Luận án Tổng hợp và thiết lập tạp chất đối chiếu của allopurinol sử dụng trong kiểm nghiệm

h đỉnh (mV x giây) Nồng độ thử (mg) Diện tích thử (mV x giây) Tỷ lệ 1 0,05 2542598 0,0502 2559687 99,8% 2 2556369 0,0505 2569874 99,6% 3 2554715 0,0505 2564152 99,4% 4 2554789 0,0503 2563218 99,8% 5 2549638 0,0504 2554654 99,3% 6 2547891 0,0502 2556935 99,7% 1 0,05 2548964 0,0503 2559874 99,7% 2 2559638 0,0505 2569314 99,6% 3 2559874 0,0503 2561478 99,7% 4 2558528 0,0505 2569314 99,6% 5 2558413 0,0504 2569358 99,8% 6 2549638 0,0504 2568746 99,8% Trung bình 2553421 2563884 99,7% RSD 0,17% PL 70 TÍNH TUYẾN TÍNH Nồng độ (μg/ml) Diện tích (µV x giây) Phương trình hồi quy 30 14062275 40 20017640 50 25445685 60 29809575 70 35196268 ĐỘ ĐÚNG Mức độ đúng Lượng mẫu trắng (ml) Lượng chuẩn thêm vào mẫu (mg) Lượng chuẩn tìm lại theo thực tế (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) RSD (%) 60% 10,0 0,300 0,302 100,56 0,67 10,0 0,300 0,305 101,78 10,0 0,300 0,305 101,67 100% 10,0 0,500 0,492 98,33 1,33 10,0 0,500 0,494 98,73 10,0 0,500 0,504 100,80 140% 10,0 0,700 0,688 98,33 0,17 10,0 0,700 0,687 98,19 10,0 0,700 0,690 98,52 Tỷ lệ phục hồi TB (%) 99,66 1,00 y = 713781x - 2E+06 R² = 0.9975 15000000 35000000 55000000 20 30 40 50 60 70 80D iệ n t íc h đ ỉn h (µ V xg iâ y) Nồng độ (µg/ml) PL 71 PHỤ LỤC 2.3. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP C ALLOPURINOL KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Khảo sát thành phần pha động Khảo sát tỷ lệ pha động Khảo sát tốc độ dòng PL 72 SẮC KÝ ĐỒ ĐẠI DIỆN TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG TẠP C External Standard Report Method Name: D:\luthienphuc\Tap C-Allopurinol.met Data: D:\luthienphuc\ Tap C-Allopurinol \ Tap-C-H3PO4-pH2-ACN-98-2- tinhtuongthichhethong-M1.dat User: luthienphuc Acquired: 01/31/2021 9:34:02 PM Printed: 02/03/2021 7:40:48 AM TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG STT Diện tích đỉnh (µV x giây) Số đĩa lý thuyết Hệ số đối xứng Thời gian lưu (phút) 1 26507230 5075 1,05 6,15 2 26614152 5061 1,04 6,14 3 26557854 5141 1,05 6,15 4 26490487 5092 1,06 6,14 5 26520989 5123 1,07 6,14 6 26591261 5197 1,05 6,16 TB 26546996 5115 1,05 6,15 RSD (%) 0,18 0,98 0,98 0,15 PL 73 ĐỘ CHÍNH XÁC Độ chính xác (n = 6) STT Nồng độ chuẩn (mg) Diện tích đỉnh (µV x giây) Nồng độ thử (mg) Diện tích thử (µV x giây) Tỷ lệ 1 0,05 26842279 0,0507 27095897 99,7% 2 26706809 0,0503 26881596 99,7% 3 26845837 0,0504 26987840 99,9% 4 26861282 0,0503 26905030 99,8% 5 26748502 0,0502 26852034 99,8% 6 26816840 0,0505 26893022 99,3% Trung bình 26803592 99,7% RSD 0,08% Độ chính xác trung gian (n = 12) STT Nồng độ chuẩn (mg) Diện tích đỉnh (µV x giây) Nồng độ thử (mg) Diện tích thử (µV x giây) Tỷ lệ 1 0,05 26741189 0,0502 26878921 99,9% 2 26715827 0,0501 26790146 99,8% 3 26837910 0,0509 26909382 98,6% 4 26839201 0,0502 26882194 99,9% 5 26709703 0,0501 26801820 99,8% 6 26889381 0,0502 26809812 99,7% 1 0,05 26842279 0,0501 26810975 99,9% 2 26706809 0,0500 26719023 99,7% 3 26845837 0,0502 26834710 99,7% 4 26861282 0,0502 26810928 99,7% 5 26748502 0,0501 26720981 99,5% 6 26816840 0,0509 27199710 99,7% Trung bình 26796230 26847384 99,7% RSD 0,34% PL 74 TÍNH TUYẾN TÍNH Nồng độ (µg/ml) Diện tích pic (µV x giây) Phương trình hồi quy 25 12418650 30 14902380 50 26506951 75 37255950 100 49674600 ĐỘ ĐÚNG Mức độ đúng Lượng mẫu trắng (ml) Lượng chuẩn thêm vào mẫu (mg) Lượng chuẩn tìm lại theo thực tế (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) RSD (%) 50% 10,0 0,2500 0,2505 100,20 0,61 10,0 0,2500 0,2526 101,04 10,0 0,2500 0,2496 99,84 100% 10,0 0,5000 0,5012 100,24 0,22 10,0 0,5000 0,4991 99,82 10,0 0,5000 0,5006 100,12 150% 10,0 0,7500 0,7492 99,89 0,13 10,0 0,7500 0,7511 100,15 10,0 0,7500 0,7507 100,09 Tỷ lệ phục hồi TB (%) 100,15 RSD (%) 0,37 y = 494223x + 475241 R² = 0.9977 5000000 25000000 45000000 65000000 20 40 60 80 100 120D iệ n t íc h đ ỉn h (µ V xg iâ y) Nồng độ (µg/ml) PL 75 PHỤ LỤC 2.4. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP D ALLOPURINOL KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ PL 76 SẮC KÝ ĐỒ ĐẠI DIỆN TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG TẠP D TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG STT Diện tích đỉnh (µV x phút) Số đĩa lý thuyết Hệ số đối xứng Thời gian lưu (phút) 1 16842280 9626 1,29 15,72 2 16706110 9516 1,29 15,74 3 16842873 9441 1,28 15,76 4 16871228 9429 1,28 15,78 5 16748502 9430 1,28 15,82 6 16817834 9235 1,27 15,77 TB 16804805 9446 1,28 15,77 RSD (%) 0,18 1,36 0,98 0,22 PL 77 ĐỘ CHÍNH XÁC STT Mẫu chuẩn Mẫu thử Nồng độ (mg/mL) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/mL) Diện tích đỉnh Hàm Lượng (%) 1 0,0500 16842280 0,0507 16948927 99,5 2 16706110 0,0513 17181569 99,7 3 16842873 0,0505 16937836 99,8 4 16871228 0,0506 16955041 99,7 5 16748502 0,0504 16872023 99,6 6 16817834 0,0506 16913011 99,5 Hàm lượng trung bình (%) 99,6 RSD (%) 0,15 ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN STT Mẫu chuẩn Mẫu thử Nồng độ (mg/mL) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/mL) Diện tích đỉnh Hàm Lượng (%) 1 0,0500 16842280 0,0507 16948927 99,5 2 16706110 0,0513 17181569 99,7 3 16842873 0,0505 16937836 99,8 4 16871228 0,0506 16955041 99,7 5 16748502 0,0504 16872023 99,6 6 16817834 0,0506 16913011 99,5 1 0,0500 16780550 0,0503 16762658 99,8 2 16762089 0,0502 16734086 99,8 3 16722834 0,0498 16566810 99,7 4 16611745 0,0503 16738938 99,6 5 16748615 0,0502 16723528 99,8 6 16621903 0,0502 16728580 99,7 Hàm lượng trung bình (%) 99,7 RSD (%) 0,11 PL 78 TÍNH TUYẾN TÍNH STT Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh (mVxphút) Phương trình hồi quy 1 30 10193964 2 40 13446623 3 50 16928440 4 60 20314128 5 70 23514247 ĐỘ ĐÚNG Mức độ đúng Lượng mẫu trắng (mL) Lượng chuẩn thêm vào mẫu (mg) Lượng chuẩn tìm lại theo thực tế (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) RSD (%) 60 % 10,0 0,3000 0,3020 100,7 0,48 10,0 0,3000 0,3000 99,9 10,0 0,3000 0,3030 100,9 100 % 10,0 0,3000 0,5020 100,5 0,50 10,0 0,5000 0,5000 100,0 10,0 0,5000 0,4970 99,5 140 % 10,0 0,7000 0,6940 99,1 0,32 10,0 0,7000 0,0980 99,8 10,0 0,7000 0,6970 99,6 Tỷ lệ phục hồi TB (%) 99,99 RSD (%) 0,58 y = 335081x + 125445 R² = 0.9998 9000000 14000000 19000000 24000000 29000000 20 40 60 80 D iệ n t íc h đ ỉn h (m V xp h ú t) Nồng độ (µg/ml) PL 79 PHỤ LỤC 2.5. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP E ALLOPURINOL KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ TẠP E ALLOPURINOL PL 80 SẮC KÝ ĐỒ ĐẠI DIỆN TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG TẠP E TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG STT Diện tích đỉnh Số đĩa lý thuyết Hệ số đối xứng Thời gian lưu (phút) 1 7337271 12207 1,191 17,558 2 7367607 12095 1,184 17,525 3 7296917 12026 1,181 17,538 4 7356620 12011 1,178 17,556 5 7336501 12020 1,177 17,584 6 7270671 12010 1,174 17,570 TB 7327598 12062 1,180 17,555 RSD (%) 0,5 0,12 PL 81 ĐỘ CHÍNH XÁC STT Mẫu chuẩn Mẫu thử Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Hàm lượng (%) 1 0,0500 7337271 0,0502 7338745 99,8 2 7367607 0,0503 7348356 99,7 3 7296917 0,0503 7339642 99,7 4 7356620 0,0502 7310998 99,4 5 7336501 0,0501 7312428 99,7 6 7270671 0,0502 7329143 99,7 Hàm lượng trung bình (%) 99,6 RSD (%) 0,14 ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN STT Mẫu chuẩn Mẫu thử Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Hàm lượng (%) 1 0,0500 7337271 0,0502 7338745 99,8 2 7367607 0,0503 7348356 99,7 3 7296917 0,0503 7339642 99,7 4 7356620 0,0502 7310998 99,4 5 7336501 0,0501 7312428 99,7 6 7270671 0,0502 7329143 99,7 1 0,0500 7298639 0,0499 7209150 99,7 2 7267015 0,0502 7271554 99,8 3 7304179 0,0505 7289511 99,6 4 7190222 0,0502 7237807 99,5 5 7272819 0,0501 7219883 99,4 6 7192903 0,0500 7224558 99,6 Hàm lượng trung bình (%) 99,6 RSD (%) 0,14 PL 82 TÍNH TUYẾN TÍNH STT Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Phương trình hồi quy 1 30 4388832 2 40 5779557 3 50 7305588 4 60 8725963 5 70 10161417 ĐỘ ĐÚNG Mức độ đúng Lượng mẫu trắng (ml) Lượng chuẩn thêm vào mẫu (mg) Lượng chuẩn tìm lại theo thực tế (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) RSD (%) 60 % 10,0 0,300 0,300 100,0 0,03 10,0 0,300 0,300 100,0 10,0 0,300 0,300 100,0 100 % 10,0 0,500 0,498 99,7 0,17 10,0 0,500 0,497 99,4 10,0 0,500 0,498 99,7 140 % 10,0 0,700 0,695 99,3 0,20 10,0 0,700 0,692 98,9 10,0 0,700 0,693 99,1 Tỷ lệ phục hồi TB (%) 99,55 RSD (%) 0,4 y = 144916x + 26483 R² = 0.9998 4000000 9000000 14000000 25 35 45 55 65 75 Diện tích pic (µV x phút) PL 83 PHỤ LỤC 2.6. THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG TẠP F ALLOPURINOL KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Khảo sát thành phần pha động Khảo sát pH pha động PL 84 SẮC KÝ ĐỒ ĐẠI DIỆN TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG TẠP F TÍNH TƯƠNG THÍCH HỆ THỐNG STT Diện tích đỉnh Số đĩa lý thuyết Hệ số đối xứng Thời gian lưu (phút) 1 114344261 6269 1,161 9,240 2 114280960 6156 1,103 9,158 3 114187886 6284 1,147 9,136 4 114234566 6171 1,145 9,276 5 114187743 6151 1,129 9,312 6 113958667 5954 1,157 9,329 TB 114199002 6164 1,140 9,240 RSD (%) 0,12 0,84 PL 85 ĐỘ CHÍNH XÁC STT Mẫu chuẩn Mẫu thử Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Hàm lượng (%) 1 0,0500 114280960 0,0512 115403358 98,8 2 114187886 0,0513 116062278 99,1 3 114344261 0,0513 115687406 98,8 4 114234566 0,0512 115680294 98,9 5 114187743 0,0511 115258242 98,9 6 113958667 0,0512 116820992 99,0 Hàm lượng trung bình (%) 98,9 RSD (%) 0,1 ĐỘ CHÍNH XÁC TRUNG GIAN STT Mẫu chuẩn Mẫu thử Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Nồng độ (mg/ml) Diện tích đỉnh Hàm lượng (%) 1 0,0500 114280960 0,0512 115403358 98,8 2 114187886 0,0513 116062278 99,1 3 114344261 0,0513 115687406 98,8 4 114234566 0,0512 115680294 98,9 5 114187743 0,0511 115258242 98,9 6 113958667 0,0512 116820992 99,0 1 0,0500 113548911 0,0519 115971741 98,6 2 113380490 0,0521 116753974 98,8 3 113498906 0,0517 115954048 99,0 4 113344676 0,0517 115727796 98,8 5 113300140 0,0516 115565916 98,8 6 113389354 0,0525 117333723 98,5 Hàm lượng trung bình (%) 98,83 RSD (%) 0,17 PL 86 TÍNH TUYẾN TÍNH STT Nồng độ (µg/ml) Diện tích đỉnh Phương trình hồi quy tuyến tính 1 35 79797134 2 45 102851142 3 50 114273919 4 55 125596438 5 65 148223747 ĐỘ ĐÚNG Mức độ đúng Lượng mẫu trắng (ml) Lượng chuẩn thêm vào mẫu (mg) Lượng chuẩn tìm lại theo thực tế (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) RSD (%) 70 % 10,0 0,0350 0,0348 99,5 0,16 10,0 0,0350 0,0349 99,6 10,0 0,0350 0,0348 99,3 100 % 10,0 0,0500 0,0498 99,7 0,11 10,0 0,0500 0,0497 99,5 10,0 0,0500 0,0498 99,6 130 % 10,0 0,0650 0,0648 99,7 0,23 10,0 0,0650 0,0647 99,6 10,0 0,0650 0,0645 99,2 Tỷ lệ phục hồi TB (%) 99,5 RSD (%) 0,2 y = 2.106x + 135909 R² = 1 70000000 120000000 170000000 30 40 50 60 70D iệ n t íc h đ ỉn h (m V xp h ú t) Nồng độ (µg/ml) PL 87 PHỤ LỤC 3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN TẠP ALLOPURINOL PHỤ LỤC 3.1. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP A ALLOPURINOL VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP A ALLOPURINOL Mã số: ĐT084-8 Ngày HL: KHOA TL CC&CĐC 1. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG STT CHỈ TIÊU YÊU CẦU 1 Mô tả Bột màu trắng 2 Định tính Sản phẩm phải đáp ứng phép thử định tính của tạp A allopurinol 2.1 - IR 2.2 - MS 2.3 - NMR 3 Nhiệt độ nóng chảy 230-240 °C 4 Mất khối lượng do làm khô Không quá 0,5% 5 Định lượng Không ít hơn 95% tính trên chế phẩm khan 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Mô tả: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính 2.2.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của chế phẩm trong KBr (hoặc đo trực tiếp ATR) có các đỉnh hấp thu tương ứng với phổ hồng ngoại của phổ chuẩn tạp A allopurinol 2.2.2. Phổ khối lượng ESI-MS có m/z phù hợp với công thức phân tử của tạp A allopurinol. 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Pha 10 mg mẫu thử trong 0,5 ml DMSO. Tiến hành đo phổ 1H NMR và 13C NMR. 1H NMR và 13C NMR có các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với phổ 1H NMR và 13C NMR của tạp A allopurinol chuẩn hoặc phổ của tạp A allopurinol từ thư viện phổ. PL 88 3. Nhiệt độ nóng chảy Đo bằng máy đo điểm chảy hoặc máy phân tích nhiệt vi sai (DSC). 4. Mất khối lượng do làm khô Cân chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm, sấy ở nhiệt độ 105 ºC cho đến khối lượng không đổi. 5. Định lượng Hệ thống sắc ký: máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu hoặc Hitachi đầu dò DAD. - Pha tĩnh: cột Gemini – NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm). - Pha động: acetonitril – nước acid phosphoric pH 2,5 (2:98). - Nhiệt độ cột: 25 °C - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút - Thể tích tiêm: 10 µl - Đầu dò: DAD, bước sóng 220 nm Dung dịch thử: cân khoảng 5,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung pha động đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn: cân khoảng 5,0 mg allopurinol impurity A EP CRS cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung pha động đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: acetonitril-pha động (2:8). Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của các thông số thời gian lưu và diện tích pic của tạp A allopurinol không được lớn hơn 2,0% và hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi nhận sắc ký đồ. Tính hàm lượng % tạp A allopurinol. PL 89 PL 90 PL 91 PHỤ LỤC 3.2. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP B ALLOPURINOL VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP B ALLOPURINOL Mã số: NCS2017-2 Ngày HL: KHOA TL CC&CĐC 1. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG STT CHỈ TIÊU YÊU CẦU 1 Mô tả Bột màu trắng 2 Định tính Sản phẩm phải đáp ứng phép thử định tính của tạp B allopurinol 2.1 - IR 2.2 - MS 2.3 - NMR 3 Nhiệt độ nóng chảy 284-285 °C 4 Mất khối lượng do làm khô Không quá 0,5% 5 Định lượng Không ít hơn 95% tính trên chế phẩm khan 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Mô tả: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính 2.2.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của chế phẩm trong KBr (hoặc đo trực tiếp ATR) có các đỉnh hấp thu tương ứng với phổ hồng ngoại của phổ chuẩn tạp B allopurinol trong thư viện (hay phổ hồng ngoại của chất chuẩn tạp B allopurinol). 2.2.2. Phổ khối lượng ESI-MS có m/z phù hợp với công thức phân tử của tạp B allopurinol. 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Pha 10 mg mẫu thử trong 0,5 ml DMSO. Tiến hành đo phổ 1H NMR và 13C NMR. 1H NMR và 13C NMR có các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với phổ 1H NMR và 13C NMR của tạp B allopurinol chuẩn hoặc phổ của tạp B allopurinol từ thư viện phổ. PL 92 3. Nhiệt độ nóng chảy Đo bằng máy đo điểm chảy hoặc máy phân tích nhiệt vi sai (DSC). 4. Mất khối lượng do làm khô Cân chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm và sấy ở nhiệt độ 105 ºC cho đến khối lượng không đổi. quan có trong mẫu thử dựa trên sắc ký đồ của dung dịch thử, trừ các pic mẫu trắng. 6. Định lượng Hệ thống sắc ký: HPLC Shimadzu hoặc Hitachi đầu dò DAD. - Pha tĩnh: cột Gemini – NX C18 (15 cm; 4,6 mm; 5 μm). - Pha động: acetonitril – nước acid phosphoric pH 2 (2:98). - Nhiệt độ cột: 25oC. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Thể tích tiêm: 10 μl. - Đầu dò: DAD, bước sóng 220 nm Dung dịch thử: cân khoảng 5,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung pha động đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn: cân khoảng 5,0 mg allopurinol impurity B EP CRS cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung pha động đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: acetonitril – pha động (2:8) Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của các thông số thời gian lưu và diện tích pic của tạp B allopurinol không được lớn hơn 2,0% và hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi nhận sắc ký đồ. Tính hàm lượng % tạp B allopurinol. PL 93 PL 94 PL 95 PHỤ LỤC 3.3. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP C ALLOPURINOL VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP C ALLOPURINOL Mã số: NCS2017-3 Ngày HL: KHOA TL CC&CĐC 1. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG STT CHỈ TIÊU YÊU CẦU 1 Mô tả Bột màu trắng 2 Định tính Sản phẩm phải đáp ứng phép thử định tính của tạp C allopurinol 2.1 - IR 2.2 - MS 2.3 - NMR 3 Nhiệt độ nóng chảy 231-233 °C 4 Mất khối lượng do làm khô Không quá 0,5% 5 Định lượng Không ít hơn 95% tính trên chế phẩm khan 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Mô tả: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính 2.2.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của chế phẩm trong KBr (hoặc đo trực tiếp ATR) có các đỉnh hấp thu tương ứng với phổ hồng ngoại của phổ chuẩn tạp C allopurinol trong thư viện (hay phổ hồng ngoại của chất chuẩn tạp C allopurinol). 2.2.2. Phổ khối lượng ESI-MS có m/z phù hợp với công thức phân tử của tạp C allopurinol. 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Pha 10 mg mẫu thử trong 0,5 ml DMSO. Tiến hành đo phổ 1H NMR và 13C NMR. 1H NMR và 13C NMR có các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với phổ 1H NMR và 13C NMR của tạp C allopurinol chuẩn hoặc phổ của tạp C allopurinol từ thư viện phổ. PL 96 3. Nhiệt độ nóng chảy Đo bằng máy đo điểm chảy hoặc máy phân tích nhiệt vi sai (DSC). 4. Mất khối lượng do làm khô Cân chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm và sấy ở nhiệt độ 105 ºC cho đến khối lượng không đổi. 5. Định lượng Hệ thống sắc ký: máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu hoặc Hitachi đầu dò DAD. - Pha tĩnh: cột C12 Synergi – 4u MAX – RP 80R (25 cm; 4,6 mm; 4 µm). - Pha động: acetonitril – nước acid phosphoric pH 2,0 (2:98). - Nhiệt độ cột: 25 oC. - Tốc độ dòng: 1 ml/phút. - Thể tích tiêm: 20 µl. - Đầu dò: DAD, bước sóng 200 nm. Dung dịch thử: cân khoảng 5,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml pha động, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung pha động đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn: cân khoảng 5,0 mg allopurinol impurity C EP CRS cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml pha động, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung pha động đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với pha động, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: acetonitril-pha động (2:8). Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của các thông số thời gian lưu và diện tích pic của tạp C allopurinol không được lớn hơn 2,0% và hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi nhận sắc ký đồ. Tính hàm lượng % tạp C allopurinol. PL 97 PL 98 PL 99 PHỤ LỤC 3.4. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP D ALLOPURINOL VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP D ALLOPURINOL Mã số: ĐT084-9 Ngày HL: KHOA TL CC&CĐC 1. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG STT CHỈ TIÊU YÊU CẦU 1 Mô tả Bột màu trắng 2 Định tính Sản phẩm phải đáp ứng phép thử định tính của tạp D allopurinol 2.1 - IR 2.2 - MS 2.3 - NMR 3 Nhiệt độ nóng chảy Khoảng 105 °C 4 Mất khối lượng do làm khô Không quá 0,5 % 5 Định lượng Không ít hơn 95 % tính trên chế phẩm khan 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Mô tả: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính 2.2.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của chế phẩm trong KBr (hoặc đo trực tiếp ATR) có các đỉnh hấp thu tương ứng với phổ hồng ngoại của phổ chuẩn tạp D allopurinol trong thư viện (hay phổ hồng ngoại của chất chuẩn tạp D allopurinol). 2.2.2. Phổ khối lượng ESI-MS có m/z phù hợp với công thức phân tử của tạp D allopurinol. 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Pha 10 mg mẫu thử trong 0,5 ml DMSO. Tiến hành đo phổ 1H NMR và 13C NMR. 1H NMR và 13C NMR có các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với phổ 1H NMR và 13C NMR của tạp D allopurinol chuẩn hoặc phổ của tạp D allopurinol từ thư viện phổ. PL 100 3. Nhiệt độ nóng chảy Đo bằng máy đo điểm chảy hoặc máy phân tích nhiệt vi sai (DSC). 4. Mất khối lượng do làm khô Cân chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm và sấy ở nhiệt độ 105 ºC cho đến khối lượng không đổi. 5. Định lượng Hệ thống sắc ký: máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu hoặc Hitachi đầu dò PDA. - Pha tĩnh: cột Gemini – NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm). - Pha động: acetonitril – nước acid formic pH 2,5 (30:70). - Nhiệt độ cột: 40 °C. - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Thể tích tiêm: 10 µl. - Đầu dò: DAD, bước sóng 254 nm Dung dịch thử: cân khoảng 5,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung acetonitril đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với acetonitril, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn: cân khoảng 5,0 mg tạp D allopurinol chuẩn cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung acetonitril đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với acetonitril, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: acetonitril : pha động (2:8). Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của các thông số thời gian lưu và diện tích pic của tạp D allopurinol không được lớn hơn 2,0% và hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi nhận sắc ký đồ. Tính hàm lượng % tạp D allopurinol. PL 101 PL 102 PL 103 PHỤ LỤC 3.5. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP E ALLOPURINOL VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP E ALLOPURINOL Mã số: ĐT084-10 Ngày HL: KHOA TL CC&CĐC 1. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG STT CHỈ TIÊU YÊU CẦU 1 Mô tả Bột màu trắng 2 Định tính Sản phẩm phải đáp ứng phép thử định tính của tạp E allopurinol 2.1 - IR 2.2 - MS 2.3 - NMR 3 Nhiệt độ nóng chảy Khoảng 195 °C 4 Mất khối lượng do làm khô Không quá 0,5 % 5 Định lượng Không ít hơn 95 % tính trên chế phẩm khan 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Mô tả: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính 2.2.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của chế phẩm trong KBr (hoặc đo trực tiếp ATR) có các đỉnh hấp thu tương ứng với phổ hồng ngoại của phổ chuẩn tạp E allopurinol trong thư viện (hay phổ hồng ngoại của chất chuẩn tạp E allopurinol). 2.2.2. Phổ khối lượng ESI-MS có m/z phù hợp với công thức phân tử của tạp E allopurinol. 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Pha 10 mg mẫu thử trong 0,5 ml DMSO. Tiến hành đo phổ 1H NMR và 13C NMR. 1H NMR và 13C NMR có các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với phổ 1H NMR và 13C NMR của tạp E allopurinol chuẩn hoặc phổ của tạp E allopurinol từ thư viện phổ. PL 104 3. Nhiệt độ nóng chảy Đo bằng máy đo điểm chảy hoặc máy phân tích nhiệt vi sai (DSC). 4. Mất khối lượng do làm khô Cân chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm và sấy ở nhiệt độ 105 ºC cho đến khối lượng không đổi. 5. Định lượng Hệ thống sắc ký: máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu hoặc Hitachi đầu dò DAD. - Pha tĩnh: cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm). - Pha động: acetonitril – nước acid formic pH 2,5 (30:70). - Nhiệt độ cột: 40 °C. - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Thể tích tiêm: 10 µl. - Đầu dò: DAD, bước sóng 254 nm. Dung dịch thử: cân khoảng 5,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung acetonitril đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với acetonitril, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn: cân khoảng 5,0 mg tạp E allopurinol chuẩn cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung acetonitril đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: acetonitril : pha động (2:8). Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của các thông số thời gian lưu và diện tích pic của tạp E allopurinol không được lớn hơn 2,0% và hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi nhận sắc ký đồ. Tính hàm lượng % tạp E allopurinol. PL 105 PL 106 PL 107 PHỤ LỤC 3.6. XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP F ALLOPURINOL VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TP HCM TIÊU CHUẨN CƠ SỞ TẠP F ALLOPURINOL Mã số: ĐT084-11 Ngày HL: KHOA TL CC&CĐC 1. YÊU CẦU CHẤT LƯỢNG STT CHỈ TIÊU YÊU CẦU 1 Mô tả Bột màu trắng 2 Định tính Sản phẩm phải đáp ứng phép thử định tính của tạp F allopurinol 2.1 - IR 2.2 - MS 2.3 - NMR 3 Nhiệt độ nóng chảy Khoảng 247 °C 4 Mất khối lượng do làm khô Không quá 0,5 % 5 Định lượng Không ít hơn 95 % tính trên chế phẩm khan 2. PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1. Mô tả: Thử bằng cảm quan, chế phẩm phải đạt các yêu cầu đã nêu. 2.2. Định tính 2.2.1. Phổ hồng ngoại Phổ hồng ngoại của chế phẩm trong KBr (hoặc đo trực tiếp ATR) có các đỉnh hấp thu tương ứng với phổ hồng ngoại của phổ chuẩn tạp F allopurinol trong thư viện (hay phổ hồng ngoại của chất chuẩn tạp F allopurinol). 2.2.2. Phổ khối lượng ESI-MS có m/z phù hợp với công thức phân tử của tạp F allopurinol. 2.2.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Pha 10 mg mẫu thử trong 0,5 ml DMSO. Tiến hành đo phổ 1H NMR và 13C NMR. 1H NMR và 13C NMR có các tín hiệu cộng hưởng phù hợp với phổ 1H NMR và 13C NMR của tạp F allopurinol chuẩn hoặc phổ của tạp F allopurinol từ thư viện phổ. PL 108 3. Nhiệt độ nóng chảy Đo bằng máy đo điểm chảy hoặc máy phân tích nhiệt vi sai (DSC). 4. Mất khối lượng do làm khô Cân chính xác khoảng 0,1 g chế phẩm và sấy ở nhiệt độ 105 ºC cho đến khối lượng không đổi. 5. Định lượng Hệ thống sắc ký: máy sắc ký lỏng HPLC Shimadzu hoặc Hitachi đầu dò DAD. - Pha tĩnh: cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 μm). - Pha động: acetonitril – nước acid formic pH 2,0 (35:65). - Nhiệt độ cột: 25 °C. - Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. - Thể tích tiêm: 10 µl. - Đầu dò: DAD, bước sóng 254 nm. Dung dịch thử: cân khoảng 5,0 mg mẫu thử cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung acetonitril đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với acetonitril, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Dung dịch chuẩn: cân khoảng 5,0 mg tạp F allopurinol chuẩn cho vào bình định mức 5 ml, thêm 1 ml acetonitril, siêu âm 5 phút. Để nguội, bổ sung acetonitril đến vạch. Lắc đều. Pha loãng 5 ml dung dịch trên thành 100 ml với methanol, lọc qua màng lọc 0,45 µm. Mẫu trắng: acetonitril : pha động (2:8). Tiến hành: Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn. Phép thử chỉ có giá trị khi độ lệch chuẩn tương đối của các thông số thời gian lưu và diện tích pic của tạp F allopurinol không được lớn hơn 2,0% và hệ số bất đối trong khoảng 0,8 – 1,5. Lần lượt tiêm vào hệ thống dung dịch mẫu trắng, dung dịch chuẩn, dung dịch thử. Ghi nhận sắc ký đồ. Tính hàm lượng % tạp F allopurinol. PL 109 PL 110 PL 111 PHỤ LỤC 4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM PHỤ LỤC 4.1 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA TẠP A ALLOPURINOL PL 112 PL 113 PL 114 PL 115 PHỤ LỤC 4.2 KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA TẠP B ALLOPURINOL PL 116 PL 117 PL 118 PL 119 PHỤ LỤC 4.3. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA TẠP C ALLOPURINOL PL 120 PL 121 PL 122 PL 123 PHỤ LỤC 4.4. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA TẠP D ALLOPURINOL PL 124 PL 125 PL 126 PL 127 PHỤ LỤC 4.5. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA TẠP E ALLOPURINOL PL 128 PL 129 PL 130 PL 131 PHỤ LỤC 4.6. KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ LIÊN PHÒNG THÍ NGHIỆM CỦA TẠP F ALLOPURINOL PL 132 PL 133 PL 134 PL 135 PHỤ LỤC 5. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI TẠP 6 TẠP ALLOPURINOL BẰNG PHƯƠNG PHÁP LC/MS/MS PHỤ LỤC 5.1. KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ Ảnh hưởng của thành phần pha động Sắc ký đồ pha động là methanol – nước Sắc ký đồ pha động là acetonitril PL 136 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha động Sắc kí đồ pha động là acetonitril và acid formic tỉ lệ 30:70 Sắc kí đồ pha động là acetonitril và acid formic 55:45 PL 137 PHỤ LỤC 5.2. KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI 6 TẠP ALLOPURINOL BẰNG LC/MS/MS Độ đặc hiệu Sắc kí đồ dung môi pha mẫu, tá dược, mẫu phân hủy, tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol trong mẫu giả lập thành phẩm. PL 138 Sắc kí đồ dung môi pha mẫu, tá dược, mẫu phân hủy, tạp A, B, C, D, E, F và allopurinol trong mẫu giả lập nguyên liệu. PL 139 Độ đúng _____________________________________________________________ PL 140 PL 141 PL 142 Sắc ký đồ LOD và LOQ TẠP A allopurinol Tạp B allopurinol Tạp C allopurinol PL 143 Tạp D allopurinol Tạp E allopurinol Tạp F allopurinol PL 144 Allopurinol PHỤ LỤC 5.3. KẾT QUẢ ĐỊNH LƯỢNG CÁC MẪU NGUYÊN LIỆU VÀ THÀNH PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG Sắc kí đồ mẫu NL1 Tạp A Tạp B Tạp C Tạp D Tạp E Tạp F Allopurinol PL 145 Sắc kí Sắc ký đồ mẫu NL2 Sắc kí đồ mẫu NL3 Tạp A Tạp B Tạp C Tạp D Tạp E Tạp F Allopurinol PL 146 Sắc ký đồ mẫu TPTN1 Sắc ký đồ mẫu TPTN2 PL 147 Sắc ký đồ mẫu TPTN3 Sắc kí đồ mẫu TPTN4 PL 148 Sắc ký đồ mẫu TPTN5 Sắc ký đồ mẫu TPTN6 PL 149 Sắc ký đồ mẫu TPTN7 Sắc ký đồ mẫu TPTN8 PL 150 Sắc ký đồ mẫu TPNK1 Sắc ký đồ mẫu TPNK2