Luận văn Khảo sát một số tác dụng dược lý của công thức phối hợp dược liệu Thiên niên kiện (Homalomena occulta) và Bách bệnh (Eurycoma longifolia) trên chuột nhắt trắng (Mus musculus var albino)

um iodide, Irritant R 36/38 Tiến hành Lần lượt hút chính xác cho vào ống nghiệm theo bảng 2.3 Bảng 2.3 Quy trình định lượng protein toàn phần Trắng Chuẩn Mẫu Thuốc thử 1 ml 1ml 500 µl Dung dịch chuẩn - 20 µl - Mẫu thử - - 10 µl Trộn đều, để yên 10 phút sau đó đem đi đo trong máy sinh hóa bán tự động Kỹ thuật định lượng creatinin trong huyết tương theo phương pháp laffé Nguyên tắc Creatinin trong môi trường kiềm phản ứng với acid picric tạo thành hợp chất màu cam. Creatinin + acid picric g hợp chất màu cam Chuẩn bị hóa chất Huyết thanh hoặc huyết tương (Heparin chống đông) R1 (pha loãng NaOH theo tỉ lệ 1NaOH:4H2O) R2 (Picric acid) Tiến hành Pha hỗn hợp gồm R1, R2 theo tỉ lệ 1R1:1R2 ta được thuốc thử A. Lần lượt hút chính xác cho vào ống nghiệm theo bảng 2.4 Bảng 2.4 Quy trình định lượng creatinin Nhiệt độ 370C Mẫu thử 50 µl Thuốc thử A 500 µl Trộn đều, sau 10 giây đem đi đo trong máy sinh hóa bán tự động. Chỉ số bình thường trên chuột nhắt trắng: 0,5 – 0,8 mg/dl Kỹ thuật định lượng urea toàn trong huyết tương theo phương pháp Berthelot urease Urea + H2O 2NH3 + CO2 Nguyên tắc Amonium + Salicylate + Hypochlorite sodium g Indophenol có màu xanh (2,2 – Dicarboxylindophenol ) Chuẩn bị hóa chất Huyết thanh hoặc huyết tương (Heparin chống đông) RGT1: Phosphat buffer (PH 7,0), sodium salicylate, sodium nitroprussiate, EDTA RGT2: Phosphate buffer (PH <13), sodium hypochlorite. ENZ: urease Tiến hành Pha hỗn hợp gồm RGT1 và ENZ theo tỉ lệ 100ml RGT1:1ml ENZ ta được thuốc thử A Lần lượt hút chính xác cho vào ống nghiệm theo bảng 2.5 Bảng 2.5 Quy trình định lượng urea Trắng Mẫu Mẫu/ Chất chuẩn - 10µl Thuốc thử A 1000 µl 1000 µl Trộn, ủ 5 phút ở 20 – 250C RGT2 1000 µl 1000 µl Trộn, ủ 10 phút ở 20 – 250C, đo trong máy sinh hóa bán tự động Kỹ thuật định lượng triglyceride toàn phần trong huyết tương theo phương pháp GPO-PAP Nguyên tắc lipases Triglycerides Glycerol + fatty acids Glycerol + ATP Glycerol-3-phosphate + ADP Glycerol-3-phosphate + O2 Dihydroxyacetone phosphate + H2O2 H2O2+ 4-aminoantipyrine Quinoneimine + HCl + H2O +4-chlorophenol GK GPO POD Chuẩn bị hóa chất Huyết thanh hoặc huyết tương (Heparin, EDTA hay citrate chống đông). Thuốc thử: PIPES buffer, 4-chlorophenol, 4-aminofenazona, ATP, Lipases, peroxidase, glycerol kinase, glycerol-3-phosphate oxidase. Magnesium ions. Tiến hành Lần lượt hút chính xác cho vào ống nghiệm theo bảng 2.6 Bảng 2.6 Quy trình định lượng triglyceride Trắng Chuẩn Mẫu Thuốc thử 1 ml 1 ml 1 ml Nước cất 10 µl - - Dung dịch chuẩn - 10 µl - Mẫu thử - - 10 µl Trộn đều, để yên 10 phút rồi đo trong máy sinh hóa bán tự động. Khảo sát tác dụng tăng lực bằng nghiệm pháp chuột bơi Brekhman có cải tiến [2] Mục đích Phương pháp thuận tiện, đơn giản đánh giá tình trạng phục hồi sức lực cơ thể động vật, đánh giá tác dụng tăng lực của thuốc. Tiến hành thí nghiệm Chọn chuột có trọng lượng trung bình 20 ± 2 g. Chuột được mang vào đuôi gia trọng bằng 5% thể trọng, cho chuột bơi trong thùng nước có dung tích 20 lít, đường kính 30 cm, chiều cao cột nước 25 cm, nhiệt độ 29 ± 10C. Chuột được cho bơi lần 1, thời gian bơi tính từ khi chuột được thả vào thùng nước, bơi đến khi chìm khỏi mặt nước 20 giây và không trồi lên được nữa, lúc đó vớt chuột ra lau khô (T0). Cho chuột nghỉ 5 phút, chia lô thí nghiệm: Hình 2.2 Chuột bơi Lô chứng: được uống nước cất. Lô thử 1: uống cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh liều 1,075 g/kg. Lô thử 2: uống cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh liều 2,15 g/kg. Một giờ sau khi cho chuột uống cao thử nghiệm, ghi nhận thời gian bơi lần 2 (T60 phút). Chuột cho uống nước cất và cao thử nghiệm liên tục (mỗi ngày vào một giờ nhất định) đến ngày thứ 7 và ngày thứ 14 tiến hành cho chuột bơi lần 3 ( T7 ngày) và lần 4 (T14 ngày). Đánh giá tác dụng tăng lực Đánh giá tác dụng tăng lực bằng so sánh tỉ lệ phần trăm của thời gian bơi giữa các lô chứng và lô thử sau khi dùng thuốc sau 60 phút, sau 7 ngày và sau 14 ngày. Trong mô hình này, không tính theo thời gian bơi tuyệt đối của chuột mà tính thời gian bơi của chuột sau khi dùng thuốc (T60 phút, T7 ngày, T14 ngày) gọi chung là Tt so với thời gian bơi lần 1 (T0) theo công thức: X% = (Tt/T0) × 100 T60 phút / T0 (%) của lô uống cao thuốc lớn hơn T60 phút / T0 (%) của lô chứng: cao thử nghiệm có tác động tăng lực tức thời. T7 ngày / T0 (%) của ô uống cao thuốc lớn hơn T7 ngày / T0 (%) của lô chứng: cao thử nghiệm có tác động tăng lực sau 7 ngày. T14 ngày / T0 (%) của lô uống cao thuốc lớn hơn T14 ngày / T0 (%) của lô chứng: cao thử nghiệm có tác động tăng lực sau 14 ngày. Khảo sát tác dụng giảm đau cấp [2] Nguyên tắc Gây đau xoắn bụng ở chuột bằng cách tiêm màng bụng dung dịch acid acetic. Số lần đau xoắn bụng phụ thuộc vào mức độ chịu đựng của chuột. Những chuột uống thuốc giảm đau thì số lần đau xoắn bụng giảm so với chuột bình thường. Tiến hành thí nghiệm Hình 2.3 Chuột bị xoắn bụng Chọn chuột có trọng lượng trung bình 25 ± 2 gam. Chuột được cho uống nước cất (lô chứng) hoặc cao thử nghiệm (lô thử) hàng ngày trong 7 ngày và 60 phút trước khi tiêm phúc mô acid acetic 0,6% vào ngày 7. Sau 10 phút, ghi nhận số lần xoắn bụng do đau của súc vật thử trong từng thời gian 10 phút gồm 3 giai đoạn: 1 - 10 phút, 11 - 20 phút, 21 - 30 phút. Thuốc đối chiếu Aspirin pH8 (viên bao phim, chứa acid acetylsalicylic 500 mg, Mekophar) được cho uống liều duy nhất 200 mg/kg, 60 phút trước khi tiêm phúc mô acid acetic. Khảo sát tác dụng kháng viêm cấp Viêm là một phản ứng không đặc hiệu của mô do sự tấn công của các yếu tố hóa học, vật lý, sinh học. Trong thành phần các yếu tố tấn công, thường có yếu tố miễn dịch hay vi sinh vật. Phản ứng viêm phát triển thành hai giai đoạn. Giai đoạn thứ nhất tiến triển rất nhanh là giai đoạn cấp tính. Giai đoạn thứ hai gồm những hiện tượng phức tạp, là sự phối hợp của những hiện tượng viêm và những quá trình sửa chữa, là giai đoạn mạn tính. Giai đoạn cấp tính gồm những hiện tượng về mạch máu và một phản ứng tế bào xuất hiện sớm. Ở những mô bị yếu tố tấn công làm tổn thương, các tiểu động mạch bị giãn gây nên ứ huyết trong các mao mạch. Trạng thái phù nề của mô là do sự rỉ dịch huyết tương qua thành các mao mạch vào trong khoang ngoài tế bào. Sự xuyên mạch của bạch cầu xảy ra song song với sự rỉ dịch huyết tương. Những hiện tượng cấp tính này là do sự can thiệp của hai yếu tố: yếu tố thần kinh là sự tê liệt các dây thần kinh co mạch ở các mao mạch, và các yếu tố thể dịch là sự giải phóng các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, leucotaxin, và bradykinin. Giai đoạn mạn tính của phản ứng viêm gồm một phản ứng tế bào phát triển chậm và sự tạo nên mô tạo keo. Sự di cư tế bào nguồn gốc từ máu hoặc từ trung mô vẫn tiếp diễn ở ổ viêm rất lâu sau sự can thiệp của các yếu tố tấn công. ổ viêm có thể tiến tới chỗ làm mủ hoặc hoại tử. Sự tăng sinh nguyên bào sợi và những tân tạo mao mạch tạo thành u hạt. U hạt này khi tiến triển mất các thành phần tế bào và các mao mạch tân tạo, trong khi đó mô tạo keo xuất hiện dần dần. Nguyên tắc Gây viêm sưng chân chuột bằng carragenin sau đó đo thể tích chân chuột. So sánh độ phù chân chuột giữa các lô uống cao thuốc, lô đối chiếu với lô thử và so sánh độ giảm phù chân chuột giữa lô uống cao thuốc và lô đối chiếu. Tiến hành thí nghiệm Chia 3 lô thí nghiệm (mỗi lô 10 con): lô chứng uống nước cất, lô đối chiếu uống celexcocib®, lô thử uống cao thuốc phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh. Cho chuột uống trước 30 phút rồi tiến hành tiêm 50µl caragenin 1% (caregenin là chất sulfopolygalactosid, chiết suất từ Chondrus crispus, có tác dụng gây viêm) vào gang bàn chân trái chuột. Hình 2.4 Tiêm carragenin vào chân chuột Thể tích chân chuột được xác định bằng thiết bị đo thể tích chân chuột (plethysmometer của Ugo Basile, Italy) vào các thời điểm sau khi tiêm carragenin 3 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Thuốc thử nghiệm được tiếp tục cho uống mỗi ngày liên tục trong 3 ngày sau khi tiêm carragenin và 1 giờ trước khi đo thể tích chân chuột. Dung dịch carragenin 1% chỉ pha trước khi dùng: cho carragenin vào một cối nhỏ, cho dần NaCl 0,9% vào từng ít một và nghiền bằng chày để tạo dung dịch đồng nhất. Để 60 phút sau đem sử dụng. Thuốc đối chiếu Celexcocib® (selective cyclooxygenase – 2 inhibitor) liều uống 25mg/kg Mức độ phù chân chuột biểu thị mức độ viêm cấp và được tính theo công thức: X% = (Vt – Vo)*100/Vo Trong đó: X% là tỉ lệ % độ sưng phù bàn chân chuột, Vt là thể tích chân chuột có tiêm carragenin, Vo là thể tích chân chuột không tiêm carragenin. Độ giảm phù chân chuột ở các lô thử, lô đối chiếu so với lô chứng được tính theo công thức: % Ức chế = (X – Y)/X *100 X: Độ sưng phù chân chuột ở lô chứng. Y: Độ sưng phù chân chuột ở lô đối chiếu, hoặc lô thử nghiệm. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thực nghiệm Malonyl dialdehyde [2] Có nhiều phương pháp được dùng trong nghiên cứu quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào. Các phương pháp này dựa trên: (a). Sự xác định các sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipid. (b). Sự nhận biết gốc tự do trong chuỗi phản ứng như đo phát quang sinh học đánh giá các gốc LOO* hình thành. (c). Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của mô. Hai nhóm (a), (b) đơn giản và dễ thực hiện hơn so với (c), đặc biệt là phương pháp xác định sản phẩm sinh ra trong quá peroxy hóa lipid: malonyl dialdehyd (MDA), là sản phẩm cuối cùng của quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, do đó được áp dụng rộng rãi trong thực tế. Phương pháp sử dụng acid thiobartiburic thường được áp dụng để xác định hàm lượng MDA trong tổ chức tế bào, từ đó đánh giá khả năng chống oxy hóa in vitro hoặc in vivo của chất nghiên cứu thể hiện qua việc làm giảm hàm lượng MDA. Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipid thông qua việc xác định hàm lượng MDA theo phương pháp của E.V Markorova (1989), J.Robak và cs (1988). Nguyên tắc MDA được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid, khi cho phản ứng với acid thiobarbituric, một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử acid thiobarbituric tạo phức hợp màu hồng hấp thụ cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường pH 2 – 3, ở nhiệt độ 90 – 100o trong vòng 10 – 15 phút. Phương trình như sau: Malonyl dialdehyd Trimethin complex Acid thiobarbituric Tiến hành thí nghiệm (1). Pha hóa chất, dung dịch thử: pha dung dịch đệm PBS 50mM (pH = 7,4), acid tricloacetic 10%, aicd thiobarbituric 0,8 %. Pha dung dịch mẫu thử ở các nồng độ: 2000 µg/m, 1000 gµ/ml, 500 µg/ml, 250 µg/ml, 125 µg/ml, 62,5 µg/ml (dung môi cồn 33o). (2). Tách não chuột và nghiền đồng thể trong dung dịch đệm PBS 50mM (tỉ lệ 1 : 10), tốc độ 13000 vòng/phút ở nhiệt độ 0 – 5oC. Pha phản ứng theo bảng 2.7 Bảng 2.7 Pha mẫu thử với dung dịch đồng thể não Ống Đồng thể não(ml) Đệm PBS 50mM (ml) Mẫu thử (ml) Trắng - 2 - Chứng 0,5 1,5 - Thử 0,5 1,4 0,1 (3). Ủ các ống ở 37oC trong 15 phút (tự oxy hóa). (4). Kết thúc phản ứng bằng dung dịch acid tricloacetic 10%, ly tâm lấy dịch trong cho phản ứng với 1m aicd thiobartiburic 0,8% ở 100oC trong 15 phút và đo màu ở l = 532 nm theo bảng 2. Bảng 2.8 Hỗn hợp phản ứng của phương pháp định lượng malonyl dialdehyd Ống Dung dịch sau li tâm (ml) PBS (ml) TCA (ml) TBA (ml) Trắng - 1 1 1 Chứng, thử 2 - - 1 Tính toán kết quả Hoạt tính chống oxy hóa (HTCO) được tính theo công thức: HTCO(%)= ((ODchứng – ODthử)/ ODchứng )*100 ODchứng: mật độ quang của mẫu chứng ODthử: mật độ quang của mẫu thử Các số liệu kết quả thử nghiệm được biểu thị bằng trị số trung bình của 2 lần đo. Chương 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN Độc tính cấp Bảng 3.1 Kết quả khảo sát độc tính cấp đường uống của cao phối hợp Liều cho uống (g cao/kg thể trọng) Số chuột thử Số chuột chết Phân suất tử vong (%) 25 10 6 60 24,15 10 3 30 21,5 5 0 0 Bảng kết quả ghi nhận phân suất tử vong sau 72 giờ cho thấy liều tối đa của cao đặc phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh có thể bơm qua kim cho chuột nhắt trắng uống là 25 g/kg thể trọng chuột có phân suất tử vong là 60%. Do đó không thể xác định được LD50 nhưng vẫn xác định được liều tối đa mà không có chuột nào chết, gọi là liều dưới liều chết LD0 = 21,5g cao/kg thể trọng chuột. Nhận xét Sau khi uống cao đặc phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh liều 25 g/kg (liều cao nhất có thể bơm qua kim) chuột có biểu hiện đầu tiên là gãi mõm liên tục, hoạt động chậm, lông hơi xù, khó thở khoảng 2 – 3 giờ. Sau 8 - 24 giờ thấy xuất hiện chuột chết (tỉ lệ chuột chết 60 %). Số con chuột còn lại vẫn hoạt động và ăn uống bình thường. Chúng tôi tiếp tục pha loãng cao thuốc với nước cất để tìm ra liều an toàn không gây chết chuột (liều này phải thấp hơn liều có độc tính 25 g/kg), sau khi pha loãng ta được liều 24,15 g/kg thể trọng. Những biểu hiện của chuột sau khi uống cao thuốc đều tương tự như lần thí nghiệm đầu tiên. Sau 72 giờ có 30 % tỉ lệ chuột chết, các con chuột còn lại vẫn hoạt động bình thường. Vậy cao phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh ở liều 24,15 g/kg cũng là liều có độc tính gây chết chuột. Chúng tôi tiếp tục pha loãng cao thuốc với nước cất được liều 21,5 g/kg. Sau 72 giờ uống cao thuốc tất cả con chuột đều ăn uống và hoạt động bình thường. Cao phối hợp Thiên niên kiện – Bách bệnh liều 21,5 g/kg là liều tối đa cho chuột uống nhưng không làm chết chuột. Bàn luận về độc tính cấp Chuột biểu hiện khó thở trong thời gian 2 – 3 giờ đầu do chuột uống cao thuốc khá đặc lại ít tan trong nước cất. Khi cho chuột uống cao thuốc được đưa xuống cổ họng, thì chuột sẽ nuốt để đưa cao thuốc xuống dạ dày. Lúc này thanh quản nâng lên ép chặt vào sụn nắp thanh quản do đó trong lúc nuốt chuột tạm nín thở, cao khá đặc nên việc nuốt của chuột trở nên khó khăn và thời gian dài nên gây ảnh hưởng đến đường hô hấp biểu hiện trên tất cả số chuột thí nghiệm sau khi uống cao Thiên niên kiện – Bách bệnh. Sau 8 – 24 giờ cho chuột uống cao thuốc có một số chuột di chuyển chậm và chết, lúc này thuốc đã có hoạt tính gây độc. Gan giữ vai trò quan trọng trong chuyển hóa thuốc, khử độc tính hoặc thải ra trong nước tiểu. Trường hợp NH3 sinh ra trong phản ứng khử độc cao thuốc ở gan (khử amin) được tổng hợp thành ure và được bài tiết vào máu, một phần bài tiết vào máu dưới dạng tự do hoặc gắn với acid glutamic thành glutamin nhưng cuối cùng đều bài xuất ở thận. Độc tính của cao Thiên niên kiện – Bách bệnh khá cao nên lượng NH3 tăng nhiều trong máu gây rối loạn đến hoạt động thần kinh và hô hấp (khó thở) là nguyên nhân gây chết cho chuột [4], [6]. Bàn luận về liều tương đối an toàn Liều tương đối an toàn Ds trên chuột nhắt trắng có thể được lấy giá trị bằng 1/5-1/10 hoặc nhỏ hơn (1/20 - 1/100) của LD0. Liều tương đối an toàn trên người được ngoại suy từ liều trên chuột nhắt trắng theo cách tính như sau: Liều trên chuột nhắt trắng x 0,085 (= hệ số ngoại suy liều có hiệu quả tương đương giữa chuột nhắt trắng và người) x thể trọng trung bình ở người trưởng thành (# 50 kg). Do đó, liều thử nghiệm được chọn cho các thử nghiệm tiếp theo: 1/10 LD0 = 2,15 g/kg và 1/20 = 1,075 g/kg LD0. Độc tính bán trường diễn Trọng lượng cơ thể chuột Trọng lượng cơ thể chuột trước thử nghiệm, sau 7 ngày, sau 14 ngày Bảng 3.2 Trọng lượng cơ thể chuột trước thử nghiệm, sau 7 ngày, sau 14 ngày Lô (N=10) Liều (g/kg) Trọng lượng cơ thể (g) Trước thử nghiệm Sau 7 ngày Sau 14 ngày Chứng - 20,43 ± 0,51 23,64 ± 0,91 26,29 ± 1,14 Cao phối hợp TNK - BB 1,075 19,80 ± 0,35 23,13 ± 0,36 24,80 ± 0,44 2,15 21,46 ± 0,37 24,00 ± 0,52 26,23 ± 0,79 Nhận xét Trọng lượng của chuột sau khi uống cao thuốc liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg ở các thời điểm sau 7 ngày và sau 14 ngày không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg, liều 2,15 g/kg đều không có tác dụng làm tăng thể trọng chuột sau 7 ngày, sau 14 ngày. Trọng lượng cơ thể chuột trước thử nghiệm, sau 1 tháng, sau 2 tháng Bảng 3.3 Trọng lượng chuột trước thử nghiệm, sau 1 tháng, sau 2 tháng Lô Liều (g/kg) Trọng lượng cơ thể (g) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 24,10 ± 0,23 30,90 ± 1,93 35,80 ± 1,76 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 25,30 ± 0,33 29,20 ± 1,16 34,30 ± 1,78 Nhận xét Trọng lượng của chuột sau khi uống cao thuốc liều 2,15 g/kg ở các thời điểm sau 1 tháng và sau 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không có tác dụng làm tăng thể trọng chuột sau 1 tháng và sau 2 tháng. Các thông số huyết học Hồng cầu Bảng 3.4 Số lượng hồng cầu Lô Liều (g/kg) Số lượng hồng cầu (triệu tế bào/µl) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 5,10 ± 0,19 6,64 ± 0,42 a 6,23 ± 0,22 a Cao phối hợp TNK - BB 2,15 5,17 ± 0,14 8,43 ± 0,20 ab 6,39 ± 0,24 a a: P < 0,05 so với trước thử nghiệm b: P < 0,05 so với lô chứng Nhận xét Số lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, sau 2 tháng tăng đạt ý nghĩa thống so với thời điểm trước thử nghiệm. Số lượng hồng cầu giữa lô chứng và lô uống cao phối lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg ở thời điểm trước thử nghiệm, sau 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Số lượng hồng cầu ở uống cao phối hợp lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng nhưng vẫn nằm trong giới hạn trị số hồng cầu của chuột nhắt bình thường. Như vậy cao phối hợp lượng hồng cầu ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu trong máu. Hemoglobin Bảng 3.5 Hàm lượng Hemoglobin Lô Liều (g/kg) Hemoglobin (g/dl) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 7,59 ± 0,75 11,12 ± 0,65 a 11,37 ± 0,71 a Cao phối hợp TNK - BB 2,15 7,40 ± 0,10 13,35 ± 0,37 ab 10,75 ± 0,31 a a: P <0,05 so với trước thử nghiệm b: P < 0,05 so với lô chứng Nhận xét Hàm lượng hemoglobin ở lô chứng và lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, sau 2 tháng tăng đạt ý nghĩa thống kê so với thời điểm trước thử nghiệm. Hàm lượng hemoglobin giữa lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê tại thời điểm trước thử nghiệm, sau 2 tháng. Sau 1 tháng hàm lượng Hemoglobin ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng nhưng vẫn nằm trong giới hạn hàm lượng hemoglobin ở chuột nhắt bình thường. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu trong máu. Hematocrit Bảng 3.6 Hàm lượng hematocrit Lô Liều (g/kg) Hematocrit (%) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 27,9 ± 0,76 34,7 ± 1,72 a 29,65 ± 1,46 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 28,65 ± 0,67 43,2 ± 1,37 ab 31,10 ± 1,01 a: P <0,05 so với trước thử nghiệm b: P < 0,05 so với lô chứng Nhận xét Hàm lượng hematocrit ở lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thí nghiệm, sau 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thí nghiệm. Hàm lượng hematocrit giữa lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tại thời điểm trước thử nghiệm, sau 2 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê, tại thời điểm sau 1 tháng tăng đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng nhưng sự thay đổi hematocrit vẫn nằm trọng giới hạn hàm lượng hematocrit ở chuột nhắt bình thường (38,5 – 45,1 %). Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến hàm lượng hematocrit. Tiểu cầu Bảng 3.7 Số lượng tiểu cầu Lô Liều (g/kg) Tiểu cầu (103 tế bào/µl) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 533,9 ± 41,4 513,1 ± 40,8 472,0 ± 62,1 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 535,0 ± 30,7 417,0 ± 21,0a 418,0 ± 56,8 a: P < 0,05 so với trước thử nghiệm Nhận xét Lô chứng: số lượng tiểu cầu ở lô chứng tại các thời điểm trước thí nghiệm, sau 1 tháng, sau 2 tháng đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg: số lượng tiểu cầu sau 1 và 2 tháng giảm so với trước thử nghiệm và đạt ý nghĩa thống kê ở thời điểm 1 tháng. Tuy nhiên, số lượng tiểu cầu giữa lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg so với lô chứng tại các thời điểm khảo sát không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến số lượng tiểu cầu trong máu. Bạch cầu Bảng 3.8 Số lượng bạch cầu Lô Liều (g/kg) Bạch cầu (tế bào/µl) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 5050 ± 456,1 5800 ± 366,7 4900 ± 541,6 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 5500 ± 258,2 5150 ± 428,5 4850 ± 494,7 Nhận xét Số lượng bạch cầu ở lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, sau 2 tháng đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Số lượng bạch cầu của lô uống cao phối hợp Thiên Niên Kiện - Bách Bệnh liều 2,15 g/kg tại các thời điểm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến số lượng bạch cầu trong máu. Thông số thuộc chức năng gan Hàm lượng GOT Bảng 3.9 Hàm lượng GOT Lô Liều (g/kg) GOT (IU/l) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 48,6 ± 5,2 40,1 ± 2,0 38,1 ± 3,5 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 45,1 ± 0,9 41,8 ± 1,8 36,6 ± 2,8 a a: P < 0,05 so với trước thử nghiệm Nhận xét Lô chứng: hàm lượng GOT trước thí nghiệm, sau 1 tháng, sau 2 tháng đều tương đương nhau đạt ý nghĩa thống kê. Hàm lượng GOT của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng GOT sau 2 tháng giảm đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng GOT của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tại các thời điểm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên Niên Kiện và Bách Bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến hàm lượng GOT trong máu. Hàm lượng GPT Bảng 3.10 Hàm lượng GPT Lô Liều (g/kg) GPT (IU/l) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 45,9 ± 3,4 47,6 ± 2,3 44,0 ± 3,3 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 45,8 ± 1,6 47,0 ± 2,5 43,0 ± 2,7 Nhận xét Hàm lượng GPT ở lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, sau 2 tháng đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng GPT của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tại các thời điểm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến hàm lượng GPT trong máu. Protein toàn phần Bảng 3.11 Hàm lượng protein toàn phần Lô Liều (g/kg) Protein toàn phần (g/l) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 4,94 ± 0,14 5,16 ± 0,19 5,06 ± 0,19 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 4,55 ± 0,16 5,26 ± 0,12 a 5,28 ± 0,14 a a: P < 0,05 so với trước thử nghiệm Nhận xét Hàm lượng protein ở lô chứng sau 1 tháng và sau 2 tháng đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng protein của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 và 2 tháng tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng protein của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tại các thời điểm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến hàm lượng protein trong máu. Thông số thuộc chức năng thận Creatinin Bảng 3.12 Hàm lượng creatinin Lô Liều (g/kg) Creatinin (mg/dl) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 0,50 ± 0,03 0,77 ± 0,06 a 0,71 ± 0,04 a Cao phối hợp TNK - BB 2,15 0,50 ± 0,04 0,70 ± 0,04 a 0,81 ± 0,03 a a: P < 0,05 so với trước thử nghiệm Nhận xét Hàm lượng creatinin ở lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, sau 2 tháng đều tăng đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng creatinin của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tại các thời điểm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến hàm lượng creatinin trong máu. Urea Bảng 3.13 Hàm lượng Urea Lô Liều (g/kg) Urea (mg/dl) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 52,46 ± 3,32 50,51 ± 2,29 51,72 ± 1,34 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 51,34 ± 1,47 47,99 ± 3,83 44,27 ± 3,01 ab a: P < 0,05 so với trước thử b: P < 0,05 so với lô chứng Nhận xét Hàm lượng urea ở lô chứng sau 1 tháng và sau 2 tháng đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng urea ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 2 tháng giảm đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm và giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng nhưng sự thay đổi này vẫn nằm trong trị số giới hạn urea ở chuột nhắt bình thường. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến hàm lượng urea. Triglyceride Bảng 3.14 Hàm lượng triglyceride Lô Liều (g/kg) Triglyceride (mg/dl) (N=10) Trước thử nghiệm Sau 1 tháng Sau 2 tháng Chứng - 113,8 ± 10,3 113,5 ± 4,8 121,0 ± 8,9 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 107,7 ± 10,4 119,6 ± 4,6 121,6 ± 6,2 Nhận xét Hàm lượng triglyceride ở lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, sau 2 tháng đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với trước thử nghiệm. Hàm lượng triglyceride của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tại các thời điểm không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến hàm lượng triglyceride trong máu. Trọng lượng gan, tim, thận Bảng 3.15 Trọng lượng tương đối của gan, tim, thận sau 2 tháng Lô Liều (g/kg) Trọng lượng tương đối (g%) (N=10) Gan Tim Thận Chứng - 4,66 ± 0,21 0,45 ± 0,05 1,19 ± 0,04 Cao phối hợp TNK - BB 2,15 4,80 ± 0,10 0,49 ± 0,02 1,19 ± 0,04 Nhận xét Trọng lượng tương đối của gan, tim, thận ở lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 2 tháng đều không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không ảnh hưởng đến trọng lượng tương đối của gan, tim, thận của chuột. Bàn luận về độc tính bán trường diễn Tại thời điểm trước thử nghiệm, chuột đang giai đoạn tăng trưởng và phát triển để chuyển sang giai đoạn trưởng thành nên các thông số hồng cầu, hemoglobin, hematocrit, protein, creatinin của lô chứng và lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg sau 1 tháng, 2 tháng đều tăng so với trước thử nghiệm. Các thông số trở nên ổn định hơn sau 1 tháng và sau 2 tháng. Số lượng hồng cầu, hemoglobin, hematocrit đều tăng chứng tỏ hồng cầu bình thường cả về hình dạng và chức năng. Lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg có tác dụng làm tăng hồng cầu so với lô chứng sau 1 tháng. Có thể giải thích rằng lô uống cao thuốc khả năng hấp thu chất dinh dưỡng cao hơn, ở thận tăng sản xuất erythropoidtine, tăng erythropoidtine gắn vào các thụ thể ở tủy xương làm tăng sự biệt hóa, tăng tốc độ trưởng thành của hồng cầu dẫn đến tăng số lượng hồng cầu hơn so với lô chứng [4] Số lượng tiểu cầu, bạch cầu ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg ở mức bình thường. Chứng tỏ tình trạng sức khỏe chuột bình thường (không bị suy tủy, không bị xuất huyết hay tổn thương ở các cơ quan, không bị nhiễm độc tính..) Hàm lượng GOT, GPT khi uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tương đương so với lô chứng, chứng tỏ gan không bị tổn thương, xơ hoặc hoại tử. Hàm lượng protein ở mức bình thường khi uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg tương đương so với lô chứng, chứng tỏ không rối loạn quá trình chuyển hóa ở gan, cao thuốc không có tác dụng làm tăng protein trong máu. Hàm lượng creatinin ở mức bình thường khi uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg chứng tỏ không ảnh hưởng đến chức năng thận, không bị rối loạn trong quá trình chuyển hóa ở thận. Hàm lượng urea khi uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg giảm so với lô chứng sau 2 tháng. Lượng urea thấp có thể là do quá trình khử acid amin trong cơ thể ở chuột uống cao thuốc thấp hơn lô chứng, không ảnh hưởng đến chức năng thận. Hàm lượng triglyceride trong máu ở mức bình thường khi uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg chứng tỏ không làm tăng lipid máu, các cholesterol xấu ảnh hưởng thành mạch máu. Nhận định chung về độc tính Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg (liều tương đương 1/10 LD0) sau 2 tháng uống không có biểu hiện bất thường về độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. Các thông số về huyết học, chỉ số sinh hóa thuộc về chức năng gan - thận nằm trong giới hạn bình thường. Khảo sát tác dụng tăng lực Bảng 3.16 Thời gian bơi của chuột tại các thời điểm ở các lô thử nghiệm Lô (N = 15) Liều (g/kg) T 0 T 60 phút T 7 ngày T 14 ngày Chứng - 34,07 ± 6,75 6,21 ± 0,75 34,57 ± 9,55 32,14 ± 10,95 Cao phối hợp TNK -BB 1,075 37,4 ± 5,41 8,93 ± 1,07 63,40 ± 13,82 73,47 ± 20,26 2,15 54,69 ± 8,55 9,23 ± 1,95 41,77 ± 11,33 55,23 ± 25,86 Bảng 3.17 Tỉ lệ % thời gian bơi ở các thời điểm T 60 phút, T 7 ngày, T 14 ngày so với T0 ở các lô thử nghiệm Lô (N = 15) Liều (g/kg) T 60 phút/ T0 T 7 ngày/ T0 T 14 ngày/ T0 Chứng - 25,37 ± 4,57 111,57 ± 24,93 105,53 ± 25,96 Cao phối hợp TNK -BB 1,075 28,11 ± 4,28 189,85 ± 38,81 272,32 ± 104,36 2,15 21,79 ± 4,20 92,40 ± 29,24 118,08 ± 48,54 Biểu đồ 3.1: Tỉ lệ % thời gian bơi ở các thời điểm T 60 phút, T 7 ngày, T 14 ngày so với T0 ở các lô thử nghiệm Nhận xét Thời điểm T60/ T0: tỉ lệ % thời gian bơi ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh hai liều 1,075 g/kg và 2,15 g/kg không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không thể hiện tác dụng tăng lực tức thời. Thời điểm T7 ngày/T0: tỉ lệ % thời gian bơi ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg tăng cao so với lô chứng nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê. Tỉ lệ % bơi ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không thể hiện tác dụng tăng lực sau 7 ngày uống. Thời điểm T14ngày/T0: tỉ lệ % thời gian bơi ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg và 2,15g/kg tăng so với lô chứng nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê. Như vậy cao phối hợp Thiên Niên Kiện và Bách Bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không thể hiện tác dụng tăng lực sau 14 ngày. Bàn luận về tác dụng tăng lực Thời gian bơi của chuột còn phụ thuộc vào tính hưng phấn của chuột, nhiệt độ môi trường nên ở lần đầu tiên chuột bơi với thời gian dài nhưng bơi lần 2, lần 3 chuột có thể bơi ít hơn hoặc nhiều hơn (thời gian bơi chênh lệch nhau nhiều giữa các con chuột và các thời điểm khảo sát). Ở thí nghiệm này thời gian bơi của chuột ở các lô là chênh lệch nhau không đạt ý nghĩa thống kê trong sinh học. Vì vậy chúng tôi chỉ có thể đánh giá thuốc có chiều hướng tác dụng tăng lực hay không. Ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg tỉ lệ % thời gian bơi trung bình cao hơn nhiều so với lô chứng nên có chiều hướng biểu hiện tác dụng tăng lực. Nhận định chung về tác dụng tăng lực Ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg có chiều hướng biểu hiện tác dụng tăng lực (sau 7 ngày có thời gian bơi tăng 83,4% và sau 14 ngày tăng 128,6% so với chứng). Khảo sát tác dụng giảm đau cấp Bảng 3.18 Số lần xoắn bụng ghi nhận mỗi 10 phút trong 30 phút của các lô thử nghiệm Lô thử nghiệmN = 12 Số lần xoắn bụng 0-10 phút 11-20 phút 21-30 phút Chứng 24,50 ± 2,66 20,25 ± 1,72 13,50 ± 1,51 Cao TN 1,075 g/kg 17,67 ± 1,15* 19,08 ± 2,58 8,92 ± 1,32* 15,08 ± 1,54* 4,20 ± 1,04* 11,25 ± 2,20 2,15 g/kg Aspirin 200 mg/kg 16,42 ± 1,62* 6,00 ± 1,23* 1,17 ± 0,41* * P < 0,05 so với lô chứng Biểu đồ 3.2: Số lần xoắn bụng của chuột tại các thời điểm ghi nhận mỗi 10 phút trong 30 phút của các lô thử nghiệm sau khi tiêm. Bảng 3.19 Tổng số lần xoắn bụng trong 30 phút của các lô thử nghiệm Lô thử nghiệmN = 12 Liều Tổng số lần xoắn bụng trong 30 phút % giảm đau so với chứng Chứng  - 58,25 ± 2,76 - Cao phối hợp 1,075 g/kg 30,08 ± 2,00* 48,35 2,15 g/kg 45,42 ± 3,92* 22,03 Aspirin 200 mg/kg 23,58 ± 2,86* 59,51 * P < 0,05 so với lô chứng Biểu đồ 3.3 Tổng số lần xoắn bụng của chuột trong 30 phút của các lô thử nghiệm Nhận xét Thời điểm từ 0 đến phút thứ 10: Số lần xoắn bụng giữa lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Số lần xoắn bụng của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg giảm nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg có tác dụng giảm đau ở phút thứ 0 – 10 sau khi gây đau xoắn bụng bằng acid acetic. Tác dụng giảm đau ở liều 1,075 g/kg tương đương với thuốc đối chiếu aspirin liều 200 mg/kg. Thời điểm từ phút thứ 11 đến phút 20: Số lần xoắn bụng của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg và liều 2,15 g/kg đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg có tác dụng giảm đau ở phút thứ 11 – 20 sau khi gây đau xoắn bụng bằng acid acetic. Tác dụng giảm đau ở liều 1,075 g/kg tương đương với thuốc đối chiếu aspirin liều 200 mg/kg. Thời điểm từ phút thứ 20 đến phút thứ 30: Số lần xoắn bụng của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng với. Số lần xoắn bụng của lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg giảm nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. So sánh tổng số lần xoắn bụng trong 30 phút sau khi tiêm: Số lần xoắn bụng của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều liều 1,075g/kg và liều 2,15 g/kg đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Bàn luận khảo sát tác dụng giảm đau cấp Khi tiêm acid acetic vào phúc mô chuột sẽ gây độc tế bào, phản ứng viêm xảy ra. Nhiều chất gây viêm được giải phóng trong dịch ngoại bào trong đó có chất gây đau như kinin, prostaglandin, các chất chuyển hóa acid, histamin [6]. Khi neuron cảm giác nhận tín hiệu gây đau ở vị trí tiêm acid acetic thì chúng sẽ chuyển trạng thái tĩnh sang trạng thái điện hoạt động và được dẫn truyền theo sợi trục dưới dạng một xung thần kinh. Neuron trung gian nhận thông tin từ các neuron cảm giác, chế biến thông tin và chuyển mệnh lệnh đến neuron đáp ứng. Neuron đáp ứng truyền thông tin tới cơ dẫn đến hiện tượng gây đau xoắn bụng ở chuột [6]. Lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg và liều 2,15 g/kg có tác dụng giảm đau cấp trong 30 phút sau khi tiêm acid acetic chứng tỏ cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có thể có tác dụng ức chế các chất trung gian hóa học gây đau. Nhận định chung về tác dụng giảm đau Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có tác dụng giảm đau trong thực nghiệm gây đau xoắn bụng bằng acid acetic. Mức độ giảm đau là 48,35% ở liều 1,075 g/kg và 22,03% ở liều 2,15 g/kg so với lô chứng uống nước cất. Tác dụng giảm đau của cao thử nghiệm yếu hơn thuốc đối chiếu Aspirin (liều uống 200 mg/kg). Mức độ giảm đau của Aspirin là 59,51% so với lô chứng uống nước cất. Mức độ giảm đau xoắn bụng ở lô uống cao thử nghiệm liều 1,075g/kg điển hình hơn liều 2,15g/kg khi ghi nhận chi tiết ở từng giai đoạn 10 phút trong 30 phút. Khảo sát tác dụng kháng viêm So sánh độ sưng phù chân chuột sau 3 giờ, 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ giữa lô thử, lô đối chiếu với lô đối chứng Bảng 3.20 Độ sưng phù chân chuột ở các lô thử nghiệm trong thực nghiệm carragenin Lô TN Mức độ viêm chân chuột (%) Sau 3 giờ Sau 24 giờ Sau 48 giờ Sau 72 giờ Chứng 119,94 ± 8,12 72,47 ± 6,55 64,02 ± 4,80 65,53 ± 7,69 Cao phối hợp 1,075 g/kg 87,22 ± 5,21* 93,11 ± 5,88* 73,44 ± 4,73 65,93 ± 7,72 60,71 ± 4,59 54,89 ± 8,66 39,73 ± 6,07* 40,90 ± 6,54* 2,15 g/kg Celebrex 25 mg/kg 71,67 ± 2,33* 41,82 ± 2,32* 29,47 ± 2,08* 22,36 ± 2,01* *P < 0,05 so với lô chứng Biểu đồ 3.4: Độ viêm chân chuột ở các lô thử nghiệm trong thực nghiệm carragenin Nhận xét Carragenin (viscarin) là chất sulfopolygalactocid, chiết xuất từ Chondrus crispus, có tác dụng gây viêm cấp. Mức độ viêm tối đa ở trong khoảng thời gian 3-4 giờ. Kết quả thực nghiệm cho thấy độ sưng phù chân chuột tăng tối đa sau 3 giờ tiêm carragenin (đạt 119,9 %) và giảm dần sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi tiêm. Độ sưng phù chân chuột sau 3 giờ tiêm carragenin: độ sưng phù chân chuột của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg, liều 2,15 g/kg, lô đối chiếu uống Celebrex® (celexcocib liều 25 mg/kg) đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/Kg có tác dụng kháng viêm cấp sau 3 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. Độ sưng phù chân chuột sau 24 giờ tiêm carragenin: độ sưng phù chân chuột ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không có sự khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Độ sưng phù chân chuột ở lô uống Celebrex® (celexcocib liều 25 mg/kg) giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng (P < 0,05). Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không có tác dụng kháng viêm so với lô đối chứng sau 24 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. Độ sưng phù chân chuột sau 48 giờ tiêm carragenin: độ sưng phù chân chuột ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg giảm so với lô đối chứng nhưng chưa đạt ý nghĩa thống kê. Độ sưng phù chân chuột ở lô uống Celebrex® (celexcocib liều 25 mg/kg) giảm so với lô chứng đạt ý nghĩa thống kê. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg không có tác dụng kháng viêm so với lô đối chứng sau 48 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. Độ sưng phù chân chuột sau 72 giờ tiêm carragenin: độ sưng phù chân chuột của các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg, liều 2,15 g/kg, lô đối chiếu uống Celebrex® (celexcocib liều 25 mg/kg) đều giảm đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng. Như vậy cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở liều 1,075 g/kg và liều 2,15 g/kg có tác dụng kháng viêm sau 72 giờ gây phù chân chuột bằng carragenin. So sánh độ giảm phù chân chuột giữa lô thử và lô đối chiếu Bảng 3.21 Độ giảm phù chân chuột ở các lô uống cao và lô uống celebrex® Lô TN Mức độ giảm viêm chân chuột (%) Sau 3 giờ Sau 24 giờ Sau 48 giờ Sau 72 giờ Cao phối hợp 1,075 g/kg 27,28 22,37 -1,34 9,02 5,17 14,27 39,37 37,59 2,15 g/kg Celebrex 25 mg/kg 40,25 42,29 53,97 65,88 Biểu đồ 3.5 Độ giảm viêm chân chuột ở các lô uống cao thuốc và lô uống celebrex® Nhận xét Độ giảm phù chân chuột các lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075 g/kg, liều 2,15 g/kg thể hiện rõ sau 3 giờ, sau 72 giờ đo nhưng vẫn còn thấp so với lô uống Celebrex® (celexcocib liều 25 mg/kg) Bàn luận về tác dụng kháng viêm cấp [2], [6] Ở thời điểm sau 3 giờ tiến hành gây viêm thì độ sưng phù chân chuột lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg, 2,15g/kg giảm rõ rệt so với lô chứng (liều 1,075 g/kg giảm 32,72%, liều 2,15g/kg giảm 18,83 % so với lô chứng). Chứng tỏ cao phối hợp có tác dụng gây ức chế các thành phần gây viêm như histamin, kinin, prostaglandin, chất bổ trợ, lymphokin đồng thời làm tĩnh mạch ít giãn hơn, làm giảm tính thấm ở các mao mạch (hiện tượng thoát dịch – chất dịch chứa các protein như các yếu tố đông máu và các kháng thể thấm từ mạch máu vào trong khoảng ngoại bào) kết quả là cao phối hợp làm giảm độ sưng phù chân chuột với lô chứng uống nước cất. Sau 24 giờ, sau 48 giờ độ sưng phù ở lô uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg, 2,15g/kg tương đương so với lô chứng vì sau phản ứng viêm cấp là giai đoạn đáp ứng miễn dịch có nhiệm vụ phá hủy tế bào chết. Các chất hóa học gọi là yếu tố gây tăng bạch cầu được tiết ra do tế bào bị tổn thương, làm giải phóng nhanh các neutrophil từ tủy xương và tăng nhiều trong máu trong thời gian ngắn. Các hóa chất gây viêm là tác nhân hóa ứng động lôi kéo các neutrophil và các bạch cầu khác tới nơi bị tổn thương. Do đó tại vùng tổn thương tập trung nhiều thực bào là các neutrophil và đại thực bào (macrophage). Vì chất dịch máu chảy tràn vào vùng tổn thương nên dòng máu ở vùng đó chảy chậm và neutrophil bắt đầu bám vào vách trong của mao mạch. Tín hiệu hóa học tiếp tục làm các neutrophil xuyên mạch đến vùng bị viêm nuốt các tế bào đã chết. Sau đó neutrophil được thay thế bằng bạch cầu đơn nhân (monocyte) từ máu đi vào vùng bị tổn thương. Monocyte là những thực bào yếu nhưng sau khi tới mô chúng phát triển thành các đại thực bào với chức năng “dọn dẹp” các mảnh vụn tế bào chết. Sau 72 giờ, lô chuột uống cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg, 2,15g/kg lại có tác dụng kháng viêm ở đây là do carragenin lại gây viêm tế bào ở thời điểm sau 72 giờ. Điều này chứng tỏ cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 1,075g/kg, 2,15g/kg có thể có tác dụng kháng viêm mạn tính. Điều này cần được nghiên cứu tiếp tục trên một số thực nghiệm gây viêm mạn như thực nghiệm tạo u hạt, thực nghiệm gây viêm khớp bằng collagen, liposaccharide hay bổ thể Freund. Kết quả khảo sát hoạt tính chống oxy hóa in vitro bằng thực nghiệm Malonyl dialdehyd Bảng 3.22 Hoạt tính chống oxy hóa của cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh Mẫu Nồng độ (µg/ml) OD1 OD2 ODtb HTCO (%) Chứng 0 0,421 0,557 0,4890 ± 0,0680 - Cao phối hợp Thiên niên kiện -Bách bệnh 2000 0,099 0,107 0,1030 ± 0,0040 78,94 1000 0,167 0,208 0,1875 ± 0,0205 61,66 500 0,312 0,303 0,3075 ± 0,0045 37,12 250 0,347 0,341 0,3440 ± 0,0030 29,65 125 0,412 0,399 0,4055 ± 0,0065 17,08 62,5 0,457 0,413 0,4350 ± 0,0220 11,04 Biểu đồ 3.6: Hoạt tính chống oxy hóa của cao phối hợp Thiên niên kiện và Bách bệnh Nhận xét Từ phương trình hồi quy tuyến tính y = 0.0513x + 11.448, xác định được IC50 của cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh là 751,5 µg/ml. Trolox là chất đối chiếu trong thử nghiệm MDA não. Giá trị IC50 của Trolox trong thử nghiệm này là 562,7 μg/ml. Trong thử nghiệm MDA, MDA là chất được sinh ra trong quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, khi phản ứng với thuốc thử acid thiobarbituric tạo ra phức hợp có màu hồng. Hoạt tính chống oxy hóa của chất thử thể hiện qua việc làm giảm màu của phức hợp này do làm giảm lượng MDA có trong mẫu. Do đó, mẫu cao thử làm giảm màu phức hợp MDA và acid thiobarbituric, chứng tỏ cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid tế bào nên đã làm giảm hàm lượng MDA trong dịch não chuột, dẫn đến hiện tượng giảm màu của các phức hợp này. Tuy nhiên, khi so sánh với chất đối chiếu Trolox (dựa vào giá trị IC50), hoạt tính của cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh thấp hơn. Chương 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ Kết luận Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có biểu hiện độc tính cấp, đường uống với liều LD0 là 21,5 g/kg. Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh liều 2,15 g/kg (liều = 1/10 LD0) sau 2 tháng uống không có biểu hiện bất thường về độc tính bán trường diễn trên chuột nhắt trắng. Các thông số về huyết học, chỉ số sinh hóa thuộc về chức năng gan - thận nằm trong giới hạn bình thường. Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh không thể hiện tác dụng tăng lực-hồi phục sức, tuy nhiên liều uống 1,075g/kg có chiều hướng biểu hiện tác dụng tăng lực. Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh ở hai liều uống 1,075 g/kg và 2,15 g/kg có tác dụng giảm đau, kháng viêm. Cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh có hoạt tính ức chế quá trình peroxy hóa lipid tế bào nên đã làm giảm hàm lượng MDA trong dịch não chuột. Đề nghị Tiếp tục khảo sát tác dụng kháng viêm mạn của cao phối hợp Thiên niên kiện - Bách bệnh. Cao thuốc Thiên niên kiện - Bách bệnh có thể định hướng nghiên cứu dạng chế phẩm phù hợp (viên nang hoặc rượu thuốc) trong hỗ trợ điều trị các loại bệnh mạn tính như đau nhức xương khớp hoặc tăng cường thể trạng tổng quát.. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt [1] Viện Dược liệu (2007), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tập I, tập II, trang 116 – 118, 868. [2] Viện Dược Liệu (2006), Phương pháp nghiên cứu tác dụng dược lý của thuốc từ thảo dược, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, trang 57 – 63, 140 – 141, 279 – 284, 295,311 – 320. [3] Đỗ Trung Đàm (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp của thuốc, Nhà xuất bản Y học Hà Nội, trang 7 - 22. [4] Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh (2006), Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Nhà xuất bản Y Học chi nhánh Thành phố Hồ Chí Minh. [5] Lê Thị Luyến (2010), Bệnh học, Nhà xuất bản Y Học. [6] Nguyễn Đình Giậu, Nguyễn Chi Mai, Trần Thị Việt Hồng (2000), Sinh lý học người và động vật, Nhà xuất bản Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh, trang 7 – 91, 187 – 188, 235 – 237. [7] Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Huyên (1998), Giáo trình sinh hóa hiện đại, Nhà xuất bản giáo dục, trang 255 – 261. [8] Bộ Y tế, Quy chế đánh giá tính an toàn và hiệu lực thuốc cổ truyền, Quyết định 371/BYT – QĐ, 12-3-1996. [9] Nguyễn Phương Dung (2007), Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm Bảo Kiện, Y học TP. Hồ Chí Minh, tập 11, phụ bản số 2, 112-116. [10] Lê Thị Hồng Vân, Nguyễn Ngọc Khôi, Nguyễn Minh Đức (2010), Y học TP Hồ Chí Minh (2010), nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình chế biến lên sự thay đổi thành phần hóa học saponin và tác dụng tăng lực của sâm Việt Nam, Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 14, phụ bản số 1, 145-150. [11] Nguyễn Thị Thu Giang, Đỗ Tường Hạ, Thái Khắc Minh, Võ Phùng Nguyên, Trần Thành Đạo (2010), Tổng hợp và đánh giá tác dụng kháng viêm in vivo của dẫn chất polyoxychalcon, Y học Tp Hồ Chí Minh, tập 14, phụ bản số 1, 93-99. Tài liệu nước ngoài [12] Byeong-Cheol Kang, Kyung-Sun Kang, Yong-Soon Lee (2005), Biocompatibility and long-term toxicity of Innopol imlant, a Biodegradable polymer Sacffold, Exp.Anim,54(1), 37-52. [13] Erik Walum (1998), Acute oral toxicity, Environmental heath perspect, 106(2): 497-503. [14] George J. Amabeoku and Joseh Kabatende (2012), Antinociceptive and anti-inflammatory activities of leaf methanol extract of Cotyledon orbiculata L. (Crassulaceae), Hindawi publishing corporation, Advances in Pharmacological Sicences, volume 2012, article ID 862625. [15] Hu YM, Liu C, Cheng KW, Sung HH, Williamsm LD, Yang ZL, Ye WC (2008) Sesquiterpenoids from Homalomena occlulta affect osteoblast proliferation, differentiation and mineralization in vitro, Phytochemistry, 69(12):2367-2373. [16] Hu YM, Yang ZL, Wang H, Ye WC (2009) Nat Prod Res, 23(14):1279-83 [17] Low BS, Teh CH, Yuen KH, Chan KL (2011), Physico-chemical effects of the major quassinoids in a standardized Eurycoma longifolia extract (Fr2) on the bioavailability and pharmacokinetic properties, and their implications for oral antimalarial activity, Nad Prod Commun, 6(3):337-341. [18] Mark A. Suckow, Peggy Danneman, Cory Brayton (2001), The laboratory mouse, CRC Press, 18 – 21. [19] Miyake K, Li F, Tezuka Y, Awale S, Kadota S (2010), Cytotoxic activity of quassinoids Eurycoma longifolia, Nat Prod Commun, 5(7):1009-1012. [20] Orish Ebere Orisakwe, Onyenmechi Johnson Afonne, Mary Adaora Chude, Ejeatuluchukwu Obi, and Chudi Emma Dika (2003), Sub-chronic toxicity studies of the aqueouse extract of Boerhavia diffusa leaves, Journal of Health science, 49(6) 444-447. [21] Pena, et al. (2006), Anti-inflammatory and anti-diarrheic activity of Isocarpha cubana Blanke, Pharmacology online 3: 744-749. [22] S.D.S Banjarnahor, Risna T. Dewi, Indah D. Dewijanti, M.Angelina (2008), Acute toxicity study and LD50 determination of MTC fraction from Aspergillus terreus Koji, Proceeding of the International seminar on Chemistry 2008 (pp. 676-678) Jatinangor. [23] Shuid AN, Abu Bakar MF, Abdul Shukor TA, Muhammad N, Mohamed N, Soelaiman IN (2011), The anti-osteoporotic effect of Eurycoma longifolia in aged orchidectomised rat model, Aging Male, 14(3):150-154. [24] Tambi MI, Imran MK, Henkel RR (2012), Standardised water – soluble extract of Eurycoma longifolia, Tongkat ali, as testosterone booster for managing men with late-onset hypogonadism, Andrologia, 44 Suppl 1:226-30, doi: 10.1111/j.1439-0272.2011.01168.x. [25] Tambi MI, Imran MK 2010, Eurycoma longifolia Jack in managing idiopathic male infertility, Asian J Androl, 12(3):376-380. [26] Wang YF, Wang XY, Lai GF, Lu CH, Luo SD (2007), Tree new sesquiterpenoids from aerial parts of Homalomena occulta, Chem Biodivers, 4(5):925-931. [27] Wong KC, Hamid A, Eldeen IM, Asmawi MZ, Baharuddin S, Abdillahi HS, Van Staden J. (2012), A new sesquiterpenoid from the rhizomes of Homalomena sagittifolia, Nat Prod Res, 26(9):850-858.