Luận văn Hiệu quảcủa benzyl adenine, naphthaleneacetic acid, indole-3-butyric acid và than hoạt tính trên sựnhân chồi và tạo rễ cây gấc (momordica cochinchinensis(lour.) spreng.) in vitro

t quá trình tiến hành thí nghiệm ghi nhận, hai nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA cây sinh trưởng và phát triển tốt với lá mới hình thành to hơn so với các nghiệm thức còn lại. Các nghiệm thức ở nồng độ BA cao (0,6 ppm; 0,8 ppm) lá hình thành nhỏ, thuôn nhọn, xanh vàng. Điều này có thể do cytokinin ngoài vai trò phân chia tế bào, còn kính thích sự biến đổi của những lục lạp còn non thành lục lạp, giúp chồi bên tránh bớt sự ức chế của chồi ngọn, làm chậm sự lão hoá đặc biệt là đối với bộ lá (Bùi Tuấn Anh và ctv., 2000). Do đó, cytokinin ở nồng độ cao đã gây bất lợi cho sự phát triển của bộ lá. 40 Bảng 3.1 Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng chiều cao cụm chồi của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 3,46 bc 4,68 de 0,1 ppm BA 3,78 abc 5,65 bc 0,2 ppm BA 3,62 abc 5,67 bc 0,4 ppm BA 3,67 abc 5,10 cd 0,6 ppm BA 3,45 ab 4,29 def 0,8 ppm BA 3,21 c 4,13 ef 1 ppm BA 3,34 bc 3,71 f 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA 4,06 a 6,38 ab 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA 4,09 a 6,73 a 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA 3,90 ab 5,87 abc 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 3,73 abc 5,07 cde F tính * ** CV (%) 11,23 9,9 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% Qua kết quả phân tích chiều cao cho thấy, vào cả 2 thời điểm 3 và 6 TSKC ở các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA và IBA chiều cao cụm chồi gia tăng cao hơn so với các nghiệm thức chỉ sử dụng BA, và sự khác biệt này biểu hiện càng rõ vào thời điểm 6 TSKC. Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm, quan sát thấy ở ba nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA, 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA và nghiệm thức đối chứng có sự xuất hiện rễ. Điều này có thể do hàm lượng auxin nội sinh trong cây gấc cao nên đã gây ra sự xuất hiện rễ. Đồng thời auxin được biết đến là chất điều hoà sinh trưởng có vai trò quan trọng trong sự kiểm soát sự tăng dài của tế bào từ đó đã làm gia tăng chiều dài thân chính. Theo Bùi Tuấn Anh và ctv. 41 (2000), khi có sự kết hợp giữa cytokinin nồng độ cao và auxin nồng độ thấp thì thân và lá được tạo ra ngược lại thì sự tăng trưởng của rễ bắt đầu. Do đó, có thể sự kết hợp ở nghiệm thức 0,1 ppm BA +0,01 ppm IBA đã xác định được sự phát triển của lá, thân, rễ, còn ở nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA chỉ giúp cho cây vươn chiều cao và tạo lá còn sự hình thành rễ rất ít. 3.1.2 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.2 cho thấy, vào thời điểm 3 và 6 TSKC trọng lượng cụm chồi ở tất cả các nghiệm thức đều gia tăng. Vào thời điểm 3 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao nhất (0,39 g) có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa1% so với 2 nghiệm thức: đối chứng và 0,2 ppm BA. Tuy nhiên không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Vào thời điểm 6 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA và nghiệm thức 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao nhất (1,37 g và 1,38 g) và có khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 1%. Nghiệm thức đối chứng có trọng lượng cụm chồi gia tăng thấp nhất (0,58 g). 42 Bảng 3.2 Hiệu quả của BA và IBA lên sự gia tăng trọng lượng cụm chồi của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 0,24 c 0,58 d 0,1 ppm BA 0,33 ab 0,70 cd 0,2 ppm BA 0,27 bc 0,72 cd 0,4 ppm BA 0,36 a 0,82 bcd 0,6 ppm BA 0,31 ab 1,05 b 0,8 ppm BA 0,35 a 0,95 bc 1 ppm BA 0,34 ab 1,00 bc 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA 0,33 ab 0,75 bcd 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA 0,35 a 0,91 bc 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA 0,39 a 1,37 a 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 0,35 a 1,38 a F tính * ** CV (%) 17,64 17,36 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% Từ kết quả phân tích ở Bảng 3.3 cũng cho thấy, có sự tác động phối hợp giữa 2 nồng độ BA và IBA, nhưng ở 3 TSKC sự biểu hiện khác biệt chưa lớn có thể do sự tác động phối hợp này chưa đủ thời gian để biểu hiện. Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm quan sát ở tất cả các nghiệm thức đều có sự hình thành mô sẹo ở phần gốc của mẫu chồi cấy, trong đó 2 nghiệm thức 0,8 ppm BA, 1 ppm BA và 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA có phần mô sẹo hình thành to, màu nâu vàng vào thời điểm 6 TSKC. Trọng lượng cụm chồi gia tăng bao gồm sự gia tăng về số chồi, chiều cao, số lá và khối mô sẹo hình thành. Khi tăng nồng độ BA thì mô sẹo gia tăng theo. Do đó trọng lượng cụm chồi ở các nghiệm thức có sử dụng kích thích tố đều có xu 43 hướng gia tăng cao. Theo Đặng Phương Trâm (1997), sự tăng sinh của mô sẹo chính là kết quả của sự cân bằng giữa trạng thái sinh lý của mẫu cấy và tác động của chất điều hoà sinh trưởng thực vật ngoại sinh trong môi trường nuôi cấy. Những mảnh cơ quan đã trưởng thành thường không có khả năng tạo mô sẹo. Ngược lại, những mảnh thân non hay cây con cắt đoạn dễ tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đặc biệt khi có auxin vì auxin có vai trò trong sự tạo mô sẹo (Ahloowalia, 1991; Komamin và ctv., 1992; Liu và ctv., 1993; Zimmerman, 1993) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao thì không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo ra mô sẹo (Torres, 1989) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Nhưng khi nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹo dạng bở và khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc. Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2002), đa số mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có sự phối hợp giữa cytokinin và auxin, nhưng cytokinin lại không cần thiết trong sự tạo mô sẹo từ cây một lá mầm và auxin phải được sử dụng với nồng độ cao, ví dụ: 2,4-D 9,0 - 45,2 µM (2,0 - 10,0 mg/l). 3.1.3 Số chồi lớn (chồi hữu hiệu, chiều cao chồi ≥ 2 cm) Một chồi được xem là hữu hiệu khi chồi này có thể được dùng để nhân tiếp hay tạo rễ cũng như có thể đem ra nhà lưới cho việc thuần dưỡng. Qua quá trình thử nghiệm, chọn các chồi có chiều cao từ 2 cm trở lên, có từ 3-5 lá là chồi hữu hiệu (chồi lớn) và chồi trung bình là chồi có từ 1 đến nhỏ hơn 2 cm chiều cao (chồi nhỏ). Kết quả trình bày ở Bảng 3.3 cho thấy, vào thời điểm 3 TSKC các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA và IBA thì sự phát sinh chồi cũng như chiều cao chồi cao hơn so với các nghiệm thức chỉ sử dụng BA. Trong đó nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có số chồi lớn nhiều nhất (1,23 chồi) và có khác biệt thống kê so với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 1%. Tuy nhiên lại không khác biệt so với 2 nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA, giữa các nghiệm thức còn lại có số chồi lớn vẫn không có sự khác biệt. Điều này có thể do trong thời gian đầu các mẫu chồi đang trong giai đoạn phân hoá. 44 Vào thời điểm 6 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA vẫn có số chồi lớn nhiều nhất (4,19 chồi) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với các nghiệm thức còn lại ở mức. Tuy nhiên lại không khác biệt so với nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA (3,78 chồi). Nghiệm thức 1 ppm BA có số chồi lớn ít nhất (0,28 chồi). Bảng 3.3 Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi lớn của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 0,1 ppm BA 0,2 ppm BA 0,4 ppm BA 0,6 ppm BA 0,8 ppm BA 1 ppm BA 0,1 ppm BA+ 0,01 ppm IBA 0,2 ppm BA+ 0,02 ppm IBA 0,4 ppm BA+ 0,04 ppm IBA 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 0,04 c 0,15 c 0,21 c 0,14 c 0,10 c 0,08 c 0,09 c 0,28 ab 0,73 a 1,23 a 0,23 bc 0,44 de 0,46 de 1,03 c 0,95 cd 0,60 de 0,55 de 0,28 e 2,08 b 3,78 ab 4,19 a 1,81 b Ftính CV (%) ** 80,54 ** 26,52 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% 3.1.4 Số chồi nhỏ (1 cm ≤ chiều cao chồi < 2 cm) Kết quả trình bày ở Bảng 3.4 cho thấy, sự kết hợp giữa BA và IBA đã có hiệu quả đáng kể trong giai đoạn nhân chồi gấc in vitro. 45 Vào thời điểm 3 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có số chồi nhỏ nhiều nhất (3,59 chồi) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 5% so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên lại không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA. Nghiệm thức đối chứng có số chồi nhỏ ít nhất (0,44 chồi). Vào thời điểm 6 TSKC, nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA vẫn cho thấy có sự phát sinh chồi nhỏ nhiều nhất (3,7 chồi) và khác biệt có ý nghĩa thống kê 1% so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên lại không khác biệt so với hai nghiệm thức: 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA và 0,4 ppm BA. Nghiệm thức đối chứng có sự hình thành số chồi ít nhất (0,24 chồi). Bảng 3.4 Hiệu quả của BA và IBA lên sự hình thành số lượng chồi nhỏ của mẫu chồi gấc in vitro theo thời gian (tuần sau khi cấy) Nghiệm thức Tuần sau khi cấy 3 6 Đối chứng 0,1 ppm BA 0,2 ppm BA 0,4 ppm BA 0,6 ppm BA 0,8 ppm BA 1 ppm BA 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA 0,44 e 0,46 e 0,51 e 0,58 cde 0,62 de 0,90 bcd 0,72 de 1,04 cde 2,26 ab 3,59 a 1,86 bc 0,24 f 1,60 e 2,30 bcd 2,91 ab 2,01 cde 1,84 de 1,52 e 1,64 bc 2,45 bc 3,70 a 2,92 ab F tính CV (%) ** 48,79 ** 12,15 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% 46 Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.4 cũng cho thấy, vào thời điểm 3 TSKC ở các nghiệm thức có sử dụng nồng độ BA cao (1 ppm BA; 0,8 ppm BA) và các nghiệm thức có sự kết hợp giữa BA và IBA (0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA) thì sự phát sinh chồi nhỏ nhanh hơn so với các nghiệm thức chỉ sử dụng BA. Nhưng sau 6 TSKC ở các nghiệm thức sử dụng nồng độ BA cao, các chồi hầu như không phát sinh hoặc phát sinh rất ít. Các chồi này ngắn hoặc tăng trưởng chậm sau khi hình thành, các lá nhỏ có màu xanh vàng. Điều này có thể do nồng độ cytokinin quá cao đã kích thích sự hình thành nhiều chồi nhỏ, nhưng những chồi này không thể kéo dài, làm lá biến dạng, làm cho chồi chứa nhiều nước (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Ở ba nghiệm thức 0,2 ppm BA; 0,4 ppm BA và 0,6 ppm BA sự phát sinh chồi nhỏ nhiều vào thời điểm 6 TSKC. Điều này có thể do thời gian đủ để nồng độ cytokinin có tác dụng tăng sinh chồi bên bằng cách kính thích sự tăng trưởng của chồi bên và làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn của mẫu chồi sau khoảng 4-6 tuần. Trong quá trình tiến hành thí nghiệm ghi nhận, ở nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA có sự phát sinh chồi cao nhất (chồi lớn và chồi nhỏ sau 3 và 6 TSKC). Nhưng chồi hữu hiệu ở nghiệm thức này có chiều cao chồi ngắn hơn so với chiều cao chồi hữu hiệu ở hai nghiệm thức 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA, kèm theo kích thước lá nhỏ hơn, có màu xanh nhạt và hình thái cây phát triển không tốt. Từ kết quả thí nghiệm trên cho thấy, ở nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA tuy có số chồi hữu hiệu không bằng so với nghiệm thức 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA, tuy nhiên giữa chúng lại không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Hình thái cây sinh trưởng và phát triển tốt, trọng lượng cụm chồi cũng như số chồi nhỏ đều ở mức cao so với các nghiệm thức còn lại. Do đó, trong dãy các nồng độ từ 0-1 ppm BA và IBA thì nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có hiệu quả nhất trong sự tạo chồi gấc in vitro. 47 3.1.5 Hệ số nhân giống Công thức tính hệ số nhân giống theo George (1993) K= (N/N0)T/t Trong đó: K: Số chồi N0: Số chồi ban đầu N: Số chồi thu được sau một lần cấy T: Thời gian cần để thực hiện (tuần) t: Thời gian giữa 2 lần cấy chuyền Từ kết quả thí nghiệm trên, nếu chọn nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA (có số chồi trung bình 3,78 chồi) để tiến hành nhân giống. Như vậy, nếu áp dụng công thức tính hệ số nhân chồi của George (1993), về mặt lý thuyết chúng ta có thể tạo ra được trên 104.300 chồi/năm từ một chồi ban đầu. Tóm lại, để có thể tạo ra một số lượng lớn chồi hữu hiệu phục vụ cho nhu cầu sản xuất, việc sử dụng kết hợp giữa cytokinin và auxin ở tỷ lệ 10/1 tỏ ra có ưu điểm hơn so với việc chỉ sử dụng cytokinin trong việc tạo chồi cây gấc trong điều kiện in vitro. Trong đó nghiệm thức 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có hiệu quả tạo chồi cao hơn so với các nghiệm thức còn lại. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm này có sự khác biệt đối với kết quả thí nghiệm tạo chồi gấc in vitro của Trang Ngọc Diệp (2005), với số chồi đạt cao nhất ở nghiệm thức 0,6 ppm BA (3,43 chồi) vào thời điểm 6 TSKC. Ngược lại, ở thí nghiệm này nghiệm thức 0,6 ppm BA chỉ tạo được 0,6 chồi hữu hiệu vào thời điểm 6 TSKC. Điều này có thể do mẫu chồi cấy chuyền nhiều lần trên môi trường cơ bản MS có bổ sung BA, nên nồng độ cytokinin tích tụ dần trong mẫu chồi cấy, từ đó làm cho chồi trở nên sinh trưởng và phát triển kém với lá xanh vàng, tạo callus to, tạo ít chồi hữu hiệu. Vì vậy, để đạt hệ số nhân chồi cao có thể nên sử dụng những mẫu chồi gấc khi mới đưa vào khử trùng tạo chồi, hoặc cấy chuyền mẫu chồi trên môi trường cơ bản MS không có bổ sung hoặc bổ sung chất ĐHST với nồng độ thấp. Như thế khi tiến hành tạo chồi sẽ cho hiệu quả cao hơn. 48 Hình 3.1 Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro ở các nghiệm thức có nồng độ BA khác nhau vào thời điểm 6 tuần sau khi cấy 0,1 ppm BA (6 TSKC) 0,2 ppm BA (6 TSKC) 0,4 ppm BA (6 TSKC) 0,6 ppm BA (6 TSKC) 0,8 ppm BA (6 TSKC) 49 Hình 3.2 Sự sinh trưởng của chồi gấc in vitro ở các nghiệm thức có nồng độ BA và IBA khác nhau vào thời điểm 6 tuần sau khi cấy 0,8 ppm BA+0,08 ppm IBA (6TSKC) 0,4 ppm BA+0,04 ppm IBA (6TSKC) Đối chứng (6 TSKC) 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA (6TSKC) 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA (6TSKC) 50 3.2 Thí nghiệm 2: Hiệu quả của Naphthaleneacetic acid (NAA) và than hoạt tính trên sự tạo rễ chồi gấc in vitro Trong quá trình vi nhân giống, sự tạo rễ bất định phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: độ tuổi và giai đoạn phát triển của cây, vị trí thu mẫu trên cây, loài thực vật, ánh sáng, nhiệt độ, đường, nguồn dinh dưỡng khoáng và các chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Đặc biệt là auxin, vì hầu hết thực vật cần phải có auxin để cảm ứng ra rễ. Nhưng loại và nồng độ auxin phụ thuộc vào nhiều loài thực vật. Trong đó, IBA và NAA là 2 loại auxin có hiệu quả nhất trong sự kích thích ra rễ. Thêm vào đó than hoạt tính cũng được biết đến như là yếu tố quan trọng góp phần tạo rễ tốt hơn cho nhiều loài thực vật (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Do đó, thí nghiệm này nhằm tìm ra loại và nồng độ auxin thích hợp cũng như sự hiện diện của than hoạt tính trong sự tạo rễ chồi gấc in vitro. 3.2.1 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) Kết quả trình bày ở Bảng 3.5 cho thấy, vào thời điểm 5 TSKC ở tất cả các nghiệm thức có sử dụng NAA đều có sự gia tăng trọng lượng cao hơn so với nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA). Trong đó nghiệm thức 0,2 ppm NAA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao nhất (0,4 g), có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với nghiệm thức đối chứng có trọng lượng gia tăng thấp nhất (0,23 g). Tuy nhiên giữa chúng lại không có sự khác biệt. Khi kể đến nhân tố than hoạt tính trong việc gia tăng trọng lượng mẫu chồi gấc sau thời gian nuôi cấy, ở các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính, trọng lượng gia tăng không đáng kể. Trong đó, nghiệm thức 0,4 ppm NAA có trọng lượng gia tăng cao nhất (0,27 g), có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA) có trọng lượng cụm chồi gia tăng thấp nhất (0,14 g). Tuy nhiên lại không có khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả trình bày ở Bảng 3.5 cũng cho thấy, có sự tương tác giữa nồng độ NAA và than hoạt tính. Các nghiệm thức có sự kết hợp giữa than hoạt tính và nồng độ NAA có trọng lượng cụm chồi gia tăng cao hơn so với các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính. Trong đó, nghiệm thức 0,2 ppm NAA có trọng lượng gia tăng cao nhất (0,59 g) và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các 51 nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức đối chứng có trọng lượng cụm chồi gia tăng thấp nhất (0,32 g). Bảng 3.5 Hiệu quả của NAA và than hoạt tính trong sự gia tăng trọng lượng cụm chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sai khi cấy Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) 0 2 Trung bình Đối chứng 0,1 ppm NAA 0,2 ppm NAA 0,4 ppm NAA 0,6 ppm NAA 0,8 ppm NAA 0,14 b 0,23 ab 0,21 ab 0,27 a 0,22 ab 0,19 ab 0,32 c 0,38 bc 0,59 a 0,46 b 0,45 b 0,58 a 0,23 c 0,30 b 0,40 a 0,37 ab 0,34 ab 0,39 a Trung bình 0,21b 0,46 a F (A) F (B) F (A x B) CV (%) ** ** ** 27,67 Ghi chú : Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): Than hoạt tính F(B): nồng độ NAA F(A x B): Tương tác giữa than hoạt tính và NAA Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm ghi nhận, ở nghiệm thức 0,8 ppm NAA có sự hình thành khối mô sẹo to nhất, có màu nâu vàng và xốp sau 5 tuần nuôi cấy. Điều này có thể do nồng độ NAA quá cao đã kích thích sự tạo mô sẹo. Trọng lượng tươi gia tăng bao gồm sự gia tăng về số lượng, chiều cao, số lá và khối mô sẹo hình thành ở phần gốc của mẫu chồi cấy. Kích thước khối mô sẹo gia tăng khi nồng độ chất điều hoà sinh trưởng gia tăng. Theo Nguyễn Đức Lượng và ctv. (2002), ở những loài cây thân gỗ cần có auxin mạnh với nồng độ cao hơn cây thân 52 thảo để ra rễ. Ngược lại cây thân thảo thường sử dụng loại auxin có tác dụng yếu như IAA trong suốt quá trình tạo rễ. Do đó, nếu sử dụng những loại auxin mạnh như NAA và 2,4-D với nồng độ cao thì có thể có sự tạo mô sẹo từ mẫu cấy. Mô sẹo sau khi hình thành nếu tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì mô sẹo tăng sinh nhanh và tuỳ thuộc vào thành phần cũng như nồng độ auxin sử dụng (Bonner và Galston, 1959; De Garcia và Martinez, 1995; Grant và Fuller, 1968), nồng độ auxin cao kích thích tạo mô sẹo dạng bở, nồng độ thấp mô sẹo dạng nốt và chắc (Ceriani và ctv, 1992) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Mô sẹo thường tăng trưởng trong môi trường đặc. Thêm vào đó, những mảnh cơ quan đã trưởng thành thì không có khả năng tạo sẹo, ngược lại cây non cắt đoạn có thể tạo mô sẹo trên môi trường có chất điều hoà sinh trưởng thực vật, đặc biệt là auxin. Như vậy, có thể mẫu chồi gấc đã được cấy chuyền nhiều lần trước khi bố trí thí nghiệm nên trở nên trẻ hoá, từ đó rất dễ tạo mô sẹo. 3.2.2 Chiều cao gia tăng (cm) Kết quả trình bày ở Bảng 3.6 cho thấy, ở các nghiệm thức có sử dụng NAA thì chiều cao gia tăng nhưng không khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA). Như vậy, có thể NAA ảnh hưởng không có ý nghĩa lên sự gia tăng chiều cao của mẫu chồi gấc in vitro trong môi trường tạo rễ, vì nghiệm thức đối chứng có chiều gia tăng cao nhất (3,75 cm), trong khi các nghiệm thức có sử dụng NAA lại có chiều cao gia tăng thấp hơn. Trong đó, nghiệm thức 0,8 ppm NAA có chiều cao chồi gia tăng thấp nhất (3,02 cm). Ở các nghiệm thức có phối hợp sử dụng than hoạt tính thì có chiều cao gia tăng cao hơn so với các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính. Trong đó, nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA) kết hợp với than hoạt tính vẫn có chiều cao gia tăng cao nhất (4,44 cm) và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức còn lại. Hai nghiệm thức có nồng độ NAA cao là 0,8 ppm NAA và 0,6 ppm NAA có chiều cao gia tăng thấp nhất lần lượt là 2,98 cm và 2,99 cm. Từ kết quả phân tích ở trên cho thấy không có sự tương tác giữa than hoạt tính và NAA lên sự gia tăng chiều cao chồi gấc in vitro. 53 Bảng 3.6 Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự gia tăng chiều cao của cụm chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) 0 2 Trung bình Đối chứng 0,1 ppm NAA 0,2 ppm NAA 0,4 ppm NAA 0,6 ppm NAA 0,8 ppm NAA 3,05 3,54 2,86 3,17 3,15 3,06 4,44 3,76 3,68 3,66 2,99 2,98 3,75 3,65 3,27 3,41 3,07 3,02 Trung bình 3,14 b 3,59 a F (A) F (B) F (A x B) CV (%) ** ns ns 55,39 Ghi chú : Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): Than hoạt tính F(B): nồng độ NAA F(A x B): Tương tác giữa than hoạt tính và NAA Từ những phân tích trên cho thấy, khi sử dụng NAA ở nồng độ thấp thì có sự gia tăng về chiều cao chồi. Ngược lại, ở nồng độ cao thì chiều cao chồi tăng không tăng hoặc gia tăng rất ít. Điều này có thể do vai trò của auxin có liên quan đến nhiều quá trình sinh lý trong cây. Vì auxin vừa có ảnh hưởng đến sự vươn dài tế bào đồng thời cũng ảnh hưởng đến sự sinh sản ethylene. Mà ngày nay, người ta đã biết ethylene có thể ức chế hoặc kích thích sự vươn dài của thân, rễ hoặc những cơ quan khác. Nhưng sự ức chế vươn dài biểu hiện nhanh hơn so với biểu hiện kích thích sự vươn dài ở thân và rễ. Theo Neljubow (1901) (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Chơn, 2005), ethylene vừa ức chế sự vươn dài, vừa kích thích sự nở rộng theo chiều ngang và sự phát triển theo chiều ngang. Sự kích thích sinh sản ethylene gây ra do 54 auxin được ghi nhận đầu tiên trên cà chua bởi Zimmerman và Wileoxon (1935), và trên nhiều loài thực vật như: đậu xanh, lúa, cỏ lồng vực; auxin kích thích sự sản sinh ethylene được điều hoà bởi mức độ auxin nội sinh (trích dẫn bởi Nguyễn Minh Chơn, 2005). Từ thí nghiệm 1 tạo chồi ghi nhận ở ba nghiệm thức: đối chứng, 0,1 ppm BA+0,01 ppm IBA và 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA có sự xuất hiện rễ, điều này có thể do hàm lượng auxin nội sinh trong cây gấc cao. Do đó, khi bổ sung auxin ngoại sinh vào môi trường tạo rễ đã làm gia tăng hàm lượng auxin trong mẫu chồi cấy. Từ đó có sự sản sinh ethylene cao, nên đã ức chế sự vươn dài của thân và rễ. 3.2.3 Số lá Kết quả trình bày ở Bảng 3.7 cho thấy, các nghiệm thức tạo rễ có sử dụng than hoạt tính có số lá mới hình thành có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính. Trong đó, nghiệm thức 0,2 ppm NAA có số lá nhiều nhất (5,28 lá), hai nghiệm thức 0,6 ppm NAA và 0,8 ppm NAA có số lá ít nhất lần lượt là 3,55 lá và 3,84 lá. Điều này có thể do than hoạt tính có hiệu quả trong sự tạo rễ chồi gấc in vitro. Tuy nhiên, giữa các nghiệm thức có sử dụng NAA số lá lại không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Tuy nhiên trung bình số lá ở các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính (5,2 lá) nhiều hơn so với các nghiệm thức có sử dụng than hoạt tính (4,25 lá). Kết quả tình bày ở Bảng 3.7 cũng cho thấy có sự tương tác giữa NAA và than hoạt tính giữa các nghiệm thức ở mức ý nghĩa 5%. 55 Bảng 3.7 Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự gia tăng số lá của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) 0 2 Trung bình Đối chứng 0,1 ppm NAA 0,2 ppm NAA 0,4 ppm NAA 0,6 ppm NAA 0,8 ppm NAA 3,81 5,96 5,05 5,18 5,90 5,28 4,30 ab 4,49 ab 5,28 a 4,04 ab 3,55 b 3,84 b 4,06 5,23 5,17 4,61 4,73 4,56 Trung bình 5,20 a 4,25 b F (A) F (B) F (A x B) CV (%) ** ns * 55,39 Ghi chú : Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): Than hoạt tính F(B): nồng độ NAA F(A x B): Tương tác giữa than hoạt tính và NAA Trong suốt quá trình tiến hành thí nghiệm khảo sát ở các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính ít tạo lá to, màu sắc lá ở ngọn chồi xanh nhạt, xuất hiện nhiều đốm có màu trắng hoặc vàng nhạt. Trong đó, hai nghiệm thức 0,8 ppm và 0,6 ppm lá có kích thướt nhỏ, hình vót nhọn, đôi khi các lá ở ngọn xoắn lại. Ngược lại, ở các nghiệm thức có sử dụng than hoạt tính, lá mới hình thành đều phát triển bình thường. Như vậy, có thể than hoạt tính không ảnh hưởng đến số lá nhưng ảnh hưởng đến sự phát triển toàn diện của lá. Đây chính là yếu tố quan trọng giúp cho cây gấc thích nghi tốt với điều kiện môi trường in vivo. Từ đó giúp cây sinh trưởng và phát triển tốt trong giai đoạn ex vitro. 56 3.2.4 Số rễ Kết quả trình bày ở Bảng 3.8 cho thấy, ở các nghiệm thức có sử dụng NAA thì nghiệm thức 0,2 ppm có sự hình thành số rễ nhiều nhất (2,58 rễ) và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% so với nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA) và các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức đối chứng có số rễ ít nhất (1,03 rễ). Kết quả trình bày ở Bảng 3.8 cũng cho thấy có sự khác biệt giữa 2 nghiệm thức tạo rễ (có than và không có than hoạt tính) ở mức ý nghĩa thống kê 1%. Trong đó các nghiệm thức có sử dụng than hoạt tính tỏ ra có hữu hiệu lên sự tạo rễ gấc in vitro. Kết quả trình bày ở Bảng 3.8 cũng cho thấy có sự tương tác giữa 2 yếu tố NAA và than hoạt tính lên sự hình thành số rễ của mẫu chồi gấc in vitro ở mức ý nghĩa thống kê 1%. Trong đó, nghiệm thức 0,2 ppm NAA có số rễ hình thành nhiều nhất (4,84 rễ) có khác biệt so với nghiệm thức đối chứng (không sử dụng NAA) có số rễ ít nhất (1,8 rễ). Tuy nhiên lại không khác biệt so với các nghiệm thức còn lại. 57 Bảng 3.8 Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự hình thành số rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) 0 2 Trung bình Đối chứng 0,1 ppm NAA 0,2 ppm NAA 0,4 ppm NAA 0,6 ppm NAA 0,8 ppm NAA 0,26 0,36 0,30 0,26 0,17 0,00 1,80 c 2,91 ab 4,84 a 4,00 ab 2,80 bc 2,42 bc 1,03 d 1,64 abc 2,58 a 2,13 ab 1,49 bcd 1,21 cd Trung bình 0,23 b 1,13 a F (A) F (B) F (A x B) CV (%) ** ** ** 36,59 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt có ý nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): Than hoạt tính F(B): nồng độ NAA F(A x B): Tương tác giữa than hoạt tính và NAA 3.2.5 Chiều dài rễ (cm) Kết quả trình bày ở Bảng 3.9 cho thấy có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% giữa các nghiệm thức có sử dụng và không sử dụng than hoạt tính lên sự kéo dài phác thể rễ gấc in vitro theo thời gian. Trong đó các nghiệm thức có sử dụng than hoạt tính thì tốt hơn. Khi khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA lên sự kéo dài phác thể rễ thì ở các nghiệm thức có sử dụng NAA đều có sự kéo dài phác thể rễ. Nhưng ở nồng độ càng cao sẽ hạn chế sự kéo dài rễ. Giữa các nghiệm thức có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Trong đó, nghiệm thức 0,2 ppm NAA có sự kéo dài phác thể rễ nhiều nhất (1,57 cm), nghiệm thức đối chứng có sự kéo dài phác thể rễ thấp nhất 58 (0,6 cm). Kết quả trình bày ở Bảng 3.9 cũng cho thấy không có sự tương tác giữa 2 yếu tố NAA và than hoạt tính lên sự kéo dài phác thể rễ vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Bảng 3.9 Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên chiều dài rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Nghiệm thức Than hoạt tính (g/l) 0 2 Trung bình Đối chứng 0,1 ppm NAA 0,2 ppm NAA 0,4 ppm NAA 0,6 ppm NAA 0,8 ppm NAA 0,22 0,28 0,24 0,18 0,14 0,00 0,97 2,14 2,90 1,78 1,70 1,60 0,60 c 1,21 ab 1,57 a 0,98 abc 0,92 abc 0,80 bc Trung bình 1,78 b 1,85 a F (A) F (B) F (A x B) CV (%) ** * ns 47,67 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt ý có nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): Than hoạt tính F(B): nồng độ NAA F(A x B): Tương tác giữa than hoạt tính và NAA Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.9 cũng cho thấy, ở các nghiệm thức có sử dụng than hoạt tính thì sự xuất hiện rễ cũng như chiều dài rễ cao hơn so với các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính. Điều này có thể do ảnh hưởng của than hoạt tính. Vì than hoạt tính có vai trò quan trọng trong sự tạo rễ bất định. Nó vừa có tác dụng hấp thu các chất hữu cơ vừa làm đen môi trường tạo sự cảm ứng ra rễ dễ (Cheema và Sharma, 1983 và Preil và Engelhardt, 1977) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức 59 Lượng và ctv., 2002). Nhưng khi sử dụng NAA ở nồng độ cao thì ức chế hình thành rễ, cũng như sự kéo dài phác thể rễ. Trong suốt quá trình thí nghiệm ghi nhận, ở tất cả các nghiệm thức không sử dụng than hoạt tính thì rễ chính hình thành có hình thái ngắn, to, không hoặc có rất ít sự tạo rễ phụ, đồng thời ở các nghiệm thức có sử dụng than hoạt tính nhưng nồng độ NAA cao 0,6 ppm và 0,8 ppm các rễ cũng hình thành ngắn, to và rất ít tạo rễ phụ. Ngược lại ở các nồng độ 0,4 ppm; 0,2 ppm; 0,1 ppm khi kết hợp với than hoạt tính thì các rễ hình thành to, dài và có phát sinh nhiều rễ phụ. Như đã biết, hầu hết thực vật cần có auxin để cảm ứng ra rễ và nhu cầu này sẽ thay đổi sau khi đã được khởi tạo. Để cảm ứng ra rễ thì thực vật cần nồng độ auxin cao, nhưng để kéo dài phác thể rễ (rễ sơ khởi) thì nồng độ auxin thấp là cần thiết. Vì vậy, người ta thường khởi tạo rễ bất định trong điều kiện in vitro với nồng độ auxin cao, sau đó để cho sự phát triển của phác thể rễ xảy ra trong điều kiện in vivo (Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002). Theo Julius Von Sachs (1880) (trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng và ctv., 2002), trong lá non và những chồi hoạt động có chứa một chất điều hoà sinh trưởng được biết đến là IAA có khả năng dẫn truyền và kích thích sự tượng rễ. Do đó, khi áp dụng thêm auxin ngoại sinh thì có thể kích thích sự tượng rễ và phát triển sớm của rễ, nhưng sự vươn dài rễ bị ức chế khi sử dụng ở nồng độ cao. Sự ức chế sinh trưởng của auxin được biết đến có liên quan đến sự kích thích sinh tổng hợp ethylene (Nguyễn Minh Chơn, 2005). Từ đó, khi ethylene hình thành sẽ là yếu tố sự cản trở sự kéo dài phác thể rễ. Từ kết quả thí nghiệm trên cũng cho thấy, ở nghiệm thức 0,2 ppm NAA kết hợp với than hoạt tính có số rễ và chiều dài phác thể cao nhất, số lá, chiều cao, trọng lượng tươi không khác biệt so với các nghiệm thức có chiều cao chồi, số lá, trọng lượng cao nhất. Vì vậy, trong dãy các nồng độ từ 0-0,8 ppm NAA thì nghiệm thức 0,2 ppm NAA kết hợp với than hoạt tính có hiệu quả nhất đối với sự tạo rễ của chồi gấc in vitro. 60 Hình 3.3 Hiệu quả của NAA và than hoạt tính lên sự tạo rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy Đối Chứng +Than (5 TSKC) 0,1 ppm NAA +Than (5 TSKC) 0,2 ppm NAA +Than (5 TSKC) 0,4 ppm NAA +Than (5 TSKC) 0,8 ppm NAA +Than (5 TSKC) 0,6 ppm NAA +Than (5 TSKC) 61 Hình 3.4 Hiệu quả của NAA lên sự tạo rễ của mẫu chồi gấc in vitro vào thời điểm 5 tuần sau khi cấy 0,6 ppm NAA (5 TSKC) 0,8 ppm NAA (5 TSKC) 0,2 ppm NAA (5 TSKC) 0,4 ppm NAA (5 TSKC) Đối Chứng (5 TSKC) 0,1 ppm NAA (5 TSKC) 62 3.2 Thí nghiệm 3: Khảo sát khả năng thích ứng ban đầu của cây gấc khi chuyển từ ống nghiệm ra vườn ươm trên 3 nền giá thể khác nhau: tro trấu, xơ dừa, tro trấu + xơ dừa (1:1) và nylon giữ ẩm Sau khi tiến hành tạo rễ, chúng tôi tiến hành thuần dưỡng trên 3 loại giá thể khác nhau: xơ dừa, tro trấu, xơ dừa+tro trấu (1:1), với 2 điều kiện không phủ và có phủ nylon giữ ẩm cho cây, tưới ẩm hàng ngày. Kết quả ghi nhân như sau: 3.3.1 Tỷ lệ sống (%) Qua kết quả ở Bảng 3.10 cho thấy giá thể trồng cũng như điều kiện có và không có sử dụng màng phủ nylon giữ ẩm có ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cây gấc khi đưa từ ống nghiệm ra vườn ươm. Phần lớn, ở các giá thể có phủ nylon thì tỷ lệ cây sống đạt cao hơn so với các giá thể không sử dụng nylon giữ ẩm và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong đó, tỷ lệ cây sống đạt cao nhất ở giá thể tro trấu kết hợp với nylon giữ ẩm (85%) vào thời điểm 4 tuần sau khi giâm. Tỷ lệ cây sống thấp nhất ở 2 giá thể tro trấu, tro trấu + xơ dừa không sử dụng nylon giữ ẩm lần lượt là 25% và 25%. Qua kết quả trình bày ở Bảng 3.10 cũng cho thấy, tỷ lệ cây sống giữa các giá thể trồng không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê. Trong đó giá thể tro trấu có tỷ lệ sống cao nhất (55%) và giá thể xơ dừa có tỷ lệ cây sống thấp nhất (42,5%). Tuy nhiên cũng từ kết quả trình bày ở Bảng 3.10 cho thấy, khi khảo sát sự tương tác giữa giá thể trồng và điều kiện có sử dụng và không có sử dụng nylon giữ ẩm cho cây thì tỷ lệ sống giữa các nghiệm thức không có sự khác biệt ý nghĩa thống kê. Trong đó giá thể tro trấu kết hợp với nylon giữ ẩm cũng cho tỷ lệ cây sống cao nhất (85%), giá thể xơ dừa cho tỷ lệ cây sống thấp nhất (40%). Điều này có thể do giá thể tro trấu có độ dinh dưỡng cao (giàu Kali), có độ thông thoáng cao, khả năng thoát nước tốt, rễ cây có thể hấp thụ nhiều không khí, cây không bị thối rễ. Kết quả này cũng được tìm thấy ở thí nghiệm thuần giống cúc CN97 trên giá thể tro trấu đạt tỷ lệ cây sống cao nhất 83,3% sau 15 ngày (Hoàng Thị Lan Phương và ctv., 2004). Giá thể tro trấu cũng tỏ ra có ưu điểm trong việc ra cây của ba giống cúc (S6, S7, S26) đạt tỷ lệ sống cao nhất, cụ thể: S6: 75%, S7: 90%, S26: 60% (Lê Hữu Cần và ctv., 2005). 63 Bảng 3.10 Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên tỷ lệ cây sống của cây gấc in vitro sau 4 tuần giâm Giá thể Nylon Không phủ Phủ Trung bình Xơ dừa Tro trấu Xơ dừa+tro trấu (1:1) 45 25 25 40 85 65 42,5 55 45 Trung bình 31,67 b 63,33 a F (A) F (B) F (AxB) CV (%) ** ns ns 40,61 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt ý có nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): nylon F(B): 3 loại giá thể F(A x B): Tương tác nylon và 3 loại giá thể 3.3.2 Chiều cao gia tăng (cm) Kết quả trình bày ở Bảng 3.11 cho thấy, sau 4 tuần giâm, đa số các cây đều có sự gia tăng chiều cao ở tất cả các giá thể. Nhưng giữa các giá thể có chiều cao gia tăng khác biệt không có ý nghĩa thống kê. Trong đó giá thể tro trấu có chiều cao gia tăng cao nhất (8,33 cm) và giá thể xơ dừa có chiều cao gia tăng thấp nhất (5,85 cm). Tuy nhiên khi có sự hiện diện của nylon giữ ẩm thì các giá thể có sử dụng nylon giữ ẩm cây có chiều cao gia tăng cao hơn so với cây ở các giá thể không sử dụng nylon giữ ẩm, và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Kết quả trình bày ở Bảng 3.11 cũng cho thấy, khi khảo sát sự tương tác giữa các giá thể và nylon giữ ẩm lên chiều cao gia tăng thì có sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong đó giá thể tro trấu có chiều cao gia tăng cao nhất (9,85 cm), khác biệt so với giá thể xơ dừa có chiều cao gia tăng thấp nhất (4,31 cm), 64 nhưng không khác biệt so với giá thể xơ dừa+tro trấu (7,58 cm). Điều này có thể do tình trạng cây lúc đem từ ống nghiệm ra vườn ươm và cách bố trí cây lên từng giá thể, ở điều kiện không phủ nylon giữ ẩm thì xơ dừa có khả năng giữ ẩm tốt nên tỷ lệ sống và chiều cao gia tăng cao nhất. Nhưng khi có nylon giữ ẩm thì cây lại thích nghi và phát triển tốt trên nền giá thể tro trấu với tỷ lệ sống và chiều cao gia tăng cao nhất. Bảng 3.11 Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên chiều cao cây gia tăng của cây gấc in vitro sau 4 tuần giâm Giá thể Nylon Không phủ Phủ Trung bình Xơ dừa Tro trấu Xơ dừa+tro trấu (1:1) 7,39 6,8 5,9 4,31 b 9,85 a 7,58 ab 5,85 8,33 6,74 Trung bình 6,7 b 7,23 a F (A) F (B) F (AxB) CV (%) * ns ** 53,73 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt ý có nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): nylon F(B): 3 loại giá thể F(A x B): Tương tác nylon và 3 loại giá thể 3.3.3 Số lá Kết quả trình bày ở Bảng 3.12 cho thấy, sau 4 tuần giâm, đa số các cây đều có sự gia tăng hình thành lá mới. Nhưng giữa các giá thể có số lá không khác biệt có ý nghĩa thống kê. Trong đó giá thể tro trấu cho số lá cao nhất (6,8 lá), giá thể xơ dừa cho số lá ít nhất (6,4 lá). 65 Tuy nhiên khi sử dụng nylon giữ ẩm, ở các giá thể có sử dụng nylon giữ ẩm có số lá cao hơn so với các giá thể không có sử dụng nylon giữ ẩm, và có khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1%. Trong đó, giá thể tro trấu có số lá gia tăng hình thành cao nhất (7,59 lá) và giá thể xơ dừa +tro trấu có số lá gia tăng thấp nhất (5,8 lá). Kết quả trình bày ở Bảng 3.12 cũng cho thấy, khi khảo sát sự tương tác giữa các giá thể và nylon giữ ẩm lên sự hình thành số lá mới thì không có khác biệt ý nghĩa thống kê. Trong đó, giá thể tro trấu có số lá gia tăng cao nhất (7,59 lá), giá thể xơ dừa có số lá gia tăng thấp nhất (6,13 lá). Bảng 3.12 Hiệu quả của 3 loại giá thể và nylon lên sự gia tăng số lá của cây gấc in vitro sau 4 tuần giâm Giá thể Nylon Không phủ Phủ Trung bình Xơ dừa Tro trấu Xơ dừa+tro trấu (1:1) 6,67 6,00 5,80 6,13 7,59 7,23 6,40 6,80 6,52 Trung bình 6,16 b 6,98 a F(A) F(B) F(AxB) CV (%) ** ns ns 52,16 Ghi chú: Trong cùng một cột các số có chữ số theo sau giống nhau không khác biệt có ý nghĩa thống kê. ns: không khác biệt ý có nghĩa thống kê *: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 5% **: khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa 1% F(A): nylon F(B): 3 loại giá thể F(A x B): Tương tác nylon và 3 loại giá thể Trong suốt quá trình tiến hành thuần dưỡng, quan sát ở tất cả các cây ngoài sự gia tăng hình thành số lá, chiều cao, số rễ mới và chiều dài rễ cũng gia tăng, thêm 66 vào đó kích thước lá to và hình thái cây phát triển tốt. Đặc biệt, các cây ở giá thể tro trấu kết hợp với nylon giữ ẩm có hình thái cây phát triển rất tốt. Ngoài ra, tuy các giá thể trước khi bố trí thí nghiệm đã được khủ trùng và có sử dụng thuốc duyệt nấm bệnh, nhưng phát hiện 2 cây ở giá thể tro trấu kết hợp với nylon giữ ẩm có xuất hiện côn trùng gây hại vào thời điểm 25 ngày sau khi giâm, mật số không đáng kể. Hiện tượng cây bị chết trong quá trình ex vitro có thể được giải thích như sau: trước hết có thể do điều kiện môi trường của in vitro và ex vitro hoàn toàn khác nhau. Trong điều kiện in vitro cây sống trong điều kiện có ẩm độ cao cây không bị mất nước và hoàn toàn không có vi sinh vật gây hại còn trong điều kiện ex vivo thì có ẩm độ thấp, cường độ ánh sáng cao làm cho cây dễ bị mất nước dẫn đến cây bị héo và chết. Thêm vào đó, điều kiện dinh dưỡng trong điều kiện in vitro được cung cấp đầy đủ khoáng và năng lượng (đường), ngược lại ở điều kiện in vivo cây phải chuyển từ dị dưỡng sang tự dưỡng, chính sự thay đổi đó đã làm ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây. Về mặt hình thái của cây, cây cấy mô chưa phát triển hoàn chỉnh với số khí khẩu và độ mở khí khẩu cao hơn so với cây trồng trong nhà lưới, vì vậy đã làm cho cây cấy mô bị mất nước rất cao. Cấu trúc của thân, lá và rễ cũng chưa hoàn chỉnh. Tóm lại, từ kết quả phân tích trên cho thấy, ở các giá thể có sử dụng nylon giữ ẩm có tỷ lệ cây sống cũng như chiều cao và số lá cao hơn so với các giá thể không sử dụng nylon giữ ẩm. Trong đó, giá thể tro trấu kết hợp với nylon giữ ẩm tỏ ra thích hợp đối với cây gấc in vitro khi bước đầu đem ra vườn ươm. Như vậy, việc giữ ẩm cho cây gấc in vitro khi bước đầu đem ra vườn ươm là yếu tố quyết định đến tỷ lệ cây sống cao nhất. 67 Hình 3.5 Sự sinh trưởng của gấc in vitro sau 4 tuần giâm 68 CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ kết quả thí nghiệm trên rút có thể ra kết luận như sau: - Môi trường thích hợp cho sự nhân chồi gấc in vitro là môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA hiệu quả nhất trong sự tạo chồi gấc in vitro. - Sử dụng môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2 ppm NAA kết hợp với 2 g/l than hoạt tính thích hợp cho tạo rễ chồi gấc in vitro. - Sử dụng môi trường chất nền là tro trấu có phủ màng nylon giữ ẩm thích hợp cho bước đầu thuần dưỡng cây gấc in vitro. 4.2 ĐỀ NGHỊ - Cần tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của loại và nồng độ auxin cũng như thành phần dinh dưỡng MS đến sự tạo rễ chồi gấc in vitro. - Cần tiếp tục nghiên cứu điều kiện, cách thức giữ ẩm cho cây gấc in vitro trong giai đoạn thuần dưỡng. 69 QUI TRÌNH NHÂN GIỐNG GẤC IN VITRO Thuần dưỡng Nylon giữ ẩm+ tro trấu Chuyển mẫu vào ống nghiệm chứa môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,5 ppm BA Ngâm mẫu trong nước xà phòng 10-15 phút Rửa mẫu lại nhiều lần dưới vòi nước chảy Ngâm mẫu trong dung dịch HgCl2 0,05% (trong 50 phút) rửa sạch 3 lần với nước cất tuyệt trùng. Sau đó cho mẫu vào dung dịch Streptomycine 0,05% (trong 50 phút) Chọn dây gấc to, không sâu bệnh, cho trái tốt Cắt thành đoạn (3-5 cm) có chứa mầm Rửa mẫu sơ bộ dưới vòi nước chảy Tạo rễ 0,2 ppm NAA+2g/l than hoạt tính Tạo chồi 0,2 ppm BA+0,02 ppm IBA Thuầ dưỡng Tạo rễ Tạo chồi 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO BÙI TUẤN ANH, VÕ VĂN BÉ, PHẠM THỊ NGA. 2000. Giáo trình sinh học đại cương A2. Thư viện khoa Nông Nghiệp. Trường Đại học Cần Thơ. ĐỖ TẤT LỢI. 2003. Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. Nhà xuất bản y học. ĐỖ THỊ TRANG NHÃ. 2005. Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng cytokynin và auxin lên sự tạo chồi và biến dị của dưa hấu tam bội (Citrullus Vulgaris Schrad.) in vitro. Luận văn thạc sĩ. Thư viện khoa Nông nghiệp. Trường Đại học Cần Thơ. GEORGE, E. F. 1993. Plant propagation by tissue culture. 2rd Edition. Exergetics limited. HOÀNG THỊ LAN HƯƠNG, NGUYỄN XUÂN LINH, NGUYỄN KIM LÝ. 2004. Nghiên cứu qui trình nhân nhanh giống cúc CN97 bằng phương pháp nuôi cây mô. Nông Nghiệp và phát triển Nông Thôn số 4/2004. Thư viện khoa Nông Nghiệp. Trường Đại học Cần Thơ. LÂM NGỌC PHƯƠNG, MAI QUANG THẢO.2003. Nhân giống dưa hấu tam bội Citrullus vulgaris Schrad. in vitro. Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ. LÊ HỮU CẦN, NGUYỄN THỊ HẢI HÀ. 2005. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ in vitro trong nhân nhanh một số giống cúc tại Thanh Hoá. Nông Nghiệp và phát triển Nông Thôn kỳ 2 tháng 12/2005. Thư viện khoa Nông Nghiệp. Trường Đại học Cần Thơ. LÊ TRẦN BÌNH, HỒ HỮU NGHỊ, LÊ THỊ MUỘI. 1997. Công nghệ Sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông nghiệp. LÊ VĂN HOÀ. 1997. Giáo trình sinh lý thực vật. Thư viện khoa Nông nghiệp. Trường Đại học Cần Thơ. NGUYỄN BẢO TOÀN. 2005. Giáo trình nuôi cây mô và tế bào thực vật. Tủ sách Đại học Cần Thơ. NGUYỄN ĐỨC LƯỢNG, LÊ THỊ THUỶ TIÊN. 2002. Công nghệ tế bào. Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh. 71 NGUYỄN MINH CHƠN. 2005. Giáo trình chất điều hoà sinh trưởng thực vật. Tủ sách Đại học Cần Thơ. NGUYỄN MINH HÙNG. 2006. Hiệu quả của cytokinin, auxin và than hoạt tính trên sự nhân chồi và tạo rễ cây dưa lê (Cucumis melo L.). Thư viện khoa nông nghiệp. Trường Đại học Cần Thơ NGUYỄN THỊ PHƯƠNG DUNG. 2006. Ảnh hưởng của một số hoá chất khử trùng đến sự sinh trưởng của chồi gấc (Momordica cochinchinesis (Lour.) Spreng.) trong điều kiện in vitro. Luận văn tốt nghiệp đại học. Thư viện khoa Khoa Học. Trường Đại học Cần Thơ. PHẠM HOÀNG HỘ. 1999. Cây cỏ Việt Nam (Quyển I). Nhà xuất bản Trẻ. Trang 568. Thư viện khoa Nông nghiệp. Trường Đại học Cần Thơ. PHAN VĂN MÃI, PHAN THỊ THUỶ NGÂN. 2006. Khảo sát môi trường làm giảm hiện tượng bất thường trong vi nhân giống khóm (Ananas comosus (L) Merr.) nhóm Queen trong điều kiện bình phản ứng sinh học. Luận văn tốt nghiệp đại học. Thư viện khoa Khoa Học. Trường Đại học Cần Thơ. TRANG NGỌC DIỆP. 2006. Ảnh hưởng của Benzyl Adenine đến sự sinh trưởng của chồi gấc (Momordica cochinchinensis (Lour.) Spreng) trong điều kiện in vitro. Thư viện khoa Khoa Học. Trường Đại học Cần Thơ. 72 BẢNG PHỤ CHƯƠNG 1 1.1 BẢNG PHÂN TÍCH ANOVA (THÍ NGHIỆM 1) 1.1 Ba tuần sau khi cấy 1.1.1 Chiều cao gia tăng (cm) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 4,033 7,453 11,486 0,403 0,169 2,381 0,0236 CV = 11,23% 1.1.2 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 0,090 0,148 0,238 0,009 0,003 2,678 0,0119 CV = 17,64% 1.1.3 Số chồi nhỏ Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 1,392 0,899 2,291 0,139 0,02 6,812 0,0000 CV = 48,97% 73 1.1.4 số chồi lớn Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 0,398 0,202 0,600 0,040 0,005 8,655 0,0000 CV = 80,54% 1.2 Sáu tuần sau khi cấy 1.2.1 Chiều cao gia tăng (cm) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 44,516 11,691 57,207 4,552 0,266 17.130 0,0000 CV = 9,9% 1.2.2 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 3,312 1,147 4,459 0,331 0,026 12,701 0,0000 CV = 17,36% 74 1.2.3 Số chồi nhỏ Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 1,391 0,205 1,596 0,139 0,005 29,926 0,0000 CV = 15,12% 1.2.4 Số chồi lớn Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Ngiệm thức Sai số Tổng cộng 10 44 54 2,372 0,310 2,682 0,237 0,007 33,635 0,0000 CV = 26,52% 1.2 BẢNG PHÂN TÍCH ANOVA (THÍ NGHIỆM 2) 1.2.1 Chiều cao gia tăng (cm) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Than (A) Nồng độ (B) A*B Sai số 1 5 5 48 3,944 2,285 3,747 17,802 3,944 0,457 0,749 0,371 10,6345 1,2324 2,0208 0,002 0,3087 0,0925 Tổng cộng 59 27,779 CV = 26,52% 75 1.2.2 Trọng lượng cụm chồi gia tăng (g) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Than (A) Nồng độ (B) A*B Sai số 1 5 5 48 1,058 1,193 0,13 0,252 1,058 0,039 0,026 0,005 201,9000 7,3833 4,975 0,0000 0,0000 0,0009 Tổng cộng 59 27,779 CV = 27,67% 1.2.3 Số lá Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Than (A) Nồng độ (B) A*B Sai số 1 5 5 48 0,09 0,051 0,085 0,259 0,09 0,01 0,017 0,005 16,7596 1,8995 3,1616 0,0002 0,1119 0,0151 Tổng cộng 59 0,485 CV = 10,00% 76 1.2.4 Số rễ Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Than (A) Nồng độ (B) A*B Sai số 1 5 5 48 3,428 0,305 0,242 0,565 3,428 0,061 0,048 0,012 291,0952 5,1830 4,1046 0,0000 0,0007 0,0035 Tổng cộng 59 4,54 CV = 36,59% 1.2.5 Chiều dài rễ (cm) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Than (A) Nồng độ (B) A*B Sai số 1 5 5 48 1,842 0,16 0,127 0,548 1,842 0,032 0,025 0,011 161,4545 2,7968 2,2296 0,0000 0,0270 0,0664 Tổng cộng 59 2,676 CV = 47,67% 77 1.3 BẢNG PHÂN TÍCH ANOVA (THÍ NGHIỆM 3) 1.3.1 Tỷ lệ sống (%) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Nylon (A) Giá thể (B) A*B Sai số 1 2 2 24 0,845 0,099 0,627 2,280 0,845 0,049 0,313 0,095 8,8971 0,5198 3,2997 0,0065 0,0542 Tổng cộng 29 3,85 CV= 40,61 % 1.3.2 Chiều cao gia tăng (cm) Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Nylon (A) Giá thể (B) A*B Sai số 1 2 2 24 0,346 0,016 1,231 1,615 0,346 0,008 0,615 0,067 5,1500 0,1204 9,1471 0,0325 0,0011 Tổng cộng 29 3,208 CV= 53,73% 78 1.3.3 Số lá Nguồn biến động Độ tự do Tổng bình phương Trung bình bình phương Ftính P Nylon (A) Giá thể (B) A*B Sai số 1 2 2 24 0,729 0,003 0,294 1,653 0,729 0,002 0,147 0,069 10,5861 0,0232 2,1309 0,0034 0,1407 Tổng cộng 29 2,679 CV= 52,16% 79 BẢNG PHỤ CHƯƠNG 2 1. Môi trường Murashige and Skoog (MS) (1962) Macro MS Hoá chất Hàm lượng (g/lít) NH4NO3 1,65 KNO3 1,9 MS1 MgSO4.7.H2O 0,37 MS2 CaCl2 0,33 MS3 KH2PO4 0,17 Micro MS Hoá chất Hàm lượng (mg/lít) H3BO4 6,2 MnSO4 22,3 ZnSO4.7.H2O 11,5 Na2MoO4.2.H2O 0,25 CuSO4.5.H2O 0,025 KI 0,83 CoCl2 0,025 FeSO4.7.H2O 27,8 Fe-EDTA EDTA 37,3 2. Vitamin Tên Hàm lượng (mg/lít) Nicotinic acid 100 Pyridoxin 100 Thiamin 100