Luận án Nghiên cứu tổng hợp, biến tính bề mặt hệ Nano Dendrimer Polyamidoamin mang thuốc kháng virus HIV

0,82 87,37 89,81 Bảng 3.34. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF- [email protected]@mPEG Thời gian –giờ pH 1,2 (%) pH 4,5 (%) pH 6,8 (%) pH 7,4 (%) TDF RTV TDF RTV TDF RTV TDF RTV 1 24,56 23,03 20,22 22,71 21,39 21,08 19,63 17,38 3 34,09 30,70 29,50 30,12 29,48 27,73 28,33 26,59 5 40,72 39,27 38,05 37,54 36,90 34,07 34,53 35,59 7 49,13 47,07 46,22 45,77 45,83 47,81 40,43 42,25 9 59,52 58,09 56,75 54,23 55,49 52,36 46,59 50,39 11 66,97 69,43 64,83 67,88 65,90 65,48 55,07 55,81 13 78,07 76,87 77,74 77,82 71,47 69,82 68,90 64,51 95 15 93,64 87,86 88,06 86,46 82,01 79,65 81,93 72,46 17 - - - - 90,54 86,53 85,77 79,92 19 - - - - - - - 86,47 Hình 3.25. Đồ thị biểu diễn % AZT (I), % 3TC (J), % TDF (K) và % RTV (L) giải phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp [email protected]@PEG Bảng 3.35. Kết quả giải phóng AZT, 3TC trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, [email protected]@F127 Thời gian –giờ pH 1,2 (%) pH 4,5 (%) pH 6,8 (%) pH 7,4 (%) AZT 3TC AZT 3TC AZT 3TC AZT 3TC 1 23,87 26,06 24,86 25,36 22,24 23,61 22,04 23,61 3 33,06 35,52 31,98 34,71 31,95 34,67 32,64 34,67 5 41,67 43,82 43,13 44,78 39,53 41,30 35,72 41,30 7 54,32 59,03 52,22 55,05 52,35 51,64 51,24 51,64 9 65,45 69,72 63,70 69,21 62,80 59,66 60,08 59,66 11 74,63 78,57 72,77 77,85 67,52 68,29 69,92 68,29 13 90,17 95,66 89,23 91,72 77,90 77,74 76,29 77,74 15 - - - - 87,85 89,76 85,34 89,76 96 Bảng 3.36. Kết quả giải phóng TDF, RTV trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, [email protected]@F127 Thời gian –giờ pH 1,2 (%) pH 4,5 (%) pH 6,8 (%) pH 7,4 (%) TDF RTV TDF RTV TDF RTV TDF RTV 1 21,33 19,30 20,71 18,40 19,18 17,77 19,55 18,08 3 30,01 27,08 26,59 26,69 27,36 26,56 25,76 28,34 5 37,69 36,09 36,96 29,56 32,49 34,27 37,08 36,08 7 44,68 43,21 44,87 37,01 40,48 41,77 42,64 40,76 9 59,20 55,98 54,19 44,85 51,38 50,72 52,20 47,15 11 68,30 66,44 61,61 55,44 61,04 58,56 58,01 53,72 13 75,76 72,89 71,72 64,04 66,28 64,69 64,44 57,28 15 83,08 80,43 76,27 72,43 78,00 72,04 73,18 66,88 17 89,91 87,36 82,12 82,35 84,81 79,64 82,16 72,04 19 - - 90,87 87,27 92,05 84,07 90,67 80,55 21 - - - - - 88,95 - 86,04 Hình 3.26. Đồ thị biểu diễn % AZT (M), % 3TC (N), % TDF (O) và % RTV (P) giải phóng trong hệ dẫn truyền thuốc kết hợp [email protected]@F127 Từ kết quả Bảng 3.33 đến Bảng 3.36, Hình 3.25, Hình 3.26 cho thấy: 97 Môi trường pH 1,2 và pH 4,5: Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, [email protected]@mPEG có tốc độ phóng thích hoạt chất khá đồng đều: môi trường pH 1,2 đạt 97,37 % (AZT) và 99,84 % (3TC) sau 13 giờ; môi trường pH 4,5 đạt 90,15 % (AZT) và 92,66 % (3TC) sau 13 giờ, điều này được giải thích có thể do cả hai thuốc đều là thuốc dễ tan trong nước. Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, [email protected]@F127 có tốc độ phóng thích hoạt chất tương tự hệ dẫn truyền thuốc AZT, [email protected]@mPEG: môi trường pH 1,2 đạt 97,37 % (AZT) và 99,84 % (3TC); môi trường pH 4,5 đạt 90,17 % (AZT) và 95,66 % (3TC) sau 13 giờ. Không có sự khác biệt giữa 2 hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, [email protected]@mPEG và AZT, [email protected]@F127 do đều có tương tác ưa nước của hoạt chất AZT và 3TC (cả hai hoạt chất này đều tan tốt trong môi trường nước) với nhóm - NH-, -OH, của phân tử polyme [98] của hệ dẫn truyền. Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích hoạt chất chậm thơn so với hệ AZT, [email protected]@mPEG; cụ thể môi trường pH 1,2 đạt 93,64 % (TDF) và 87,86 % (RTV) sau 15 giờ; môi trường pH 4,5 đạt 88,06 % (TDF) và 86,46 % (RTV) sau 15 giờ điều này được giải thích do thuốc TDF và RTV xếp nhóm ít tan (TDF) và gần như không tan (RTV). Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@F127 có tốc độ phóng thích hoạt chất chậm thơn so với hệ TDF, [email protected]@mPEG; cụ thể môi trường pH 1,2 đạt 89,91 % (TDF) và 87,36 % (RTV) sau 17 giờ; điều này được giải thích do thuốc TDF và RTV thuộc nhóm ít tan (TDF) và gần như không tan (RTV) nên sẽ có các tương tác kỵ nước trong cấu trúc của phân tử F127 với thuốc [106], kết quả thuốc được giữ chặt hơn nên tốc độ phóng thích chậm hơn. Môi trường pH 6,8 và pH 7,4 Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, [email protected]@mPEG có tốc độ phóng thích hoạt chất khá đồng đều: môi trường pH 6,8 đạt 88,21 % (AZT) và 90,82 % (3TC) sau 15 giờ; môi trường pH 7,4 đạt 87,37 % (AZT) và 89,81 % (3TC) sau 15 giờ, so với môi trường pH 1,2 và pH 4,5 thì tốc độ phóng thích của AZT và 3TC chậm hơn 2 giờ. Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@mPEG có tốc độ phóng thích hoạt chất chậm thơn so với hệ AZT, [email protected]@mPEG; cụ thể môi trường pH 6,8 đạt 90,54 % (TDF) và 86,53 % (RTV) sau 17 giờ. 98 Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp AZT, [email protected]@F127: môi trường pH 6,8 đạt 87,85 % (AZT) và 89,76 % (3TC) sau 15 giờ; môi trường pH 7,4 đạt 85,34 % (AZT) và 89,76 % (3TC) sau 15 giờ, so với môi trường pH 1,2 và pH 4,5 thì tốc độ phóng thích của AZT và 3TC chậm hơn 2 giờ. Hệ dẫn truyền thuốc kết hợp TDF, RTV@ G3.0@F127 có tốc độ phóng thích hoạt chất chậm thơn so với hệ TDF, RTV@ G3.0@mPEG; cụ thể môi trường pH 6,8 đạt 90,05 % (TDF) sau 19 giờ và 88,95 % (RTV) sau 21 giờ; môi trường pH 7,4 đạt 90,67 % (TDF) sau 19 giờ và 86,04 % (RTV) sau 21 giờ. So với kết quả phóng thích hoạt chất trong hệ dẫn truyền đơn Bảng 3.37. cho thấy: Môi trường pH 1,2 và pH 4,5 của hệ dẫn truyền đơn [email protected]@mPEG, [email protected]@mPEG, [email protected]@F127, [email protected]@F127 và hệ dẫn truyền kết hợp AZT, [email protected]@mPEG là tương đương nhau, phóng thích ≥ 85,0 % hoạt chất sau 13 giờ và ở môi trường pH 6,8 và pH 7,4 là 15 giờ. Tương tự cho hệ [email protected]@mPEG, [email protected]@mPEG, TDF,[email protected]@mPEG sau 15 giờ phóng thích ≥ 85,0 % ở pH 1,2 và pH 4,5 và 17 giờ TDF, [email protected]@F127 so với hệ dẫn truyền đơn [email protected]@F127 ở pH 1,2 và pH 4,5 lần lượt là 19 giờ và 21 giờ, kết quả cho thấy tốc độ phóng thích của TDF ít thay đổi trong hệ đơn và hệ phối hợp. Tuy nhiên, với RTV phóng thích nhanh hơn trong hệ kết hợp với TDF, do có sự hiện diện của TDF kéo theo RTV (thuốc kém tan hơn) phóng thích nhanh hơn [107] so với khi chỉ có RTV trong hệ dẫn truyền đơn. Kết quả này lặp lại tương tự với hệ kết hợp TDF, [email protected]@F127 so với hệ dẫn truyền đơn [email protected]@F127 và [email protected]@F127 ở pH 6,8 và pH 7,4. Cụ thể pH 7,4 hệ [email protected]@F127 là 21 giờ; hệ [email protected]@F127 là 25 giờ; hệ TDF, [email protected]@F127 là 19 giờ (TDF) và 21 giờ (RTV). Bảng 3.37. Thời gian phóng thích ARV hệ dẫn truyền đơn và hệ dẫn truyền kết hợp Hệ dẫn truyền Thời gian (giờ) phóng thích ≥ 85,0 % hoạt chất pH 1,2 pH 4,5 pH 6,8 pH 7,4 [email protected]@mPEG .13 13 15 15 [email protected]@mPEG 13 13 15 15 [email protected]@mPEG 15 15 17 17 [email protected]@mPEG 15 15 19 21 99 [email protected]@F127 13 13 15 17 [email protected]@F127 13 13 15 17 [email protected]@F127 17 19 19 21 [email protected]@F127 19 21 23 25 AZT, [email protected]@mPEG 13 13 15 15 TDF, [email protected]@mPEG 15 15 17 17-TDF 19-RTV AZT, [email protected]@F127 13 13 15 17 TDF, [email protected]@F127 17 17 19-TDF 21-RTV 19-TDF 21-RTV 3.6. KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 3.6.1. Kết quả thử độc tính tế bào Bảng 3.38. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên hệ G3.0, G3.0@mPEG và G3.0@F127 Nồng độ ppm Tỷ lệ tế bào sống (%) G3.0 G3.0@F127 G3.0@mPEG 0 101,20 ± 3,24 105,80 ± 2,60 98,00 ± 2,32 5 94,70 ± 1,64 - - 25 82,30 ± 1,64 - - 50 70,60 ± 2,22 101,60 ± 3,37 97,60 ± 0,85 100 48,30 ± 5,5 96,40 ± 2,73 99,30 ± 0,06 200 39,90 ± 2,63 95,80 ± 0,66 97,40 ± 0,93 400 26,10 ± 1,31 86,50 ± 2,05 90,90 ± 0,97 800 6,60 ± 4,66 81,10 ± 1,04 86,50 ± 0,94 100 G3.0 G3.0@mPEG G3.0@F127 Hình 3.27. Kết quả về cảm ứng chết của tế bào trên dendrimer G3.0, G3.0@mPEG và G3.0@F127 Bảng 3.39. Kết quả tỷ lệ tế bào sống trên các hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp Nồng độ ppm Tỷ lệ tế bào sống (%) [email protected] @mPEG [email protected]@F 127 [email protected]@ F127 TDF- [email protected]@ F127 [email protected]@ mPEG 0 99,70 ± 2,38 103,30 ± 3,12 102,9 ± 3,17 98,80 ± 4,73 102,40 ± 2,29 50 99,70 ± 1,99 102,70 ± 2,88 102,10 ± 2,98 102,60 ± 2,37 102,80 ± 4,47 100 102,40 ± 0,14 101,50 ± 2,75 97,60 ± 1,30 100,20 ± 4,42 101,90 ± 2,50 200 93,80 ± 1,34 85,10 ± 1,41 93,30 ± 0,86 94,00 ± 1,41 95,30 ± 0,82 400 91,10 ± 0,99 76,10 ± 0,63 87,60 ± 0,58 85,90 ± 0,42 91,10 ± 1,15 800 87,40 ± 1,33 70,90 ± 0,86 79,60 ± 0,97 80,40 ± 1,30 84,10 ± 1,17 101 [email protected]@mPEG [email protected]@F127 [email protected]@F127 [email protected]@F127 [email protected]@F127 Hình 3.28. Kết quả về cảm ứng chết của tế bào trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp [email protected]@F127, [email protected]@mPEG Hình 3.299. Biểu đồ cảm ứng chết của tế bào trên hệ dẫn truyền thuốc đơn và kết hợp Từ kết quả Tỷ lệ tế bào sống Bảng 3.38, Bảng 3.39 cho thấy: 0 20 40 60 80 100 120 0 50 100 200 400 800 Tế b ào s ố n g (% ) Nồng độ (ppm) [email protected] @mPEG [email protected]@F127 [email protected]@F127 [email protected]@F127 [email protected]@mPEG 102 Tỷ lệ sống sót của tế bào giảm từ 101 % xuống 6,6 %, khi nồng độ G3.0 trong môi trường nuôi cấy tăng từ 0 đến 800 ppm. Sau khi biến tính bề mặt G3.0 với F127 hoặc PEG, tỷ lệ sống của nguyên bào sợi được cải thiện đáng kể. Ở nồng độ 800 ppm (nồng độ cao nhất trong thử nghiệm), trên 80 % nguyên bào sợi sống sót so sánh với mẫu chứng. Theo ISO 10993-5:1999 hay tiêu chuẩn quốc gia Việt Nam TCVN 7391-5:2005 về tính an toàn của vật liệu trong y tế, có thể kết luận vật liệu G30@F127 và G3.0@mPEG có tính tương hợp sinh học cao, và vật liệu có tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực dược phẩm. Đối với các mẫu được dẫn truyền hóa thuốc, ở nồng độ thử nghiệm dưới 200 ppm, phần trăm nguyên bào sợi sống sót đều trên 80 %. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ, sức sống của nguyên bào sợi giảm dần. Đặc biệt với mẫu mang thuốc RTV, tỷ lệ sống của tế bào giảm còn 70 % ở nồng độ 800 ppm. Dựa trên kết quả khảo sát độc tính chất mang, có thể kết luận nguyên nhân gây chết tế bào là do thuốc mang trong hệ. Từ kết quả về cảm ứng chết của tế bào Hình 3.27 và Hình 3.28 nhận thấy: Dựa trên kết quả về độc tính, để kiểm tra tính an toàn của sản phẩm sau dẫn truyền hóa thuốc ARV đơn và ARV phối hợp, phương pháp nhuộm kép AO/PI được sử dụng. Theo kết quả trên hình, nguyên bào sợi sau 24 giờ được ủ G3.0, chất nhuộm PI đi vào tế bào, cường độ tín hiệu huỳnh quang mạnh, chứng tỏ tế bào đang trong quá trình chết. Kết quả này phù hợp với kết quả MTT. Đối với các mẫu biến tính, G3.0@mPEG và G3.0@F127, nguyên bào sợi bắt màu xanh, cường độ của bước sóng 700 nm không ghi nhận được. Ở trường hợp sử dụng 2 bước sóng đồng thời 525 nm/700 nm, tín hiệu huỳnh quang ở 525 nm (màu xanh) át hoàn toàn, chứng tỏ tế bào sống và khỏe mạnh trong điều kiện môi trường nuôi cấy có bổ sung G3.0@mPEG hoặc G3.0@F127. Nói cách khác, độc tính của G3.0 được loại bỏ sau khi biến tính bề mặt. Bên cạnh đó, đánh giá về độc tính của hệ chất mang thuốc: Tất cả các mẫu nguyên bào khi ủ với mẫu mang thuốc, nguyên bào sợi phát triển theo đúng hình thái học của chúng, không có sự biến đổi về nhân. Thêm vào đó, mật độ tế bào bắt huỳnh quang của AO trội hơn hẳn so với PI, do đó có thể kết luận, các thuốc được mang trong hệ G3.0@PEG và G3.0@F127 không gây ảnh hưởng đến tế bào lành. 3.6.2. Kết quả thử hoạt tính ức chế pepsin Bảng 3.40. Kết quả thử hoạt tính ức chế của ARV chuẩn đối với pepsin 103 AZT 3TC TDF RTV Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại 0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0377 92,95 ± 0,20 0,0439 96,10 ± 0,16 0,0159 99,80 ± 0,87 0,0141 85,61 ± 0,35 0,0754 88,15 ± 0,07 0,0878 95,71 ± 0,04 0,0318 98,54 ± 0,15 0,0282 78,50 ± 0,91 0,1130 82,96 ± 0,38 0,1318 95,75 ± 0,10 0,0477 98,90 ± 0,17 0,0423 65,32 ± 0,96 0,1507 75,48 ± 0,06 0,1757 95,77 ± 0,22 0,0636 97,66 ± 0,05 0,0564 53,11 ± 1,29 0,1884 68,76 ± 0,43 0,2196 98,61 ± 0,20 0,0795 99,70 ± 0,49 0,0705 41,60 ± 0,57 0,2261 63,68 ± 0,05 0,2635 99,01 ± 0,04 0,0954 98,66 ± 0,08 0,0845 28,49 ± 0,50 0,2638 60,91 ±0,20 - - - - - - 0,3014 59,55 ± 0,29 - - - - - - 0,3391 58,74 ± 0,18 - - - - - - Bảng 3.41. Kết quả thử hoạt tính ức chế của [email protected]@mPEG đối với pepsin [email protected]@mPEG [email protected]@mPEG [email protected]@mPEG [email protected]@mPEG Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại Nồng độ (mM) % hoạt độ còn lại 0 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0000 100,00 0,0379 93,93 ± 0,25 0,0447 98,27 ± 0,11 0,0157 99,17 ± 0,48 0,0139 87,14 ± 1,12 0,0758 88,59 ± 0,07 0,0893 99,04 ± 0,25 0,0313 99,72 ± 0,53 0,0277 80,15 ± 1,10 0,1137 85,57 ± 0,06 0,1340 98,82 ± 0,02 0,0470 98,51 ± 1,02 0,0416 65,86 ± 0,66 0,1516 77,68 ± 0,06 0,1787 97,23 ± 0,67 0,0627 98,20 ± 1,24 0,0555 56,28 ± 0,68 0,1895 74,25 0,2233 99,37 0,0783 99,98 0,0694 44,89 104 ± 0,34 ± 0,37 ± 1,48 ± 0,71 0,2274 67,23 ± 0,12 0,2680 97,22 ± 0,31 0,0940 98,36 ± 0,75 0,0832 39,29 ± 0,22 0,2653 62,65 ± 0,11 - - - - - - 0,3032 61,23 ± 0,08 - - - - - - 0,3411 60,42 ± 0,08 - - - - - - Hình 3.30. Đồ thị biểu diễn hoạt tính ức chế của ARV đối với pepsin Từ kết quả thử nghiệm khả năng ức chế pepsin theo phương pháp Anson cải tiến của các ARV nhận thấy: - Hoạt tính ức chế pepsin giữa của các hoạt chất khi chưa dẫn truyền và sau khi dẫn truyền là tương đương nhau, sau dẫn truyền hoạt chất vẫn giữ được hoạt tính ức chế pepsin được thể hiện thông qua phần trăm hoạt độ còn lại là như nhau. - AZT: AZT thuộc nhóm thuốc ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid và nucleotid (NRTI) nhưng vẫn có hoạt tính ức chế pepsin. Ở nồng độ 0,038 mM AZT, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 92,62 % (ức chế khoảng 7 % hoạt 105 độ của pepsin) và ở nồng độ 0,226 mM AZT phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 64,06 % (ức chế 36 % hoạt độ của pepsin). Điều này cho thấy, AZT tuy thuộc nhóm NRTI nhưng vẫn có khả năng ức chế pepsin tuy nhiên khả năng ức chế pepsin không mạnh do đặc tính này không điển hình của nhóm NRTI - 3TC và TDF thuộc nhóm thuốc ức chế enzym sao chép ngược tương tự nucleosid và nucleotid (NRTI). Ở nồng độ 0,264 mM đối với 3TC và 0,233 mM đối với TDF, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin lần lượt là 99,01 % và 98,59 %. Do đó 3TC và TDF hoàn toàn không có hoạt tính ức chế pepsin. - RTV thuộc nhóm thuốc ức chế men protease (PI). Ở nồng độ 0,014 mM RTV, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 84,95 % (ức chế khoảng 15 % hoạt độ của pepsin), ở nồng độ 0,056 mM RTV phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 50,95 % (ức chế khoảng 50 % hoạt độ của pepsin) và ở nồng độ 0,085 mM RTV, phần trăm hoạt độ còn lại của pepsin là 25,20 %. Điều này cho thấy, RTV có khả năng ức chế pepsin mạnh hơn AZT. Kết quả nồng độ IC50 của RTV được dẫn truyền hóa là 0,056 Mm - Navia và cộng sự từ các phòng thí nghiệm Merck là nhóm đầu tiên có được cấu trúc tinh thể của PR HIV [48]. Dựa trên sự hiện diện của trình tự acid amin đặc trưng, Asp-Thr-Gly, nó được đề xuất bởi Toh et al. vào năm 1985 cho rằng protease của HIV có thể thuộc về họ protease aspartic. Điều này đã được xác nhận thông qua sự ức chế pepstatin A, một chất ức chế chọn lọc protease aspartic. Vì trình tự protease của HIV không có nhiều hơn 99 acid amin và chỉ chứa một của bộ ba bắt buộc Asp-Thr-Gly, người ta cho rằng dạng hoạt động của HIV protease là một đồng phân tử (dạng dimer) của 198 acid amin. Giả thuyết này sau đó đã được xác nhận bằng phương pháp xác định tinh thể học tia X [82]. - Protease của HIV-1 là một enzyme không thể thiếu trong chu trình sống của virus HIV. Nó cắt các chuỗi poly peppeptide gag, gag-pol tại những vị trí đặc hiệu để tạo thành các protein cấu trúc và enzym cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Nếu protease HIV bị ức chế, các hạt virus vẫn nảy chồi từ màng tế bào, nhưng các protein bên trong chúng không ở dạng trưởng thành và hoạt động, do đó virus không lây nhiễm. Vì vậy, protease HIV-1 được xem như một trong các đích quan trọng trong phát triển thuốc chống HIV thông qua khả năng ức chế enzym. Protease HIV-1 thuộc họ protease aspartat, có dạng dimer và mang những đặc 106 điểm tương đồng với pepsin về cấu trúc cũng như cơ chế xúc tác. Các protease HIV-1 và pepsin đều có trình tự nhận biết Asp-Thr-Gly. Nhìn chung, chúng có cấu trúc bậc nhất tương tự nhau, đều bị ức chế bởi pepstatin A và bị bất hoạt khi đột biến xảy ra ở vùng hoạt tính chứa Aso [108]. Do đó, pepsin có thể được dùng như một enzym đích để sàng lọc các chất ức chế protease HIV-1[109], [110-111]. - Hệ sau dẫn truyền thuốc AZT, 3TC, TDF và RTV có hoạt tính ức chế pepsin tương đương với hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV tinh khiết khi chưa dẫn truyền 107 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua thời gian nghiên cứu và hoàn thành luận án, chúng tôi đã đạt được những kết quả sau: 1. Đã tổng hợp các chất mang dendrimer PAMAM đến thế hệ G3.0 từ lõi ethylendiamin và mạch nhánh là methyl acrylat có khối lượng phân tử 6.962,5 g/ml bằng phương pháp GPC so với khối lượng lý thuyết của G3.0 là 6.908,9 g/mol, với độ lệch là 0,78 %. Cấu trúc của sản phẩm được chứng minh bằng phương pháp FTIR, MS, 1H- NMR, GPC và tính toán khối lượng phân tử trên cơ sở dữ liệu của phổ 1H-NMR, hình thái và kích thước bằng TEM và DLS 2. Đã biến tính thành công dendrimer G3.0 với PEG 5.000 và pluronic F127 12.600 Da. Cấu trúc sản phẩm được chứng minh bằng FTIR, 1H-NMR, GPC 3. Đã xây dựng và thẩm định phương pháp theo ICH (Hội nghị quốc tế về hài hòa hóa các thủ tục đăng ký dược phẩm sử dụng cho con người) xác định các hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV đơn và xác định đồng thời AZT,3TC; TDF, RTV bằng phương pháp HPLC - PDA 4. Đã dẫn truyền thành công các hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV lên hệ G3.0@mPEG tạo các hệ dẫn truyền thuốc đơn [email protected]@mPEG với khả năng dẫn truyền thấp nhất là AZT (7,18 %), cao nhất RTV (13,86 %). Với hệ [email protected]@F127 với khả năng dẫn truyền thấp nhất là AZT (7,36 %), cao nhất ARV (14,78 %). Sản phẩm của hệ dẫn truyền đơn được kiểm tra bằng phổ FTIR và kích thước bằng DLS. Với hệ dẫn truyền thuốc phối hợp, khả năng dẫn truyền của AZT, 3TC, TDF và RTV lần lượt là 4,17 %, 4,20 %, 7,39 % và 9,96 % thấp hơn dẫn truyền đơn. Tuy nhiên, tổng lượng thuốc được dẫn truyền cao hơn dẫn truyền đơn. Sử dụng hệ G3.0@F127 dẫn truyền hoạt chất AZT, 3TC, TDF và RTV hiệu quả hơn hệ G3.0@mPEG đặc biệt với các chất ít tan như TDF, RTV 5. Đã khảo sát khả năng giải phóng các hoạt chất của AZT, 3TC, TDF và RTV khi được dẫn truyền đơn và dẫn truyền kết hợp. Hệ dẫn truyền đơn [email protected]@mPEG giải phóng ≥ 85,0 % thấp nhất pH 1,2 (AZT, 13 giờ), cao nhất pH 7,4 (RTV, 21 giờ). Hệ dẫn truyền đơn [email protected]@F127 giải phóng ≥ 85,0 %, thấp nhất pH 1,2 (AZT, 13 giờ), cao nhất pH 7,4 (RTV, 25 giờ). Hệ dẫn truyền kết hợp AZT, [email protected]@F127 108 thấp nhất pH 1,2 (13 giờ); cao nhất pH 7,4 (15 giờ). Hệ TDF, [email protected], thấp nhất pH 1,2 (17 giờ); cao nhất sau pH 7,4 (21 giờ) 6. Đã khảo sát độc tính của sản phẩm dendrimer PAMAM G3.0, G3.0@mPEG và G3.0@F127 cho thấy: G3.0 gây độc tế bào, G3.0@mPEG và G3.0@F127 độc tính không còn. Bên cạnh đó, đánh giá về độc tính của hệ chất mang thuốc các thuốc được mang trong hệ G3.0@PEG và G3.0@F127 không gây ảnh hưởng đến tế bào lành. 7. Đã thử hoạt tính ức chế pepsin hệ sau dẫn truyền thuốc cho thấy: AZT có khả năng ức chế pepsin tuy nhiên khả năng ức chế pepsin không mạnh do đặc tính này không điển hình của nhóm NRTI; 3TC hoàn toàn không có hoạt tính ức chế pepsin, RTV có khả năng ức chế pepsin mạnh hơn AZT. Kết quả nồng độ IC50 của RTV là 0,056 Mm KIẾN NGHỊ Trong thời gian tới, chúng tôi đề xuất một số kiến nghị sau: Tiếp tục nghiên cứu in vivo trên hệ dẫn truyền thuốc [email protected]@mPEG và [email protected]@F127 và thử độc tính tế bào với dòng tế bào đại thực bào hoặc tế bào miễn dịch. Nghiên cứu bào chế hạt nano kết hợp giữa lipid - polymer mang thuốc ARV (có thể sử dụng polymer polyvinylpyrrolidon – PVP để bao thuốc RTV, bên ngoài là acid béo stearic và poly ethylen glycol (PEG). Sản phẩm được đánh giá qua sự hấp thụ trên tế bào thần kinh Nghiên cứu khả năng phân hủy sinh học, độ ổn định của hệ dẫn truyền thuốc [email protected]@mPEG và [email protected]@F127 109 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Vu Minh Thanh, Thi Hiep Nguyen, Tuong Vi Chan, Uyen-Thi Phan Ngoc, Minh Nhat Ho, Thi Thinh Nguyen, Yen Nguyen Tram Chau, Van Thu Le, Ngoc Quyen Chan, Cuu Khoa Nguyen, Dai Hai Nguyen, Low systemic toxicity nanocarriers fabricated from heparin-mPEG and PAMAM dendrimers for controlled drug release. Materials Science & Engineering C, 82 (2018) 291-298, IF = 5,33 (Q1) 2. Nguyễn Thị Thịnh, Nguyễn Cửu Khoa, Thẩm định quy trình xác định đồng thời Zidovudin và Lamivudin trên hệ chất mang nano dendrimer G3.0- F127@AZT/3TC bằng phương pháp HPLC-PDA, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 63 (5), 5.2021, 29-34 3. Thi Thinh Nguyen, Bao Phu Nguyen, Dinh Tien Dung Nguyen, Ngoc Hoi Nguyen, Dai Hai Nguyen, Cuu Khoa Nguyen, Retrovirus Drugs-Loaded PEGylated PAMAM for Prolonging Drug Release and Enhancing Efficiency in HIV Treatment, Polymers, 2022, 14, 114, IF = 4,329 (Q1) 110 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Global HIV & AIDS statistics. AIDS Statistics - 2019 https://www.unaids.org/en/resources/fact (Truy cập ngày 15/12/2021) 2. Cục phòng, chống HIV/AIDS - Bộ Y tế. Dịch HIV/AIDS có gì thay đổi trong năm 2021. https://vaac.gov.vn/dich-hiv-aids-co-gi-thay-doi-trong-nam-2021.html (Truy cập ngày 29/07/2022) 3. https://ykhoaphuocan.vn/thuvien/duoc-thu/Saquinavir (Truy cập ngày 29/07/2022) 4. Nguyễn Cửu Khoa (2015), Dendrimer Tổng hợp và ứng dụng trong Y – Dược, trang 54 - 235 5. Ning Li, Hao Cai, Lei Jiang, Jiani Hu, Ashika Bains, Jesse Hu, Qiyong Gong, Kui Luo, and Zhongwei Gu, Enzyme-sensitive and amphiphilic PEGylated dendrimer- paclitaxel prodrug-based nanoparticles for enhanced stability and anticancer efficacy. ACS applied materials & interfaces, 2017. 9(8): p. 6865-6877. 6. https://healthvietnam.vn/thu-vien/tai-lieu-tieng-viet/vi-sinh-vat/virus-hiv-aids (Truy cập ngày 29/07/2022). 7. Tế bào lympho TCD4 và bệnh HIV/AIDS. https://www.vinmec.com/vi/tin- tuc/thong-tin-suc-khoe/suc-khoe-tong-quat/te-bao-lympho-tcd4-va-benh-hivaids (Truy cập ngày 29/07/2022). 8. Cục phòng, chống HIV/AIDS (2016), Cẩm nang Hướng dẫn sử dụng thuốc điều trị HIV/AIDS, trang 18 - 60. 9. Julie S. Eggleton; Shivaraj Nagalli, Highly active Antiretroviral Therapy (HAART) (2022). 10. Bộ Y tế (2021), Quyết định 5968/QĐ-BYT ngày 31/12/2021 về việc ban hanh Hướng dẫn điều trị và chăm sóc HIV/AIDS, Trang 34-47. 11. Allyne cristina Grando, Nilza Nascimento Guimaraes, Ana Paula de Souza, Mauricio Lehmann, Kenya Silva Cunha, Rafael Rodrigues Dihl, Assessment of complex genomic alterations induced by AZT, 3TC and the combination AZT+3TC. Drug and chemical Toxicology (2020); 43(4). 12. Tung-Che Hung, Guan-Jhou Chen, Shu-Hsing Cheng, Jhen-Hong Chen, Jheng-Lun Eei, Chien-Yu Cheng, Chien-Ching Hung, Dual therapy with ritonavir-boosted 111 protease inhibitor (PI) plus lamivudine versus triple therapy with ritonavir-boosted PI plus two nucleos(t)ide reverse-transcriptase inhibitor in HIV-infected patients with viral suppression. Journal of Microbiology, Immunology and Infection (2019) 52. 13. Appakkudal R. Anand, Swaminathan Sethuraman, Uma Maheswari Krishnan, Targeting strategies for delivery of anti-HIV drugs, Journal of Controlled Release, 2014. 192: p. 271-283. 14. World Health Organization (2022), HIV drug resistance Available online https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hiv-drug-resistance (Truy cập ngày 3/12/2022). 15. Guidelines for the Use of Antiretroviral Agents in Adults and Adolescents with HIV (2022). Available online https://clinicalinfo.hiv.gov/en/guidelines/hiv-clinical- guidelines-adult-and-adolescent-arv/overview (Truy cập ngày 03/12/2022). 16. Christa Buckheit Sturdevant, Sarah B. Joseph, Gretja Schnell, Richard W. Price, Ronald Swanstrom, Serena Spudich, Compartmentalized Replication of R5 T Cell Tropic HIV-1 in the Central Nervous System Early in the Course of Infection, Journals PLOS Pathog, 2015, 11(3). 17. Gaurav Agarwal, Shilpi Agarwal, PK Kara and Shagun Goyal, Oral Sustained Release Tablets: An overview with a special emphasis on Matrix Tablet, American Journal of Advanced Drug Delivery, 2017. 5(4): p. 064-076. 18. Cost is Primary Driver of Medication non-Adherence rates (2022) https://healthitanalytics.com/news/cost-is-a-primary-driver-of-medication-non- adherence-rates (Truy cập ngày 3/12/2022). 19. Nihad Al-Hashimi, Nazish Begg, Raid G. Alany. Hany Hassanin, Amr Elshaer, Oral Modified Release Multiple - Unit Particulate Systems: Compressed Pellets, Micropaticles and Nanoparticles. Pharmaceutics (2018). 10 (4), 176. 20. D.G. Myszka, R.W. Sweet, P. Hensley, M. Brigham-Burke, P.D. Kwong, W.A. Hendrickson, R. Wyatt, J. Sodroski, M.L. Doyle, Energetics of the HIV gp120–CD4 binding reaction, Proc. Natl. Acad. Sci. 97(2000) 9026–9031. 21. Jing Pu, Qian Wang, Wei Xu, Lu Lu and Shibo Jiang, Development of Protein- and Peptide-Based HIV Targeting gp120 or gp41, Viruses 2019, 11, 705. 112 22. Shaik, M.M.; Peng, H.; Lu, J.; Rits-Volloch, S.; Xu, C.; Liao, M.; Chen, B. Structural basis of coreceptor recognition by HIV-1 envelope spike. Nature 2019, 565, 318–323. 23. Starcich, B.R.; Hahn, B.H.; Shaw, G.M.; McNeely, P.D.; Modrow, S.; Wolf, H.; Parks, E.S.; Parks, W.P.; Josephs, S.F.; Gallo, R.C.; et al., Identification and characterization of conserved and variable regions in the envelope gene of HTLV- III/LAV, the retrovirus of AIDS. Cell 1986, 45, 637–648. 24. Huang, C.C.; Tang, M.; Zhang, M.Y.; Majeed, S.; Montabana, E.; Stanfield, R.L.; Dimitrov, D.S.; Korber, B.; Sodroski, J.; Wilson, I.A.; et al., Structure of a V3- containing HIV-1 gp120 core. Science 2005, 310, 1025–1028. 25. Zhou, T.; Georgiev, I.; Wu, X.; Yang, Z.Y.; Dai, K.; Finzi, A.; Kwon, Y.D.; Scheid, J.F.; Shi, W.; Xu, L.; et al., Structural basis for broad and potent neutralization of HIV-1 by antibody VRC01. Science 2010, 329, 811– 817. 26. Sattentau, Q.J.; Moore, J.P. The role of CD4 in HIV binding and entry. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 1993, 342, 59–66. 27. Traunecker, A.; Luke, W.; Karjalainen, K. Soluble CD4 molecules neutralize human immunodeficiency virus type 1. Nature 1988, 331, 84–86. 28. Daar, E.S.; Li, X.L.; Moudgil, T.; Ho, D.D. High concentrations of recombinant soluble CD4 are required to neutralize primary human immunodeficiency virus type 1 isolates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87, 6574– 6578. 29. Schooley, R.T.; Merigan, T.C.; Gaut, P.; Hirsch, M.S.; Holodniy, M.; Flynn, T.; Liu, S.; Byington, R.E.; Henochowicz, S.; Gubish, E.; et al., Recombinant soluble CD4 therapy in patients with the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and AIDS-related complex. A phase I-II escalating dosage trial. Ann. Int. Med. 1990, 112, 247–253. 30. Haim, H.; Si, Z.; Madani, N.; Wang, L.; Courter, J.R.; Princiotto, A.; Kassa, A.; DeGrace, M.; McGee-Estrada, K.; Mefford, M.; Soluble CD4 and CD4-mimetic compounds inhibit HIV-1 infection by induction of a shortlived activated state. PLoS Pathog. 2009, 5. 31. Orloff, S.L.; Kennedy, M.S.; Belperron, A.A.; Maddon, P.J.; McDougal, J.S. Two mechanisms of soluble CD4 (sCD4)-mediated inhibition of human 113 immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) infectivity and their relation to primary HIV-1 isolates with reduced sensitivity to sCD4. J. Virol. 1993, 67, 1461–1471. 32. Allan, J.S. Receptor-mediated activation of immunodeficiency viruses in viral fusion. Science 1991, 252, 1322–1323. 33. Schutten, M.; Andeweg, A.C.; Bosch, M.L.; Osterhaus, A.D. Enhancement of infectivity of a non-syncytium inducing HIV-1 by sCD4 and by human antibodies that neutralize syncytium inducing HIV-1. Scand. J. Immunol. 1995, 41, 18–22. 34. Jacobson, J.M.; Lowy, I.; Fletcher, C.V.; O’Neill, T.J.; Tran, D.N.; Ketas, T.J.; Trkola, A.; Klotman, M.E.; Maddon, P.J.; Olson, W.C.; et al. Single-dose safety, pharmacology, and antiviral activity of the human immunodeficiency virus (HIV) type 1 entry inhibitor PRO 542 in HIV-infected adults. J. Infect Dis. 2000, 182, 326–329. 35. Allaway, G.P.; Davis-Bruno, K.L.; Beaudry, G.A.; Garcia, E.B.; Wong, E.L.; Ryder, A.M.; Hasel, K.W.; Gauduin, M.C.; Koup, R.A.; McDougal, J.S.; et al., Expression and characterization of CD4-IgG2, a novel heterotetramer that neutralizes primary HIV type 1 isolates. AIDS Res. Hum. Retrovir. 1995, 11, 533– 539. 36. Gauduin, M.C.; Allaway, G.P.; Olson, W.C.; Weir, R.; Maddon, P.J.; Koup, R.A. CD4-immunoglobulin G2 protects Hu-PBL-SCID mice against challenge by primary human immunodeficiency virus type 1 isolates. J. Virol. 1998, 72, 3475- 3478. 37. Trkola, A.; Pomales, A.B.; Yuan, H.; Korber, B.; Maddon, P.J.; Allaway, G.P.; Katinger, H.; Barbas, C.F. 3rd; Burton, D.R.; Ho, D.D.; et al. Cross-clade neutralization of primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 by human monoclonal antibodies and tetrameric CD4-IgG. J. Virol. 1995, 69, 6609– 6617. 38. Jacobson, J.M.; Israel, R.J.; Lowy, I.; Ostrow, N.A.; Vassilatos, L.S.; Barish, M.; Tran, D.N.; Sullivan, B.M.; Ketas, T.J.; O’Neill, T.J.; Treatment of advanced human immunodeficiency virus type 1 disease with the viral entry inhibitor PRO 542. Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48, 423–429 39. Chong, H.; Wu, X.; Su, Y.; He, Y. Development of potent and long-acting HIV-1 fusion inhibitors. AIDS 2016, 30, 1187–1196 (33). 114 40. Ashkenazi, A.; Viard, M.; Unger, L.; Blumenthal, R.; Shai, Y. Sphingopeptides: Dihydrosphingosine-based fusion inhibitors against wild-type and enfuvirtide- resistant HIV-1. FASEB J 2012, 26, 4628–4636. (34). 41. Urbanowicz, R.A.; Lacek, K.; Lahm, A.; Bienkowska-Szewczyk, K.; Ball, J.K.; Nicosia, A.; Cortese, R.; Pessi, A. Cholesterol conjugation potentiates the antiviral activity of an HIV immunoadhesin. J. Pept. Sci. 2015, 21, 743–749 (35). 42. Wexler-Cohen, Y.; Ashkenazi, A.; Viard, M.; Blumenthal, R.; Shai, Y. Virus-cell and cell-cell fusion mediated by the HIV-1 envelope glycoprotein is inhibited by short gp41 N-terminal membrane-anchored peptides lacking the critical pocket domain. FASEB J. 2010, 24, 4196–4202. 936) 43. Jiang, S.; Lin, K.; Strick, N.; Neurath, A.R. HIV-1 inhibition by a peptide. Nature 1993, 365, 113 (31). 44. Pan, C.; Cai, L.; Lu, H.; Qi, Z.; Jiang, S. Combinations of the first and next generations of human immunodeficiency virus (HIV) fusion inhibitors exhibit a highly potent synergistic effect against enfuvirtide-sensitive and-resistant HIV type 1 strains. J. Virol. 2009, 83, 7862–7872 (32) 45. Lim, S.B.; Banerjee, A.; Onyuksel, H. Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers. J. Control. Release. 2012, 163, 34–45 46. Chong, H.; Xue, J.; Xiong, S.; Cong, Z.; Ding, X.; Zhu, Y.; Liu, Z.; Chen, T.; Feng, Y.; He, L.; et al. A lipopeptide HIV-1/2 fusion inhibitor with highly potent in vitro, ex vivo and in vivo antiviral activity. J. Virol. 2017, 91. 47. Ding, X.; Zhang, X.; Chong, H.; Zhu, Y.; Wei, H.; Wu, X.; He, J.; Wang, X.; He, Y. Enfuvirtide (T20)-based lipopeptide is a potent HIV-1 cell fusion inhibitor: Implications for viral entry and inhibition. J. Virol. 2017, 91. 48. US FDA. Drug approval package: Edurant; 2011. 49. Cohen CJ, Andrade-Villanueva J, Clotet B, et al., Rilpivirine versus efavirenz with two background nucleoside or nucleotide reverse A. I. Rana et al. transcriptase inhibitors in treatment-naive adults infected with HIV-1 (THRIVE): a phase 3, randomised, non-inferiority trial. Lancet. 2011;378(9787):229–37. 50. Molina J-M, Cahn P, Grinsztejn B, et al., Rilpivirine versus efavirenz with tenofovir and emtricitabine in treatment-naive adults infected with HIV-1 (ECHO): a phase 3 randomised double-blind active-controlled trial. Lancet. 2011;378(9787):238–46 115 51. Hoeben E, Borghys H, Looszova A, Bouche M-P, van Velsen F, Baert L. Pharmacokinetics and disposition of rilpivirine (TMC278) nanosuspension as a long-acting injectable antiretroviral formulation. Antimicrob Agents Chemother. 2010;54(5):2042–50. 52. Verloes R, Deleu S, Niemeijer N, Crauwels H, Meyvisch P, Williams P. Safety, tolerability and pharmacokinetics of rilpivirine following administration of a long- acting formulation in healthy volunteers. HIV Med. 2015;16(8):477–84. 53. McGowan I, Siegel A, Engstrom J, et al. Persistence of rilpivirine following single dose of long‐acting injection. J Int Aids Society. 2016;19. 54. Yoshinaga T, Kobayashi M, Seki T, et al. Antiviral characteristics of GSK1265744, an HIV integrase inhibitor dosed orally or by long-acting injection. Antimicrob Agents Chemother. 2015;59(1):397–406. 55. Spreen W, Min S, Ford S, et al. Pharmacokinetics, safety, and monotherapy antiviral activity of GSK1265744, an HIV integrase strand transfer inhibitor. HIV Clin Trials. 2013;14(5):192–203. 56. Spreen W, Ford SL, Chen S, et al. GSK1265744 pharmacokinetics in plasma and tissue after single-dose long-acting injectable administration in healthy subjects. J Acquir Immune Defc Syndr. 2014;67(5):481–6 57. Nayak D, et al., Stavudine loaded gelatin liposomes for HIV therapy: Preparation, characterization and in vitro cytotoxic evaluation. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl, 2017 73: p. 406–416. 58. Kraft JC, et al., Emerging Research and Clinical Development Trends of Liposome and Lipid Nanoparticle Drug Delivery Systems. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2014 103(1): p. 29–52. 59. Kinman L, et al., Lipid-drug association enhanced HIV-1 protease inhibitor indinavir localization in lymphoid tissues and viral load reduction: a proof of concept study in HIV-2287-infected macaques. J. Acquir Immune Defic Syndr, 2003 34(4): p. 387–97. 60. Duan J, et al., Evaluation of atazanavir and darunavir interactions with lipids for developing pHresponsive anti-HIV drug combination nanoparticles. J Pharm Sci, 2014 103(8): p. 2520–9. 116 61. Naseri N, Valizadeh H, and Zakeri-Milani P, Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application. Advanced Pharmaceutical Bulletin, 2015 5(3): p. 305–313. 62. Javan F, et al., Encapsulation of ritonavir in solid lipid nanoparticles: in-vitro anti- HIV-1 activity using lentiviral particles. Journal of Pharmacy and Pharmacology, 2017 69(8): p. 1002–1009. 63. . K SJ, et al., Gelatin modified lipid nanoparticles for anti-viral drug delivery. Chem Phys Lipids, 2017 207(Pt A): p. 24–37. 64. Dubey V, et al., Enhanced transdermal delivery of an anti-HIV agent via ethanolic liposomes. Nanomedicine, 2010 6(4): p. 590–6. 65. Chu GJ and Murad A, A case of ethanol-induced systemic allergic dermatitis. Contact Dermatitis, 2017 76(3): p. 182–184. 66. Aggarwal R, Sahoo PK, Ethosomes: The Novel Drug Delivery Carriers, Sch. Acad. J. Pharm., Jun 2018; 7(6): 266-273. 67. Khalil NM, et al., Potential of polymeric nanoparticles in AIDS treatment and prevention. Expert Opin Drug Deliv, 2011 8(1): p. 95–112. 68. Zhilin Chen , Boris Julg. Therapeutic Vaccines for the Treatment of HIV. Journal Pre-proy 2020. 69. Tomáš Hanke, Aiming for protective T-cell responses: a focus on the first generation conserved-region HIV consv vaccines in preventive and therapeutic clinical trials. Expert Review of Vaccines (2019). 70. Nguyễn Thị Trâm Châu (2015), Nghiên cứu biến tính các dendrimer PAMAM bằng biopolymer ứng dụng mang thuốc, Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu, Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 71. Li, N., et al., Enzyme-sensitive and amphiphilic PEGylated dendrimer-paclitaxel prodrug-based nanoparticles for enhanced stability and anticancer efficacy. ACS applied materials & interfaces, 2017. 9(8): p. 6865-6877. 72. Pasut G, Sergi M, Veronese FM. Anti-cancer PEG-enzymes: 30 years old, but still a current approach. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:69–78. 73. Brocchini S, Godwin A, Balan S, Choi J, Zloh M, Shaunak S. Disulfide bridge based PEGylation of proteins. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:3–12. 117 74. Eto Y, Yoshioka Y, Mukai Y, Okada N, Nakagawa S. Development of PEGylated adenovirus vector with targeting ligand. International Journal of Pharmaceutics 2008;354:3–8. 75. Huynh L, Neale C, Pomès R, Allen C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine 2012;8:20–36. 76. Payne RW, Murphy BM, Manning MC. Product development issues for PEGylated proteins. Pharmaceutical Development and Technology 2011;16:423–40. 77. Abuchowski A, Van Es T, Palczuk NC, Davis FF. Alteration of immunological properties of bovine serum albumin by covalent attachment of polyethylene glycol. Journal of Biological Chemistry 1977;252:3578–81. 78. Abuchowski A, McCoy JR, Palczuk NC, van Es T, Davis FF. Effect of covalent attachment of polyethylene glycol on immunogenicity and circulating life of bovine liver catalase. Journal of Biological Chemistry;252:3582–6. 79. Li C, Wallace S. Polymer-drug conjugates: recent development in clinical oncology. Advanced Drug Delivery Reviews 2008;60:886–98. 80. Pasut G, Veronese FM. Polymer–drug conjugation, recent achievements and general strategies. Progress in Polymer Science 2007;32:933–61. 81. Andrew M. Bodratti and Paschalis Alexandridis. Formulation of Poloxamers for Drug Delivery. J. Funct. Biomater. 2018, 9, 11. 82. Alexandridis, P.; Hatton, T.A. Poly(ethylene oxide)-poly(propylene oxide)- poly(ethylene oxide) block copolymer surfactants in aqueous solutions and at interfaces: Thermodynamics, structure, dynamics, and modeling. Colloids Surf. A Physicochem. Eng. Asp. 1994, 96, 1–46. 83. Nguyễn Ngọc Thể (2021), Tổng hợp và đánh giá hiệu quả mang thuốc và tiêu diệt tế bào ung thư của một số hệ nanogel trên cơ sở polysaccharide sulfate (Heparin, Fucoidan) ghép các copolymer tương hợp sinh học , Luận án Tiến sĩ Hóa hữu cơ, Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 84. P. Dinesh Kumar, P.Vijayaraj Kumar, T. Panneer Selvam and K.R.S. Sambasiva Rao. Prolonged Drug Delivery System of PEGylated PAMAM Dendrimers with a Anti-HIV Drug. Research in Pharmacy 3(2): 08-17, 2013. 118 85. Mohammad R Aghasadeghi , Hossein Heidari, Seyed M Sadat, Shiva Irani, Safieh Amini, Seyed D Siadat, Mohammad E Fazlhashemy, Rezvan Zabihollahi, Seyed M Atyabi, Seyed B Momen, Mohammad S Khosraavy, Mehdi Davari, Tahmineh Darvish Mohammadi, Mohammad Doroudian, Mehdi S Ardestani. Lamivudine – PEGylated chitosan: a novel effective nanosized antiretroviral agent. Curr HIV Res.2013 Jun; 11(4):309-20. 86. Esmaeel Mohammadi Pargoo,Mohammad Reza Aghasadeghi,Kazem Parivar,Mehri Nikbin, Pooneh Rahimi,Mehdi Shafiee Ardestan. Lamivudine- conjugated and efavirenz – loaded G2 dendrimers: Novel anti-retroviral nano drug delivery systems. IET Nanobiotechnology Jun 2021. 87. Hồ Minh Nhật (2020), Nghiên cứu tổng hợp hệ nano dendrimer Poly (amidoamine) mang thuốc chống ung thư (Carboplatin và Oxaliplatin), Luận án Tiến sĩ Khoa học vật liệu, Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 88. Viện Kiểm nghiệm An toan Vệ sinh Thực phẩm Quốc gia, Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. 89. ICH Harmonised Tripartite Guideline validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) (1994) 90. The United States Pharmacopeia 2021 (USP 44) 91. Le Hang Dang, Phuong Doan, Tran Thi Yen Nhi, Dinh Trung Nguyen, Bich Tram Nguyen, Thi Phuong Nguyen, Ngoc Quyen Tran. Multifunctional injectable pluronic-cystamine-alginate-based hydrogel as a novel cellular delivery system towards tissue regeneration. Intternational journal of Biological Macromolecules, Volume 185, 31August 2021, 592-603 92. ATCC.BJ https://www.atcc.org/products/crl- 2522#:~:text=BJ%20cells%20are%20fibroblasts%20established,Applications%20 include%20toxicology%20research.&text=Discounts%2 (Truy cập ngày 3/12/2022 93. Enzymatic Assay of Pepsin (3.4.23.1) https://www.sigmaaldrich.com/VN/en/technical-documents/protocol/protein- biology/enzyme-activity-assays/enzymatic-assay-of-pepsin (Truy cập ngày 3/12/2020) 119 94. Van-Dung Nguyen, Hong-Loan Thi Nguyen¸ Linh-Chi Do, Vu Van Tuan, Phuong Thien Thuong and Tuan-Nghia Phan. A New Saponin with Anti-HIV-1 Protease Activity from Acacia pennata. Natural Product Communication Vol.13 (4) 2018, 411-414 95. Nguyễn Văn Dũng, Lương Thị Kim Châu, Nguyễn Thị Hồng Loan, Nguyễn Thị Phương, Phương Thiện Thương, Phan Tuấn Nghĩa, Bùi Phương Thuận (2015). Hoạt tính ức chế pepsin và protease HIV-1 của các cao chiết và hoạt chất Acid maslinic từ dược liệu. Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 31, Số 2 (2015) 18-27 96. Ho, M.N.; Bach, L.G.; Nguyen, D.H.; Nguyen, C.H.; Nguyen, C.K.; Tran, N.Q.; Nguyen, N.V.; Thi, T.T.H. PEGylated PAMAM dendrimers loading oxaliplatin with prolonged release and high payload without burst effect. Biopolymers 2019, 110. 97. Thi Bich Tram Nguyen, Thi Tram Chau Nguyen, Hoang Chinh Tran, Cuu Khoa Nguyen, Ngoc Quyen Tran, 1H NMR spectroscopy as an effective method for predicting molecular weight of polyaminoamine dendrimers and their derivatives. International Journal of Polymer Analysis and Characterization, 2015. 20(1): p. 57- 68. 98. B. L. Schwartz, A. L. Rockwood, R. D. Smith, D. A. Tomalia, R. Spindler, Detection of high molecular weight starburst dendrimers by electrospray ionization mass spectrometry. Rapid communications in mass spectrometry, 1995. 9(15): 1552-1555. 99. R.J., Hood, J.T. Watson, and A.D. Jones. Resolution and mass accuracy of highmass ions in TOF mass spectrometry: Applications to PAMAM dendrimers. 54th Annual Conference on Mass Spectrometry, Seattle, Washington, 2006. 100. K. Madaan, S. Kumar, N. Poonia, V. Lather, D. Pvaita. Dendrimers in drug delivery and targeting: drug-dendrimer interactions and toxicity issues. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences, 2014. 6(3): 139-150. 101. Luong, D.; Kesharwani, P.; Deshmukh, R.; Amin, M.C.I.M.; Gupta, U.; Greish, K.; Iyer, A.K. PEGylated PAMAM dendrimers: Enhancing efficacy and mitigating toxicity for effective anticancer drug and gene delivery. Acta Biomater. 2016, 43, 14–29. 120 102. Ho, M.N.; Bach, L.G.; Nguyen, D.H.; Nguyen, C.H.; Nguyen, C.K.; Tran, N.Q.; Nguyen, N.V.; Thi, T.T.H. PEGylated PAMAM dendrimers loading oxaliplatin with prolonged release and high payload without burst effect. Biopolymers 2019, 110. 103. Ahmed, R.; Aucamp, M.; Ebrahim, N.; Samsodien, H. Supramolecular assembly of rifampicin and PEGylated PAMAM dendrimer as a novel conjugate for tuberculosis. J. Drug Deliv. Sci. Technol. 2021, 66. 104. Lin-Vien, D.; Colthup, N.B.; Fateley, W.G.; Grasselli, J.G. The Handbook of Infrared and Raman Characteristic Frequencies of Organic Molecules; Academic Press: London, UK, 1991. 105. Sonam Choudhary, Lokesh Gupta, Santa Rani, Kaushalkuma Dave, Umesh Gupta. Impact of dendrimers on solubility of hydrophobic Drug. Front Pharmacol, 2017, 8:261 106. M A Navia, P M Fitzgerald, B M McKeever, C T Leu, J C Heimbach, W K Herber, I S Sigal, P L Darke, J P Springer. Three-dimensional structure of aspartyl protease from human immunodeficiency virus HIV-1, Nature 1989 Feb 16;337(6208):615-20 107. Bazzo, Giovana Carolina; Mostafa, Dina; França, Maria Terezinha; Pezzini, Bianca Ramos; Stulzer, Hellen Karine (2019). How tenofovir disoproxil fumarate can impact on solubility and dissolution rate of efavirenz?. International Journal of Pharmaceutics, 118597. 108. Anthony D. Richards, Lowri H. Phylip, William G.Farmerie, Paula E.Scarborough, Alicia Alvarez, Ben M,Dunn, Ph-Herve Hire, Libuse pavlickova, Vladimir Kostka, and John Kay. Sensitive, Solube Chromogenic Subtrates for HIV- 1 proteinase. The Journal of Biological chemistry Vol.265, No.14, Issue of May 16, pp.7733-7736, 1990 109. Alterman, M. Design and Synthesis of HIV-1 Protease Inhibitor; Acta Universitatis Upsaliensis: Uppsala, Sweden, 2001. 110. Gaber, R.; Majerle, A.; Jerala, R.; Benˇcina, M. Noninvasive high-throughput single-cell analysis of HIV protease activity using ratiometric flow cytometry. Sensors 2013, 13, 16330–16346. 121 111. Oluwaseun Ogunwuy, Namita Kumari, Kahli A. Smith, Oleg Bolshakov, Simeon Adesina, Avele Gugssa, Winston A. Anderson, Sergei Nekhai, Emmanuel, O. Akala, Antiretroviral Druds-Loaded Nanoparticles Fabricated by Dispersion Polymerization with Potential for HIV/AIDS Treatment. Infect Dis (Auckl), 2016; 9: 21-32 122 PHỤ LỤC 123 PHỤ LỤC 1. PHỔ CẤU TRÚC SẢN PHẨM DENDRIMER PAMAM G-0.5, G0.0, G0.5, G1.0, G1.5, G2.0, G2.5, G3.0 Phổ IR dendrimer PAMAM G-0.5 124 Phổ IR dendrimer PAMAM G0.0 125 Phổ IR dendrimer PAMAM G0.5 126 Phổ IR dendrimer PAMAM G1.0 127 Phổ IR dendrimer PAMAM G1.5 128 Phổ IR dendrimer PAMAM G2.0 129 Phổ IR dendrimer PAMAM G3.0 130 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G-0.5 131 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.0 132 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G0.5 133 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.0 134 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G1.5 135 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.0 136 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G2.5 137 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0 138 Phổ GPC của dendrimer PAMAM G3.0 139 PHỤ LỤC 2. PHỔ CẤU TRÚC SẢN PHẨM DENDRIMER PAMAM BIẾN TÍNH VỚI mPEG VÀ PLURONIC F127 Phổ 1H-NMR mPEG-NPC 140 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@mPEG 141 Phổ GPC của dendrimer PAMAM G3.0@mPEG 142 Phổ 1H-NMR của HO-F127-NPC 143 Phổ 1H-NMR dendrimer PAMAM G3.0@F127 144 PHỤ LỤC 3 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH TDF, RTV VÀ XÁC ĐỊNH ĐỒNG THỜI TDF, RTV Tính tuyến tính Kết quả khảo sát tính tuyến tính của TDF Nồng độ C (µg/ml) 2,72 67,93 135,87 271,74 407,61 Diện tích pic S 13989 309796 738331 1468549 2167338 (mAu.s) Phương trình hồi qui ŷ = 5385,8396x – 14622,2039 Hệ số tương quan r = 0,9995 Kết quả khảo sát tính tuyến tính của RTV Nồng độ C (µg/ml) 2,63 65,67 131,34 262,68 394,02 Diện tích pic S 16839 469233 942161 1881293 2827375 (mAu.s) Phương trình hồi qui ŷ = 7178,0380x - 1983,4253 Hệ số tương quan r = 1,0000 Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ chất phân tích và diện tích pic đáp ứng trong khoảng nồng độ khảo sát đối với các hợp chất nghiên cứu. Kết quả này được sử dụng làm cơ sở cho các nghiên cứu dẫn truyền hóa thuốc và phóng thích thuốc in vitro y = 5385.840x - 14622.204 R² = 00.999 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 - 100 200 300 400 500 D iệ n t íc h p ic Nồng độ (µg/ml) y = 7178.038x - 1983.425 R² = 01.000 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 - 100 200 300 400 500D iệ n t íc h p ic Nồng độ (µg/ml) 145 Độ chính xác Kết quả khảo sát độ lặp của TDF và RTV TDF RTV Thử Lượng cân g Diện tích Pic (mAu.s) Hàm lượng % Diện tích Pic (mAu.s) Hàm lượng % 1 0,0621 533105 8,04 943024 10,57 2 0,0630 549955 8,18 977888 10,81 3 0,0625 550793 8,26 977767 10,89 4 0,0628 550419 8,21 975882 10,82 5 0,0635 550231 8,12 976029 10,70 6 0,0620 549625 8,31 976219 10,96 Trung bình 8,19 10,79 RSD (%) 1,16 1,29 Kết quả khảo sát độ chính xác trung gian của TDF và RTV TDF RTV Thử Lượng cân g Diện tích Pic (mAu.s) Hàm lượng % Diện tích Pic (mAu.s) Hàm lượng % 1 0,0627 529766 7,99 936398 10,41 2 0,0632 529812 7,85 938480 10,36 3 0,0612 529294 8,10 938897 10,70 4 0,0615 529180 8,06 936405 10,62 5 0,0621 528635 7,98 938411 10,54 6 0,0628 529619 7,90 936538 10,40 Trung bình 7,98 10,50 RSD (%) 1,18 1,30 Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy phương pháp đạt độ chính xác có RSD < 2,0 % (n=12): TDF có RSD 1,18 % và RTV có RSD là 1,30 % 146 Độ đúng Kết quả khảo sát độ đúng của TDF Mức Lượng chuẩn Nồng độ Diện tích pic (mAu.s) Nồng độ chuẩn Tỷ lệ Trung bình RSD thêm mg chuẩn µg/ml tìm lại µg/ml phục hồi % % % 80 % 10,85 107,96 589592 109,47 101,40 10,80 107,46 589229 109,40 101,81 101,35 0,48 10,91 108,55 589562 109,47 100,84 100 % 13,60 135,32 738154 137,05 101,28 13,58 135,12 740101 137,42 101,70 101,41 0,25 13,61 135,42 738387 137,10 101,24 120 % 16,32 162,38 883469 164,04 101,02 100,82 0,17 16,35 162,68 883046 163,96 100,78 16,37 162,88 883208 163,99 100,68 Kết quả khảo sát độ đúng của RTV Mức Lượng chuẩn Nồng độ Diện tích pic Nồng độ chuẩn Tỷ lệ Trung bình RSD thêm mg chuẩn µg/ml tìm lại µg/ml phục hồi % % % 80 % 10,50 105,00 755329 105,23 100,22 10,55 105,50 753794 105,01 99,54 99,75 0,41 10,57 105,70 754826 105,16 99,49 100 % 13,20 132,00 945840 131,77 99,82 13,22 132,20 941420 131,15 99,21 99,37 0,40 13,25 132,50 942419 131,29 99,09 120 % 16,00 160,00 1129909 157,41 98,38 15,96 159,60 1130985 157,56 98,72 98,73 0,35 15,90 159,00 1130813 157,54 99,08 147 PHỤ LỤC 4 SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN AZT TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127 148 149 PHỤ LỤC 5 SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN 3TC TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127 150 151 PHỤ LỤC 6 SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN TDF TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127 152 153 PHỤ LỤC 7 SẮC KÝ ĐỒ DẪN TRUYỀN RTV TRÊN HỆ G3.0@mPEG VÀ G3.0@F127 154