220 225 230 235 240 245 250 255 260 265 PA IB Hình 3.4 Sự phụ thuộc của chiều cao peak sắc ký vào bước sóng của detector. Như vậy, từ các kết quả trên ta nhận thấy: tốc độ và thành phần pha động có thể làm chuyển dịch cực đại hấp thụ của PA và IB. Để tách được đồng thời PA và IB, ta chọn bước sóng 224 nm cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3. Khảo sát nồng độ acid phosphoric Trong nghiên cứu này, ta chọn acid phosphoric vì PA và IB theo lý thuyết đều có tính acid yếu. Nếu chọn môi trường trung tính hoặc base thì PA và IB có thể tồn tại ở dạng muối và kết tinh trên cột khi gặp MeOH hay ACN. Tuy nhiên ta cũng cần phải kiểm soát nồng độ của acid H3PO4. Nếu pH quá thấp, vượt quá giới hạn của cột tách sẽ làm biến đổi pha tĩnh. Tiến hành khảo sát nồng độ acid H3PO4 theo mục 2.2.1.5. Kết quả được thể hiện trong bảng 3.2 và hình 3.5 như sau: Bảng 3.2 Sự phụ thuộc hệ số lưu Ki’ vào nồng độ acid H3PO4: Nồng độ acid H3PO4 (M) pH Hệ số lưu Ki’ PA IB 0,001 3,10 2,47 3,23 0,005 2,47 2,44 3,24 0,01 2,25 2,41 3,19 0,05 1,81 2,40 3,23 Trang 34 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3 3.1 3.2 3.3 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 PA IB Hình 3.5 Sự phụ thuộc thời gian lưu vào nồng độ acid H3PO4. Hình 3.6 Sắc ký đồ của hỗn hộp PA và IB (4,8 ppm) với nồng độ acid H3PO4 0,001M. Dựa vào kết quả phân tích được, ta chọn nồng độ acid H3PO4 là 0,01 M cho các nghiên cứu tiếp theo vì tại nồng độ này, pH nằm trong giới hạn cho phép của cột, peak sắc ký rõ nét, cân đối, ít tốn thời gian phân tích và dung môi pha động. tPA = 3,23 tIB = 3,95 t0 = 0,93 mV Thời gian(phút) Trang 35 3.1.4. Khảo sát thành phần pha động Thành phần pha động ảnh hưởng trực tiếp đến lực rửa giải các chất phân tích, ảnh hưởng đến thời gian lưu và hệ số tách của hai chất. Theo dược điển Mỹ USP 23, 24 và các tài liệu tham tham khảo ở mục 1.4 thì dung môi pha động thường là hỗn hợp ACN và một acid yếu như: acid acetic, acid formic, acid phosphoric Trong đề tài này, ta chọn acid phosphoric vì nó là acid vô cơ, không hấp thụ ở bước sóng 224 nm. Tiến hành khảo sát thành phần pha động như mục 2.2.1.6. Kết quả được thể hiện trong hình 3.7 như sau: (3) (4) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) Trang 36 (5) (6) (7) (8) (9) Dựa vào hình 3.7, ta thấy rằng thành phần pha động ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số lưu, hệ số tách và hệ số đối xứng của peak. Hình 3.7. Sắc ký đồ của hỗn hợp PA và IB với pha động là: (1) ACN/ H3PO4 0.01M (60:40 v/v). (2) ACN/ H3PO4 0.01M (70:30 v/v). (3) ACN/ H3PO4 0.01M (80:20 v/v). (4) ACN/ H3PO4 0.01M (90:10 v/v). (5) ACN/ H3PO4 0.01M (95:5 v/v). (6) ACN/ H3PO4 0.01M (96:4 v/v). (7) ACN/ H3PO4 0.01M (97:3 v/v). (8) ACN/ H3PO4 0.01M (98:2 v/v). (9) ACN/ H3PO4 0.01M (99:1 v/v). mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) Trang 37 Tỷ lệ ACN càng lớn thì thời gian lưu càng ngắn, hệ số tách càng nhỏ, peak đẹp, cân đối, hiện tượng kéo đuôi giảm dần. Tuy nhiên, khi tỷ lệ ACN lên đến 98 – 99 % thì hệ số tách quá nhỏ, hai peak không tách rời nhau. Vì vậy ta chọn thành phần pha động là hỗn hợp dung môi ACN và dung dịch H3PO4 0,01M (97:3 v/v) cho những nghiên cứu tiếp theo. 3.1.5. Khảo sát tốc độ dòng Tốc độ pha động cũng là yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sắc ký vì nó ảnh hưởng đến quá trình thiết lặp cân bằng của chất tan giữa pha tĩnh và pha động. Tốc độ dòng quá nhỏ sẽ gây ra hiện tượng doãng peak, thời gian rửa giải lâu hơn. Tuy nhiên nếu tốc độ dòng quá lớn có thể làm cho các chất trong hỗn hợp không tách khỏi nhau hoàn toàn, nghĩa là gây ra hiện tượng chồng chéo peak lên nhau. Vì vậy cần phải khảo sát để tìm ra tốc độ dòng phù hợp với hệ phân tích. Tiến hành khảo sát theo mục 2.2.1.7. Kết quả khảo sát được thể hiện ở hình 3.8 Từ kết quả trong hình 3.8 ta thấy rằng, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số tách. Tốc độ dòng từ 0,6 – 1,0 ml/phút cho thấy thời gian lưu giảm dần, peak rõ đẹp, tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần. Tốc độ dòng lớn sẽ làm hao tốn dung môi và tăng áp suất cột tách, nhưng tốc độ quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian phân tích và làm doãng peak gây ra hiện tượng kéo đuôi. Do đó, ta chọn tốc độ dòng là 0,7 ml/phút để tiến hành định lượng PA và IB. Tóm lại, điều kiện tối ưu được đề xuất như sau: Cột tách: RP – 18, 5 μm, 220x4,6 mm. Pha động: Acetonitril (CH3CN) : dung dịch H3PO4 0,01M (97:3 v/v). Thời gian: 0 – 4,5 phút. Tốc độ dòng: 0,7 ml/phút. Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 224 nm. Thể tích vòng mẫu: 20 μl. Trang 38 (1) (2) (3) (4) (5) Hình 3.8 Sắc ký đồ hỗn hợp PA và IB với tốc độ dòng thay đổi (1) tốc độ dòng = 1,0 ml/phút (2) tốc độ dòng = 0,9 ml/phút (3) tốc độ dòng = 0,8 ml/phút (4) tốc độ dòng = 0,7 ml/phút (5) tốc độ dòng = 0,6 ml/phút. mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) Trang 39 3.2. Xây dựng phương pháp định lượng 3.2.1. Xác định LOD và LOQ của thiết bị Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng. Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: chuẩn bị một mẫu trắng làm nền, pha loãng liên tiếp 2 đến 5 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp PA và IB. Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC. Đến khi nào chiều cao peak = 3 lần chiều cao đường nền thì lấy đó là LOD. Hình 3.9 Mẫu hỗn hợp PA và IB nồng độ 1,2 ppm (a) và mẫu trắng (b). Kết quả: khi nồng độ PA và IB là 1,2 ppm thì chiều cao = 3 lần đường nền. Do đó: LOD của PA là 1,2 ppm LOD của IB là 1,2 ppm Từ đó suy ra: LOQ của PA = 10/3 LOD = 4 ppm. LOQ của IB = 10/3LOD = 4 ppm. 3.2.2. Khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. Để khảo sát khoảng tuyến tính giữa nồng độ của Paracetamol, Ibuprofen và diện tích peak sắc ký, ta lần lượt pha các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 4,8 ppm đến 360 ppm trong dung môi pha động. mV Thời gian(phút) mV Thời gian(phút) (a) (b) Trang 40 Bảng 3.3 Cách pha loãng dung dịch mẫu trước khi tiêm vào hệ thống HPLC Thể tích (ml) hút từ dung dịch chuẩn 1200 ppm Hệ số pha loãng Nồng độ của dung dịch sau khi pha loãng 0,1 0,1/25 4,8 0,2 0,2/25 9,6 0,5 0,5/25 28,8 1,0 1,0/25 57,6 2,0 2,0/25 115,2 5,0 5,0/25 240 7,5 7,5/25 360 Sau đó tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 1.2.2, ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy. Bảng 3.4 Diện tích peak ứng với từng nồng độ của PA trong dãy chuẩn. Paracetamol C (ppm) Speak 4,8 1624,11 9,6 111005,47 28,8 397690,90 57,6 914222,87 115,2 1945623,06 240 4042599,58 360 5975959,25 Bảng 3.5 Diện tích peak ứng với từng nồng độ của IB trong dãy chuẩn. Ibuprofen C (ppm) Speak 4,8 224205,66 9,6 320008,04 28,8 841851,68 57,6 1528423,76 115,2 2894882,44 240 6028463,40 360 9161289,52 Trang 41 Đường chuẩn của Paracetamol y = 16879x - 54957 R2 = 0,9997 0,00 1000000,00 2000000,00 3000000,00 4000000,00 5000000,00 6000000,00 7000000,00 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 Nồng độ (ppm) mA U Hình 3.10 Đồ thị biểu sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của Paracetamol. Đường chuẩn của Ibuprofen y = 25061x + 78528 R2 = 0,9998 0,00 1000000,00 2000000,00 3000000,00 4000000,00 5000000,00 6000000,00 7000000,00 8000000,00 9000000,00 10000000,00 0,00 50,00 100,00 150,00 200,00 250,00 300,00 350,00 400,00 Nồng độ (ppm) m Au Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của IB Trang 42 Dựa vào kết quả khảo sát, ta có các phương trình hồi quy sau được biểu diễn trong hình 3.10, 3.11 và bảng 3.6. Bảng 3.6 Phương trình hồi quy của PA và IB Chất phân tích Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R2 Khoảng nồng độ tuyến tính (ppm) Paracetamol Y = 16879x – 54957 0,9997 4,8 – 360 Ibuprofen Y = 25061x + 78528 0,9998 4,8 - 360 Nhận xét: qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc ký và nồng độ các acid béo phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao, R = 0,9997. Khoảng nồng độ tuyến tính rộng đối với cả hai chất PA và IB từ 4,8 – 360 ppm. Do đó, ta có thể sử dụng các phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để định lượng PA và IB trong mẫu thật ở khoảng tuyến tính đã khảo sát. 3.2.3. Khảo sát độ lặp lại của phép đo Một phương pháp phân tích tốt ngoài yêu cầu về độ đúng của phương pháp, người ta còn chú ý đến độ lặp lại của phương pháp. Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 7 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp PA và IB vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu ở mục 1.2.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR. Bảng 3.7 Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu PA Thứ tự Thời gian lưu của PA Diện tích peak của PA Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê 1 2,25 Giá trị trung bình Xtb = 2,27 Độ lệch chuẩn: SD = 0,011 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = 0,47 % 274172,44 Giá trị trung bình Xtb = 275718,71 Độ lệch chuẩn: SD = 2206,77 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = 0,80 % 2 2,26 274378,18 3 2,27 278549,62 4 2,27 278947,38 5 2,27 275137,04 6 2,28 275626,77 7 2,28 273219,56 Trang 43 Bảng 3.8 Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu IB Thứ tự Thời gian lưu của IB Diện tích peak của IB Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê 1 3,89 Giá trị trung bình Xtb = 3,90 Sai số ngẫu nhiên: SD = 0,011 Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = 0,29 % 575941,83 Giá trị trung bình Xtb = 577933,34 Sai số ngẫu nghiên: SD = 3263,80. Độ lệch chuẩn tương đối: RSD(%) = 0,56 % 2 3,90 576812,77 3 3,89 580467,34 4 3,90 583875,91 5 3,91 577994,18 6 3,91 576278,13 7 3,92 574163,22 Theo kết quả khảo sát ta thấy hệ thống sắc ký lỏng có độ lặp lại tốt. Đối với phép định lượng, thông số diện tích peak Speak là 0,80 % và 0,56 % ứng với PA và IB. Quy trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thật. 3.3. Ứng dụng quy trình phân tích mẫu thật 3.3.1. Quy trình chiết mẫu Mẫu thuốc Alaxan được thu thập từ các hiệu thuốc về, ghi lại các thông tín về bao bì, ngày sản xuất, hạn sử dụng, số đăng kiểm và thành phần như trong bảng 2.5. Sau khi thực hiện quy trình khảo sát phương pháp chiết mẫu, kết quả thu được thể hiện trong bảng 3.9 và hình 3.12: Bảng 3.9 Diện tích peak với số lần chiết tách PA và IB trong mẫu thật. Số lần chiết i Mẫu Alaxan Speak PA Speak IB 2 2262527,5 339689,29 3 109617,87 24555,11 4 46703,42 14352,24 5 16639,31 11064,97 6 5589,70 4183,39 7 4845,69 1946,18 Trang 44 Hình 3.12 Sự phụ thuộc của diện tích peak vào số lần chiết PA (a) và IB (b). Nhận xét, như vậy sau 7 lần lắc và chiết xem như ta đã tách hoàn toàn PA và IB ra khỏi mẫu ban đầu là 250 mg thuốc Alaxan. Dựa vào đây, ta có thể áp dụng quy trình này để chiết tách PA và IB cho phép định lượng. 3.3.2. Xác định hệ số thu hồi của phương pháp Để xác định độ đúng của phương pháp, ta cần xác định hệ số thu hồi. Tiêm lặp 3 lần dung dịch chứa đồng thời PA và IB nồng độ 120 ppm. Ghi số liệu, dựa vào đường chuẩn của PA và IB trong bảng 3.7, tính nồng độ của PA và IB. Sau đó tính hệ số thu hồi theo công thức 2.2. Kết quả của phép đo được thể hiện trong bảng 3.10: Bảng 3.10 Hệ số thu hồi của phương pháp trên mẫu chuẩn PA và IB Mẫu PA IB Nồng độ Cx (ppm) 115,23 113,38 Nồng độ C0 (ppm) 120 120 Hệ số thu hồi R% 96,03 % 94,48 % 3.3.3. Định lượng PA và IB trong một số mẫu dược phẩm Với phương pháp định lượng PA và IB đã xây dựng, ta tiến hành phân tích 2 mẫu: Alaxan có số lô và ngày sản xuất khác nhau. Khối lượng 10 viên thuốc lấy từ mẫu M01: 7,2061 gam. Khối lượng 10 viên thuốc lấy từ mẫu M11: 7,2045 gam. Suy ra khối lượng trong 1 viên thuốc lấy từ mẫu M01: 720,61 mg. khối lượng trong 1 viên thuốc lấy từ mẫu M11: 720,45 mg. Tiến thành cân lấy mẫu: Khối lượng mẫu M01 = 250,9 mg. Khối lượng mẫu M11 = 251,1 mg (a) (b) Trang 45 Quy trình xử lý mẫu và chiết chất thực hiện theo mục 2.2.3.1 và pha chế theo bảng 2.6. Dựa vào phương trình hồi quy từ bảng 3.6 để xác định hàm lượng PA và IB trong mẫu. Kết quả phân tích được thể hiện trong bảng và hình sau: Hình 3.13 Sắc ký đồ của mẫu M01. Hình 3.14 Sắc ký đồ mẫu M11. Trang 46 Bảng 3.11 Kết quả phân tích mẫu dược phẩm Alaxan M01 và M11. Mẫu Speak PA Speak IB CPA (ppm) CIB (ppm) M01 708161,69 673225,53 45,21 Ctb = 45,2 ± 0,30 23,73 Ctb = 23,9 ± 0,4 709626,28 679240,17 45,30 23,97 705685,92 680242,61 45,06 24,01 M11 2266033,80 1906727,95 137,51 Ctb = 137,3 ± 3,4 72,95 Ctb = 72,9 ± 0,5 2290019,04 1898207,21 138,93 72,61 2231189,70 1905224,29 135,44 72,89 Từ nồng độ PA và IB tìm được trong mẫu, ta quy đổi sang hàm lượng của chúng có trong 100 mg mẫu như sau: mcpt = Cx.V.F trong đó: mcpt là khối lượng chất phân tích có trong 0,2509 gam mẫu (đối với mẫu M01) và 0,2511 gam mẫu (đối với mẫu M11). Cx là nồng độ chất phân tích tính theo phương trình hồi quy. V: thể tích pha loãng. F: hệ số pha loãng (10-3). Suy ra: mcpt = Cx. 310.5,2 25.250 − = 2,5Cx đối với mẫu M01. mcpt = Cx. 310.5,7 25.250 − = 0,83Cx đối với mẫu M11. Như vậy, theo quy trình phân tích ở trên ta có hàm lượng PA và IB trong mẫu dược phẩm Alaxan được tóm tắt như sau: Bảng 3.12 Khối lượng PA và IB trong mẫu M01 và M11. Mẫu Khối lương cân (mg) Khối lượng PA (mg) Khối lượng IB (mg) Khối lượng PA trong 1 viên thuốc Khối lượng IB trong 1 viên thuốc M01 250,9 112,9 ± 0,7 59,8 ± 0,9 324,5 ± 2,2 171,6 ± 2,7 M11 251,1 113,9 ± 2,8 60,5 ± 0,4 326,9 ± 8,0 173,5 ± 1,2 Trang 47 Bảng 3.13 Hàm lượng PA và IB trong mẫu dược phẩm Alaxan Mẫu Hệ số thu hồi (%) PA IB M01 99,8 ± 0,7 85,8 ± 1,4 M11 100,6 ± 2,5 86,8 ± 0,6 Dựa vào kết quả phân tích hàm lượng PA và IB ở trên ta nhận xét như sau Hàm lượng PA và IB trong hai mẫu Alaxan khá ổn định. Đối với PA khối lượng từ 324,5 – 326,9 mg và đối với IB khối lượng từ 171,6 – 173,5 mg trong một viên nén thành phẩm Alaxan. Giữa hai mẫu thuốc Alaxan lấy từ hai nhà thuốc khác nhau, hàm lượng PA và IB chênh lệch nhau không nhiều, qua khảo sát hai mẫu ta thấy rằng hàm lượng PA và IB trong các mẫu tương đối ổn định suy ra quy trình sản xuất ổn định. Trang 48 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 4.1. Kết luận Kết quả đề tài “Định lượng Paracetamol và Ibuprofen trong một số dược phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” cho những kết luận sau: 1. Chọn điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời PA và IB trong một số chế phẩm thuốc dạng viên nén bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV/Vis. Cột tách RP – 18; 220x4,4 mm; kích thước hạt 5 µm Thể tích vòng mẫu 20 µl Bước sóng detector 224 nm Nồng độ acid phosphoric 0,01M Thành phần pha động ACN : H3PO4 0,01M (97 : 3 v/v) Tốc độ dòng 0,7 ml/phút 2. Đề xuất quy trình chuẩn bị mẫu – chiết chất tối ưu. Cân chính xác khối lượng 10 viên thuốc, nghiền mịn thành bột. Cân chính xác 0,250 g mẫu, cho vào bình tam giác, thêm 30 ml dung dịch pha động, đánh siêu âm trong 5 phút và lắc trong 15 phút (v = 480 vòng/phút). Lọc tách phần dung dịch và phần rắn. Lặp lại 6 lần (có thể kiểm tra dịch chiết lần thứ 6 bằng cách tiêm dịch chiết vào hệ thống HPLC và kiểm tra peak tại thời gian lưu của chất phân tích). Thu toàn bộ dịch chiết, lọc qua màng lọc 0,45 µm, sau đó cho vào bình 250 ml và định mức đến vạch bằng dung dịch pha động. 3. Xác định LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất PA và IB như sau: Tên chất Paracetamol Ibuprofen LOD (ppm) 1,2 1,2 LOQ (ppm) 4,0 4,0 Phương trình hồi quy Y = 16879x – 54957 Y = 25061x + 78528 Hệ số tương quan R = 0,9997 R = 0,9998 Khoảng tuyến tính 4,8 – 360 ppm 4,8 – 360 ppm Trang 49 4. Khảo sát và phân tích 2 mẫu thuốc Alaxan. Kết quả khảo sát cho thấy, hàm lượng PA và IB trong các mẫu thuốc tương đối phù hợp với thành phần ghi trên bao bì. Ngoài ra, hai mẫu có thành phần tương đương nhau và ổn định trong thời hạn sử dụng. 4.2. Đề xuất Như vậy, với kết quả thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt, thích hợp cho việc phân tích đồng thời PA và IB trong các mẫu dược phẩm cũng như phân tích PA hoặc IB trong các loại thực phẩm đơn thành phần. Chúng tôi hi vọng những nghiên cứu trên có thể góp phần vào việc ứng dụng phương pháp RP - HPLC nói riêng và phương pháp HPLC nói chung để xác định các dược chất trong các mẫu thuốc mới – ngày càng đa dạng về thành phần và hoạt chất. Trang 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Pharmacy Guide - Cẩm nang nhà thuốc thực hành, Vietnam Edition 2008, tr 136, 196. [2] Đặng Thanh Thủy (2008), “Định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong chế phẩm dược bằng phương pháp đo quang”, NXB ĐH Dược Hà Nội. [3] Đặng Quỳnh Chi (2008), “Định lượng đồng thời Paracetamol và Codein Phosphat bằng phương pháp điện di mao quản”, NXB ĐH Dược Hà Nội. [4] Deodhar MN et al (2009), “Reverse Phase HPLC Method for Determination of Aceclofenac and Paracetamol in Tablet Dosage Form”, Research Chem, page 37 – 40. [5] Patrica C. Damiani, et al (2001), “Spectrofluorometric determination of ibuprofen in pharmaceutical formulations”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 25, Issue 3 – 4, pages 679 – 683. [6] S.A Kulichenko and S.O Fessenko (2003), “Determination of ibuprofen and novocaine hydrochloride with the use of water–micellar solutions of surfactants”, Analytica Chimica Acta, Vol 481, Issue 1, pages 149 – 153. [7] Nguyễn Hữu Mỹ và cộng sự (2007), “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp HPLC định lượng ibuprofen trong huyết tương chó”, Báo cáo y học, Học viện Quân Y, NXB Đại học Dược Hà Nội. [8] Phạm Thanh Huyền (2008), “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng ibuprofen trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, Khóa luận tốt nghiệp, Học viện Quân Y, NXB Đại học Dược Hà Nội. [9] Phạm Thu Quế (2010), “Định lượng đồng thời Paracetamol và Ibuprofen trong viên nén bằng phương pháp quang phổ đạo hàm”, NXB ĐH Dược Hà Nội. [10] M.R. Khoshayand et al (2008), “Simultaneous spectrophotometric determination of paracetamol, ibuprofen and caffeine in pharmaceuticals by chemometric methods”, Iran, Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, Vol 70, Issue 3, pages 491 – 499. [11] Thái Duy Thìn và cộng sự (2003), “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và đo quang phổ UV – vis để định tính và định lượng các hoạt chất trong thuốc có từ 2 đến 5 thành phần”, Viện kiểm nghiệm thuốc Bộ Y tế, Trường Đại học Dược Hà Nội. Trang 51 [12] Prasanna Reddy Battu and MS Reddy (2009), “RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Paracetamol and Ibuprofen in Tablets”, Asian J. Research Chem, page 70 – 72. [13] Dipankar Basu et al (1998), “Application of least squares method in matrix form: simultaneous determination of ibuprofen and paracetamol in tablets”, Original Research Article Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol 16, Issue 5, pages 809 - 812. Trang 52 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. Một số sắc ký đồ của dãy chất chuẩn Paracetamol Hình 1.1 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 360 ppm Trang 53 Hình 1.2 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 240 ppm Hình 1.3 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 115,2 ppm Trang 54 Hình 1.4 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 57,6 ppm Trang 55 Hình 1.5 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 28,8 ppm Hình 1.1 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 9,6 ppm Trang 56 Hình 1.7 Sắc ký đồ của chất chuẩn Paracetamol, C = 4,8 ppm PHỤ LỤC 2: Một số sắc ký đồ của dãy đường chuẩn Ibuprofen Trang 57 Hình 2.1 Sắc ký đồ của chất chuẩn Ibuprofen, C = 360 ppm Hình 2.2 Sắc ký đồ của chất chuẩn Ibuprofen, C = 240 ppm Trang 58 Hình 2.3 Sắc ký đồ của chất chuẩn Ibuprofen, C = 115,2 ppm Trang 59 Hình 2.4 Sắc ký đồ của chất chuẩn Ibuprofen, C = 57,6 ppm Hình 2.5 Sắc ký đồ của chất chuẩn Ibuprofen, C = 28,8 ppm Trang 60 Hình 2.6 Sắc ký đồ của chất chuẩn Ibuprofen, C = 9,6 ppm Hình 2.7 Sắc ký đồ của chất chuẩn Ibuprofen, C = 4,8 ppm. Trang 61 Trang 62 PHỤ LỤC 3. Sắc ký đồ của mẫu M01 Hình 3.1 Sắc ký đồ mẫu M01 tiêm lần 4. Trang 63 Hình 3.2 Sắc ký đồ mẫu M01 tiêm lần 3. PHỤ LỤC 4. Sắc ký đồ mẫu M11. Hình 4.1 Sắc ký đồ mẫu M11 tiêm lần 2. Trang 64 Hình 4.1 Sắc ký đồ mẫu M11 tiêm lần 3.