Luận án Phân tích Auramine O, Sudan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu Nanosilica để xử lý mẫu

g 3.17. Hình 3.15: Sắc đồ của MI1 khi pha loãng 3 lần dịch chiết gốc. Bảng 3.17: Kết quả phân tích mẫu MI1 theo phương pháp đường chuẩn MI1 RT (phút) Speak đo được (Au.ms) Speak trung bình (Au.ms) RSD% Hệ số pha loãng dịch chiết : 3 lần 3,889 2047 2091,33 1,862 3,796 2120 3,823 2107 Hàm lượng AO trong mẫu khô ban đầu (mg/kg) Phương trình hồi quy: Speak = (103,05 ± 0,96).CAO; sr = 39,89 Kết quả đạt được giới hạn của độ không đảm bảo đo trong phép định lượng AO nên kết luận kết quả phân tích mẫu MI1 là (2,12±0,07) µg/g là chính xác. Hình ảnh một số mẫu phân tích măng, miến, dưa chua và sắc ký đồ các mẫu thực được trình bày trong các hình từ Hình 3.16 đến Hình 3.20. a. MI2 b. MAK8 c. MA5 d. MD2 Hình 3.16: Ảnh một số mẫu thực phẩm phân tích AO Hình 3.17: Sắc ký đồ MA1 của dịch chiết gốc pha loãng 10 lần. Hình 3.18: Sắc ký đồ MA2 của dịch chiết gốc pha loãng 2 lần. Hình 3.19: Sắc ký đồ MA6 của dịch chiết gốc. Hình 3.29: Sắc ký đồ MA6 khi thêm chuẩn AO 90 µg/L. Nhận xét các sắc ký đồ mẫu thực: Thời gian lưu AO của các mẫu thực tương đối ổn định (từ 3,74 phút đến 3,83 phút). Hàm lượng AO trong mẫu MA1 được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn, do nếu cô đặc dịch chiết đường nền khá nhiễu và ảnh hưởng đến độ chính các của phương pháp định lượng. Đối với sắc kí đồ MA6 dịch chiết gốc (Hình 3.19), có một đỉnh peak xuất hiện tại thời gian lưu 3,56 phút, tuy nhiên đây không phải peak của AO, thể hiện rằng khi thêm chuẩn AO 90 µg/L, peak của AO xuất hiện sau peak này (tại thời gian lưu 3,97 phút) (Hình 3.20). Như vậy thành phần các chất trong mẫu thực có ảnh hưởng đến thời gian lưu của chất định phân dù trong cùng một điều kiện phân tích HPLC. Các kết quả phân tích hàm lượng AO trong các mẫu thực được trình bày trong Bảng 3.18 và các kết quả của mẫu có chứa AO đều nằm trong giới hạn cho phép của độ không đảm bảo đo trong phép định lượng AO nên kết luận các kết quả đo mẫu thực là chính xác. Bảng 3.18: Hàm lượng AO trong các mẫu măng, miến, dưa chua STT Mẫu Hàm lượng AO trong mẫu khô (µg/g) STT Mẫu Hàm lượng AO trong mẫu khô (µg/g) 1 MA1 12,50 ± 0,20 8 MAK8 ND 2 MA2 0,80 ± 0,02 9 MI1 2,10 ± 0,07 3 MA3 1,70 ± 0,04 10 MI2 1,10 ± 0,05 4 MA4 ND ND : Không phát hiện AO trong mẫu 11 MI3 ND 5 MA5 ND 12 MD1 ND 6 MA6 ND 13 MD2 ND 7 MAK7 ND Các mẫu măng chua có màu vàng sáng và mùi hơi hắc có phát hiện AO, các mẫu măng khô đều không phát hiện AO. Đối với 2 mẫu miến có màu vàng đều phát hiện AO. Các mẫu dưa chua đều không phát hiện AO dù đã làm giàu mẫu hoặc phân tích theo phương pháp đường thêm chuẩn. Dựa vào các đặc điểm cảm quan này, người tiêu dùng có thể bước đầu lựa chọn thực phẩm ít có nguy cơ nhuộm chất màu tổng hợp độc hại (hình ảnh xem tại phụ lục 6). 3.5.2. Các mẫu phấn hoa, cá khô, mì tôm Mẫu phấn hoa PH1 được tự thu tại khu Trại Ong – Mai Sơn – Sơn La, là mẫu được thu hoàn toàn tự nhiên. Sấy khô bằng máy sấy ở 60°C trong 3 ngày. Sử dụng các điều kiện chiết tách và phân tích AO bằng HPLC tối ưu được nghiên cứu ở mục 3.1 và 3.2, tiến hành chiết mẫu phấn hoa PH1 đã được thêm một lượng AO chuẩn. Dịch chiết ban đầu sau đó được chia làm 2 phần bằng nhau: Hình 3.21: Dung dịch phân tích mẫu phấn hoa PH1. A: Dung dịch sau chiết, B: pha loãng 1 phần dung dịch A với PĐ4 H: Hấp phụ một phần dung dịch A bằng RHNS, C: dung dịch giải hấp phụ của H + Phần 1 đem pha loãng 2 lần bằng dung dịch đệm phosphate (pH = 3,0; thêm 0,2% triethylamine) : ACN tỉ lệ v/v = 65:35 (PĐ4) được dung dịch B (Hình 3.21), dung dịch B thu được bị vẩn đục, tiến hành quay ly tâm và lọc, phân tích HPLC không xuất hiện peak AO- đường sắc đồ rất nhiễu không mịn (Hình 3.22). Hình 3.22: Sắc ký đồ mẫu phấn hoa PH1 khi phân tích dung dịch B. + Phần 2 đem hấp phụ bằng RHNS theo các điều kiện tối ưu nghiên cứu ở mục 3.3, giải hấp 3 lần bằng PĐ4 thu được dung dịch C (Hình 3.21). Kết quả phân tích dịch chiết C bằng HPLC theo Bảng 3.4 cho thấy hiệu suất chiết – hấp phụ AO trung bình là 60,53% (n=4, SD=0,3572). Sắc ký đồ phân tích mẫu PH1 và mẫu PH1 thêm chuẩn AO 100 µg/L được trình bày trong Hình 3.23, đỉnh hấp phụ AO tại thời gian lưu RT = 3,824 phút. Dịch sau hấp phụ khi phân tích HPLC cho sắc ký đồ rõ nét, đường nền ít nhiễu, chứng tỏ có thể sử dụng nanosilica RHNS để hấp phụ AO trong dịch chiết mẫu thực phẩm. Hình 3.23: Sắc ký đồ phân tích PH1 gốc và PH1 khi thêm chuẩn AO 100 µg/L. Thực hiện quy trình chiết – hấp phụ - phân tích HPLC các mẫu phấn hoa khác tương tự như mẫu PH1, thu được các sắc đồ như Hình 3.24 và Hình 3.25. Các kết quả phân tích sau khi xử lý số liệu được trình bày trong Bảng 3.16. Hình 3.24: Sắc ký đồ mẫu PH3 gốc (có hấp phụ bằng RHNS). Hình 3.25: Sắc đồ mẫu PH3 gốc và thêm chuẩn. Kết quả phân tích trên sắc ký đồ (Hình 3.24) của mẫu PH3 gốc bằng HPLC xuất hiện 1 peak ở thời gian lưu 3,758 phút, tuy nhiên peak rất tù, có thể giả thiết có sự xen phủ peak, trong đó có một peak của AO, các peak còn lại có thể là một muối có công thức cấu tạo tương tự AO. Việc xác định hàm lượng AO trong mẫu PH3 mang tính chất tương đối với giả thiết peak tại vị trí trên là của AO, sử dụng phương pháp đường thêm chuẩn, đo lặp lại 3 lần (Hình 3.25), cho kết quả tính toán hàm lượng AO trong mẫu PH3 là 0,82 ± 0,19 (µg/g) theo Bảng 3.19. Bảng 3.19: Kết quả phân tích mẫu PH3 theo phương pháp đường thêm chuẩn. - Khối lượng mẫu: 0,0263 gam - Thể tích dung môi chiết 10,0 mL - Hệ số cô đặc dịch chiết: 10 lần Đường thêm chuẩn mẫu PH3 Hàm lượng AO trong mẫu PH3 khô ban đầu (µg/g) Phương trình đường thêm chuẩn Speak = (73,98 ± 4,66).CAO + (1606,70 ± 289,63); sy = 120,79 Tiến hành phân tích với quy trình trên đối với các mẫu cá khô, phấn hoa, mì tôm. Kết quả phân tích được trình bày trong Bảng 3.20. Bảng 3.20: Kết quả phân tích hàm lượng AO trong các mẫu mì tôm, phấn hoa, cá khô. Stt Mẫu Hàm lượng AO trong mẫu khô (µg/g) Stt Mẫu Hàm lượng AO trong mẫu khô (µg/g) 1 PH1 ND ND : Không phát hiện. 6 CK3 ND 2 PH2 ND 7 MT1 ND 3 PH3 0,82 ± 0,19 8 MT2 ND 4 CK1 ND 9 MT3 ND 5 CK2 ND Kết quả phân tích cho thấy hầu hết các mẫu phấn hoa, cá khô và mì tôm được phân tích không phát hiện chứa Auramine O. Chỉ có 1 mẫu PH3 chứa AO với hàm lượng thấp, tuy nhiên về mặt cảm quan không có sự khác nhau giữa các mẫu phấn hoa có chứa/không chứa AO. 3-B – ĐỐI VỚI HỖN HỢP SUDAN I VÀ SUDAN II 3.6. Điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan bằng HPLC 3.6.1. Bước sóng Kết quả đo độ hấp thụ quang phụ thuộc bước sóng đối với các dung dịch Sudan I, Sudan II và hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong dung môi hỗn hợp methanol, nước và acetonitril theo tỉ lệ v/v MeOH:H2O:ACN = 77:3:20 (PĐ5) được trình bày trên Hình 3.26. Bước sóng hấp thụ cực đại của Sudan I, Sudan II là khá gần nhau. Bước sóng tối ưu cho phép đo hỗn hợp Sudan I và Sudan II bằng HPLC được lựa chọn là 490 nm. A. Sudan I (λmax=483nm) B. Sudan II (λmax=496nm) C. hỗn hợp Sudan I và Sudan II Hình 3.26: Phổ hấp thụ của dung dịch các Sudan. 3.6.2. Thành phần pha động Kết quả khảo sát sắc ký đồ hỗn hợp Sudan I và Sudan II khi phân tích HPLC với các pha động khác nhau được trình bày trong Bảng 3.21. Có thể nhận thấy các pha động PĐ3-S và PĐ5-S cho peak Sudan I và Sudan II là rõ ràng và có sự phân tách các peak tốt. Tuy nhiên, khi tiến hành phân tích HPLC sử dụng pha động PĐ3-S có các nhược điểm: diện tích peak của Sudan II nhỏ, đường nền sắc ký đồ khá nhiễu, độ lặp lại của peak kém. Khi sử dụng pha động PĐ5-S, tín hiệu 2 peak của Sudan I và Sudan II là rõ, và đường nền ít nhiễu hơn. Thời gian lưu đối với Sudan I: khoảng 3,3 phút, Sudan II: khoảng 4,7 phút là tương đối phù hợp đối với phương pháp sắc ký. Vì vậy, pha động PĐ5-S sẽ tiếp tục được nghiên cứu để lựa chọn tỉ lệ dung môi pha động tối ưu cho phép phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trên hệ thống HPLC. Bảng 3.21: Sắc ký đồ hỗn hợp Sudan với thành phần pha động khác nhau. Thành phần pha động Hình dáng peak, đặc trưng (PĐ1-S) MeOH:HCOOH 0,2% (v/v=90:10) 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min -1 0 1 AU 490nm,4nm (1.00) (PĐ2-S) MeOH : H2O (v/v=85:15 trong 10 phút, sau đó 100% MeOH) 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 min -2.5 0.0 2.5 5.0 AU 490nm,4nm (1.00) (PĐ3-S) ACN : CH3COOH 1% (v/v =85:15) (PĐ4-S) ACN : H2O, gradient 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min -0.25 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 AU 490nm,0nm (1.00) 3.335/3420 4.663/4061 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 min -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 AU 490nm4nm (1.00) (PĐ5-S) MeOH : H2O : ACN (v/v/v=65:15:20) 3.6.3. Tỉ lệ thành phần pha động Kết quả khảo sát tỉ lệ thành phần của pha động khi tiến hành phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II có cùng nồng độ 0,05 mg/L trong pha động PĐ5-S được trình bày trong Bảng 3.22. Bảng 3.22: Các tham số của các peak Sudan I và Sudan II trong PĐ5-S. Tỉ lệ MeOH :H2O: ACN (v/v/v) RT trung bình (n=3) Hệ số đối xứng AF Hệ số phân giải RS Sudan I Sudan II Sudan I Sudan II 65:15:20 3,335 4,663 1,312 1,452 3,762 70:10:20 3,336 4,676 1,167 1,222 4,011 77:3:20 3,339 4,683 0,963 0,925 5,183 Qua việc đánh giá các tham số của các peak trên sắc ký đồ đối với thành phần pha động, tỉ lệ thể tích của pha động MeOH:H2O:ACN là 77:3:20 cho các peak cân đối (hệ số AF xấp xỉ bằng 1,0), hệ số phân giải cao (RS = 5,183) và thời gian phân tích phù hợp, thời gian lưu trung bình của chất hấp phụ trên pha tĩnh tốt hơn là Sudan II với RT= 4,683 phút. Vì vậy, PĐ5 với tỉ lệ thể tích MeOH : H2O : ACN là 77:3:20 được lựa chọn cho các phép phân tích sau này đối với hỗn hợp Sudan I và Sudan II. 3.6.4. Tốc độ pha động Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ pha động đến phép phân tích hỗn hợp Sudan I, Sudan II có cùng nồng độ 50 µg/L, với PĐ5 ở nhiệt độ 40°C, thể tích mẫu là 20 µL với các tốc độ pha động khác nhau. Kết quả cho thấy tốc độ pha động có ảnh hưởng đến sự xuất hiện 2 peak của Sudan I và Sudan II. Sự ảnh hưởng theo quy luật: tốc độ pha động tăng thì peak các chất xuất hiện sớm hơn (thời gian lưu ngắn hơn) và ngược lại. Tuy nhiên, tốc độ pha động được chọn là 1,0 mL/phút phù hợp để đạt được các yêu cầu: Thời gian phân tích một mẫu vừa phải (khoảng 6 phút), peak Sudan I xuất hiện xa thời gian chết (thời gian lưu của cột – cách khoảng 1,6 phút) (Hình 3.27). Hình 3.27: Sắc ký đồ phân tích dung dịch hỗn hợp chuẩn các Sudan. Qua các nghiên cứu, các điều kiện tối ưu cho quy trình phân tích được trình bày trong Bảng 3.23. Bảng 3.23: Các điều kiện tối ưu phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II bằng phương pháp HPLC. Điều kiện phân tích Giá trị Loại cột C18-RP (150 mm × 4,6 mm, 100Å, 5 µm) - Waters Nhiệt độ cột 40°C Thể tích tiêm mẫu 20 µL Bước sóng 490 nm Pha động MeOH :H2O: ACN (77:3:20 v/v/v) Tốc độ pha động 1,0 mL/phút 3.6.5. Khoảng tuyến tính, đường chuẩn, LOD và LOQ Kết quả nghiên cứu sự phụ thuộc tuyến tính của diện tích các peak vào nồng độ của Sudan I và Sudan II là khá rộng: từ 2 µg/L đến 10000µg/L (với Sudan I) và từ 5 µg/L đến 10000 µg/L (với Sudan II). Tuy nhiên, hàm lượng của Sudan I và Sudan II trong các mẫu phân tích thường không lớn, vì vậy đường chuẩn mô tả sự phụ thuộc của diện tích peak vào nồng độ của Sudan I và Sudan II được xây dựng trong khoảng từ 10 µg/L đến 100 µg/L. Các kết quả xây dựng đường chuẩn trên mẫu chuẩn được trình bày trong Bảng 3.24, và các Hình 3.28, Hình 3.29. Bảng 3.24: Số liệu đường chuẩn và LOD, LOQ của hỗn hơp 2 Sudan chuẩn. Chất phân tích Khoảng tuyến tính (µg/L) Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan R2 LOD (µg/L) LOQ (µg/L) Sudan I 2 ÷ 10000 S = (69,50 ± 0,32).C 0,9991 2,73 9,11 Sudan II 5 ÷ 10000 S = (76,03 ± 0,39).C 0,9991 2,99 9,96 Hình 3.28: Sắc ký đồ hỗn hợp Sudan I và Sudan II theo nồng độ. Hình 3.29: Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ Sudan. Tuy nhiên, tín hiệu đo ngoài phụ thuộc nồng độ chất phân tích có thể còn phụ thuộc vào nền mẫu phân tích. Vì vậy, sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ các Sudan được thêm vào trên nền mẫu trắng đã được nghiên cứu. Kết quả nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.25 và Hình 3.30. Bảng 3.25: Số liệu đường chuẩn và MDL, MQL trên nền mẫu trắng. Chất phân tích Khoảng tuyến tính (µg/L ) Phương trình đường chuẩn Hệ số tương quan R2 MDL (µg/g) MQL (µg/g) Sudan I 2÷10000 S= (69,17 ± 0,59).C 0,9994 0,0022 0,0074 Sudan II 5÷10000 S= (75,70 ± 0,37).C 0,9991 0,0029 0,0096 Hình 3.30: Đường chuẩn các Sudan trên nền mẫu trắng. Kết quả thu được cho thấy độ dốc (hệ số hồi quy a) của đường chuẩn trên nền mẫu chuẩn so với đường chuẩn trên nền mẫu trắng chênh lệch nhau 0,48% là nhỏ. Điều này chứng tỏ có thể coi ảnh hưởng của nền mẫu đến phép phân tích hàm lượng Sudan I và Sudan II bằng phương pháp HPLC sử dụng pha động PĐ5 là không đáng kể. So sánh với số liệu LOD, LOQ của các công trình đưa ra trong Bảng 1.5 có thể thấy giới giạn phát hiện Sudan I của phương pháp tương đương với kết quả nghiên cứu của tác giả Bùi Thị Ngoan và cộng sự [9], nhỏ hơn 2,5 lần so với kết quả nghiên cứu của tác giả Ping Qi và cộng sự [54]. 3.7. Điều kiện chiết hỗn hợp Sudan I và Sudan II tối ưu từ mẫu thực phẩm Tương tự như khi khảo sát phương pháp chiết rung siêu âm và rung lắc thường khi chiết AO, việc khảo sát chiết Sudan I và Sudan II trong mẫu MTB được tiến hành như sau: Sử dụng 10,0 mL dung môi chiết là ethanol 100% trong cùng thời gian chiết 120 phút ở nhiệt độ 60°C; Lượng mẫu MTB sử dụng để chiết xấp xỉ 0,1 gam. Kết quả cho thấy, khi chiết rung siêu âm cho hiệu suất chiết cao hơn hẳn khi chiết rung lắc thường : - Khi chiết rung siêu âm hiệu suất chiết trung bình là 97,5% (với Sudan I) và 92,8% (với Sudan II). - Khi chiết rung lắc thường hiệu suất chiết trung bình là 65,7% (với Sudan I) và 59,3% (với Sudan II). Vì vậy, trong các nghiên cứu tiếp theo, phương pháp chiết rung siêu âm được sử dụng để chiết các Sudan trong các mẫu phân tích. 3.7.1. Dung môi chiết Để lựa chọn dung môi chiết các Sudan trong mẫu, lượng mẫu MTB sử dụng cho phép chiết rung siêu âm bằng các dung môi khác nhau được lấy khoảng 0,1 gam, hiệu suất chiết của các dung môi được trình bảy trong Bảng 3.26. Bảng 3.26: Hiệu suất chiết hỗn hợp Sudan phụ thuộc dung môi. Dung môi chiết Khối lượng mẫu trung bình (gam) Hiệu suất chiết trung bình Sudan I (%) Hiệu suất chiết trung bình Sudan II (%) EtOH 0,1139 97,26 93,79 MeOH 0,1153 93,24 90,63 ACN 0,1208 86,28 74,51 Có thể thấy hiệu suất chiết hỗn hợp Sudan bằng ethanol là rất cao, cùng với tính chất ít độc hơn của nó trong 3 loại dung môi được nghiên cứu là lí do EtOH tuyệt đối được lựa chọn làm dung môi chiết tách Sudan I và Sudan II từ các mẫu phân tích. 3.7.2. Nhiệt độ chiết, thời gian chiết và số lần chiết Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chiết đến hiệu suất chiết Sudan trong các mẫu phân tích được trình bày trong Bảng 3.27. Bảng 3.27: Hiệu suất chiết các Sudan phụ thuộc nhiệt độ và thời gian chiết. Stt mẫu (gam) Thời gian chiết (phút) Nhiệt độ chiết (°C) H% Sudan I RSD (%) H% Sudan II RSD (%) 1 0,1272 10 60 47,62 7,14 46,53 5,83 2 0,1201 30 60 60,84 3,22 50,05 3,76 3 0,1209 60 60 74,25 4,77 63,73 3,83 4 0,1216 120 50 93,22 2,28 93,84 3,63 5 0,1138 120 60 97,88 1,76 93,33 2,53 6 0,1115 120 70 94,18 4,16 89,17 5,78 7 0,0959 200 60 97,75 2,33 94,63 4,76 Kết quả khảo sát cho thấy với nhiệt độ chiết duy trì ở 60°C cho hiệu suất chiết cao nhất (hiệu suất chiết trung bình 3 lần chiết của Sudan I là 97,88% với RSD% = 1,76%, của Sudan II là 93,33% với RSD% = 2,53%). Còn khi tăng thời gian chiết vượt quá 120 phút thì hiệu suất chiết cải thiện không đáng kể. Vì vậy, để tiết kiệm thời gian phân tích, thời gian chiết được lựa chọn là 120 phút ở nhiệt độ 60°C . Khi sử dụng tổng thể tích dung môi chiết EtOH là 10,0 mL với số lần chiết khác nhau, kết quả khảo sát được trình bày trên Hình 3.31. Hình 3.31: Hiệu suất chiết các Sudan phụ thuộc số lần chiết. Kết quả khảo sát cho thấy với số lần chiết là 2 lần và 3 lần thì hiệu suất chiết gần như tăng không đáng kể (tăng trung bình 0,86% với Sudan I và 1,14% với Sudan II), điều này có thể do nguyên nhân quá trình chia nhỏ thể tích chiết dẫn đến số các thao tác nhiều hơn dễ gây mất chất trong quá trình thí nghiệm. Vì vậy để quá trình thí nghiệm đơn giản hơn vẫn đảm bảo hiệu suất chiết cao, số lần chiết tối ưu được chọn là 2 lần, mỗi lần 5 mL EtOH. 3.7.3. Tỉ lệ mẫu và dung môi Ảnh hưởng của lượng mẫu khi sử dụng 10,0 mL dung môi EtOH để chiết các Sudan trong các mẫu phân tích được trình bày trong Bảng 3.28. Bảng 3.28: Hiệu suất chiết các Sudan theo tỉ lệ mẫu và dung môi. Khối lượng mẫu MTB trung bình (gam) Hệ số pha loãng Hiệu suất chiết trung bình (%) RSD% (n=3) Sudan I Sudan II Sudan I Sudan II 1,0712 5000 79,57 76,22 1,60 1,63 0,1138 500 97,88 93,33 1,76 2,53 0,0205 100 98,01 94,74 1,02 1,45 Khi khối lượng mẫu dao động trong khoảng từ 0,0200 gam đến 0,1000 gam thì hiệu suất chiết đều đạt trên 90% (sự sai khác hiệu suất trong khoảng này là dưới 1%). Vì vậy, để tránh sai số khi sử dụng lượng mẫu quá nhỏ, lượng mẫu phân tích có thể được chiết bằng 10,0 mL dung môi là được sử dụng là khoảng 0,1000 gam. 3.8. Các điều kiện tối ưu hấp phụ hỗn hợp Sudan trên nanosilica 3.8.1. Ảnh hưởng của lực ion của dung dịch hấp phụ Trong quá trình chiết các mẫu thực, dung dịch chiết thu được có thể chứa các chất ảnh hưởng đến phép phân tích bằng HPLC. Vì vậy, một số dung dịch chiết cần sử dụng chất hấp phụ để tách các Sudan ra khỏi các chất ảnh hưởng. Ở đây, vật liệu nanosilica chế tạo từ vỏ trấu (RHNS) được nghiên cứu và sử dụng. Trong đó cần nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường ion và lực ion đến khả năng hấp phụ của Sudan trên RHNS. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lực ion trong dung dịch hấp phụ được duy trì bằng muối trơ KCl được trình bày trong Hình 3.32. Khi nồng độ KCl được tăng lên 100 lần từ 0,01 mM đến 1,00 mM, hiệu suất hấp phụ trung bình đối với chất màu Sudan tăng từ 78,08% lên 90,97%. Tuy nhiên, khi nồng độ KCl cũng được tăng lên 100 lần từ 1,0 mM đến 100,0 mM, hiệu suất hấp phụ đối với chất màu Sudan giảm từ 90,97% xuống 82,97%. Hình 3.32: Ảnh hưởng của lực ion đến hiệu suất hấp phụ các Sudan. Sự hấp phụ của chất màu giảm là do ion K+ trung hòa một phần điện tích bề mặt âm của RHNS, dẫn đến giảm lực hút giữa bề mặt chất hấp phụ mang điện tích âm và các phân tử chất màu. Khi nồng độ KCl nhỏ hơn 1,0 mM, hiệu suất hấp phụ giảm xuống còn 72,85%. Trong trường hợp không có KCl, độ hấp phụ và độ lặp lại kém. Do đó, KCl 1,0 mM được chọn làm điều kiện tối ưu để nghiên cứu sự hấp phụ của Sudan I và Sudan II lên RHNS. 3.8.2. Ảnh hưởng của pH Độ pH của dung dịch cũng ảnh hưởng đến điện tích bề mặt của nanosilica và sự phân ly của chất màu Sudan. Hiệu suất hấp phụ các chất Sudan lên vật liệu RHNS trong khoảng pH = 2 đến pH = 6 được thể hiện trên Hình 3.33. Hình 3.33: Hiệu suất hấp phụ các Sudan khi thay đổi pH của dung dịch. Kết quả cho thấy tại pH = 3 hiệu suất hấp phụ Sudan của RHNS là tốt nhất. Có thể ở trong dung dịch có giá trị pH cao hơn 3, bề mặt của silica sẽ dần chuyển sang tích điện âm [20], và dạng azo của Sudan cũng được chuyển thành dạng anion tích điện âm [35], điều này làm giảm đáng kể lực hút tĩnh điện giữa RHNS và chất màu. Trong khi, ở vùng pH thấp hơn, bề mặt của RHNS trở nên tích điện dương [20], và chất màu Sudan ở dạng trung hòa, tuy nhiên, nguyên tử N trong nhóm azo ở vị trí 1 trong phân tử Sudan hoạt động như một chất nhận liên kết hydro ở dạng hydrazone, tạo ra các liên kết hydro giữa các phân tử [35]. Ở dạng hydrazone, mật độ electron tập trung cao xung quanh nguyên tử oxy. Điều này làm tăng tương tác van der Waals của chất màu với nanosilica (ở dạng ), do đó làm tăng hiệu quả hấp phụ. Điều này lý giải hiệu suất hấp phụ cao hơn hẳn ở vùng pH=2, pH=3. Ở pH=3, nanosilica và chất màu Sudan gần như trung hòa, vì vậy các tương tác không tĩnh điện như tương tác hydro hoặc tương tác kỵ nước đóng một vai trò quan trọng. pH = 3 là giá trị pH tối ưu được lựa chọn cho quá trình hấp phụ của chất màu Sudan trên RHNS do hiệu suất hấp phụ tại đó là cao nhất. Các chuyển dịch cân bằng của RHNS và Sudan được mô tả cụ thể hơn trong các cân bằng sau: Theo Ahmed M.N và Ram R.N [20]: Theo Umran Seven Erdemir và cộng sự [35]: 3.8.3. Thời gian cân bằng hấp phụ và ảnh hưởng của nồng độ đầu Nghiên cứu thời gian cân bằng hấp phụ của RHNS đối với các dung dịch Sudan có nồng độ ban đầu là 50 µg/L, 1000 µg/L và 10000 µg/L hấp phụ trên RHNS với thời gian hấp phụ từ 10 đến 120 phút. Kết quả hiệu suất hấp phụ được trình bày trên Hình 3.34 cho thấy, ở các giá trị nồng độ ban đầu khác nhau, thời gian hấp phụ tối ưu được lựa chọn là 120 phút. Kết quả cũng cho thấy: chọn thời gian hấp phụ cho các thí nghiệm khác là 120 phút, khi nồng độ chất hấp phụ vượt quá 1000 µg/L, hiệu suất hấp thụ chất màu Sudan bị giảm. Do đó, chúng tôi chọn khảo sát sự hấp phụ chất màu với nồng độ các Sudan nhỏ hơn 1000 µg/L. Hình 3.34: Hiệu suất hấp phụ theo nồng độ đầu các Sudan. 3.8.4. Đường hấp phụ đẳng nhiệt Các đường đẳng nhiệt hấp phụ Langmuir của từng chất màu (Hình 3.35) đã được xây dựng. Nồng độ ban đầu của Sudan I và II cùng được duy trì trong khoảng 30 µg/L đến 5000 µg/L, thời gian cân bằng hấp phụ là 120 phút, dung dịch hấp phụ có pH = 3, và nồng độ KCl là 1,0 mM. Hệ số tương quan (R2) mô tả sự phù hợp tuyến tính của đường đẳng nhiệt hấp phụ lớn hơn 0,99 cho thấy rằng các chất màu được hấp phụ bởi RHNS theo nguyên lý hấp phụ vật lý đơn lớp và các tâm hấp phụ trên bề mặt là đồng nhất. Dung lượng hấp phụ tối đa (qm) và hằng số hấp phụ (KL) đối với Sudan I lần lượt là 0,619 mg/g và 2,132 và của Sudan II lần lượt là 0,699 mg/g và 1,573. Hình 3.35: Đường đẳng nhiệt Langmuir của các Sudan. 3.8.5. Điều kiện rửa giải hỗn hợp Sudan tối ưu Kết quả khảo sát thời gian rửa giải và số lần rửa giải tối ưu đối với hỗn hợp chất Sudan I và Sudan II được trình bày trong hình 3.36 và hình 3.37. Theo đó, thời gian rửa giải gấp 3 lần (từ 10 phút lên 30 phút) hầu như không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thu hồi. Để tiết kiệm thời gian phân tích, chọn thời gian rửa giải 10 phút cho mỗi mẫu sau khi hấp phụ hỗn hợp Sudan lên RHNS. Hình 3.36: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo thời gian rửa giải Theo hình 3.37, số lần rửa giải có ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi các Sudan. Cụ thể, hiệu suất thu hồi tăng 2,51% khi rửa giải 3 lần so với rửa giải 1 lần (với Sudan I), tăng 2,74% khi rửa giải 3 lần so với rửa giải 1 lần (với Sudan II). Như vậy chọn số lần rửa giải là 3 (p3) với thể tích dung môi rửa giải lần lượt là 4ml, 3ml, 3ml, mỗi lần rửa giải 10 phút. Hình 3.37: Hiệu suất thu hồi các Sudan theo số lần rửa giải 3.9. Độ không đảm bảo đo của phương pháp phân tích hỗn hợp Sudan Các số liệu thực nghiệm phân tích các mẫu MBB4 để khảo sát độ không đảm bảo đo của quá trình chiết – hấp phụ - giải hấp Sudan I, Sudan II được trình bày trong bảng 3.29. Độ không đảm bảo đo Sudan I của phương pháp: UR%=tα,f . RSDR %= t0,05;19. RSDR %=1,73.3,62=6,26%. Độ không đảm bảo đo Sudan II của phương pháp: UR%=tα,f . RSDR %= t0,05;19. RSDR %=1,73.4,53=7,84%. Như vậy ở hàm lượng Sudan I và Sudan II từ 10÷100 µg/L thì độ không đảm bảo đo của quy trình chiết – hấp phụ - giải hấp lần lượt là 6,26% và 7,84% với độ tin cậy 95%. Điều này có nghĩa là các kết quả phân tích hàm lượng Sudan I với độ lệch <6,26%, Sudan II với độ lệch <7,84% có thể tin cậy được. Bảng 3.29: Dữ liệu tính toán độ không đảm bảo đo Hàm lượng Sudan I và Sudan II thêm chuẩn (µg/L) Hiệu suất thu hồi ngày thứ nhất (%) Hiệu suất thu hồi ngày thứ hai (%) Hiệu suất thu hồi trung bình (%) Độ lệch chuẩn của HS thu hồi SD Hệ số biến thiên RSD% 10 SudanI SudanII SudanI SudanII SudanI SudanII SudanI SudanII SudanI SudanII 92,16 88,18 89,42 85,26 91,04 87,54 3,30 3,96 3,62 4,53 89,63 85,76 90,94 85,12 91,13 89,86 93,27 81,14 93,45 90,29 94,19 90,72 92,27 88,53 83,96 89,83 100 SudanI SudanII SudanI SudanII 87,62 81,36 93,83 90,21 90,58 92,73 94,93 91,68 86,67 90,16 93,61 91,94 95,82 91,83 85,50 82,40 94,43 80,28 87,30 83,50 3.10. Kết quả phân tích hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm Do dịch chiết của các mẫu thịt khô không tạo ra huyền phù khi pha trong pha động của HPLC, nên có thể phân tích trực tiếp trên thiết bị HPLC mà không cần qua giai đoạn hấp phụ bởi RHNS. Tuy nhiên, dịch chiết các mẫu bim bim (ví dụ mẫu MBB1 – Hình 3.38) đều có phản ứng tạo huyền phù với pha động và việc phân tích trực tiếp có thể làm hỏng cột sắc ký. Vì vậy, việc tách có chọn lọc hỗn hợp chất màu từ dịch chiết các mẫu bim bim trước khi phân tích HPLC là một giải pháp có ý nghĩa thiết thực. Hình 3.38: Dịch chiết mẫu MBB1 sau xử lý. 1-A: Dung dịch mẫu thu được trước khi phân tích HPLC, xử lý theo sơ đồ 2 1-B: Dung dịch mẫu thu được trước khi phân tích HPLC, xử lý theo sơ đồ 1, có hiện tượng huyền phù Các điều kiện chiết xuất và hấp phụ tối ưu đối với hỗn hợp Sudan được áp dụng để phân tích ba mẫu thịt khô và năm mẫu bim bim. Ngoài ra, hàm lượng chính xác của chất chuẩn Sudan I và Sudan II (µg/L) được thêm vào các mẫu thực phẩm trước khi chiết để đánh giá độ thu hồi quá trình chiết.. Kết quả phân tích cho thấy hàm lượng Sudan I và Sudan II trong các mẫu thịt khô BK1, BK3 và mẫu bim bim MBB4 theo tính toán thì thấp hơn LOD (kể cả khi đã làm giàu vẫn không xuất hiện tín hiệu mẫu). Tất cả các mẫu còn lại đều chứa Sudan I và Sudan II trên giới hạn phát hiện (Bảng 3.30). Khi tiến hành các thí nghiệm khác để kiểm tra ảnh hưởng của ma trận nền, các dịch chiết của mẫu BK1, BK3, MBB4 đã được bổ sung các chất chuẩn Sudan I và Sudan II ở các nồng độ khác nhau. Các thí nghiệm cho kết quả độ thu hồi từ 81,11% đến 100,73% trong các mẫu thịt khô thực tế và 80,74% đến 92,39% trong mẫu bim bim (Bảng 3.31). Các giá trị độ thu hồi này đạt yêu cầu theo AOAC [11]. Điều này chứng tỏ rằng các chất nền trong mẫu thực không ảnh hưởng đến độ chính xác của việc định lượng các chất màu Sudan bằng phương pháp HPLC. Bảng 3.30: Kết quả định lượng Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm. Mẫu Sudan I (µg/L) ban đầu Sudan II (µg/L) ban đầu Sudan I thêm(µg/L) Sudan II thêm(µg/L) H% thu hồi Sudan I H% thu hồi Sudan II BK1 ND ND : Không phát hiện được. ND 50,00 50,00 82,76±1,13 83,64±0,81 BK2 26,72±1,48 47,68±1,39 50,00 50,00 101,53 ±1,23 93,24±0,78 BK3 ND ND 50,00 50,00 84,32±2,25 83,90±2,40 MBB1 17,59±0,80 44,43±2,57 50,00 50,00 77,31±1,06 81,73±2,07 MBB2 26,85±0,45 40,78±2,20 50,00 50,00 82,13±1,03 82,20±1,24 MBB3 15,97±0,38 Sau khi giải hấp phụ, dung dịch được pha loãng 5 lần bằng PB5-S do hàm lượng Sudan II trong dung dịch chiết nằm ngoài khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn. 28,46±0,43 50,00 50,00 86,82±0,83 91,22±1,46 MBB4 ND ND 50,00 50,00 84,98±0,99 86,90±2,31 MBB5 13,23±0,18 Sau khi giải hấp phụ, dung dịch được pha loãng 2 lần bằng PB5-S do hàm lượng Sudan I và Sudan II trong dung dịch chiết nằm ngoài khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn. 20,39±1,10 50,00 50,00 80,22±1,34 84,76±1,31 Bảng 3.31: Độ thu hồi các Sudan trên nền mẫu thực. Mẫu Mức thêm chuẩn Sudan I và Sudan II với cùng nồng độ (µg/L) 10,0 50,0 100,0 Sudan I Sudan II Sudan I Sudan II Sudan I Sudan II BK1 82,11±1,45 81,11±1,44 83,44±1,49 85,24±0,70 84,64±1,49 100,73±1,94 BK3 82,39±1,48 81,78±1,57 84,24±1,93 83,72±2,23 86,52±1,59 84,46±1,69 MBB4 80,74±1,36 82,40,±0,93 81,69±1,42 84,93±2,02 85,15±2,74 92,39±0,95 Dựa trên kết quả định lượng Sudan I và Sudan II từ dung dịch chiết và dung dịch giải hấp bằng phương pháp HPLC, hàm lượng (µg/g) của Sudan I và Sudan II trong các mẫu thực phẩm khô ban đầu đã được xử lý thống kê và được đưa ra trong Bảng 3.32. Bảng 3.32: Hàm lượng Sudan I và Sudan II trong mẫu thực phẩm khô ban đầu. Mẫu Hàm lượng Sudan I (µg/g) Hàm lượng Sudan II (µg/g) BK1 ND ND : Không phát hiện được. ND BK2 19,55 ± 1,08 34,88 ± 1,01 BK3 ND ND MBB1 11,86 ± 0,54 29,37 ± 1,02 MBB2 17,46 ± 0,29 26,53 ± 1,43 MBB3 45,59 ± 1,08 67,81 ± 1,22 MBB4 ND ND MBB5 7,38 ± 0,10 11,38 ± 0,61 Các kết quả phân tích một số mẫu thực cho các sắc ký đồ như Hình 3.39, Hình 3.40 và Hình 3.41. Hình 3.39: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB1 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 min 0.00 0.25 0.50 0.75 AU 490nm4nm (1.00) 3.338/611 4.705/980 Hình 3.40: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB2. Hình 3.41: Sắc ký đồ phân tích mẫu bim bim MBB4. Nhận xét: Thời gian lưu của Sudan I và Sudan II trên sắc ký đồ của các mẫu thực tương đối ổn định và hầu như không thay đổi so với dung dịch mẫu chuẩn. Các peak tách nhau rõ ràng, đường nền ít nhiễu và trong điều kiện tối ưu của quy trình chiết – hấp phụ - định lượng HPLC không có tín hiệu chất lạ nên có thể kết luận quy trình có độ chọn lọc cao. Về cảm quan của các mẫu phân tích các Sudan cho thấy: với mẫu bim bim và mẫu thịt chứa Sudan/ không chứa Sudan thì không có sự khác nhau rõ ràng về mùi. Tuy nhiên các mẫu thịt và bim bim có chứa Sudan đều có màu vàng cam, các mẫu không chứa Sudan có màu vàng sáng hoặc nhạt (bim bim) hoặc nâu đậm (với mẫu thịt khô) (phụ lục 6). Chúng tôi cũng đã tiến hành thử nghiệm về thời hạn bảo quản dựa trên cảm quan đối với các mẫu thịt khô và nhận thấy rằng: Ở cùng điều kiện đã sấy khô, để ở nhiệt độ phòng, áp suất thường, không bảo quản kín thì với mẫu thịt sấy khô không chứa Sudan sau thời gian 20 ngày bắt đầu có mùi lạ, mốc, còn mẫu thịt được tẩm Sudan vẫn giữ nguyên mùi ban đầu, không mốc. Điều này có thể giải thích bởi độc tính cao của Sudan có thể ức chế sự phát triển của một số loại vi khuẩn [18]. Thời gian bảo quản lâu hơn, màu bắt mắt hơn là lí do dẫn tới người kinh doanh và người sử dụng ít quan tâm đến tác hại về lâu dài của những loại thực phẩm có nhuộm màu này. KẾT LUẬN Sau khi nghiên cứu, triển khai thực hiện đề tài "Phân tích Auramin O, Sundan I, Sudan II trong thực phẩm bằng phương pháp RP-HPLC sử dụng vật liệu nanosilica để xử lý mẫu", đã thu được một số kết quả: 1. Đã khảo sát và lựa chọn được điều kiện phù hợp của phương pháp RP-HPLC với pha động PBS (pH = 3,0; thêm 0,2% triethylamine) : ACN tỉ lệ v/v = 65:35 để định lượng AO tại bước sóng 432 nm. Khi thay đổi pha động là MeOH:H2O:ACN tỉ lệ v/v = 67:3:20, phương pháp có thể định lượng đồng thời Sudan I và Sudan II trong dung dịch tại bước sóng đo 490 nm. Kết quả phân tích tin cậy với độ nhạy cao: LOD và LOQ của AO lần lượt là 1,2 µg/L, 3,9 µg/L và của Sudan I là 2,7 µg/L, 9,1 µg/L; của Sudan II là 3,0 µg/L và 10,0 µg/L. 2. Bằng cách tiếp cận và tìm điều kiện tối ưu theo phương pháp đơn biến, luận án đã giải quyết có hệ thống các nội dung nghiên cứu cần thiết để tìm điều kiện của phương pháp xử lý mẫu thực phẩm trên cơ sở nghiên cứu mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu trắng. Phương pháp xử lý mẫu thực phẩm được đề xuất qua 2 sơ đồ (Hình 3.9 và Hình 3.10) là phù hợp và đảm bảo tính mới. AO được chiết từ các mẫu thực phẩm bằng dung môi chiết là EtOH:H2O (tỉ lệ v/v = 70:30), các Sudan trong mẫu thực phẩm được chiết bằng dung môi ethanol tuyệt đối, đây là dung môi an toàn với môi trường và người sử dụng, cho hiệu suất thu hồi cao đồng thời quy trình chiết đơn giản có thể tiến hành được số lượng nhiều thí nghiệm cùng lúc. 3. Việc sử dụng RHNS để hấp phụ chất màu tổng hợp AO và hỗn hợp Sudan I và Sudan II trong dịch chiết mẫu thực phẩm là phù hợp, cho hiệu suất hấp phụ cao. Đây là giai đoạn quan trọng trong xử lý mẫu thực phẩm có nhuộm màu để phân tích định lượng chất màu theo phương pháp HPLC. RHNS có tính chọn lọc cao thể hiện ở tín hiệu sắc ký đồ rõ nét, ít nhiễu. RHNS có điểm điện tích 0 thấp (PZC), nên thích hợp để hấp phụ chất màu kỵ nước như Sudan I và Sudan II, mặt khác tương tác tĩnh điện của RHNS với AO trong dung dịch nước cũng đóng vai trò làm tăng độ hấp phụ AO trong điều kiện phù hợp. Xử lý mẫu tốt làm tăng tuổi thọ thiết bị phân tích, tăng độ chọn lọc và hơn hết quy trình xử lý mẫu này không độc với người phân tích và môi trường, tốn ít dung môi. 4. Trong tổng số 30 mẫu phân tích có tới 11 mẫu chứa AO hoặc Sudan (chiếm 36,7%) là các hợp chất màu tổng hợp bị cấm dùng trong thực phẩm ở Việt Nam. Đây là một kết quả đáng lo ngại về tình hình an toàn thực phẩm Việt Nam hiện nay. DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Phạm Thị Chuyên, Đặng Xuân Thư, Nguyễn Bích Ngân, Phạm Thị Thuyên 2020), Nghiên cứu quy trình tách chiết Auramine -O trong mẫu thực phẩm và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao- Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 25, số 3, trang 108-113. 2. Vũ Thị Tình, Nguyễn Bích Ngân, Phạm Thị Chuyên (2020), Tối ưu hóa quy trình chiết Sudan I từ thực phẩm, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học - Tập 25, số 3, trang 180-184. 3. Phạm Thị Chuyên, Đặng Xuân Thư, Nguyễn Bích Ngân (2021), Nghiên cứu hấp phụ Auramine O trên vật liệu nanosilica chế tạo từ vỏ trấu và ứng dụng trong phân tích, Tạp chí Khoa học Journal of Science, số 74, trang 16-27. 4. Thi Chuyen Pham, Bich Ngan Nguyen, Xuan Thu Dang, and Thi Tinh Vu (2021), Determination of Sudan I and II in Food by High-Performance Liquid Chromatography after Simultaneous Adsorption on Nanosilica, Journal of Analytical Methods in Chemistry, Volume 2021, ID 6664463, pp.1-9. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bộ Khoa học và công nghệ (2018), TCVN 12267:2018: Thực phẩm - Xác định hàm lượng Auramine -Phương pháp sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC-MS/MS). Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2015), Thông tư số 42/2015/TT-BNNPTNT -Danh mục bổ sung hóa chất, chất kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, kinh doanh và sử dụng trong thức ăn chăn nuôi tại Việt Nam. Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2019), Thông tư 21/2019/TT-BNNPTNT - Hướng dẫn một số điều của Luật Chăn nuôi về thức ăn chăn nuôi. Bộ Y tế (2010), QCVN 4-10 : 2010/BYT -Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm - phẩm màu. Bộ Y tế (2019), Thông tư số 24/2019/TT-BYT-Danh mục phụ gia thực phẩm được phép sử dụng trong thực phẩm. Lê Thị Hường Hoa (2013), Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm, Luận án tiến sĩ ngành Kiểm nghiệm thuốc - độc chất, Trường Đại học Dược Hà Nội, Hà Nội. GS.TS Phạm Luận (2000), Cơ sở lý thuyết Sắc ký lỏng hiệu năng cao - High performance liquid chromatography (HPLC), NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội. GS.TS Phạm Luận (2000), Giáo trình cơ sở của các kỹ thuật xử lý mẫu phân tích, Đại học Quốc gia Hà Nội, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. Bùi Thị Ngoan, Trần Thắng, Đào Tố Quyên, Phạm Văn Hoan (2009), "Xác định Sudan I trong một số loại gia vị bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao", Y học thực hành. 641+642(1), tr. 641-643. Vũ Lan Phương và cộng sự (2020), "Nghiên cứu xác định đồng thời một số chất màu trộn trái phép trong thực phẩm bằng sắc ký lỏng khối phổ hai lần", Tạp chí Kiểm nghiệm và An toàn thực phẩm. 3(1), tr. 1-10. DS. Trần Cao Sơn, PGS.TS. Phạm Xuân Đà, TS. Lê Thị Hồng Hảo (2010), Thẩm định phương pháp trong phân tích hoá học và vi sinh vật, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật. PGS.TS Cao Hữu Trượng, PGS.TS Hoàng Thị Lĩnh; (2003), Hóa học thuốc nhuộm, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. Nguyễn Trí Tuấn, Nguyễn Hữu Minh Phú , Hồ Ngọc Tri Tân, Phạm Thị Bích Thảo, Nguyễn Thị Kim Chi, Lê Văn Nhạn, Nguyễn Trọng Tuân và Trịnh Xuân Anh (2014), "Tổng hợp hạt nano SiO2 từ tro vỏ trấu bằng phương pháp kết tủa", Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ. 32, tr. 120-124. Tiếng Anh A. A. Waheed, K. Sridhar Rao and P. D. Gupta (2000), “Mechanism of Dye Binding in the Protein Assay Using Eosin Dyes”, Analytical Biochemistry 287, pp.73–79. A.B Esteban (1986), "Supercritical fluid extraction", Fluid Phase Equilib. 29(C), pp. 133-144. Abdullah Al Tamim, Mohammed AlRabeh, Ahmed Al Tamimi, Abdulaziz AlAjlan, Abdullah Alowaifeer (2020), "Fast and simple method for the detection and quantification of 15 synthetic dyes in sauce, cotton candy, and pickle by liquid chromatography/tandem mass spectrometry", Arabian Journal of Chemistry. 13(2), pp. 3882-3888. Adak. A, Bandyopadhyay. M, and Pal. A (2005), "Removal of crystal violet dye from wastewater by surfactant-modified alumina", Sep. Purif. Technol. 44(2), pp. 139-144. Adna Sijerčić, Zejneba Jassin & Monia Avdić (2019), “Effect of Food Coloring Dyes on Bacterial Growth”, International Journal of Innovative Science and Research technology, Volume 4, Issue 12. Ajiwe V. I. E, Okeke C. A and Akigwe F. C (2000), "A preliminary study of manufacture of cement from rice husk ash", Bioresour. Technol. 73(1), pp. 37-39. Ahmed M. N and Ram R. N (1992), “Removal of basic dye from waste-water using silica as adsorbent,” Environ. Pollut., vol. 77, no. 1, pp. 79–86. An. Y, Jiang. L, Cao. J, Geng. C, Zhong. L (2007), "Sudan I induces genotoxic effects and oxidative DNA damage in HepG2 cells", Mutat Res. 627(2), pp. 164-70. Anh Tuan Le Nghiem et al (2017), "Preparation and characterization of nanosilica from rice husk ash by chemical treatment combined with calcination", Vietnam Journal of Chemistry. 55(4), pp. 455-459. Bonser G. M, Clayson D. B and Jull J. W (1956), "The induction of tumours of the subcutaneous tissues, liver and intestine in the mouse by certain dyestuffs and their intermediates", Br. J. Cancer. 10(4), pp. 653-667. Bose. D. N, Govindacharyulu. P. A, and Banerjee. H. D (1982), "Large grain polycrystalline silicon from rice husk", Sol. Energy Mater. 7(3), pp. 319-321. Carmona V. B, Oliveira R. M, Silva W. T. L, Mattoso L. H. C, Marconcini J. M (2013), "Nanosilica from rice husk: Extraction and characterization", Industrial Crops and Products. 43, pp. 291-296. Case R. A. M, Hosker M. E, McDonald D. B and Pearson J. T (1954), "Tumours of the urinary bladder in workmen engaged in the manufacture and use of certain dyestuff intermediates in the British chemical industry", Br. J. Ind. Med. 50(5), pp. 389–411. Chailapakul Orawon et al (2008), "Analysis of sudan I, sudan II, sudan III, and sudan IV in food by HPLC with electrochemical detection: Comparison of glassy carbon electrode with carbon nanotube-ionic liquid gel modified electrode", Food Chem. 109(4), pp. 876-82. Chao. M and Ma.X (2012), "Electrochemical determination of Sudan I at a silver nanoparticles/poly(aminosulfonic acid) modified glassy carbon electrode", Int. J. Electrochem. Sci. 7(7), pp. 6331–6342. Chen. M, Ma. X, Li. X (2013), "Electrochemical determination of Sudan IV in food samples by using graphene-modified glassy carbon electrodes", Turkish Journal of Chemistry. 37, pp. 959-965. Center for Food Safety and Applied Nutrition (2017), Color Additive Inventories - Summary of Color Additives for Use in the United States in Foods, Drugs, Cosmetics, and Medical Devices. 1. pp. 1–20. Dang Thi Ngoc Hoa et al (2020), "Voltammetric determination of Auramine O with ZIF-67/Fe2 O3/g-C3 N4 - modified electrode", Journal of Materials Science: Materials in Electronics. 31(83), pp. 19741–19755. Duc Tien Pham, Cuong Manh Vu, Choi Hyoung Jin (2017), "Enhanced fracture toughness and mechanical properties of epoxy resin with rice husk-based nano-silica", Polymer Science, Series A. 59(3), pp. 437-444. Duc Tien Pham, Thuy Thu Bui, Thanh Van Nguyen, Van Thi Kieu Bui, Thuy Thi Tran, Chi Quynh Phan, Dat Tien Pham and Ha Thu Hoang (2018), "Adsorption of Polyelectrolyte onto Nanosilica Synthesized from Rice Husk: Characteristics, Mechanisms, and Application for Antibiotic Removal", Polymers (Basel). 10(2), pp. 1-17. Dutta Taposhree, Sarkar, Sabyasachi (2016), "Nanocarbon–{[Na10(PrW10O36)]2·130H2O} composite to detect toxic food coloring dyes at nanolevel", Applied Nanoscience. 6(8), pp. 1191-1197. Erdemir U. S, Izgi. B, Guce. S (2013), "An alternative method for screening of Sudan dyes in red paprika paste by gas chromatography-mass spectrometry", Analytical Methods. 5(7). Ertas. E, Ozer. H, Alasalvar. C (2007), "A rapid HPLC method for determination of Sudan dyes and Para Red in red chilli pepper", Food Chemistry. 105(2), pp. 756-760. Hamdaoui O. and Naffrechoux E. (2007), "Modeling of adsorption isotherms of phenol and chlorophenols onto granular activated carbon. Part I. Two-parameter models and equations allowing determination of thermodynamic parameters", J Hazard Mater. 147(1-2), pp. 381-94. He. L et al (2007), "Determination of Sudan dye residues in eggs by liquid chromatography and gas chromatography-mass spectrometry", Anal Chim Acta. 594(1), pp. 139-46. Hisham. M, Murugesan. S, Sivakumar. M (2018), "A Prospective Study to Assess the Severity and Outcome of Poisoning with Auramine-O and Malachite Green Dye", EC Pharmacol. Toxicol. 6(6), pp. 491-497. Hoang Thi Phuong , Nguyen Khanh Dieu Hong, Dinh Thi Ngo (2016), "Study on surface modification of nanosilica aerogel for oil adsorption on surface oil polluted water", Vietnam Journal of Chemistry. 54(5e1,2), pp. 426-430. Huang J.H, Huang K. L, Liu S. Q, Wang A. T, Yan. C (2008), "Adsorption of Rhodamine B and methyl orange on a hypercrosslinked polymeric adsorbent in aqueous solution", Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 330(1), pp. 55-61. Ko. K. Y, Choi. E. Y, Jeong. S. H, Kim. S, Lee. C, Cho. S (2021), "Simple HPLC-PDA Analysis to Determine Illegal Synthetic Dyes in Herbal Medicines", Applied Sciences. 11(14), pp. 1-14. Li. J, Zhai. H, Chen. Z, Zhou. Q, Liu. Z, Su. Z (2013), "Preparation and evaluation of a novel molecularly imprinted SPE monolithic capillary column for the determination of auramine O in shrimp", J Sep Sci. 36(21-22), pp. 3608-14. Ligate. F. J and Mdoe. J. E. (2015), "Removal of heavy metal ions from aqueous solution using rice husks-based adsorbents", Tanzania J. Sci. 41(1), pp. 90-102. Lin Huogang, Li Gang, Wu Kangbing (2008), "Electrochemical determination of Sudan I using montmorillonite calcium modified carbon paste electrode", Food Chemistry. 107(1), pp. 531-536. Ma. X, Chen. M and Chao. M (2013), "Voltammetric Determination of Sudan II in Food Samples at Graphene Modified Glassy Carbon Electrode Based on the Enhancement Effect of Sodium Dodecyl Sulfate", J. Chem. Soc. Pak.,. 35(1), pp. 30-36. Mcnair. H and Polite L. N (2007), "17 Troubleshooting in high performance liquid chromatography", Sep. Sci. Technol. 8, pp. 459-477 Mazzetti. M, Fascioli. R, Mazzoncini. I, Spinelli. G, Morelli. I, Bertoli. A. (2004), "Determination of 1-phenylazo-2-naphthol (Sudan I) in chilli powder and in chilli-containing food products by GPC clean-up and HPLC with LC/MS confirmation", Food Addit Contam. 21(10), pp. 935-41. Monographs IARC (2021), IARC monographs on the identification of carcinogenic hazards to humans, WHO, pp. 39. Olsson Maria (2006), "Wheat straw and peat for fuel pellets—organic compounds from combustion", Biomass and Bioenergy. 30(6), pp. 555-564. Pahlavan Ali et al (2015), "Voltammetric Nanostructure Based Sensor for Determination of Sudan I in Food Samples", Int. J. Electrochem. Sci. 10, pp. 3644 - 3656. Pankti P. D, Kunti, Raskapur. D (2012), "A Guide to Problem-Solving in High Performance Liquid Chromatography", Journal of Pharmacy Research. 5(8), pp. 4411-4420. Parodi. S Santi. L, Russo. P, Albini. A, Vecchio. D, Pala. M, Ottaggio. L, Carbone. A (1982), "DNA damage induced by auramine O in liver, kidney, and bone marrow of rats and mice, and in a human cell line (alkaline elution assay and SCE induction)", J Toxicol Environ Health. 9(5-6), pp. 941-52. Ping Qi, Tao Zeng, Zejun Wen, Xiaoyan Liang , Xuewu Zhang (2011), "Interference-free simultaneous determination of Sudan dyes in chili foods using solid phase extraction coupled with HPLC–DAD", Food Chemistry. 125(4), pp. 1462-1467. Poots V. J. P, McKay. G, and Healy J. J (1976), "The removal of acid dye from effluent using natural adsorbents-I peat", Water Res. 10(12), pp. 1061–1066. Sabir A. M, Moloy M, Bhasin P. S (2016), "Hplc Method Development and Validation: A Review", International Research Journal of Pharmacy. 4(4), pp. 39-46. Shin Younsook, Yoo Dong Il and Kim Kangwha (2012), "Process Balance of Natural Indigo Production based on Traditional Niram Method", Textile Coloration and Finishing. 24(4), pp. 253-259. S. M. Ghufran Saeed, S. Umer abdUllah, S. asad Sayeed1 and Rashida ali (2010), “Food Protein: Food Colour Interactions and its Application in Rapid Protein Assay”, Czech J. Food Sci. Vol. 28, No. 6, pp.506–513. Sricharoen P. et al (2017), "New approach applying a pet fish air pump in liquid-phase microextraction for the determination of Sudan dyes in food samples by HPLC", J Sep Sci. 40(19), pp. 3848-3856. Tatebe. C, Zhong. X, Ohtsuki. T, Kubota. H, Sato. K, Akiyama. H (2014), "A simple and rapid chromatographic method to determine unauthorized basic colorants (rhodamine B, auramine O, and pararosaniline) in processed foods", Food Sci Nupp. 2(5), pp. 547-56. Thanh Thien Tran Lam, Mo Bui Thi Hong, Giang Truong Le and Phuong Duc Luu (2020), "Auramine O in foods and spices determined by an UPLC-MS/MS method", Food Addit Contam Part B Surveill. 13(3), pp. 171-176. Thu Hoang Thi, Dat Le Tien, Tuan Vu Anh (2019), "Synthesis of mesoporous SiO2 from rice husk for removal of organic dyes in aqueous solution", Vietnam Journal of Chemistry. 57(2), pp. 175-181. Tien Duc Pham, Thi Ngan Vu, Hai Long Nguyen , Pham Hai Phong Le and Thi Sim Hoang (2020), "Adsorptive removal of antibiotic ciprofloxacin from aqueous solution using protein-modified nanosilica", Polymers (Basel). 12(1). Thuong Nguyen Thi Kim, Thi Thu Bui, Anh Tuan Pham, Van Thang Duong, and Thi Huong Giang Le (2019), "Fast Determination of Auramine O in Food by Adsorptive Stripping Voltammetry", J Anal Methods Chem. 2019, pp. 1-6. Trinh Phan Thi Ngoc et al (2019), "Development and Validation of Hplc-Pda Method for the Simultaneous Determination of Auramine O and Rhodamine B in Foodstuffs", J. Sci. -NATURAL Sci. Technol. 16(6), pp. 16-28. Tsamo. C, Kidwang G. D, Dahaina D. C (2020), "Removal of Rhodamine B from aqueous solution using silica extracted from rice husk", SN Applied Sciences. 2(2). Wang. M, Jianwei. F, Zhang .Y, Chen. Z, Wang. M, Cui. W, Zhang. J, Xu. Q (2015), "Removal of Rhodamine B, a Cationic Dye From Aqueous Solution Using Poly(cyclotriphosphazene-co-4,4′-sulfonyldiphenol) Nanotubes", Journal of Macromolecular Science, Part A. 52(2), pp. 105-113. Williams M. H. C and Bonser G. (1962), "Induction of hepatomas in rats and mice following the administration of auramine", Br. J. Cancer. 16(1), pp. 87-91. Yang Ki Ryeol, Hong Ji Yeon, Yoon Soo Hwan, Hong Jongki (2014), "Impurity Profiling and Quantification of Sudan III Dyes by HPLC-selective UV Detection", Bulletin of the Korean Chemical Society. 35(3), pp. 765-769. Yong Lin Qin，Zheng Xiao-yan，He Shu-kun，Dai Ming，Xie (2009), "Simultaneous High Performance Liquid Chromatographic Determination of Chrysoidine, Auramine O and Safranine T in Food", Food Sci. China. 30(14), pp. 2008-2010. Yu. L, Mao. Y, Gao.Y, Qu. L (2013), "Sensitive and Simple Voltammetric Detection of Sudan I by Using Platinum Nanoparticle-Modified Glassy Carbon Electrode in Food Samples", Food Analytical Methods. 7(6), pp. 1179-1185. Zhang. H Li. Z, Chen. T, Qin. B (2017), "Quantitative determination of Auramine O by terahertz spectroscopy with 2DCOS-PLSR model", Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 184, pp. 335-341. Zhang. W Qin. H, Liu. Z, Du. H, Li. H, Fang. L, Chen. Z (2019), "Quantitative Determination of Auramine O in Bean Curd Sheets by Dispersive Solid Phase Extraction with Dynamic Surfaced-Enhanced Raman Spectroscopy", Analytical Letters. 53(8), pp. 1282-1293. ZHAO Chun-yu. M. L RAO Wei-weng (2007), "Hplc determination of auramine o added in pollen typhae", Chinese J. Pharm. Anal. 27(12), pp. 1956-1958. Zhirong Mo Yafen Zhang, Faqiong Zhao, Fei Xiao, Gaiping Guo, Baizhao Zeng (2010), "Sensitive voltammetric determination of Sudan I in food samples by using gemini surfactant–ionic liquid–multiwalled carbon nanotube composite film modified glassy carbon electrodes", Food Chemistry. 121(1), pp. 233-237. Zhou. Q Wu. Y, Yuan. Y, Zhou. X, Wang. H, Tong. Y, Zhan. Y, Sun. Y, Sheng. X (2019), "Determination of Sudan red contaminants at trace level from water samples by magnetic solid-phase extraction using Fe@NiAl-layered double hydroxide coupled with HPLC", Environmental Sciences Europe. 31(1), pp. 1-10. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phổ FT-IR của vật liệu RHNS Hình 1: Phổ FT-IR của vật liệu RHNS Phụ lục 2: Phổ EDX của vật liệu RHNS Spectrum processing : Peak possibly omitted : 3.600 keV Processing option : All elements analyzed (Normalised) Number of iterations = 5 Standard : O SiO2 1-Aug-2020 12:00 AM Si SiO2 1-Aug-2020 12:00 AM Element Weight% Atomic% O K 67.18 78.23 Si K 32.82 21.77 Totals 100.00 Hình 2: Phổ EDX của vật liệu RHNS Phụ lục 3: Đường đẳng nhiệt hấp phụ - giải hấp N2 HANOI NATIONAL UNIVERSITY OF EDUCATION TriStar 3000 V6.07 A Unit 1 Port 1 Serial #: 2125 Page 2 Sample: Nano SiO2 Operator: LvK Submitter: Chuyen-NCS PT File: C:\WIN3000\DATA\2020\002-671.SMP Started: 8/19/2020 5:00:51PM Analysis Adsorptive: N2 Completed: 8/20/2020 9:25:05AM Analysis Bath Temp.: 77.350 K Report Time: 8/20/2020 5:19:07PM Sample Mass: 0.2537 g Warm Free Space: 6.7078 cm³ Measured Cold Free Space: 21.2924 cm³ Measured Equilibration Interval: 10 s Low Pressure Dose: None Sample Density: 1.000 g/cm³ Automatic Degas: No Comments: Mau: Nano SiO2. Degas o 250 C voi N2 trong 4h. Mau cua Chuyen-NCS Bo mon Hoa Phan Tich. Ngay 18-8-2020. Hình 3: Đường đẳng nhiệt hấp phụ - giải hấp N2 của vật liệu RHNS Phụ lục 4: Đường phân bố kích thước mao quản Hình 4: Đường phân bố kích thước mao quản của vật liệu RHNS Phụ lục 5: Biểu đồ diện tích bề mặt BET Hình 5: Biểu đồ diện tích bề mặt của vật liệu RHNS Phụ lục 6: Hình ảnh một số mẫu phân tích Mẫu MAK1 - Không chứa AO Mẫu MA2- Chứa AO Mẫu MI3 - Không chứa AO Mẫu MI2 - Chứa AO Mẫu MBB4 - Không chứa Sudan Mẫu MBB3 - Chứa Sudan Mẫu thịt khô BK3 - Không chứa Sudan Mẫu thịt khô MTB chứa Sudan