Luận án Nghiên cứu xây dựng và phát triển phương pháp phân tích một số chất kích thích tăng trưởng (auxin, gibberellin, cytokinin) trong rau xanh

Ngoc Tung Nguyen, Tibor Janda, Gabbriella Szala, Truong Giang Le. The potential health risks and environmental pollution associated with the application of plant growth regulators in vegetable production in several suburban areas of Hanoi, Vietnam. Biologia Futura, 2020. DOI :10.1007/s42977-020-00041-5. 3. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le. Analysis of Plant Growth Substances (Auxins, Gibberelins and Cytokinins) in Vegetables Using High-Performance Liquid Chromatography Coupled to Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry. The International Journal of Science and Technoledge, 2020, 8(7): 38-46. 4. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Hoàng Thị Thoa, Nguyễn Ngọc Tùng, Quách Thị Sơn. Quy trình phân tích sàng lọc một số chất kích thích tăng trƣởng thực vật trong rau xanh. Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2019, 24 (4B), 45-51. 5. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Phùng Trung Kiên. Nghiên cứu ảnh hƣởng của GA3 lên sự sinh trƣởng và phát triển của cải bẹ xanh [Brassica Juncea (L.) czern. et coss]. Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2019, 24 (4B), 97-102. 6. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam, Lê Trƣờng Giang, Đinh Ngọc Huy. Xây dựng các bƣớc nghiên cứu cơ bản trong phân tích thuốc kích thích tăng trƣởng trans-zeatin sử dụng thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối khối phổ. Tạp chí Phân tích: Hóa, Lý và Sinh học, 2018, 23 (4), 41-49. 7. Van Nhan Le, Quang Trung Nguyen, Ngoc Tung Nguyen, Truong Giang Le, Tibor Janda, Gabbriella Szalai, Yukui Rui. Simultaneous analysis of plant endogenous hormones in green mustard by liquid chromatography tandem mass 113 spectrometry. (Đã phản biện và đang chờ đăng trên Tạp chí Chinese Journal of Analytical Chemistry). 8. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam. Phân tích đồng thời các chất kích thích sinh trƣởng Cytokinin trong rau xanh. (Đã phản biện và đang chờ đăng trên Tạp chí Hóa học). 9. Lê Văn Nhân, Nguyễn Quang Trung, Nguyễn Ngọc Tùng, Vũ Đức Nam. Ảnh hƣởng của GA3 đến sự phát triển sinh khối của một số loại rau xanh. (Đã phản biện và đang chờ đăng trên Tạp chí Hóa học). 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. P. J. Davies, The Plant Hormones: Their Nature, Occurrence, and Functions. In Plant Hormones, Springer: Dordrecht, The Netherlands, 2010; 1-15. [2]. L. A. C. J. Voesenek, J. H. G. M. Rijnders, A. J. M. Peeters, H.M. van de Steeg, H. de Kroon, Plant Hormones Regulate Fast Shoot Elongation under Water: From Genes to Communities, Ecology, 2004, 85, 16-27. [3]. M. Bar, N. Ori, Leaf development and morphogenesis, Development, 2014, 141, 4219-4230. [4]. J. P. Nitsch, Plant Hormones in the Development of Fruits, The Quarterly Review of Biology, 1952, 27, 33-57. [5]. M. Miransari, D. L. Smith, Plant hormones and seed germination, Environmental and Experimental of Botany, 2014, 99, 110-121. [6]. E. Tanimoto, Regulation of Root Growth by Plant Hormones - Roles for Auxin and Gibberellin, Critical Review in Plant Sciences, 2005, 24, 249-265. [7]. J. D. Metzger, Plant Hormones: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. In Hormones and Reproductive Development, Ed. Springer: Dordrecht, The Netherlands, 1995, 617-648. [8]. J. Friml, Auxin transport - shaping the plant, Current Opinion in Plant Biology, 2003, 6 (1), 7-12. [9]. L. Taiz, E. Zeiger, Plant Physiology (2nd ed.), Massachusetts: Sinauer Associates, 1998. [10]. S. Simon, P. Petrášek, Why plants need more than one type of auxin, Plant Science, 2011, 180 (3), 454-460. [11]. J. Ludwig-Müller, Auxin conjugates: their role for plant development and in the evolution of land plants, Journal of Experimental Botany, 2011, 62 (6), 1757-1773. [12]. D. L. Jones and I. D. J. Phillips, Organs of Gibberellin Synthesis in Light- Grown Sunflower Plants Russell, Plant Physiology, 1966, 41, 1381-1386. [13]. N. Campbell, J. B. Reec, Biology (6th ed.). San Francisco: Benjamin Cummings, 2006. [14]. P. Hedden, V. Sponsel, A Century of Gibberellin Research, Journal of Plant Growth Regulation, 2015, 34 (4), 740-60. [15]. Gibberellins, AccessScience. doi:10.1036/1097-8542.289000. [16]. S. Yamaguchi, Gibberellin metabolism and its regulation, Annual Review of Plant Biology, 2008, 59, 225-51. [17]. J. J. Kieber, Tribute to Folke Skoog: Recent Advances in our Understanding of Cytokinin Biology, Journal of Plant Growth Regulation, 2002, 21 (1), 1-2. 115 [18]. O. Aina, K. Quesenberry, M. Gallo, Thidiazuron-Induced Tissue Culture Regeneration from Quartered-Seed Explants of Arachis paraguariensis, Crop Science, 2012, 52 (3), 555. [19]. E. Zažímalová, J. Petrášek & E. Benková, Auxin and Its Role in Plant Development, 2014, doi:10.1007/978-3-7091-1526-8. [20]. Yunde Zhao, Auxin Biosynthesis and Its Role in Plant Development, Annual Review of Plant Biology, 2010, 61(1), 49-64. [21]. M. Reguera, Z. Peleg, Y. M. Abdel-Tawab, E. B. Tumimbang, C. A. Delatorre, E. Blumwald, Stress-induced cytokinin synthesis increases drought tolerance through the coordinated regulation of carbon and nitrogen assimilation in rice, Plant Physiology, 2013, 163, 1609-1622. [22]. L. Rubia, L. Rangan, R. Choudhury, M. Kaminek, P. Dobrev, J. Malbeck, M. Fowler, A. Slater, N. Scott, J. Bennett, S. Peng, G. Khush, M. Elliott, Changes in the chlorophyll content and cytokinin levels in the top three leaves of new plant type rice during grain filling, Journal of Plant Growth Regulation, 2014, 33, 66-76. [23]. Preece, A century of progress with vegetative plant propagation, Hort Science, 2003, 38, 1015-1025. [24]. P. Salasˇ, H. Saskova´, J. Mokricˇkova´, T. Litschmann, Evaluation of different types of rooting stimulators, Acta Universitatis Agricultural et Silviculturae Mendelianae Brunensis, 2012, 60, 217-228 [25]. Võ Thị Phƣơng Nhung, Đỗ Thị Thúy Hằng, Võ Thị Hải Hiền, Xuất khẩu rau quả Việt Nam – thực trạng và giải pháp. Tạp chí Khoa học và Công nghệ Lâm Nghiệp tháng 10/2017. [26]. R. N. Prasad, S. K. Singh, R. B. Yadava, and S. N. S. Chaurasia, Effect of GA3 and NAA on growth and yield of tomato, Vegetable Science, 2013, 40 (2), 195-197. [27]. B. R. Chaudhary, M. D. Sharma, S. M. Shakya, and D. M. Gautam, Effect of plant growth regulators on growth, yield and quality of Chilli (Capsicum annuum L.) at Rampur, Chitwan, Journal of the Institute of Agriculture and Animal Science, 2006, 27, 65- 68. [28]. M. J. Patel, H. C. Patel, and J. C. Chavda, Influence of plant growth regulators and their application methods on yield and quality of onion (Allium cepa L.). Asian journal of horticulture, 2010, 5(2), 263-265. [29]. Pedro Jacob Christoffoleti, Marcelo Rodrigues Alves de Figueiredo, Lázaro Eustáquio Pereira Peres, Scott Nissen, Todd Gaines., Auxinic herbicides, mechanisms of action, and weed resistance: A look into recent plant science advances, Scientia Agricola, 2015, 72 (4), 356-362. 116 [30]. A. A. Dhage, P. K. Nagre, K. K. Bhangre and A. K. Pappu, Effect of plant growth regulators on growth and yield parameters of okra, Asian Journal of Horticulture, 2011, 6 (1), 170-172. [31]. Utpal Maity, Puspendu Dutta and Bijoy Layek, Effect of Plant Growth Regulators on Growth, Yield and Quality of Okra [Abelmoschus esculentus (L.) Moench]. Journal of Agroecology and Natural Resource Management, 2016, 3 (3), 251-253. [32]. J. L. Netam and Sharma Richa, Efficacy of plant growth regulators on growth characters and yield attributes in brinjal (Solanum melongena L.) cv, Brinjal 3112. IOSR, Journal of Agriculture and Veterinary Sciences, (IOSR- JAVS), 2014, 7, 27-30. [33]. R. S. Jadon, R. Lekhi, S. Sharma and R. Sharma, Effect of Gibberelic acid, IBA and NAA as Foliar Spray on the Growth, Yield and Quality of Cauliflower (Brassica oleracea var. botrytis L.), Agriculture: Towards a New Paradigm of Sustainability, 2009, 230. [34]. J. Chaurasiy, M. L. Meena, H. D. Singh, A. Adarsh and P. K. Mishra, Effect of GA3 and NAA on growth and yield of cabbage (Brassica oleracea var. Capitata L.) cv. Pride of India, The Bioscan, 2014, 9 (3), 1139-1141. [35]. N. Sandra, S. KumarLal, S. K. Chakrabarty, and A. Talukdar, Effect of plant growth regulators on sex expression, fruit setting, seed yield and quality in the parental lines for hybrid seed production in bitter gourd (Momordicacharantia), Indian Journal of Agricultural Sciences, 2015, 85 (9), 1185-1191. [36]. G. Koteswara Rao, P. Ashok, D. V. Swami and K. Sasikala, Influence of Plant Growth Regulators on Growth, Root Tuber Yield and Quality of Orange Flesh Sweet Potato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) Varieties G, International Journal of Current Microbiology and Applied Science, 2017, 6 (6), 2017-2025. [37]. T. Urbanova, G. Leubner-Metzger, Gibberellins and seed germination, In: Hedden P, Thomas SG (eds) The gibberellins, Annual plant reviews, Wiley, Oxford, 2016, 253-284. [38]. E. H. Colebrook, S. G. Thomas, A. L. Phillips, P. Hedden, The role of gibberellin signalling in plant responses to abiotic stress, Journal of Experimental Biology, 2014, 217, 67-75. [39]. Y. H. Li, Y. J. Wu, B. Wu et al., Exogenous gibberellic acid increases the fruit weight of ‘Comte de Paris’ pineapple by enlarging flesh cells without negative effects on fruit quality, Acta Physiologiae Plantarum, 2010, 33, 1715-1722. https ://doi.org/10.1007/s11738-010-0708-2. [40]. J. Dayan, N. Voronin, F. Gong et al. Leaf-induced gibberellin signaling is essential for internode elongation, cambial activity, and fiber differentiation 117 in Tobacco stems, Plant Cell, 2012, 24, 66-79. https ://doi.org/10.1105/tpc.111.09309 6 [41]. N. Muñoz-Fambuena, C. Mesejo, M. C. González-Mas et al., Gibberellic acid reduces flowering intensity in sweet orange [Citrus sinensis (L.) Osbeck] by repressing CiFT gene expression. Journal of Plant Growth Regulation, 2012, 31, 529-536. https ://doi.org/10.1007/s0034 4-012-9263-y [42]. P. Hedden, V. Sponsel, A century of gibberellin research, Journal of Plant Growth Regulation, 2015, 34, 740-760. https ://doi.org/10.1007/s00344-015- 9546-1 [43]. Qingfeng Niu, Tao Wang, Jianzhao Li, Qianqian Yang, Minjie Qian & Yuanwen Teng, Effects of exogenous application of GA4+7 and N- (2-chloro-4-pyridyl)-N′-phenylurea on induced parthenocarpy and fruit quality in Pyrus pyrifolia ‘Cuiguan’, Plant Growth Regulation, 2015, 76, 251-258. [44]. M. H. Curt AlmqvAkand, H. K. Mazed, M. A. Islam, M. Pulok, and S. N. C. J. F. Moonmoon, Growth and yield of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) as influenced by different level of gibberellic acid application, International Journal of Applied Research, 2015, 1(3), 71-74. [45]. M. H. Akand, H. K. Mazed, M. A. Islam, M. Pulok, and S. N. C. J. F. Moonmoon, Growth and yield of tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) as influenced by different level of gibberellic acid application, International Journal of Applied Research, 2015, 1(3), 71-74. [46]. H. H. Sitapara, N. J. Vihol, M. J. Patel and J. S. Patel, Effect of growth regulators and micro nutrient on growth and yield of cauliflower cv., Asian Journal of Horticulture, 2011, 6(2), 348-351. [47]. M. M. Islam, M. S. I. Khan, and A. Parven, Growth and Yield Potential of Late Planting Cabbage Influenced by Gibberellic Acid, International Journal of Business Social Science Research, 2017, 6(1): 62-67. [48]. Nguyễn Đình Thi, Ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (GA3, IAA và α-NAA) đến sinh trưởng và năng suất của rau cải mầm ở Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 2010, số 57. [49]. Jagati Yadagiri, Prashant Kumar Gupta, Rajesh Tiwari and V. B. Singh, Improvement of Growth and Yield of Onion (Allium cepaL.) cv.Agrifound Light Red through Different Application Methods of Gibberellic Acid andTrichoderma viride, International Journal of Pure and Applied Bioscience, 2017, 5 (4), 1444-1450. [50]. M. T. Hidayatullah, M. Farooq, M. A. Khokhar and S. I. Hussain, Plant growth regulators affecting sex expression of Bottle gourd (Lagenaria siceraria Molina) plants, Pakistan Journal of Agricultural Research, 2012, 25. 118 [51]. Lê Xuân Công, Nguyễn Đình Thi, Trần Huy Quát, Lê Thị Quyên, Hiệu quả của việc xử lý axit gibberelllic (GA3) cho hạt trước khi gieo đến sinh trưởng và năng suất rau muốn ở Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, 2009, số 52,. [52]. J. Pospísilová, Participation of phytohormones in the stomatal regulation of gas exchange during water stress. Biologia Plantarum, 2003, 46, 491-506. [53]. J. Pospísilová, I. C. Dodd, Role of plant growth regulators in stomatal limitation to photosynthesis during water stress. M. Pessarakli (Ed.), Handbook of Photosynthesis, Ed 2, Revised and Expanded, Marcel Dekker, New York, 2005, 811-825 [54]. R. Nishiyama, Y. Watanabe, Y. Fujita, D. T. Le, M. Kojima, T. Werner, et al., Analysis of cytokinin mutants and regulation of cytokinin metabolic genes reveals important regulatory roles of cytokinins in drought, salt and abscisic acid responses, and abscisic acid biosynthesis, The Plant Cell, 2011, 23, 2169-2183. [55]. T. N. Arkhipova, S. U. Veselov, A. I. Melentiev, E. V. Martynenko, G. R. Kudoyarova, Ability of bacterium Bacillus subtilis to produce cytokinins and to influence the growth and endogenous hormone content of lettuce plants, Plant Soil, 2005, 272: 201-209. [56]. T. N. Arkhipova, S. Yu Veselov, A. I. Melent’ev, E. V. Martinenko, G. R. Kudoyarova, Comparison of effects of bacterial strains differing in their ability to synthesize cytokinins on growth and cytokinin content in wheat plants, Russian Journal of Plant Physiology, 2006, 53, 507-513. [57]. S. Can, Effects of some external treated plant growth regulators on stomatal aperture of cucumber (Cucumis sativus L.), African journal of agricultural research, 2009, 4, 628-632. [58]. A. K. Kravtsov, Y. O. Zubo, M. V. Yamburenko, O. N. Kulaeva, V. V. Kusnetsov, Cytokinin and abscisic acid control plastid gene transcription during barley seedling de-etiolation, Plant Growth Regulation, 2011, 64, 173-183. [59]. I. Sergiev, D. Todorava, M. Somleva, V. Alexieva, E. Karanov, E. Stanoeva, V. Lachkova, A. Smith, M. Hall, Influence of cytokinins and novel cytokinin antagonists on the senescence of detached leaves of Arabidopsis thaliana, Biologia Plantarum, 2007, 51, 377-380. [60]. J. Dobránszki, D. N. Mendler, Cytokinin-induced changes in the chlorophyll content and fluorescence of in vitro apple leaves, Journal of Plant Physiology, 2014, 171, 1472-1478. [61]. N. J. Aghofack, A. J. Manka, Effects of exogenously applied benzylaminopurine and kinetin on the ripening of banana (Musa acuminata 119 Colla var. William) fruits, American Journal of Plant Physiology, 2012, 7, 154-163. [62]. M. L. Costa, P. M. Civello, A. R. Chaves, G. A. Martinez, Effect of ethephon and 6-benzylaminopurine on chlorophyll degrading enzymes and a peroxidase-linked chlorophyll bleaching during post-harvest senescence of broccoli (Brassica oleracea L.) at 20o C, Postharvest Biology and Technology, 2005, 35, 191-199. [63]. X. L. Wang, D. Liu, Z. Q. Li, Effects of the coordination mechanism between roots and leaves induced by root-breaking and exogenous cytokinin spraying on the grazing tolerance of ryegrass, Journal of Plant Research, 2012, 125, 407-416. [64]. L. Hu, Z. Wang, B. Huang, Growth and physiological recovery of kentucky bluegrass from drought stress as affected by a synthetic cytokinin 6- benzylaminopurine, Crop Science, 2012, 52, 2332-2340. [65]. R. Nishiyama, Y. Watanabe, Y. Fujita, D. T. Le, M. Kojima, T. Werner, L. S. Tran, Analysis of cytokinin mutants and regulation of cytokinin metabolic genes reveals important regulatory roles of cytokinins in drought, salt and abscisic acid responses, and abscisic acid biosynthesis, The Plant Cell, 2011, 23, 2169-2183. [66]. S. Srivastava, R. J. N. Emery, M. H. Rahman, N. N. V. Kav, A crucial role for cytokinins in pea ABR17-mediated enhanced germination and early seedling growth of Arabidopsis thaliana under saline and low-temperature stresses, Journal of Plant Growth Regulation, 2007, 26, 26-37. [67]. J. Pospisilova, J. Rulcova, L. Vomacka, Effect of benzyladenine and hydroxybenzyladenosine on gas exchange of bean and sugar beet leaves, Biologia Plantarum, 2001, 44, 523-528. [68]. X. X. Wu, J. He, J. L. Chen, S. J. Yang, D. S. Zha, Alleviation of exogenous 6- benzyladenine on two genotypes of eggplant (Solanum melongena Mill.) growth under salt stress, Protoplasma, 2014, 251, 169-176. [69]. L. X. Hu, Z. L. Wang, B. R. Huang, Effects of cytokinin and potassium on stomatal and photosynthetic recovery of Kentucky Bluegrass from drought stress, Crop Science, 2013, 53, 221-231. [70]. A. M. Al-Saif, A. B. M. S. Hossain, R. M. Taha, Effects of benzylaminopurine and naphthalene acetic acid on proliferation and shoot growth of pineapple (Ananas comosus L. Merr) in vitro. African Journal of Biotechnology, 2011, 10, 5291-5295. [71]. H. Gehan, S. A. Shreen and E. M. Samira, Evaluation of synthetic plant growth regulators residues in fruits and vegetables and health risk assessment in Giza, Egypt, Journal of Soil Sciences and Agricultural Engineering, Mansoura University, 2015, 6 (9), 1075-1089. 120 [72]. EU Pesticides Database, 2010, http:// ec.europa.eu/sanco pesticides/public/ index cfm?event=substance.selection&ch=1. [73]. L. Shaoying, H. Xihui, H. Huali, J. Quan, Z. Guonian, Evaluation of selected plant growth regulators and fungicides residues in fruits for dietary risk assessment, Human and Ecological risk assessment: an international journal, 2016, 22 (6), 1386-1395. [74]. L. Jiaju, L. Chaoyun, Z. Lansong, L. Xiaolang, F. Jing, Z. Wei, A Study on the Application and Residues of Plant Growth Regulators in the Fruit Sugarcane Grown in the Sub-Suitable Region, Journal of Agricultural Science, 2010, 2 (4), 254-256. [75]. A. D. Xu, Research Advance in the Toxicity and Residue of Plant Growth Regulator in Vegetables in China, Journal of China Vegtables, 2009, 8 (3), 61-66. [76]. Chen S. Y., Kuo S. R., Chien C. T., Roles of gibberellins and abscisic acid in dormancy and germination of red bayberry (Myrica rubra) seeds, Tree Physiology, 2008, 28:1431-1439. https ://doi.org/10.1093/treep hys/28.9.1431 [77]. F. Du, G. Ruan, H. Liu, Analytical methods for tracing plant hormones, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2012, 403, 55-74. [78]. X. Pan, R. Welti, X. Wang, Quantitative analysis of major plant hormones in crude plant extracts by high-performance liquid chromatography-mass spec- trometry, Nature Protoccol, 2010, 5, 986-992. [79]. Y. Bai, F. Du, H. Liu, Determination strategies of phytohormones: recent ad- vances, Analytical Methods, 2010, 2, 1867-1873. [80]. P. Sara, D. R. Marco, G. D. Silva, P. Augusto, J. C. Maria, A. Parastoo, Current analytical methods for plant auxin quantification – A review, Analytica Chimica Acta, 2016, 902, 8-21. [81]. I. Nakurte, A. Keisa, N. Rostoks, Development and validation of a reversed- phase liquid chromatography method for the simultaneous determination of indole-3-acetic acid, indole-3-pyruvic acid, and Abscisic acid in Barley (Hordeum vulgare L.), Journal of Analytical Methods Chemistry, 2012, 6, org/10.1155/2012/103575. [82]. Q. Lu, L. Chen, M. Lu, G. Chen, L. Zhang, Extraction and analysis of auxins in plants using dispersive liquid- liquid microextraction followed by high- performance liquid chromatography with fluorescence detection, Journal of Agricultural Food Chemistry, 2010, 58, 2763-2770. [83]. P. Xiangqing, W. Ruth and W. Xuemin, Simultaneous quantification of major phytohormones and related compounds in crude plant extracts by 121 liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry, Phytochemistry, 2008, 69, 1773-1781. [84]. F. Matsuda, H. Miyazawa, K. Wakasa, H. Miyagawa, Quantification of indole-3-acetic acid and amino acid conjugates in rice by liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry, Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 2005, 69, 778-783. [85]. H. T. Liu, Y. F. Li, T. G. Luan, C. Y. Lan, W. S. Shu, Simultaneous determination of phytohormones in plant extracts using SPME and HPLC, Chromatographia, 2007, 66, 515-520. [86]. X. Liu, L. Barkawi, G. Gardner, J. D. Cohen, Transport of indole-3-butyric acid and indole-3-acetic acid in Arabidopsis hypocotyls using stable isotope label-ing, Plant Physiology, 2012, 158, 1988-2000. [87]. P. Herrero, F. Borrull, E. Pocurull, R. Marcé, Efficient tandem solid-phase extraction and liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry method to determine polar benzotriazole, benzothiazole and benzenesulfon- amide contaminants in environmental water samples, Journal of Chromatography A, 2013, 1309, 22–32. [88]. R. Meyer, G. F. Rautenbach, I. A. Dubery, Identification and quantification of methyl jasmonate in leaf volatiles of Arabidopsis thaliana using solid- phase microextraction in combination with gas chromatography and mass spec-trometry, Phytochemical Analysis, 2013, 14, 155-159. [89]. J. Swaczynová, O. Novák, E. Hauserová et al, New techniques for the estimation of naturally occurring brassinosteroids, Journal of Plant Growth Regulation, 2007, 26, 1-14. [90]. J. Li, Z. Y. Wu, L. T. Xiao, A novel piezoelectric biosensor for the detection of phytohormones-indole acetic acid. Analytical Science, 2002, 18, 1-5. [91]. P. Chieh-Han, L. Shao-Kai, C. Wei-Chen, S. Tsyr-Horng, Modified QuEChERS method for 24 plant growth regulators in grapes using LC- MS/MS, Journal of Food and Drug Analysis, 2018, 26 (2), 637-648. [92]. D. M. Ribnicky, T. J. Cooke, J. D. Cohen, A microtechnique for the analysis of free and conjugated indole-3-acetic acid in milligram amounts of plant tissue using a benchtop gas chromatograph-mass spectrometer, Planta, 1998, 204, 1-7. [93]. A. Edlund, S. Eklöf, B. Sundberg, T. Moritz, G. Sandberg, A microscale technique for gas chromatography-mass spectrometry measurements of picogram amounts of indole-3-acetic acid in plant tissues, Plant Physiology, 1995, 108, 1043-1047. [94]. K. Ljung, R. P. Bhalerao, G. Sandberg, Sites and homeostatic control of auxin 122 biosynthesis in Arabidopsis during vegetative growth, Plant Journal, 2001, 28, 465-474. [95]. J. Friml, E. Benková, I. Blilou, J. Wisniewska, T. Hamann, K. Ljung, S. Woody, G. Sandberg, B. Scheres, G. Jürgens, K. Palme, AtPIN4 mediated sink-driven auxin gradients and root patterning in Arabidopsis, Cell, 2002, 108, 661-673. [96]. R. Swarup, J. Friml, A. Marchant, K. Ljung, G. Sandberg, K. Palme, M. Bennett, Localization of the auxin permease AUX1 suggests two functionally distinct hormone transport pathways operate in the Arabidopsis root apex. Genes & Development, 2001, 15, 2648-2653 [97]. A. Müller, P. Düchting, E. W. Weiler, A multiplex GC/MS/MS technique for the sensitive and quantitative single-run analysis of acidic phytohormones and related compounds, and its applications to Arabidopsis thaliana. Planta, 2002, 216, 44-56. [98]. M. Kowalczyk, G. Sandberg, Quantitative analysis of indole-3-acetic acid metabolites in Arabidopsis, Plant Physiology, 2001, 127, 1845-1853 [99]. E. Prinsen, W. Van Dongen, E. L. Esmans, H. A. Van Onckelen, Micro and capillary liquid chromatography-tandem mass spectrometry: a new dimension in phytohormone research, Journal of Chromatography A, 1998, 826, 25-37. [100]. R. W. King, T. Moritz, L. T. Evans, O. Junttila, A. J. Herlt, Long-day induction of flowering in Lolium temulentum involves sequential increases in specific gibberellins at the shoot apex, Plant Physiology, 2001, 127, 624-632. [101]. T. Moritz, J. E. Olsen, Comparison between high-resolution selected ion monitoring, selected reaction monitoring, and four-sector tandem mass spectrometry in quantitative analysis of gibberellins in milligram amounts of plant tissue, Analytical Chemistry, 1995, 67, 1711-1716. [102]. G. Schneider, J. Schmidt, Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry for analysing plant hormone conjugates, Journal of Chromatography A, 1996, 728, 371-375. [103]. S. D. Chiwocha, S. R. Abrams, S. J. Ambrose, A. J. Cutler, M. Loewen, A. R. Ross, A. R. Kermode, A method for profiling classes of plant hormones and their metabolites using liquid chromatography-electrospray ionization tandem mass spectrometry: an analysis of hormone regulation of thermodormancy of lettuce (Lactuca sativa L.) seeds, Plant Journal, 2003, 35, 405-417. [104]. R. L. Bielesky, The problem of halting enzyme action when extracting plant tissues, Analytical Biochemistry, 1964, 9, 431-442. 123 [105]. P. Dobrev, M. Kaminek, Fast and efficient separation of cytokinins from auxin and abscisic acid and their purification using mixed-mode solid-phase extraction, Journal of Chromatography A, 2002, 950, 21-29. [106]. M. Faiss, J. Zalibulova, M. Strnad, T. Schmuelling, Conditional transgenic expression of the ipt gene indicates a function for cytokinins in paracrine signalling in whole tobacco plants, Plant Journal, 1997, 12, 401-415. [107]. T. Moritz, Mass spectrometry of plant hormones, Applications of Modern Mass Spectrometry in Plant Science Research, In RP Newton, TJ Walton, eds, Clarendon Press, Oxford, 1996, 139-158. [108]. C. Åstot, K. Dolezal, T. Moritz, G. Sandberg, Precolumn derivatisation and capillary liquid chromatographic/frit-fast atom bombardment mass spectrometry analysis of cytokinins in Arabidopsis thaliana, Journal of Mass Spectrometry, 1998, 33, 892-902. [109]. E. Prinsen, W. Van Dongen, E. L. Esmans, H. A. Van Onckelen, Micro and capillary liquid chromatography-tandem mass spectrometry: a new dimension in phytohormone research, Journal of Chromatography A, 1998, 826, 25-37. [110]. Tiêu chuẩn ngành 10TCN 386:1999 về Phương pháp lấy mẫu kiểm định chất lượng và dư lượng thuốc bảo vệ thực vật, Quyết định số 116/1999/QĐ-BNN- KHCN ban hành ngày 04/8/1999. [111]. W. B. Dunn et al, Procedures for large-scale metabolic profiling of serum and plasma using gas chromatography and liquid chromatography coupled to mass spectrometry, Nature Protocol, 2011, 6 (7), 1060-1083. [112]. EMA, Bioanalytical method validation, European Medicines Agency, 2012 [Online], Available: https://www.ema.europa.eu/en/bioanalytical-method- validation. [Accessed: 08-Dec-2019]. [113]. Báo cáo Tổng kết – Chương trình thử nghiệm thành thạo so sánh Liên phòng thí nghiệm – Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố HCM, 2014. [114]. M. Kowalczyk, and G. Sandberg, Quantitative analysis of indole-3- aceticacid metabolites in Arabidopsis, Plant Physiology, 2001, 127, 1845- 1853. [115]. U. Terezie, T. Danuše, N. Ondřej, H. Peter, S. Miroslav, Analysis of gibberellins as free acids by ultra-performance liquid chromatography– tandem mass spectrometry, Talanta, 2013, 112, 85-94. [116]. N. Ondrej, H. Eva, A. Petra, S. Miroslav, Cytokinin profiling in plant tissues using ultra-performance liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry, Phytochemistry, 2008, 69, 2214-2224. [117]. Y. Izumi, A. Okazawa, T. Bamba, et al., Development of a method for comprehensive and quantitative analysis of planthormones by highly 124 sensitive nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, 2009, 648, 215–225. [118]. European Union (2002), Commission decision of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. [119]. Z. Fengzu, Z. Pengyue, S. Weili, G. Yong, J. Qiu, P. Canping, Development of a Method for the Analysis of Four Plant Growth Regulators (PGRs) Residues in Soybean Sprouts and Mung Bean Sprouts by Liquid Chromatography–Tandem Mass Spectrometry, Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, 2012, 89, 674-679. [120]. J. Šimura, I. Antoniadi, J. Široká, D. Tarkowská, M. Strnad, K. Ljung, and O. Novák, Plant Hormonomics: Multiple Phytohormone Profiling by Targeted Metabolomics, Plant Physiology, 2018, 177, 476-489. [121]. L. Sijie, W. Yongning, F. Chiguang, C. Yong, J. Nan and W. Hui, Simultaneous Determination of 19 Plant Growth Regulator Residues in Plant-originated Foods by QuEChERS and Stable Isotope Dilution–Ultra Performance Liquid Chromatography–Mass Spectrometry, Analytical Sciences, 2017, 33 (9), 1047-1052. [122]. H. Bingjun, Q. Bing, H. Yan and P. Lixu, Determination of Plant Growth Regulators in Chinese Herbal Medicine: A Comparison of Liquid (QuEChERS) and Solid (MSPD) Extraction Methods, Journal of Brazilian Chemical Society, 2019, 30 (7), 1406-1414. [123]. F. M. Frank T. Peters, Olaf H. Drummer, Validation of new methods, Forensic science international, 2007, 165 (2-3), 216-224. [124]. A. Kruve, A. K¨unnapas, K. Herodes, and I. Leito, Matrix effects in pesticide multi-residue analysis by liquid chromatography-mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2008, 1187, 58-66. [125]. C. Kong, Y. Wang, Y. Huang, and H. Yu, Multiclass screening of >200 pharmaceutical and other residues in aquatic foods by ultrahigh performance liquid chromatography quadrupole Orbitrap mass spectrometry, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2018, 410, 5545- 5553. [126]. T. G. Schwanz, C. K. Carpilovsky, G. C. C. Weis, and I. H. Costabeber, Validation of a multi-residue method and estimation of measurement uncertainty of pesticides in drinking water using gas chromatography–mass spectrometry and liquid chromatography–tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 2019, 1585, 10-18. [127]. P. O. Dasharath, B. Kaushik, S. G. Manoj, D. R. Sahadeo, G. N. Dattatraya, B. P. Shubhangi, R. J. Manjusha, G. A. Pandurang, Multiresidue Analysis of Multiclass Plant Growth Regulators in Grapes by Liquid 125 Chromatography/Tandem Mass Spectrometry, Journal of AOAC International, 2011, 94 (3), 968-977. [128]. S. F. Fan, X. P. Wang, P. W. Li, Q. Zhang, W. Zhang, Simultaneous determination of 13 phytohormones in oilseed rape tissues by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry and the evaluation of the matrix effect, Journal of Separation Science, 2011, 34, 640-650. [129]. L. Y. Ma, Z. Hongyan, X. Wentao, H. Xiaoyun, Y. Lili, L. Yunbo, H. Kunlun, Simultaneous Determination of 15 Plant Growth Regulators in Bean Sprout and Tomato with Liquid Chromatography–Triple Quadrupole Tandem Mass Spectrometry, Food Analytical Methods, 2013, 6, 941-951. [130]. Analytical quality control and method validation procedures for pesticides residues analysis in food and feed, 2017, SupersedesDocument No. SANTE/11945/2015. Implemented by 01/01/2018. [131]. Y. Izumi, A. Okazawa, T. Bamba et al, Development of a method for comprehensive and quantitative analysis of planthormones by highly sensitive nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-ion trap mass spectrometry, Analytica Chimica Acta, 2009, 648, 215-225. [132]. M. Maren and M. B. Sergi, Rapid and sensitive hormonal profilling of complex plant samples by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry, Plant Methods, 2011, 7, 1-11. [133]. J. F. Chu, S. Fang, P. Y. Xin, Z. P. Guo and Y. Chen, Quantitative analysis of plant hormones based on LC-MS/MS, Hormone Metabolism and Signaling in Plants, 2017, 471-537. [134]. N. Bauer, D. Kolberg, K. Hacker, M. Wieland, A. Barth and M. Anastassiades, Ethephon - a Growth Regulator Detected in a Broad Range of Crops. Chemistres und Chemistry und Veterinäruntersuchungsamt Stuttgart, 2010, pesticides.eu/library/docs/srm/EPRW10_Cvuas_EthephonPM034.pdf. [135]. Regulation (EC) No 178/2002 of the European parliament and the council, Laying down the general principles and requirements of food law, establishing the European Food Safety Authority and laying down procedures in matters of food safety, The 28 january 2002. 2002R0178 - EN - 25.03.2008 - 003.001 – 1. https://eur- lex.europa.eu/LexUriServ/LexUriServ.do?uri=CONSLEG:2002R0178:2008 0325:EN:PDF. [136]. S. Y. Liu, Z. T. Zheng, F. L. Wei, Y. P. Ren, W. J. Gui, H. M. Wu and G. N. Zhu, Simultaneous determination of seven neonicotinoid pesticide residues in food by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58, 3271-3278. 126 [137]. CODEX (201۰). Codex alimentarius commission Pesticide residues in food and feed. [138]. L. Yuan and D. Q. Xu, Stimulatory Effect of Exogenous GA3 on Photosynthesis and the Level of Endogenous GA(l+3) in Soybean Leaf , Acta Photophysiologica Sinica, 2002, 28, 317-320. [139]. M. T. Sørensen, V. Danielsen, Effects of the plant growth regulator, chlormequat, on mammalian fertility, International Journal of Andrology, 2006, 29 (1), 129-33. [140]. N. Erin, B. Afacan, Y. Ersoy, F. Ercan, M. K. Balci, Gibberellic acid, a plant growth regulator, increases mast cell recruitment and alters Substance P levels, Toxicology, 2008, 254 (1 and 2), 75-81. [141]. A. T. Marília, D. D. S. Gezimar, R. F. Edson, B. William and M. Axel, Validate method for phytohormone quantification in plants, Frontiers in Plant Science, 2014, 5, Article 417. [142]. M. Matías, G. C. Aurelio and Vicent A., Rapid and reproducible determination of active gibberelins in citrus tissues by UPLC/ESI-MS/MS, Plant Physiology and Biochemistry, 2015, 94, 1-9. [143]. A. Akter, E. Ali, M. M. Z. Isalm, R. Karim, A. H. M. Razzaque, Effect of GA3 on growth and yield of mustard, International Journal of Sustainable Crop Production, 2007, 2 (2),16-20. [144]. S. Nitish, N. Nikita, S. Monika, S. Prashansha, R. Priyanka, K. P. Anand, A. H. Khan, A. K. Singh and R. K. Yadav, Effect of plant growth regulators on growth, biochemical changed and yield of mustard [Brassica juncea (L.) Czern & Coss.], Plant Archives, 2017, 17 (1), 33-38. [145]. P. Satya, S. Poonam, A. P. S. Kunwar, S. Vipul, S. Raghvendra, S. C. Vimal1 and K. S. Sagar, Effect of Plant Growth Regulators on Partially Aged Seeds of Spinach (Spinacea oleracea L.) Genotypes, International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences, 2017, 6 (11), 1327-1334. [146]. R. S. Taha, S. Vahid, R. Darioush, E. Mahdi, G. Javad and M. C. Roya, The effect of plant growth regulators, explants and cultivars on spinach (Spinacia oleracea L.) tissue culture, African Journal of Biotechnology, 2010, 9 (27), 4179-4185. [147]. D. Neocleous, I. Papadopoulos and C. Olympios, The effect of growth regulators on the growth and tissue nitrate content of lettuce plant (Lactuca sativa L.), Agricultural Research Institute – Ministry of Agriculture, Natural, Resources and the environment. neocleous.pdf 127 [148]. J. F. Harrington, The use of gibberellic acid to induce bolting and increase seed yield of tight-heading lettuce, Journal of the American Society for Horticultural Science, 1960, 75: 476-479. [149]. T. George, A. P. Spyridon, M. K. Ebrahim, Effect of GA3 and nitrogen on yield and marketability of lettuce (Lactuca sativa L.), Australian Journal of Crop Science, 2014, 8 (1), 127-132. [150]. T. Akter, Effect of gibberelic acid and spacing on growth and yield of lettuce (Lactuca sativa L.L. ), Master Thesis, Department of Horticulture, Sher-e- bangla agricultural university, Dhaka-1207, 2015. [151]. M. Alessandro, M. Alessandra, L. Sabatino and F. Vetrano, Effect of Gibberellic Acid on Growth, Yield, and Quality of Leaf Lettuce and Rocket Grown in a Floating System, Agronomy, 2019, 9, 382. [152]. C. Ismail, T. Yasin and I. Ismail, Evalution of toxicity of abcisic acid and gibberellic acid in rats: 50 days drinking water study, Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2007, 22 (2), 219-226. [153]. I. Celik and M. Kara, The effects of plant growth regulators on activity of eight serum enzymesin vitro, Journal of Environmental Science and Health - Part A: Environmental Science and Engineering and Toxicology, 1997, 32 (6), 1755-1761. 128 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 1. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH DƢ LƢỢNG CÁC CHẤT KÍCH THÍCH SINH TRƢỞNG THỰC VẬT TRONG RAU 1. Phạm vi áp dụng Phƣơng pháp này có thể áp dụng đối với các mẫu rau xanh, trái cây và các sản phẩm nông nghiệp 2. Nguyên tắc Tùy theo đối tƣợng phân tích mà xây dựng đƣờng chuẩn của các chất nghiên cứu trên chính các nền mẫu đó. 3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất 3.1 . Thiết bị - Thiết bị sắc ký lỏng Ultimate 30000 HPLC system, cột sắc ký: C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) và thiết bị phân tích khối phổ LCQ Fleet MS (Thermo Fisher Scientific, Germany). - Thiết bị sản xuất nƣớc deionized (Milli-Q Integral 3 Water Purification System (Merck Millipore, France). - Một số thiết bị khác: máy đồng nhất mẫu; máy ly tâm; máy votex; lò vi sóng; máy siêu âm; bộ cô mẫu bằng khí nitơ; cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g; cân kỹ thuật có độ chính xác 0,01 g. 3.2. Dụng cụ Kim tiêm mẫu Hamilton có dung tích 500 µL; tủ đông, tủ lạnh bảo quản mẫu; micropipete các loại điều chỉnh đƣợc thể tích: 10-1000 µL; pipet Pasteur; ống ly tâm có nắp kín Teflon 15 mL, 50 mL; lọ đựng mẫu có thể tích 1,8 mL, có màu nâu dùng cho tiêm mẫu vào hệ thống LC; bình định mức, cốc, ống đong, kéo, thìa, kẹp, nhíp. 3.3. Hóa chất Các chất chuẩn: IAA, IBA, ICA, IPA, GA3, GA4, GA7, BA, K, iP, iPR, tZ, tZR và DHZR (có độ tinh khiết ≥ 98%). MeOH, Formic acid, Dichloromethane và 2-propanol. 129 Chuẩn bị dung dịch chuẩn: - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc 1000 μg.mL-1: cân chính xác 10 mg mỗi chất chuẩn chất kích thích sinh trƣởng thực vật, sau đó hòa tan trong bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Các dung dịch chuẩn gốc đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ dƣới 0oC, có thể lƣu giữ và sử dụng trong thời gian 1 năm. - Chuẩn bị dung dịch trung gian 100 μg.mL-1: Lấy 1 mL dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1000 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật pha loãng trong bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể lƣu giữ và sử dụng trong 6 tháng. - Chuẩn bị dung dịch trung gian 20 μg.mL-1: Lấy 2 mL dung dịch chuẩn có nồng độ 100 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật pha loãng trong bình định mức 10 mL bằng dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic thêm đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể lƣu giữ và sử dụng trong 6 tháng. - Chuẩn bị dung dịch chuẩn hỗn hợp với nồng độ mỗi chất 1 μg.mL-1: Lấy 1 mL dung dịch chuẩn có nồng độ 20 μg.mL-1 của mỗi chất kích thích sinh trƣởng thực vật cho vào cùng một bình định mức có dung tích 20 mL, sau định bổ sung dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic đầy đến vạch tiêu chuẩn. Dung dịch đƣợc bảo quản ở điều kiện nhiệt độ từ 0-4oC, có thể lƣu giữ và sử dụng trong 6 tháng. - Dãy dung dịch chuẩn hỗn hợp của các chất kích thích sinh trƣởng thực vật làm việc gồm: 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 và 2000 ng.mL-1 đƣợc pha từ dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ mỗi chất 1 và μg.mL-1 trong dung môi MeOH có chứa 1% axít foocmic. Các dung dịch này chỉ pha khi cần sử dụng. 4. Thu thập mẫu Mẫu rau đƣợc thu thập theo Tiêu chuẩn ngành 10TCN 386:1999 về Phƣơng pháp lấy mẫu kiểm định chất lƣợng và dƣ lƣợng thuốc bảo vệ thực vật. 130 5. Cách tiến hành Hình 1.1. Quy trình tách chiết và phân tích các KTST trong mẫu rau đƣợc phát triển và tối ƣu hóa Bƣớc 1: Mẫu rau sau khi thu thập đƣợc đông cứng trong nitơ lỏng chuyển về phòng thí nghiệm và bảo quản trong tủ đông ở nhiệt độ dƣới 0oC cho đến khi phân tích. Bƣớc 2: Tiến hành nghiền nhỏ mẫu với khối lƣợng khoảng 1 kg, sau đó, cân chính xác một lƣợng 300 mg mẫu cho vào ống teflon 15 mL, có nắp vặn chặt. Bƣớc 3: Thêm 3 mL 2-propanol/H2O/HCl (2:1:0.002, v/v/v), đồng thời bổ sung 10 ng hỗn hợp chuẩn các chất kích thích sinh trƣởng thực vật, sau đó rung lắc mẫu với Bƣớc 5: Lắc mẫu và chiết siêu âm Bƣớc 1: Đông cứng mẫu trong nitơ lỏng Bƣớc 2: Nghiền nhỏ và cân 300 mg mẫu vào ống ly tâm Teflon 15 mL Bƣớc 3: Lắc mẫu và chiết siêu âm Bƣớc 7: Hút 1 mL dung dịch lớp dƣới Bƣớc 8: Phân tích trên HPLC-ESI-MS2 Bƣớc 6: Ly tâm mẫu Bƣớc 4: Ly tâm mẫu và hút dịch lớp trên Dịch trong suốt 4000 vòng.phút-1, ở 4oC Lắc 30 phút, ở 4oC. Siêu âm 5 phút Lắc 30 phút, ở 4oC. Siêu âm 5 phút Thêm 3 ml 2-propanol/H2O/HCl Thêm 6 mL Dichloromethane 4000 vòng.phút-1, ở 4oC Cô cạn bằng nitơ, hòa tan trong MeOH 131 tốc độ 100 vòng.phút-1 trong thời gian 30 phút, ở nhiệt độ 4oC. Tiến hành siêu âm mẫu trong thời gian 5 phút. Bƣớc 4: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 ở điều kiện nhiệt độ 4oC trong thời gian 5 phút. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1mL phần dung dịch trong suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm cho vào eppendorf đựng mẫu có thể tích 2 mL. Bƣớc 5: Thêm 6 mL dung dịch Dichloromethane và rung lắc mẫu trong thời gian 30 phút ở nhiệt độ 4oC, sau đó, tiếp tục chiết siêu âm trong thời gian 5 phút. Bƣớc 6: Thực hiện ly tâm mẫu với tốc độ 4000 vòng.phút-1 trong thời gian 5 phút, có hai lớp chất lỏng khác nhau đƣợc hình thành sau ly tâm và các mảnh vụn thực vật phân bố ở giữa hai lớp. Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch trong suốt ở lớp phía trên của ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào eppendorf đựng phần dung dịch hút ra ở bƣớc 4. Tiến hành xoáy mẫu trên máy Votex trong thời gian 5 phút để trộn lẫn hai phần dung dịch này với nhau. Sau đó, dùng micropipet hút 1 mL mẫu cho vào lọ đựng mẫu 1,5 mL để phân tích trên máy HPLC-ESI-MS2. Bƣớc 7: Dùng pipet Pastuer thủy tinh hút 1 mL phần dung dịch của lớp phía dƣới ống teflon thí nghiệm, sau đó cho vào lọ thủy tinh có dung tích 15 mL. Tiến hành cô cạn bằng dòng khí nitơ, hoà tan các chất sau cô cạn bằng 1 mL dung môi MeOH. Bƣớc 8: Thực hiện lọc mẫu qua màng lọc PTFE 0,22 µm trƣớc khi phân tích trên thiết bị HPLC-ESI-MS2.  Hàm lƣợng của các chất phân tích đƣợc xác định bằng tổng hàm lƣợng của các chất thu đƣợc ở các phân đoạn đƣợc thực hiện ở bƣớc 4, 6 và bƣớc 7. 6. Tính toán kết quả Hàm lƣợng chất kích thích sinh trƣởng thực vật trong các mẫu rau xanh đƣợc tính toán theo đƣờng ngoại chuẩn. Kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày dƣới dạng TB ± độ lệch chuẩn (SD). Trong đó, giá trị trung bình đƣợc tính theo các công thức sau: n aaa a n   ...21 Trong đó: a là trung bình cộng a1, a2,...., an là các giá trị xác định tƣơng ứng lần thứ 1, 2, ..., n. 132 n là số các số hạng Công thức tính giá trị trung vị: Me =   2 2 2 2         nn XX Trong đó: Me là số trung vị 2 nX là lƣợng biến đứng ở vị trí 2 n   2 2nX là lƣợng biến đứng ở vị trí   2 2n 7. Báo cáo kết quả Bản báo cáo kết quả gồm có các thông tin sau: 1) Thông tin về đối tƣợng mẫu thu thập 2) Phƣơng pháp phân tích 3) Kết quả phân tích mẫu 133 PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT CHẾ ĐỘ GRADIENT Gradient 1: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 10% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng dung môi 0,1 mL/phút. Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.1). Hình 2.1. Chu trình dung môi gradient 1 Hình 2.2. Sắc ký đồ của các chất KTST theo chế độ gradient 1 RT: 0.00 - 15.08 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Time (min) 0 1000 0 1000 2000 3000 0 1000 2000 3000 0 500 1000 1500 0 2000 4000 In te n s it y 0 1000 2000 0 10000 20000 0 10000 20000 5.79 5.89 5.69 4.51 4.40 4.56 5.24 6.00 6.12 6.73 7.70 8.18 11.5810.9710.00 10.49 12.433.931.37 8.55 9.28 13.761.01 12.82 14.492.561.750.40 2.82 5.79 7.09 7.70 8.18 11.5810.9710.00 10.49 12.438.55 9.28 13.7613.40 14.494.74 5.334.370.73 2.55 5.24 6.38 6.993.53 8.323.902.56 9.53 11.968.811.84 7.847.601.11 4.51 5.821.37 7.016.161.01 12.827.61 12.464.04 14.648.102.580.40 8.34 10.401.98 9.19 9.55 11.01 5.74 6.54 7.153.93 10.6610.309.697.39 14.904.17 11.028.721.75 5.38 12.729.212.24 13.0812.11 14.172.60 3.331.39 8.361.140.42 5.75 6.44 10.198.01 9.347.77 10.567.16 11.16 13.8312.868.98 13.2211.539.71 4.56 5.764.09 5.30 9.006.45 6.943.85 7.42 10.69 4.71 5.31 5.990.47 13.14 NL: 2.24E4 TIC MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH NL: 2.24E4 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 204.00@cid23.00 [135.50-136.50, 147.50-148.50, 165.50-166.50] MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH NL: 2.34E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 216.00@cid26.00 [147.50-148.50, 172.50-173.50, 187.50-188.50] MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH NL: 5.80E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 220.00@cid24.00 [135.50-136.50, 147.50-148.50, 201.50-202.50] MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH NL: 1.52E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 226.00@cid28.00 [90.50-91.50, 147.50-148.50, 208.50-209.50] MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH NL: 3.15E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 336.00@cid22.00 [135.50-136.50, 147.50-148.50, 203.50-204.50] MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH NL: 3.23E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 352.00@cid22.00 [135.50-136.50, 201.50-202.50, 219.50-220.50] MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH NL: 1.65E3 TIC F: ITMS + c ESI SRM ms2 354.00@cid22.00 [135.50-136.50, 221.50-222.50, 294.50-295.50] MS Positive-0,1mL-10-90%MeOH (Ion âm) (Ion dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 134 Nhận xét: Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,75-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA rửa giải chƣa hoàn toàn. Gradient 2: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 20% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng dung môi 0,1 mL/phút. Tổng thời gian 15 phút. Hình 3.3. Chu trình dung môi gradient 2 Hình 2.4. Sắc ký đồ của các chất KTST theo chế độ gradient 2 (Ion âm) (Ion dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 135 Nhận xét: Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,42-6,96 phút. Tuy nhiên, hợp chất IPA vẫn chƣa rửa giải hoàn toàn. Gradient 3: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng dung môi 0,1 mL/phút. Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.5). Hình 2.5. Chu trình dung môi gradient 3 Hình 2.6. Sắc ký đồ của các chất PGR theo chế độ gradient 3 (Ion âm) (Ion dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 136 Nhận xét: Tín hiệu của các chất phân tích rõ ràng, với thời gian rửa giải dao động trong khoảng: 3,07-6,31 phút. Tất cả các hợp chất phân tích đƣợc rửa giải hoàn toàn và các píc gọn, sắc nét, cân đối, rõ ràng, độ rộng chân píc khoảng 0,2-0,5 phút. Gradient 4: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng dung môi 0,3 mL/phút. Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.7). Hình 2.7. Chu trình dung môi gradient 4 Hình 2.8. Sắc ký đồ của các chất KTST theo chế độ gradient 4 (Ion âm (Ion dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 137 Nhận xét: Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng có tín hiệu píc sắc ký đƣợc rửa giải sớm hơn so với tốc độ dòng 0,1 mL/phút với thời gian lƣu khoảng 1,5 phút. Gradient 5: Từ khi bắt đầu đến 2 phút 30% MeOH, sau đó từ 2 đến 10 phút tăng lên 90% MeOH, giữ 90% MeOH trong 3 phút rồi đƣa về điều kiện ban đầu trong 0,5 phút và duy trì cho hết chu trình gradient. Tốc độ dòng dung môi 0,5 mL/phút. Tổng thời gian 15 phút (Hình 3.9). Hình 2.9. Chu trình dung môi gradient 5 Hình 2.10. Sắc ký đồ của các chất PGR theo chế độ gradient 5 (Ion âm) (Ion dƣơng) ICA IAA IPA IBA GA7 GA4 GA3 iP K tZ BA iPR tZR DHZR 138 Nhận xét: Các chất phân tích theo chế độ ion âm không xuất hiện tín hiệu trên sắc ký đồ. Các chất phân tích theo chế độ ion dƣơng đƣợc phát hiện ở thời gian lƣu từ 0,8 đến 1,2 phút; sớm hơn so với các điều kiện gradient ở trên. 139 PHỤ LỤC 3. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH ĐỐI CHỨNG Ở CÁC PTN 144 PHỤ LỤC 4. ĐƢỜNG CHUẨN CỦA GA3 TRÊN CÁC NỀN MẪU RAU THÍ NGHIỆM Hình 4.1. Đƣờng chuẩn của GA3 trên các nền mẫu rau thí nghiệm 145 PHỤ LỤC 5. MỘT SỐ HÌNH ẢNH TRONG NGHIÊN CỨU Hệ thống sắc ký lỏng HPLC-ESI-MS Máy ly tâm Cột C18 Hypersil GOLD aQ (3 µm, 150 x 2.1 mm) Cột Purospher ® RP-18 endcapped (5 µm, 250 x 4,6 mm) Bộ cô mẫu bằng nitơ Máy lọc nƣớc siêu sạch Micropipette đơn kênh Cân phân tích Hình 5.1. Một số thiết bị và dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 146 Hình 5.2. Một số hình ảnh bố trí thí nghiệm 147 Hình 5.3. Một số hình ảnh khảo sát và thu thập mẫu