Kỹ thuật trồng hoa Phong Lan

goàm caùc gioáng ñöôïc laáy töø caùc vuøng cao nguyeân ôû ñoä cao treân 1.000m. caùc loaøi naøy neáu ñöôïc troàng ôû nhieät ñoä cao hôn hoaëc baèng 250C, thì caây vaãn soáng, thì caây vaãn soáng nhöng hieám khi ra hoa. - Nhoùm öa noùng, nhieät ñoä thích hôïp cho caùc loaøi cuûa nhoùm naøy laø 250C, goàm ña soá caùc gioáng Dendrobium ôû vuøng nhieät ñôùi, vaø caùc loaøi cuûa gioáng Dendrobium lai hieän ñang troàng taïi thaønh phoá Hoà Chí Minh vaø caùc tænh phía Nam… - Ngoaøi ra, coøn coù moät nhoùm Dendrobium trung gian coù theå soáng ôû caû vuøng laïnh vaø vuøng noùng, nhöng ôû vuøng laïnh caây sinh tröôûng vaø ra hoa nhieàu hôn nhö Dendrobium primulinum, Dendrobium farmeri nhieät ñoä lyù töôûng cuûa caùc loaøi naøy laø 200C [11]. 2.4.2 Aåm ñoä. Caùc caây lan, nhaát laø phong lan, soáng baùm treân caùc caây cao, chuùng laáy nöôùc töø caùc traän möa, töø hôi nöôùc trong khoâng khí. Chính aåm ñoä quyeát ñònh söï hieän dieän cuûa caùc loaøi phong lan [16]. Thoâng thöôøng aåm ñoä töông ñoái toái thieåu 70% thích hôïp cho söï taêng tröôûng cuûa nhieàu loaøi. Tuy nhieân aåm ñoä lyù töôûng vaãn laø aåm ñoä cuûa vuøng baûn xöù maø loaøi lan ñoù ñöôïc tìm thaáy. Dendrobium cuõng nhö ña soá caùc gioáng lan khaùc chæ phaùt trieån toát trong khoâng khí aåm vaø thoaùng. Aåm ñoä töông ñoái caàn thieát laø 40-70%. Caáu taïo giaù theå quaù aåm vaø uùng thì boä reã seõ bò thoái vaø bieåu hieän laø caây con keiki moïc ra töø phaàn ngoïn cuûa thaân [11]. Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 8 2.4.3 Aùnh saùng. Aùnh saùng laø ñieàu kieän caàn thieát cho söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa caây lan thoâng qua quaù trình quang hôïp. Ñaây laø yeáu toá quyeát ñònh söï troå hoa cuûa lan [16]. Dendrobium laø gioáng öa saùng, coù theå troàng trong ñieàu kieän aùnh saùng tröïc tieáp hay khueách taùn. Aùnh saùng höõu hieäu cho gioáng Dendrobium laø 70%. Neáu thöøa aùnh saùng, caây seõ bò vaøng laù, giaû haønh bò teo laïi, caây xaáu ñi nhöng caây seõ thích nghi daàn, vaãn ra hoa nhieàu vaø ñeïp. Neáu thieáu aùnh saùng, caây seõ bò thoaùi hoùa roõ reät, caây eøo uoät vaø soá löôïng hoa seõ ít ñi [11]. 2.4.4 Nhu caàu phaân boùn. Dendrobium thaân ñöùng ñoøi hoûi dinh döôõng cao, chuùng caàn raát nhieàu phaân boùn vaø coù theå duøng nhieàu daïng phaân boùn khaùc nhau. Coøn caùc loaïi Dendrobium thaân thoøng haáp thu phaân chaäm neân phaûi duøng noàng ñoä thaät loaõng. Caùc loaïi phaân höõu cô nhö: phaân heo, baùnh daàu khoâ, phaân toâm caù, phaân traâu boø khoâ… coù theå duøng raát toát baèng caùch pha loaõng vôùi nöôùc roài töôùi, hoaëc voø chaët töøng vieân ñaët treân beà maët giaù theå, reã lan seõ haáp thuï daàn daàn caùc döôõng chaát ñöôïc phoùng thích qua quaù trình töôùi nöôùc. Caùc loaïi phaân voâ cô ñöôïc duøng thöôøng coù coâng thöùc 30-10-10 duøng 3 laàn/tuaàn vôùi noàng ñoä 1 muoãng caø pheâ/4lít. Trong suoát muøa taêng tröôûng, ta boùn phaân 10-20- 30 laøm 2 laàn/tuaàn ñeå taïo moät söùc chòu ñöïng cho caây tröôùc khi böôùc vaøo muøa nghæ. Trong muøa taêng tröôûng neáu caây coù nuï hoa, ta thay phaân 30-10-10 baèng phaân 10-20- 20 vôùi chu kyø boùn nhö treân cho ñeán khi hoa taøn. Trong muøa nghæ hoaøn toaøn khoâng boùn phaân cho Dendrobium, hay ñuùng hôn giaûm vaø khoâng boùn phaân cho Dendrobium khi caây hoaøn taát thôøi kì taêng tröôûng haèng naêm cuûa noù. Khoâng neân duøng caùc loaïi phaân rieâng reõ, thöôøng phaân boùn ñöôïc duøng ôû daïng hoãn hôïp vaø boå sung theâm caùc chaát phuï gia laø caùc sinh toá vaø caùc nguyeân toá vi löôïng. 2.4.5 Saâu beänh vaø caùc vaán ñeà khaùc. Vì lan Dendrobium caàn ñöôïc boùn nhieàu loaïi phaân höõu cô khaùc nhau vaø moâi tröôøng sô döøa seõ muïc naùt sau moät thôøi gian ngaén ñöôïc troàng. Ñaây laø 2 nguyeân nhaân gaây ra nhieàu saâu beänh haïi. Moät loaïi reäp dính maøu vaøng, kích thöôùc raát beù thöôøng xuaát hieän treân beà maët laù. Loaïi naøy gaây taùc haïi treân caây qua vieäc huùt nhöïa. Ñoái vôùi caùc loaøi coân truøng caén phaù Dendrobium thì loaïi tröø chuùng töông ñoái deã daøng baèng Serpa, Bassa, noàng ñoä 1/500. Maëc duø Dendrobium laø caây khaùng beänh raát maïnh, tuy nhieân caây vaãn bò naám vaø virus taán coâng neáu ñieàu kieän veä sinh quaù keùm. Nguy hieåm nhaát laø beänh khoâ thaân gaàn goác giaû haønh do moät loaøi virus thaâm nhaäp laøm cho caùc giaû haønh bò khoâ vaø cheát. Coù theå ngöøa beänh baèng caùch nöûa thaùng xòt Topsil, Zineb, Benomyl vôùi noàng ñoä 1/400 [11]. Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 9 Hình 2.4: Moät soá daïng hoa ñeïp cuûa gioáng Dendrobium. Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 10 III. Caùc phöông phaùp nhaân gioáng. 3.1 Nhaân gioáng ngoaøi thieân nhieân. 3.1.1 Nhaân gioáng voâ tính. a. Taùch buïi: ñaây laø phöông phaùp ñaõ ñöôïc caùc ngheä nhaân söû duïng ñoái vôùi caùc gioáng lan ña thaân nhö Cattleya, Dendrobium, Cymbidium, Paphiopelium…ôû Cattleya, Dendrobium, vaø nhöõng gioáng töông töï: ôû moãi goác cuûa giaû haønh thöôøng coù ít nhaát moät maét nguû neân coù theå taùch moãi haønh giaû thaønh moät ñôn vò ñeå troàng. b. Chieát caønh: ôû Dendrobium thöôøng taïo ra caây con treân giaû haønh (Keiki) moät caùch töï nhieân. Khi caùc caây con naøy khaù maïnh, coù reã toát, coù theå taùch ra khoûi giaû haønh ñeå troàng. 3.1.2 Nhaân gioáng höõu tính. a. Söï thuï phaán: Trong thieân nhieân söï thuï phaán ôû lan do coân truøng thöïc hieän. Caáu truùc cuûa hoa lan laø hoaøn toaøn ñeå thích öùng cho söï thuï phaán aáy. Coù hai phöông phaùp thuï phaán: - Söï töï thuï phaán: Khi phaán hoa cuûa boâng hoa naøy ñöôïc rôi vaøo nuoám cuûa chính hoa aáy. Ñieàu naøy hieám khi xaûy ra trong töï nhieân ôû hoa lan vì caáu truùc cuûa boä phaän sinh duïc ñöïc vaø caùi ôû hoa lan. - Söï thuï phaán cheùo: Khi phaán hoa ôû hoa naøy ñöôïc ñeå vaøo nuoám cuûa hoa khaùc cuûa cuøng caây hay cuøng loaøi (thöôøng xaûy ra trong thieân nhieân do coân truøng thöïc hieän), hoaëc khaùc loaøi, khaùc gioáng (thöôøng do con ngöôøi thöïc hieän). b. Quaû lan: Neáu söï thuï phaán coù keát quaû, thì coù theå ngay trong ngaøy hay sang ngaøy hoâm sau, caùc phieán hoa xuï laïi nhöng khoâng ruïng. Vaø ñeå traønh söï thuï phaán khaùc do coân truøng ngöôøi ta duøng bao nilong truøm hoa laïi, nhöng khoâng buoäc kín mieäng vì haàm hôi seõ laøm hö traùi. Sau khi thuï phaán, baàu noaõn töø töø tröông phuø to ra thaønh traùi. Moãi traùi coù theå chöùa haøng ngaøn hay ñeán caû trieäu hoät. Khi traí töø maøu xanh luïc chuyeån sang maøu vaøng luïc thì neân haùi traùi. c. Gieo haït: Trong thieân nhieân muoán haït lan naåy maàm thì haït lan phaûi ñöôïc nhieãm moät loaïi naám kí sinh. Ngöôøi ta ñaõ khaùm phaù ra moät soá loaøi naám giuùp naåy maàm ôû haït lan, moãi loaøi chæ giuùp naåy maàm moät soá gioáng lan maø thoâi. - Rhizoctonia repens giuùp naûy maàm ôû Cattleya, Laelia, Angraecum, Cypripedium (Paphiopedilum). Download» Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 11 - Rhizoctonia mucoroides giuùp naåy maàm ôû Vanda, Phalaenopsis. - Rhizoctonia lanugiosa giuùp cho hoät naåy maàm ôû Oncidium, Odontoglossum vaø Miltonoa [16]. 3.2 Nhaân gioáng trong phoøng thí nghieäm. Trong phoøng thí nghieäm lan Dendrobium ñöôïc chuùng toâi nhaân gioáng baèng phöông phaùp gieo haït in-vitro. Trong thieân nhieân, vì hoät lan quaù nhoû, khoâng chöùa chaát döï tröõ vaø chæ coù moät phoâi chöa phaân hoùa, neân khoâng theå phaùt trieån theo moät phöông caùch bình thöôøng ñöôïc vaø vì vaäy maø vieäc cho hoät lan naåy maàm vaø phaùt trieån thaønh caây lan tröôûng thaønh laø vaán ñeà khoù khaên. Ngöôøi troàng lan ñaõ tìm nhieàu caùch gieo haït nhöng khoâng thaønh coâng. Naêm 1922, Knudson ôû Myõ, thaønh coâng trong vieäc thay theá naám baèng ñöôøng ôû moâi tröôøng thaïch ñeå gieo haït [16]. Phöông phaùp naøy coù nhieàu öu ñieåm nhö: - Keát hôïp vôùi kyõ thuaät lai gioáng taïo ra nhieàu gioáng lan môùi cung caáp cho thò tröôøng. - Giuùp baûo toàn caùc loaøi lan quyù, vaø nhaân nhanh soá löôïng giuùp cho coâng taùc baûo toàn. IV. Sô löôïc veà kyõ thuaät nuoâi caáy moâ thöïc vaät. Nhaân gioáng in vitro hay nuoâi caáy moâ ñeàu laø thuaät ngöõ moâ taû caùc phöông thöùc nuoâi caáy caùc boä phaän thöïc vaät trong oáng nghieäm coù chöùa moâi tröôøng xaùc ñònh ôû ñieàu kieän voâ truøng [5]. Kyõ thuaät in vitro döïa treân nguyeân lyù laø teá baøo thöïc vaät coù tính toaøn theå, nghóa laø töø moät moâ, moät cô quan hoaëc moät teá baøo cuûa baát kyø boä phaän naøo cuûa caây ñeàu coù theå phaùt trieån thaønh moät caây hoaøn chænh neáu ñöôïc nuoâi trong moâi tröôøng thích hôïp [6]. 4.1 Ñieàu kieän nuoâi caáy teá baøo thöïc vaät. a. Yeâu caàu cô baûn nhaát cuûa phoøng nuoâi caáy moâ laø phaûi ñaûm baûo voâ truøng. Khaùi nieäm voâ truøng naøy bao goàm voâ truøng moâi tröôøng nuoâi caáy vaø caû söï baûo ñaûm sao cho maãu nuoâi caáy ñöôïc hoaøn toaøn voâ truøng. b. Caùc yeâu caàu cô baûn cuûa kyõ thuaät nuoâi caáy moâ teá baøo thöïc vaät: - Khi thieát laäp phoøng nuoâi caáy moâ thöïc vaät phaûi ñaûm baûo ñöôïc tính lieân tuïc thuaän lôïi cho caùc thao taùc, caùc giai ñoaïn trong suoát quaù trình nuoâi caáy moâ. - Ñaûm baûo ñöôïc veä sinh (tính voâ truøng) cuûa saûn phaåm cuoái cuøng. - Chuaån bò moâi tröôøng ñuùng caùch, choïn ñuùng moâi tröôøng cho töøng loaïi thöïc vaät vaø töøng giai ñoaïn nuoâi caáy. - Choïn vaø xöû lyù moâ thích hôïp tröôùc khi caáy [7]. Download» Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 12 c. Caùc thaønh phaàn cô baûn cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy bao goàm: nöôùc, muoái khoaùng (ña löôïng vaø vi löôïng), nguoàn cacbon, vitamin, chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng, agar (ñoái vôùi moâi tröôøng raén) [14]. - Nöôùc: nöôùc duøng trong moâi tröôøng nuoâi caáy laø nöôùc caát, hoaëc nöôùc khöû ion, toát nhaát laø nöôùc caát hai laàn töø caùc maùy caát nöôùc hoaøn toaøn baèng thuûy tinh. - Ñöôøng: taïo nguoàn cacbon giuùp moâ toång hôïp neân cacbohydrat cho caây maø khoâng phaûi do quanh hôïp cuûa moâ caây taïo neân; ñöôøng söû duïng phoå bieán laø saccarose (1-6%w/v), glucose (2% w/v). - Caùc muoái khoaùng ña löôïng: nuoâi caáy moâ thöïc vaät ñoøi hoûi moät löôïng nhaát ñònh caùc nguyeân toá ña löôïng nhö N, P, K, Ca, Mg, S, Fe, … - Caùc muoái khoaùng vi löôïng coù vai troø quan troïng trong ñôøi soáng thöïc vaät. Chuùng tham gia vaøo caùc quaù trình sinh hoùa trong teá baøo, tham gia vaøo trung taâm hoaït tính cuûa enzyme vaø vitamin, taêng tính choáng chòu cuûa thöïc vaät vôùi caùc ñieàu kieän moâi tröôøng baát lôïi. Caùc vi löôïng thoâng duïng laø Mn, B, Zn, Cu, Co, I, noàng ñoä söû duïng trong moâi tröôøng raát thaáp. - Vitamins: chuû yeáu myo-inositol, acid nicotinic, puridoxin HCl (B6), thiamin HCl (B1)…Caùc vitamin deã bò hoûng do nhieãm taïo neân caàn giöõ ôû t0< 00C [9]. - Chaát ñieàu hoøa taêng tröôûng: tuøy theo töøng muïc ñích nuoâi caáy coù theå choïn caùc noàng ñoä vaø toå hôïp caùc noàng ñoä vaø toå hôïp caùc chaát ñieâu hoøa sinh tröôûng phuø hôïp. Caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöôøng duøng laø IAA, NAA, 2,4D, Kinetin, BAP, IBA…[14] - Agar(ñoái vôùi moâi tröôøng ñaëc): laø moät polisacarit laøm töø rong bieån. Agar tan ôû 1000C vaø khi nguoäi seõ ñoâng ñaëc laïi. Haøm löôïng söû duïng töø 8-10g/l tuøy haõng cheá taïo[10]. d. Nhieät ñoä, aùnh saùng vaø pH aûnh höôûng ñeán quaù trình caáy: - Nhieät ñoä: nhieät ñoä cuûa phoøng nuoâi caáy thöôøng ñöôïc ñieàu chænh oån ñònh töø 22-250C. ôû moãi teá baøo thöïc vaät khaùc nhau thì nhieät ñoä nuoâi caáy cuõng khaùc nhau [5]. - Aùnh saùng: coù aûnh höôûng ñeán quaù trình phaùt sinh hình thaùi caây nuoâi caáy. Caùc yeáu toá aûnh höôûng bao goàm: cöôøng ñoä, chu kyø, thaønh phaàn quang phoå aùnh saùng. Cöôøng ñoä aùnh saùng töø: 1000- 2500 lux ñöôïc duøng phoå bieán cho nuoâi caáy nhieàu loaïi moâ [5]. - pH: laø moät yeáu toá quan troïng. Söï oån ñònh pH moâi tröôøng laø yeáu toá duy trì trao ñoåi caùc chaát trong teá baøo. Ñeå ñieàu chænh Download» Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 13 pH moâi tröôøng coù theå duøng dung dòch 10% hoaëc 1N NaOH hoaëc 1N HCl [14]. 4.2 Kyõ thuaät gieo haït trong oáng nghieäm. a. Ñaëc ñieåm cuûa haït lan. Khoâng gioáng nhöõng loaïi haït khaùc, haït lan raát nhoû, nhö haït buïi vaø khoâng chöùa nguoàn döï tröõ thöùc aên. Trong töï nhieân, haït coù theå naåy maàm nhöng seõ khoâng phaùt trieån neáu khoâng coù söï taùc ñoäng cuûa naám mycorrhizal [22]. Loaïi naám naøy tieâu hoùa caùc vaät chaát höõu cô treân caây chuû hoaëc trong ñaát, chuyeån hoùa thaønh caùc ñöôøng ñôn giaûn giuùp haït lan naåy maàm vaø giuùp phoâi phaùt trieån [23]. Khi haït lan ñaõ naåy maàm, noù seõ taïo ra moät löôïng lôùn caùc teá baøo khoâng phaân hoùa ñöôïc goïi laø protocorm. Neáu taát caû ñeàu toát, protocorm seõ tieáp tuïc trong vaøi tuaàn, vaøi thaùng, thaäm chí caû naêm tuøy loaøi, cho ñeán khi ñuû lôùn ñeå taïo thaân vaø reã. Ôû caùc loaøi lan ñaát, duy trì moái quan heä coäng sinh naøy raát quan troïng trong suoát giai ñoaïn ñaàu tieân cuûa caây, vì protocorm naèm döôùi ñaát neân khoâng theå töï toång hôïp thöùc aên. Ôû caùc loaøi lan phuï sinh, protocorm thöôøng xanh, vaø vì theá noù coù theå töï toång hôïp ñöôïc moät ít thöùc aên [22]. b. Khöû truøng traùi lan. Vieäc khöû ruøng traùi lan coù theå thöïc hieän theo hai phöông phaùp: - Quaû lan sau khi moå ra, haït thu ñöôïc tröôùc khi ñem gieo caàn tuyeån choïn caùc haït chaéc, caùc haït leùp khoâng thuï tinh caàn phaûi loaïi boû ñi baèng caùch ñem ly taâm trong nöôùc caát; caùc haït lan toát seõ laéng phía döôùi oáng nghieäm, haït leùp noåi leân treân, ñöôïc gaïn boû ñi. Caùc haït toát ñöôïc tieáp tuïc khöû truøng baèng Hypochlorite de calcium 10%. Sau ñaáy, cho haït lan vaø nöôùc khöû truøng vaøo oáng nghieäm, vöøa ñuû phuû kín haït lan, laéc maïnh, ñeàu vaø ñeå yeân trong voøng 10 phuùt, sau ñoù ñoå nöôùc khöû truøng ra baèng oáng huùt, vaø tieáp tuïc röûa haït lan 3 laàn baèng nöôùc caát voâ truøng. Cuoái cuøng haït lan ñaõ khöû truøng seõ ñöôïc gieo vaøo caùc bình chöùa moâi tröôøng. - Khi quaû lan ñaõ ñöôïc caét treân caây, mang vaøo phoøng thí nghieäm, caàn ñeå nôi saïch seõ, thoaùng maùt. Neáu chöa gieo haït ngay thì coù theå giöõ quaû trong tuû laïnh, trong voøng 3-4 ngaøy. Khi gieo haït, tröôùc tieân quaû lan caàn caét boû caùc cuoáng daøi, ñuoâi coøn soùt laïi caùc laù ñaøi, caùnh hoa…Duøng boâng goøn coù taåm alcol 700 ñeå lau toaøn boä maët ngoaøi cuûa quaû. Moät khi vaøo tuû caáy voâ truøng, quaû lan seõ ñöôïc: - Nhuùng vaøo alcol 90-960, trong 1 phuùt, hô nhanh qua ngoïn löûa. - Nhuùng vaøo Hypochlorite de calcium 10%, trong 10 phuùt, röûa laïi 3 laàn baèng nöôùc caát voâ truøng. Download» Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 14 Sau ñaáy quaû lan seõ ñöôïc caét goït hai ñaàu, vaø duøng dao moå xeû doïc quaû lan (moå hai ñöôøng ñoái dieän nhau), taùch laøm hai quaû lan, keá ñeán duøng pince vaø dao moå ñeå giöõ laáy taát caû caùc haït coù trong hai nöûa quaû lan, baèng caùch goõ nheï leân phaàn ngoaøi cuûa voû quaû. Neáu söï thuï tinh toát, taát caû caùc haït seõ coù maøu vaøng vaø ñeàu rôi xuoáng moät ñóa petri duøng ñeå höùng laáy haït. Sau ñoù ngöôøi ta seõ duøng muoãng hoaëc moät duïng cuï inox duøng ñeå gieo haït vaøo caùc bình chöùa moâi tröôøng [8]. c. Kyõ thuaät gieo haït trong oáng nghieäm: haït seõ naåy maàm trong oáng nghieäm baèng thuûy tinh hay baèng nhöïa treân moâi tröôøng raén coù chöùa ñöôøng vaø caùc loaïi chaát khoaùng caàn thieát ñeå haït naåy maàm vaø phaùt trieån. Ñoái vôùi lan coù hai kieåu naåy maàm cô baûn: naåy maàm caàn naám coäng sinh vaø naåy maàm khoâng coäng sinh. - Trong kieåu naåy maàm coäng sinh, haït ñöôïc gieo vôùi moät löôïng nhoû naám mycorrhizal thích hôïp. Naám naøy seõ phaùt trieån treân moâi tröôøng, bao phuû caùc haït naåy maàm vaø moái quan heä coäng sinh xuaát hieän seõ duy trì söùc soáng cuûa protocorm cho ñeán khi noù taïo ra laù vaø coù khaû naêng töï döôõng. Kyõ thuaät naøy ñöôïc söû duïng roäng raõi ñeå nhaân gioáng caùc loaïi lan ñaát ôû vuøng oân ñôùi. Kyõ thuaät naøy coù lôïi theá laø moâi tröôøng söû duïng raát ñôn giaûn (moät trong nhöõng daïng phoå bieán chæ bao goàm boät yeán maïch vaø moät ít dòch chieát naám men), vaø caây sinh ra thöôøng khoûe hôn vaø coù khaû naêng ñeå khaùng vôùi caùc taùc ñoäng cuûa naám toát hôn caây ñoái chöùng naåy maàm khoâng caàn naám. Kyõ thuaät naøy coù moät nhöôïc ñieåm laø caàn phaûi coù moät chuûng naám mycorrhizal thuaàn khieát, hoaëc quan heä coäng sinh khoâng phaùt trieån, hoaëc trôû thaønh kyù sinh vaø haït gieo seõ cheát. Coù raát ít nghieân cöùu thöïc hieän veà caùc loaøi naám mycorrhizal ôû caùc loaøi lan nhieät ñôùi, neân kyõ thuaät naøy ít ñöôïc aùp duïng. - Kieåu naåy maàm khoâng coäng sinh thöôøng ñöôïc söû duïng ñeå nhaân gioáng caùc loaøi lan nhieät ñôùi. Moâi tröôøng söû duïng phöùc taïp hôn bao goàm caùc muoái khoaùng, caùc chaát höõu cô vaø ñöôøng vôùi moät löôïng thích hôïp ñeå haït lan naåy maàm maø khoâng caàn naám [22]. d. Öùng duïng cuûa vieäc gieo haït. - Gia taêng löôïng hoa lan treân thò tröôøng - Nhaân gioáng caùc loaøi lan hieám nhaèn nhaân nhanh soá löôïng caû trong töï nhieân vaø trong caùc chöông trình baûo toàn. - Cung caáp caây con ñeå baùn, giuùp haïn cheá söï khai thaùc caây hoang daïi, kích thích söï quan taâm cuûa coâng chuùng vaø taïo nguoàn thu ngaân saùch. - Keát hôïp vôùi kyõ thuaät lai gioáng taïo ra nhöõng caây lan khoûe maïnh coù maøu saéc ñaëc bieät [22]. Download» Khoaù luaän toát nghieäp - 2005 Toång quan taøi lieäu SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 15 V. Caùc coâng trình ngieân cöùu gieo haït lan trong oáng nghieäm. 5.1 Trong nöôùc: Döông Coâng Kieân vaø coäng söï nghieân cöùu lai taïo vaø gieo haït lan Dendrobium trong oáng nghieäm [8]. 5.2 Ngoaøi nöôùc: Naêm 1844, Neumann, moät ngöôøi Phaùp laøm vöôøn, ñaõ laøm naåy maàm moät soá hoät lan baèng caùch raûi ñaïi caùc hoät lan treân caùc cuïc ñaát ôû quanh goác cuûa caùc caây lan lôùn. Naêm 1899, Noel Bernard, nhaø thöïc vaät ngöôøi Phaùp, ñaõ khaùm phaù ra bí maät cuûa vieäc naåy maàm ôû hoät lan khi oâng khaûo saùt caùc hoät Neottia nidus-avis naåy maàm töï nhieân trong röøng. Naêm 1904, oâng coäng taùc vôùi Burgeff ñeå ñöa ra phöông phaùp gieo hoät lan coù nhieãm naám trong chai thaïch [16]. Naêm 1909, Hans Burgeff ñaõ laøm naåy maàm ñöôïc Laeliocattleya treân moâi tröôøng dinh döôõng goàm 0,33% saccarose (ñöôøng mía). Naêm 1922, Lewis Knudson ñaõ laøm naåy maàm Cattleya mossiae treân moâi tröôøng Pfefferds 1% saccarose (ñöôøng mía) [11]. VI. Muïc ñích gieo haït lan Dendrobium trong oáng nghieäm. Hình 2.5: Quaû lan Dendrobium. Caùc nhaø troàng lan khoâng ngöøng tìm kieám caùc gioáng lan môùi ñeå thoõa maõn söï hieáu kì cuûa mình hoaëc coù theå ñem baùn. Coù hai caùch ñeå coù ñöôïc gioáng lan môùi. Moät laø, söu taäp nhöõng gioáng lan hoang daïi trong röøng ñem veà thuaàn hoùa, taïo caùc ñieàu kieän nhaân taïo gioáng töï nhieân ñeå caây lan coù theå ra hoùa. Phöông phaùp naøy gaëp nhieàu ruûi ro do ñieàu kieän moâi tröôøng khoâng thuaän lôïi cho caây lan phaùt trieån. Hai laø, taïo ra nhöõng gioáng lan lai môùi, caây lan lai seõ mang nhöõng ñaëc tính toát vöïôt troäi cuûa caû boá meï, coù theå thoûa maõn ñöôïc nhu caàu cuûa ngöôøi thöôûng thöùc lan. Tuy nhieân khi hai caây lan lai vôùi nhau ñaït keát quaû vaø taïo traùi caàn phaûi keát hôïp vôùi phöông phaùp gieo haït trong oáng nghieäm ñeå haït lan coù theå naåy maàm deã daøng. Coù nhö vaäy môùi coù theå kieåm tra keát quaû cuûa vieäc lai hai caây lan. Ñoái vôùi moät soá gioáng lan quyù caàn phaûi baûo veä thì phöông phaùp gieo haït trong oáng nghieäm giuùp baûo toàn gioáng, nhaân nhanh soá löôïng caây maø vaãn ñaûm baûo ñöôïc tính oån ñònh di truyeàn. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 16 PHAÀN III: VAÄT LIEÄU – PHÖÔNG PHAÙP I. Vaät lieäu vaø ñieàu kieän gieo haït trong oáng nghieäm. 1.1 Maãu quaû gieo haït. Vaät lieäu laø quaû lan Dendrobium lai daøi töø 4-5 cm laáy töø caây ngoaøi thieân nhieân, taïi vöôøn thaày Döông Coâng Kieân, quaän 12, thaønh phoá Hoà Chí Minh. 1.2 Moâi tröôøng nuoâi caáy. Moâi tröôøng Knudson C (1946), boå sung theâm: - Nöôùc döøa 15%. - Than hoaït tính 0.5g/l, tuøy theo muïc ñích thí nghieäm. - Ñöôøng 30g/l. - Agar 8,5 g/l. - pH = 5.7 – 6. Moâi tröôøng MS (Murashige vaø Skoog, 1962), boå sung theâm: - Nöôùc döøa 15%. - Than hoaït tính 0.5g/l, tuøy theo muïc ñích thí nghieäm. - Glycin 0.5g/l - myo-Inositol 0.1mg/l - Ñöôøng 30g/l. - Agar 8,5 g/l. - pH = 5.5 – 5.7. Söû duïng chai thuûy tinh 100 ml vaø 500 ml ñeå nuoâi caáy. Taát caû moâi tröôøng ñöôïc haáp khöû truøng ôû 1atm, 1210C trong thôøi gian 20 phuùt. 1.3 Ñieàu kieän nuoâi caáy. Thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän töø ngaøy 20/01/2005 ñeán ngaøy 26/05/2005, taïi coâng ty Vaên Thaønh Taøi, 114 Hoàng Haø, Quaän Taân Bình, Thaønh phoá Hoà Chí Minh, vôùi caùc ñieàu kieän nuoâi caáy nhö sau: - Nhieät ñoä phoøng nuoâi: 24-280C. - Cöôøng ñoä chieáu saùng: 2000-3000 lux. - Thôøi gian chieáu saùng: 8 giôø/ngaøy. - AÅm ñoä trung bình: 60-70%. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 17 II. Höôùng ñi cuûa ñeà taøi. Ñoái vôùi ñeà taøi, chuùng toâi höôùng muïc ñích nhaân gioáng lan Dendrobium lai baèng phöông phaùp gieo haït in-vitro nhaèm: - Cung caáp gioáng lan môùi cho caùc phoøng nuoâi caáy moâ. - Taïo ra caây con khoûe, saïch beänh, ñeå troàng ra vöôøn öôm. - Kieåm tra keát quaû lai. Vôùi thôøi gian quaù ngaén, töø nguyeân lieäu ban ñaàu laø quaû lan, chuùng toâi chæ coù theå thöïc hieän ñöôïc caùc giai ñoaïn: - Khöû truøng quaû. - Nhaân protocorm. - Ra reã. III. Boá trí thí nghieäm: 3.1 Thí nghieäm 1: Khöû truøng quaû a. Muïc ñích thí nghieäm: - Tìm phöông phaùp khöû truøng thích hôïp. - Tìm noàng ñoä Hypochloride calcium Ca(OCl)2 vaø thôøi gian khöû truøng thích hôïp ñoái vôùi quaû lan. - Theo doõi bieåu hieän cuûa haït. b. Phöông phaùp vaø hoùa chaát söû duïng: - Phöông phaùp ñoát coàn. - Phöông phaùp hoùa chaát: duøng Ca(OCl)2. c. Boá trí thí nghieäm: - Maãu laáy töø thieân nhieân. - Röõa maãu döôùi nöôùc chaûy khoaûng 10 phuùt. - Röûa maãu baèng xaø phoøng pha loaõng. - Röûa laïi nhieàu laàn baèng nöôùc caát. Chuyeån maãu vaøo tuû caáy voâ truøng. - Röûa maãu baèng coàn 700 trong 1-2 phuùt. - Röûa maãu laïi baèng nöôùc caát voâ truøng khoaûng 2-3 laàn. - Ngaâm maãu trong Ca(OCl)2 vaø thöôøng xuyeân laéc maãu. - Röûa laïi maãu nhieàu laàn baèng nöôùc caát voâ truøng khoaûng 3-4 laàn cho thaät saïch. - Nhuùng vaøo coàn 900 vaø hô nhanh qua ngoïn löûa. - Nhanh choùng ñaët quaû lan vaøo ñóa petri vaøo ñaäy naép laïi. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 18 - Sau ñaáy quaû lan seõ ñöôïc caét goït 2 ñaàu, vaø duøng dao moå xeû doïc quaû lan, taùch laøm 2. - Duøng dao giöõ phaàn voû quaû, duøng keïp laáy heát hoät ra moät ñóa petri. - Gieo haït vaøo moâi tröôøng. - Thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 2 laàn, moãi laàn moät quaû. d. Chæ tieâu theo doõi. Tyû leä haït soáng sau khi gieo. Tình traïng haït gieo: Xanh. Traéng. Hoùa naâu. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 19 Hình 3.1: Quy trình khöû maãu. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 20 3.2 Thí nghieäm 2: Tìm moâi tröôøng thích hôïp ñeå gieo haït. a. Muïc ñích thí nghieäm. Tìm moâi tröôøng khoaùng thích hôïp ñeå gieo haït. b. Moâi tröôøng gieo haït. - Moâi tröôøng MS khoâng boå sung kích thích toá, kyù hieäu Mo. - Moâi tröôøng MS boå sung 1ppm BA, kyù hieäu laø M1. - Moâi tröôøng Knudson’C khoâng boå sung kích toá kyù hieäu Ko. - Moâi tröôøng Knudson’C boå sung 1ppm BA, kyù hieäu K1. c. Boá trí thí nghieäm. - Caùc quaû lan ñaõ ñöôïc khöû truøng töø thí nghieäm 1, seõ ñöôïc gieo vaøo 4 loaïi moâi tröôøng thöû nghieäm. - Theo doõi vaø ghi nhaän keát quaû sau 2-4 tuaàn - Thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 2 laàn , moãi laàn 15 chai 100ml. d. Chæ tieâu theo doõi. - Thôøi gian haït naåy maàm. - Moâi tröôøng thích hôïp gieo haït Dendrobium. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 21 3.3 Thí nghieäm 3: Taïo Protocorm a. Muïc ñích thí nghieäm. - So saùnh söï thaønh laäp protocorm treân hai moâi tröôøng khaùc nhau vaø boå sung cuøng noàng ñoä kích thích toá. - Tìm moâi tröôøng thích hôïp cho caùc thí nghieäm veà sau. b. Moâi tröôøng nuoâi caáy. - Moâi tröôøng MS khoâng boå sung kích thích toá, kyù hieäu Mo. - Moâi tröôøng MS boå sung 2ppm BA, kyù hieäu laø M2. - Moâi tröôøng Knudson’C khoâng boå sung kích toá kyù hieäu Ko. - Moâi tröôøng Knudson’C boå sung 2ppm BA, kyù hieäu K2. c. Boá trí thí nghieäm. - Nhöõng maãu haït ñaõ phình to ra, coù maøu xanh, khoâng nhieãm töø thí nghieäm 2. - Theo doõi vaø ghi nhaän keát quaû sau 2-4 tuaàn nuoâi caáy. - Thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 3 laàn, moãi laàn 8 chai 100ml. d. Chæ tieâu theo doõi - Thôøi gian taïo protocorm. - Moâi tröôøng taïo protocorm toát nhaát. - Tình traïng phaùt trieån cuûa prorocorm. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 22 3.4 Thí nghieäm 4: Nhaân protocorm a. Muïc ñích thí nghieäm. So saùnh söï nhaân protocorm treân cuøng moät loaïi moâi tröôøng vôùi noàng ñoä kích thích toá thay ñoåi. b. Moâi tröôøng nuoâi caáy. - Moâi tröôøng Knudson’C ñoái chöùng khoâng boå sung kích thích toá kyù hieäu K0. - Moâi tröôøng Knudson’C boå sung BA vôùi noàng ñoä 1ppm:2ppm:3ppm, kyù hieäu laø K1, K2, K3. - Moâi tröôøng Knudson’C boå sung 2ppm BA vaø IAA vôùi noàng ñoä 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, kyù hieäu laø K4, K5, K6. c. Boá trí thí nghieäm. - Söû duïng caùc protocorm ñöôïc taïo thaønh töø thí nghieäm 3. - Theo doõi vaø ghi nhaän keát quaû sau 2-4 tuaàn nuoâi caáy. - Thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 3 laàn, moãi laàn 3 chai 500ml. d. Chæ tieâu theo doõi. - Nhaän xeùt moâi tröôøng nhaân nhanh protocorm baät choài toát nhaát: thôøi gian ngaén nhaát cho caây coù chieàu cao 2-3 cm vaø coù 2-3 laù. - Söï taïo thaønh caây giöõa caùc moâi tröôøng. - Maøu saéc vaø chieàu daøi laù. - Thôøi gian xuaát hieän reã ñaàu tieân. Download» Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Vaät lieäu – Phöông phaùp SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 23 3.5 Thí nghieäm 5: Ra reã a. Muïc ñích thí nghieäm. Khaûo saùt moâi tröôøng thích hôïp cho söï ra reã. b. Moâi tröôøng nuoâi caáy. - Moâi tröôøng Knudson’C ñoái chöùng khoâng boå sung kích thích toá kyù hieäu K0. - Moâi tröôøng Knudson’C boå sung NAA vôùi noàng ñoä 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, kyù hieäu laø KN1, KN2, KN3. - Moâi tröôøng Knudson’C boå sung IAA vôùi noàng ñoä 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, kyù hieäu laø KI1, KI2, KI3. - Moâi tröôøng Knudson’C boå sung IBA vôùi noàng ñoä 0.1ppm:0.5ppm:1ppm, kyù hieäu laø KB1, KB2, KB3. c. Boá trí thí nghieäm. - Nhöõng caây con coù chieàu cao töø 2-3 cm vaø coù 2-3 laù ñöôïc taïo thaønh töø thí nghieäm 4. - Theo doõi vaø ghi nhaän keát quaû sau 3-4 tuaàn nuoâi caáy. - Thí nghieäm ñöôïc laëp laïi 3 laàn, moãi laàn 3 chai 500 ml. d. Chæ tieâu theo doõi - Chieàu daøi reã. - Söï taêng tröôûng chieàu cao caây. Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 30 PHAÀN IV: KEÁT QUAÛ – THAÛO LUAÄN I. Thí nghieäm 1: Khöû truøng maãu. Quaû lan sau khi ñöôïc khöû truøng, gieo haït vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy, sau 1 tuaàn keát quaû ghi nhaän ñöôïc nhö sau: Baûng 1: Keát quaû khöû truøng maãu baèng Ca(OCl)2, sau 1 tuaàn. Soáng vaø khoâng nhieãm Cheát vaø khoâng nhieãm Nhieãm NT Soá laàn ñoát Soá löôïng Tyû leä (%) Soá löôïng Tyû leä (%) Soá löôïng Tyû leä (%) 1 1 16 100 0 0 0 0 2 2 10 62,5 6 37,5 0 0 Baûng 2: Keát quaû khöû truøng maãu baèng phöông phaùp ñoát, sau 1 tuaàn. Maãu haït lan ñöôïc gieo vaøo moâi tröôøng, sau 1 tuaàn khöû truøng, maãu baét ñaàu coù nhöõng bieåu hieän khaùc nhau: - Ñoái vôùi nhöõng maãu soáng vaø khoâng nhieãm, sau 1 tuaàn, haït daàn daàn thích nghi vôùi moâi tröôøng, baét ñaàu chuyeån sang maøu naâu vaøng maät ong. - Coøn vôùi nhöõng maãu haït bò aûnh höôûng bôûi Ca(OCl)2, vaø nhieät ñoä cao, haït chuyeån sang maøu traéng vaø naâu ñuïc, khoâng phaùt trieån. Keát quaû ghi nhaän ñöôïc ôû baûng 1 cho thaáy: - Noàng ñoä Ca(OCl)2 7%, thôøi gian khöû truøng laø 15 phuùt tyû leä haït soáng vaø khoâng nhieãm laø 75%, maãu khoâng bò cheát nhöng tyû leä Soáng vaø khoâng nhieãm Cheát vaø khoâng nhieãm Nhieãm N T Noàng ñoä Ca(OCl)2 (%) Thôøi gian (phuùt) Soá löôïng Tyû leä (%) Soá löôïng Tyû leä (%) Soá löôïng Tyû leä (%) 1 7 15 12 75 0 0 4 25 2 7 20 15 93,75 1 6,25 0 0 3 9 15 16 100 0 0 0 0 4 9 20 10 62,5 6 37,5 0 0 Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 31 nhieãm cao (25%). Coøn vôùi thôøi gian khöû truøng 20 phuùt, tyû leä haït soáng khaù cao (93,75%), maãu hoaøn toaøn khoâng bò nhieãm, nhöng bò cheát (6,25%). - Khi khöû truøng ôû noàng ñoä taêng thì tyû leä maãu bò cheát taêng theo vaø soá maãu nhieãm giaûm daàn. Ôû noàng ñoä 9%, thôøi gian khöû truøng laø 15 phuùt, tyû leä haït soáng raát cao (100%), maãu haït gieo hoaøn toaøn khoâng bò nhieãm, khoâng cheát. Khi keùo daøi thôøi gian khöû truøng 20 phuùt, thì tyû leä maãu cheát taêng cao (37,5%). Khi ngaâm quaû lan trong dung dòch Ca(OCl)2, phaàn voû beân ngoaøi tieáp xuùc tröïc tieáp vôùi dung dòch khöû truøng, coøn phaàn haït beân trong khoâng bò aûnh höôûng. Khi gieo haït vaøo moâi tröôøng, haït coù khaû naêng phuïc hoài nhanh vaø naåy maàm. Tuy nhieân, neáu taêng noàng ñoä vaø keùo daøi thôøi gian khöû truøng, dung dòch seõ ngaám vaøo beân trong voû quaû, neân sau khi gieo vaøo moâi tröôøng, haït phuïc hoài raát chaäm vaø coù theå seõ bò cheát (hoùa traéng). Nhö vaäy, vôùi caùc noàng ñoä Ca(OCl)2 ñaõ ñöôïc söû duïng trong loaït thí nghieäm, thì noàng ñoä 9% trong thôøi gian 15 phuùt laø thích hôïp nhaát. Keát quaû ghi nhaän ñöôïc ôû baûng 2 cho thaáy: - Khöû truøng quaû lan baèng phöông phaùp ñoát coàn thì maãu haït gieo hoaøn toaøn khoâng bò nhieãm. Nhöng neáu tieán haønh ñoát 2 laàn thì tyû leä maãu cheát cao (37,5%), töông ñöông vôùi phöông phaùp khöû truøng baèng Ca(OCl)2 9%, trong thôøi gian 20 phuùt. - Khi ñoát moät laàn tyû leä maãu soáng laø 100%, töông öùng vôùi khi khöû truøng baèng Ca(OCl)2 9% trong thôøi gian 15phuùt. Khi nhuùng quaû lan vaøo coàn 900 vaø ñoát, thì phaàn voû quaû beân ngoaøi seõ bò aûnh höôûng tröïc tieáp cuûa nhieät ñoä cao, ñoàng thôøi seõ loaïi boû hoaøn toaøn caùc taùc nhaân gaây nhieãm beân ngoaøi voû. Nhöng neáu tieán haønh ñoát 2 laàn, nhieät ñoä cao cuøng vôùi thôøi gian keùo daøi seõ gaây aûnh höôûng ñeán haït beân trong, neân khi gieo vaøo moâi tröôøng, maãu haït phuïc hoài raát chaäm, hoaëc coù theå hoùa naâu, khoâng naûy maàm ñöôïc. ™ Nhö vaäy, khi khöû truøng quaû lan baèng Ca(OCl)2 9% trong thôøi gian 15 phuùt vaø ñoát coàn moät laàn, tyû leä soáng, khoâng nhieãm laø nhö nhau. Tuy nhieân, duøng phöông phaùp ñoát coàn thì haït gieo phuïc hoài vaø naåy maàm nhanh hôn. Ngoaøi ra, phöông phaùp naøy coøn tieát kieäm nhieàu thôøi gian khöû truøng maãu, thao taùc ñôn giaûn hôn, kinh teá hôn. Toùm laïi: maãu khöû truøng laø quaû lan Dendrobium coøn xanh. Vì maãu haït gieo naèm beân trong, neân neáu tieán haønh röûa maãu kyõ vaø ñoát baèng coàn 1 laàn thì coù theå loaïi boû hoaøn toaøn caùc taùc nhaân gaây nhieãm. Haït khoâng bò aûnh höôûng vaø khi gieo vaøo moâi tröôøng seõ phuïc hoài raát nhanh. Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 32 Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 33 II. Thí nghieäm 2: Caùc quaû lan sau khi ñöôïc khöû truøng seõ ñöôïc gieo vaøo 4 loaïi moâi tröôøng khaùc nhau, ñöôïc theo doõi sau 4 tuaàn nuoâi caáy: Moâi tröôøng Kyù hieäu Noàng ñoä BA (ppm) Soá maãu hoùa naâu (1 tuaàn) % Soá maãu naûy maàm (2 tuaàn) % Soá maãu hoùa xanh (4 tuaàn) % M0 0 100 83,33 93,33 MS M1 1 100 90 100 K0 0 100 50 63,33 KC K1 1 100 43,33 80 Baûng 3: Söï naûy maàm cuûa haït lan treân moâi tröôøng Knudson’C vaø MS boå sung 1 ppm BA. - Moät tuaàn sau khi gieo vaøo moâi tröôøng, taát caû maãu haït lan ñeàu hoùa naâu vaøng. - Sau 2 tuaàn, maãu baét ñaàu coù hieän töôïng naåy maàm vaø coù söï khaùc bieät roõ reät giöõa caùc loaïi moâi tröôøng khaùc nhau. - Sau 4 tuaàn, nhöõng haït coù maøu hôi vaøng, daàn chuyeån sang xanh do coù söï tieáp xuùc vôùi aùnh saùng, taïo ñöôïc dieäp luïc toá. Döïa vaøo baûng keát quaû, chuùng toâi nhaän thaáy: - Haït gieo trong moâi tröôøng MS coù tyû leä naåy maàm raát cao (80- 90%), haàu nhö taát caû caùc maãu haït ñeàu coù hieän töôïng phình leân vaø chuyeån sang vaøng. Trong khi ñoù, maãu haït gieo trong moâi tröôøng Knudson’C, tyû leä naåy maàm raát thaáp (40-50%). Trong thôøi ñieåm naøy haàu nhö khoâng coù söï khaùc bieät giöõa loaïi moâi tröôøng coù vaø khoâng coù kích thích toá. Coù theå trong thôøi ñieåm naøy, kích thích toá khoâng coù aûnh höôûng gì maáy ñoái vôùi khaû naêng naåy maàm cuûa haït. - Sau 4 tuaàn, haït lan hoùa xanh. Trong moâi tröôøng MS coù boå sung BA 1ppm, taát caû maãu haït ñeàu hoùa xanh. neáu khoâng coù kích thích toá tyû leä naøy laø 93,33%. Trong moâi tröôøng KC, tyû leä maãu hoùa xanh thaáp hôn, ôû ñaây coù söï khaùc bieät roõ reät giöõa moâi tröôøng coù vaø khoâng coù kích thích toá. Moâi tröôøng KC coù BA tyû leä naåy maàm cao hôn (80%) so vôùi khoâng coù BA (63,33%). Trong giai ñoaïn naøy, vai troø cuûa kích thích toá ñaõ coù bieåu hieän roõ reät. Caùc maãu haït Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 34 gieo trong moâi tröôøng coù kích thích toá, coù maøu xanh ñaäm hôn, haït phình to hôn ™ Töø caùc keát quaû ghi nhaän ñöôïc cho thaáy, ôû cuøng noàng ñoä kích thích toá, nhöng treân moâi tröôøng MS coù noàng ñoä khoaùng cao hôn, thì haït lan naåy maàm nhanh hôn so vôùi moâi tröôøng Knudson’C. Vaäy, moâi tröôøng MS coù 1 ppm BA cho söï naåy maàm cuûa haït lan Dendrobium toát hôn so vôùi moâi tröôøng Knudson’C. Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 35 III. Thí nghieäm 3: Caùc maãu haït lan sau khi ñaõ hoùa xanh, ñöôïc caáy chuyeàn qua caùc moâi tröôøng khaùc nhau ñeå taïo protocorm, ñöôïc theo doõi sau 4 tuaàn nuoâi caáy: Tình traïng taïo protocorm Moâi tröôøng Kyù hieäu Noàng ñoä BA (ppm) Sau 2 tuaàn Sau 4 tuaàn M0 0 0 + MS M2 2 + + K0 0 + ++ KC K2 2 ++ +++ Baûng 4: Keát quaû taïo protocorm treân moâi tröôøng Knudson’C vaø MS boå sung 2 ppm BA. Vôùi 0 : khoâng coù söï taïo protocorm. + : taïo thaønh protocorm raát ít. ++ : taïo thaønh protocorm nhieàu. +++ : taïo thaønh protocorm raát nhieàu. - Tuaàn ñaàu tieân treân caû 4 moâi tröôøng ñeàu khoâng taïo protocorm. - Sau 2 tuaàn, haït gieo baét ñaàu bieán ñoåi taïo thaønh moät ñaùm teá baøo coù maøu xanh. - Soá löôïng protocorm ngaøy caøng taêng nhanh sau 3-4 tuaàn, phình to leân, vaø coù laù maàm. Döïa vaøo baûng keát quaû chuùng toâi nhaän thaáy: - Hai tuaàn sau khi caáy, moâi tröôøng MS, haït lan khoâng coù söï bieán ñoåi roõ reät, taïo thaønh raát ít protocorm. Sau boán tuaàn, soá löôïng protocorm taïo thaønh nhieàu, ñöôøng kính nhoû, maøu xanh hôi traéng, laù maàm daøi khoaûng 3-4 mm vaø raát ít . - Trong khi ñoù ôû moâi tröôøng Knudson’C, sau hai tuaàn taát caû caùc haït lan ñeàu bieán ñoåi roõ reät, ñöôøng kính protocorm khoaûng 2mm, treân protocorm coù loâng huùt. Sau 4 tuaàn, soá löôïng protocorm trong moâi tröôøng Knudson’C phaùt trieån nhanh, maøu xanh, laù maàm daøi khoaûng 5-7 mm. Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 36 - Trong moâi tröôøng Knudson’C coù chöùa BA, maëc duø soáù löôïng protocorm taïo ra töông ñöông vôùi moâi tröôøng khoâng chöùa BA. Nhöng protocorm phaùt trieån töông ñoái nhanh hôn, söï taêng tröôûng cuûa protocorm ñoàng ñeàu vôùi nhau, coù nhieàu laù maàm khoûe, maøu xanh töôi. Trong moâi tröôøng coù chöùa kích thích toá BA, laø moät cytokinin coù khaû naêng kích thích vaø ñieàu chænh söï phaân baøo, taêng söï chuyeån hoùa chaát dinh döôõng [10]. ™ Toùm laïi: - Töø nhöõng keát quaû ghi nhaän ñöôïc veà thôøi gian vaø soá löôïng protocorm taïo thaønh ta coù theå keát luaän raèng: söï taïo protocorm trong moâi tröôøng Knudson’C coù boå sung kích thích toá BA laø toát nhaát. - Do söï taïo thaønh protocorm trong moâi tröôøng Knudson’C toát hôn, neân taát caû caùc thí nghieäm veà sau, chuùng toâi chæ thöïc hieän treân moâi tröôøng Knudson’C. Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 37 Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 38 IV. Thí nghieäm 4: Caùc protocorm ñöôïc taïo thaønh töø haït coù chaát löôïng nhö nhau ñöôïc ñöa vaøo caùc thí nghieäm nhaân protocorm, sau 4 tuaàn theo doõi keát quaû ghi nhaän ñöôïc nhö sau: Kích thích toá Noàng ñoä (ppm) Kyù hieäu Soá löôïng choài môùi Chieàu cao choài (cm) Chieàu daøi laù (cm) Ghi chuù 0 0 K0 0 0 0 Protocorm nhoû, ít. 1 K1 1-2 1,5-2 0,5-0,7 Protocorm môùi xanh, nhöng ít. 2 K2 4-6 1,5-2,5 0,5-0,7 Protocorm nhieàu, to, xanh, coù loâng huùt. BA 3 K3 1-2 1,3-1,5 0,5-0,7 Protocorm nhieàu nhöng nhoû. 0,1 K4 4-6 2-3,5 1,5-2 Protocorm xanh, to, coù loâng huùt, nhöng ít 0,5 K5 5-7 3-4 2-3 Protocorm xanh, nhöng ít 2ppm BA + IBA 1 K6 4-5 2-3 1,5-2,5 Protocorm nhoû, hôi vaøng, ít Baûng 5: Keát quaû nhaân protocorm treân moâi tröôøng Knudson’C vôùi kích thích toá khaùc nhau. - Sau 2 tuaàn, baét ñaàu xuaát hieän protocorm môùi, coù loâng huùt. Soá löôïng vaø kích thöôùc thay ñoåi tuyø theo moâi tröôøng. - Sau 3 tuaàn, coù moät soá protocorm baät choài môùi. - Sau 4 tuaàn caùc choài môùi phaùt trieån maïnh, tuyø theo moâi tröôøng maø soá löôïng vaø chieàu cao choài môùi khaùc nhau. Döïa vaøo baûng keát quaû chuùng toâi nhaän thaáy: - Sau 2 tuaàn, moâi tröôøng K1, khoâng thaáy söï xuaát hieän cuûa protocorm môùi. Sang ñeán tuaàn thöù 3, môùi xuaát hieän protocorm môùi. Soá löôïng protocorm môùi taïo thaønh raát ít, coù maøu xanh. Moät soá protocorm baät choài vaøo giöõa tuaàn thöù 4, nhöng soá löôïng naøy raát ít, chæ khoaûng 1-2 choài. - Ôû moâi tröôøng K2, söï nhaân protocorm dieãn ra nhanh vaø maïnh. Sau 2 tuaàn, ñaõ xuaát hieän nhieàu protocorm môùi. Sau 4 tuaàn, soá löôïng protocorm môùi taïo thaønh raát nhieàu, caùc protocorm naøy xanh möôùt, to, xung quanh coù nhieàu loâng tô traéng mòn. Vaøo giöõa Download» Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 39 tuaàn thöù 3, coù moät soá protocorm môùi baät choài, tuy soá löôïng choài nhieàu, nhöng chieàu cao choài raát thaáp. - Soá löôïng protocorm môùi taïo thaønh nhieàu ôû moâi tröôøng K3, sau 2 tuaàn, ñaõ xuaát hieän nhöõng protocorm môùi. Sang ñeán tuaàn 4, soá löôïng protocorm ñaõ raát nhieàu, tuy nhieân caùc protocorm naøy nhoû, coù moät soá protocorm coù maøu traéng. Haàu heát caùc protocorm môùi ñeàu khoâng baät choài. ¾ Trong caùc moâi tröôøng K1, K2, K3, döôùi taùc duïng cuûa kích thích toá BA, caùc maãu caáy ñeàu taïo thaønh protocorm môùi. Caùc protocorm taïo thaønh caøng nhieàu khi noàng ñoä kích thích toá taêng leân, nhöng chaát löôïng protocorm thì ngöôïc laïi (protocorm nhoû vaø traéng). Nhö vaäy, vôùi noàng ñoä kích thích toá thích hôïp seõ taùc ñoäng toát ñeán söï phaân chia teá baøo, nhöng khi noàng ñoä khaù cao, thì cuõng coù theå gaây ñoäc. - Sau 2 tuaàn, trong caùc moâi tröôøng K4, K5, K6, ñaõ thaáy xuaát hieän protocorm môùi. Tuy nhieân, sau 4 tuaàn, soá löôïng protocorm naøy haàu nhö khoâng ñoåi. Trong moâi tröôøng K5 vaø K6, caùc protocorm coù maøu xanh möôùt, to, coù loâng huùt. Soá löôïng protocorm trong moâi tröôøng K6, ít hôn, protocorm coù maøu xanh hôi vaøng, nhoû. - Sang ñeán tuaàn thöù 3, caùc protocorm baät choài, sang ñeán tuaàn thöù 4 caùc protocorm phaùt trieån maïnh, giai ñoaïn naøy haàu heát caùc maãu haïn cheá taïo protocorm maø chæ chuû yeáu taïo choài. So saùnh giöõa cacù moâi tröôøng, thì moâi tröôøng K5 taïo theâm nhieàu choài môùi hôn, caùc choài môùi coù maøu xanh möôùt, vaø khi baät choài thì choài xanh toát vaø ñoàng loaït hôn hai moâi tröôøng coøn laïi, coù moät soá choài coù reã nhoû, maøu traéng, daøi töø 0,1-0,3 cm. ¾ Coù söï khaùc bieät roõ reät veà soá löôïng choài môùi, chieàu cao choài vaø chieàu daøi laù giöõa caùc moâi tröôøng chæ coù kích thích toá BA, vaø caùc moâi tröôøng coù BA vaø IAA. Ôû caùc moâi tröôøng chæ coù BA, sang ñeán tuaàn thöù 4, caùc protocorm môùi baät choài, nhöng soá löôïng raát ít, choài phaùt trieån chaäm, vaø thaáp. Caùc moâi tröôøng naøy chæ chuû yeáu taïo theâm protocorm môùi, ít taïo choài. Trong khi ñoù, caùc moâi tröôøng coù BA vaø IAA, caùc maãu caáy chuû yeáu taïo choài, haïn cheá vieäc taïo thaønh protocorm. Nhö vaäy, chuùng toâi nhaän thaáy, söï keát hôïp giöõa BA vaø IAA thì coù lôïi hôn cho vieâc taïo choài môùi, phaùt trieån caây con ñeå söû duïng cho caùc thí nghieäm veà sau. ™ Toùm laïi: - Ñoái vôùi thí nghieäm nhaân protocorm, thì söû duïng moâi tröôøng K2 vaø K5 ñeàu toát, nhöng neáu söû duïng moâi tröôøng K5, thì seõ taïo thaønh nhieàu choài môùi hôn, coù chieàu cao, vaø thích hôïp cho thí nghieäm ra reã sau ñoù. - Neáu söû duïng moâi tröôøng K5 cho quaù trình nhaân gioáng thì heä soá nhaân laø: Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 40 Cuïm choài ban ñaàu ñöôïc taùch laøm 3, caáy chuyeàn sang moâi tröôøng K5. Sau 4 tuaàn, töø moät cuïm choài, thu ñöôïc 4 choài cao 3-4 cm. Nhö vaäy veà maët lyù thuyeát, ta tính ñöôïc heä soá nhaân choài laø 3x412 choài/naêm. Sau 6 tuaàn, caùc caây con coù chieàu cao 3-4 cm vaø coù 2-3 laù ñöôïc taùch ra ñeå ñöa vaøo thí nghieäm taïo reã. Caùc choài thaáp cuõng ñöôïc taùch ra, tieáp tuïc ñöa vaøo moâi tröôøng K5, ñeå phaùt trieån chieàu cao. Caùc protocorm coøn laïi cuõng ñöïôc taùch ra vaø ñöa vaøo moâi tröôøng K2. Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 41 Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 42 V. Thí nghieäm 5: Nhöõng caây con trong thí nghieäm 4 coù chieàu cao töø 3-4 cm, coù töø 2-3 laù ñöôïc caáy vaøo moâi tröôøng ra reã, sau 4 tuaàn theo doõi keát quaû ghi nhaän ñöôïc nhö sau: Kích thích toá Noàng ñoä (ppm) Kyù hieäu Soá löôïng reã Chieàu daøi reã (cm) Tyû leä caây ra reã(%) Ghi chuù 0 K0 1-3 0,3-0,7 63,9 Phaùt trieån chieàu cao. 0,1 KN1 2-4 0,7-2 83,33 Caây thaáp, phaùt trieån khoâng ñeàu. 0,5 KN2 4-6 2-4 94,44 Laù daøi, xanh, phaùt trieån toát vaø ñoàng ñeàu. NAA 1 KN3 3-4 1-5 90,22 Thaân oám, laù vaø reã daøi. 0,1 KI1 1-3 0,5-1,2 62,5 Ít reã, laù ít vaø ngaén. 0,5 KI2 2-3 1-4,5 69,44 Phaùt trieån toát, nhöng khoâng ñeàu, thaân thaáp, reã daøi. IAA 1 KI3 1-3 1,5-3,5 66,67 Caây thaáp, reã ít, laù daøi. 0,1 KB1 2-4 2-3 77,78 Ít laù, phaùt trieån khoâng ñeàu. 0,5 KB2 1-3 1-2,5 91,67 Laù maøu xanh phaùt trieån toát, ñoàng ñeàu. IBA 1 KB3 1-3 1-5 72,22 Nhieàu laù, thaân ngaén, reã daøi. Baûng 6: Keát quaû thí nghieäm taïo reã treân moâi tröôøng Knudson’C, boå sung NAA, IAA, IBA vôùi caùc noàng ñoä khaùc nhau (sau 4 tuaàn). - Hai tuaàn sau khi caáy vaøo moâi tröôøng ra reã, caây baét ñaàu taêng chieàu cao vaø reã xuaát hieän. - Sau 4 tuaàn, reã phaùt trieån maïnh, nhöng tuøy theo töøng loaïi moâi tröôøng maø reã, laù vaø phaùt trieån khaùc nhau. Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 43 Döïa vaøo baûng keát quaû chuùng toâi nhaän thaáy: - Trong moâi tröôøng ñoái chöùng K0 , sau 4 tuaàn, choài ra reã chaäm, chæ coù 1-3 reã vaø chieàu daøi töø 0,3-0,7 cm. Trong moâi tröôøng coù boå sung kích thích toá, kích thöôùc caây vaø reã coù söï bieán ñoåi roõ reät tuøy theo tuøy loaïi kích thích toá vaø noàng ñoä. - Trong moâi tröôøng boå sung kích thích toá IAA, haàu nhö khoâng coù söï cheânh leäch tyû leä caây ra reã, tyû leä thaáp chæ treân 60% . Soá löôïng reã khoaûng 1-3, nhöng maäp vaø daøi. Caây con thaáp, soá löôïng laù ít, 2-3 laù, laù coù maøu xanh ñaäm. - Caùc moâi tröôøng KB1, KB2, KB3, tyû leä caây ra reã khaù cao, vaø coù söï cheânh leäch roõ raøng. Moâi tröôøng KB2 coù tyû leä caây ra reã cao hôn, nhöng reã ngaén hôn vaø coù ít laù hôn so vôùi moâi tröôøng KB3. - Trong moâitröôøng KN1, KN2, KN3, coù tyû leä caây ra reã cao. Caùc caây con coù nhieàu laù, laù daøi, coù maøu xanh möôùt. Caây con cao, khoeû coù nhieàu reã, vaø daøi. Trong moâi tröôøng KN2, tyû leä caây ra reã cao nhaát (94,44%), reã daøi, maäp, coù maøu xanh. Caây con coù nhieàu laù, khoeû maïnh seõ phaùt trieån raát toát khi chuyeån sang giai ñoaïn chuyeån tieáp tröôùc khi ra vöôøn öôm. ¾ Nhìn chung, döôùi taùc duïng cuûa caùc kích thích toá NAA, IAA, IBA laø caùc auxin, seõ gaây ra söï giaûm ñoä pH trong thaønh teá baøo neân hoaït hoaù caùc enzym phaân huyû caùc polysaccharide laø pectinmetylesteraza lieân keát giöõa caùc sôïi cellulose laøm chuùng loûng leûo. Vaùch teá baøo meàm ra, trôû neân loûng leûo hôn laøm teá baøo keùo daøi ra. Do ñoù vôùi haøm löôïng auxin taêng daàn thì soá löôïng vaø chieàu daøi reã cuõng taêng theo. Trong caùc auxin thì NAA, IBA ñöôïc söû duïng nhieàu hôn trong moâi tröôøng nuoâi caáy moâ. IAA ít ñöôïc söû duïng vì ít beàn khi haáp khöû truøng moâi tröôøng [10]. ™ Toùm laïi moâi tröôøng toát nhaát cho söï taïo reã lan Dendrobium laø moâi tröôøng Knudson’C boå sung 0,5ppm NAA. Trong moâi tröôøng naøy caây coù theå gia taêng chieàu cao, soá löôïng reã vaø cöùng caùp hôn. sau khi caây taïo ñöôïc boä reã cöùng caùp, caây khoeû maïnh thì coù theå ñöa caây vaøo giai ñoaïn chuyeån tieáp tröôùc khi ñem ra troàng ngoaøi vöôøn. Khoùa luaän toát nghieäp – 2005 Keát quaû – Thaûo luaän SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 44 Hình 4.5: Caây ra reã treân moâi tröôøng Knudson’C vôùi caùc noàng ñoä vaø kích toá khaùc nhau, sau 4 tuaàn. Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Keát luaän – Ñeà nghò SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 36 PHAÀN V: KEÁT LUAÄN – ÑEÀ NGHÒ I. Keát luaän Töø nhöõng keát quaû ñaït ñöôïc, chuùng toâi ñöa ra moät soá keát luaän sau: ¾ Maãu khöû truøng laø quaû lan Dendrobium coøn xanh. Vì maãu haït gieo naèm beân trong, neân neáu tieán haønh röûa maãu kyõ vaø ñoát baèng coàn 1 laàn thì coù theå loaïi boû hoaøn toaøn caùc taùc nhaân gaây nhieãm. Haït khoâng bò aûnh höôûng vaø khi gieo vaøo moâi tröôøng seõ phuïc hoài raát nhanh. ¾ Moâi tröôøng MS coù 1 ppm BA cho söï naåy maàm cuûa haït lan Dendrobium toát hôn so vôùi moâi tröôøng Knudson’C. ¾ Söï taïo protocorm trong moâi tröôøng Knudson’C coù boå sung kích thích toá BA laø toát nhaát. ¾ Ñoái vôùi thí nghieäm nhaân protocorm söû duïng moâi tröôøng Knudson’C boå sung 2ppm BA vaø 0,5 ppm IAA, thì seõ taïo thaønh nhieàu choài môùi hôn, coù chieàu cao, vaø thích hôïp cho thí nghieäm ra reã sau ñoù. Vôùi heä soá nhaân choài laø 3x412 choài/naêm. ¾ Moâi tröôøng toát nhaát cho söï taïo reã lan Dendrobium laø moâi tröôøng Knudson’C boå sung 0,5ppm NAA. Töø keát quaû nghieân cöùu treân chuùng toâi ñöa ra quy trình nhaân gioáng lan Dendrobium baèng phöông phaùp gieo haït in-vitro nhö sau: Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Keát luaän – Ñeà nghò SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 37 Hình 5.1: Quy trình nhaân gioáng lan Dendrobium baèng phöông phaùp gieo haït in-vitro. Khoaù luaän toát nghieäp – 2005 Keát luaän – Ñeà nghò SVTH: Nguyeãn Vuõ thò Hoaøng Uyeân Trang 38 II. Ñeà nghò: Do thôøi gian thöïc hieän ñeà taøi coù haïn neân chuùng toâi chæ môùi hoaøn thaønh ñöôïc giai ñoaïn gieo haït vaø nhaân gioáng in-vitro. Trong thôøi gian tôùi, neáu coù ñieàu kieän chuùng toâi seõ tieán haønh giai ñoaïn ñöa caây con ra vöôøn öôm vaø tieáp tuïc nghieân cöùu caùc thí nghieäm khaùc nhö: - Khaûo saùt aûnh höôûng ñoä chín cuûa quaû ñeán söï naûy maàm cuûa haït. - So saùnh khaû naêng nhaân choài môùi so vôùi caùc phöông phaùp nhaân gioáng lan Dendrobium khaùc. - Keát hôïp vôùi kyõ thuaät lai gioáng höõu tính nhaèm ñöa ra nhöõng gioáng lan môùi.