Luận văn Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy và chế tạo thử nghiệm vacxin phòng bệnh

ella phân lập được Nghiên cứu của Tạ Thị Vịnh, Đặng Khánh Vân (1996)[31] cũng chỉ ra rằng S. choleraesuis chiếm tỷ lệ cao nhất (60%) trong số các chủng Salmonella phân lập được trong phân lợn ở Ba Vì, Hà Tây. Đỗ Trung Cứ (2004)[6] cho biết: 100% số chủng Salmonella phân lập từ lợn chết có biểu hiện triệu chứng bệnh tích của bệnh Phó thương hàn đều là S. typhimurium Tại Nhật Bản, Asai và cs (2002)[32] cũng cho biết S. typhimurium được phân lập thấy nhiều ở lợn sau cai sữa là (72,6%); lợn gần xuất chuồng là (73,8%). Việc phát hiện ra một tỷ lệ cao S. typhimurium, S. enteritidis và S. choleraesuis ở lợn bị tiêu chảy và chết đã thể hiện được vai trò của các serotyp này trong bệnh Phó thương hàn của lợn. Sự phát triển bệnh do các serotyp này gây ra chính là sự tương tác giữa vi khuẩn và cơ thể, đồng thời có sự tham gia của yếu tố ngoại cảnh. Đó là trong điều kiện bình thường, sự điều tiết của hệ sinh thái nội tại ngăn cản sự hình thành của những vi sinh vật gây bệnh trong cơ thể. Nhưng khi có yếu tố bất lợi của ngoại cảnh, sẽ tạo điều kiện cho các vi sinh vật gây bệnh phát triển, nhân lên nhiều lần, các yếu tố gây bệnh như yếu tố bám dính, yếu tố xâm nhập, khả năng sinh sản độc tố…hệ quả là lợn bị bội nhiễm Salmonella và phát bệnh. Như vậy, trong phòng và chống bệnh Phó thương hàn, việc phân lập và định typ vi khuẩn Salmonella có ý nghĩa rất quan trọng, làm cơ sở cho việc quyết định sử dụng vacxin được sản xuất từ chủng nào để đạt hiệu quả phòng bệnh Phó thương hàn cho lợn tốt nhất. 4.4 Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm của các chủng Salmonella phân lập được với một số loại kháng sinh Với sự tiến bộ mạnh mẽ của khoa học sinh học, hàng loạt các kháng sinh đã được phát hiện và sản xuất theo con đường sinh học và con đường tổng hợp hóa học. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh trong phòng và trị bệnh có nhiều thành công và đem lại hiệu quả kinh tế, việc dùng kháng sinh không đúng liều lượng, liệu trình và kết hợp nhiều loại kháng sinh đã đồng thời tạo nên áp lực chọn lọc đối với vi khuẩn. Hiện tượng đề kháng kháng sinh ngày càng gia tăng trong nhiều loại vi khuẩn gây bệnh cho người và gia súc đang là mối quan tâm lo lắng của toàn xã hội. Vi khuẩn đề kháng kháng sinh làm giới hạn khả năng điều trị bệnh nhiễm trùng, một số trường hợp dẫn đến tử vong do vi khuẩn gây bệnh đề kháng với hầu hết các kháng sinh dùng trong lâm sàng. Hơn thế nữa, các chủng vi khuẩn không gây bệnh nhưng đề kháng kháng sinh còn là nơi tồn trữ tính kháng thuốc để truyền cho những vi khuẩn gây bệnh khác. Cho đến nay, có rất nhiều bệnh nói chung và bệnh do vi khuẩn Salmonella nói riêng, nhiều loại kháng sinh đã không còn tác dụng điều trị. Vì vậy trong chẩn đoán thường sử dụng phương pháp kháng sinh đồ để tìm loại kháng sinh mẫn cảm phù hợp dùng điều trị, nhằm mục đích chữa bệnh đạt hiệu quả cao mà không tốn kém, thay vì việc tự chọn một loại kháng sinh bất kỳ trong một lần điều trị, gây ra hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn với kháng sinh. Để có thể chọn được những kháng sinh trên thị trường có tác dụng điều trị bệnh tiêu chảy ở lợn do Salmonella, trong phạm vi nội dung nghiên cứu này, chúng tôi cũng chọn ngẫu nhiên 20 chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được để kiểm tra mức độ mẫn cảm với 10 loại kháng sinh và hóa dược thông dụng, tiến hành kiểm tra và đánh giá theo phương pháp của Kirby- Bauer (1996). Các mẫu giấy kháng sinh do hãng OXOID sản xuất. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6. Kết quả bảng 4.6 cho thấy: Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được đều kháng hoàn toàn với Trimethoprime/Sulfamethoxazone (100%) và kháng cao với một số kháng sinh như: Cefazolin (80%) và Spectinomycin (75%). Có rất nhiều nguyên nhân dẫn đến hiện tượng này. Như ở trên đã đề cập, do việc dùng các loại kháng sinh điều trị kéo dài, do sự có mặt thường xuyên của nhiều loại kháng sinh được bổ sung vào thức ăn và một nguyên nhân rất có thể xảy ra là hiện tượng di truyền dọc và di truyền ngang tính kháng thuốc bởi các gen nằm trong Plasmid (Resistance) của các chủng vi khuẩn Salmonella. Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số loại kháng của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được TT Tên kháng sinh Số chủng kiểm tra Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng (+) (%) (+) (%) (+) (%) 1 Neomycin 20 16 80,0 4 20,0 0 0,0 2 Spectinomycin 20 0 0,0 5 25,0 15 75,0 3 Amikacin 20 12 60,0 6 30,0 2 10,0 4 Ofloxacin 20 20 100,0 0 0,0 0 0,0 5 Trimethoprime/ Sulfamethoxazole 20 0 0,0 0 0,0 20 100,0 6 Gentamycin 20 5 25,0 10 50,0 5 25,0 7 Nofloxacin 20 20 100,0 0 0,0 0 0,0 8 Cefuzoxime 20 5 25,0 9 45,0 6 30,0 9 Cephazolin 20 2 10,0 2 10,0 16 80,0 10 Ciprofloxacin 20 18 90,0 2 10,0 0 0,0 Bên cạnh những kháng sinh đã bị kháng với tỷ lệ cao, các chủng vi khuẩn Salmonella được thử vẫn rất mẫn cảm với Ofloxacin và Nofloxacin (với tỷ lệ 100%), tiếp sau là Ciprofloxacin (90%) và Neomycin (80%). So sánh kết quả thu được với kết quả của một số tác giả trong nước nghiên cứu về khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella thì thấy không có sự sai khác nhiều. Theo Phùng Quốc Chướng (2005)[3], Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm nhất với Nofloxacin và Ciprofloxacin (100%); Còn theo Tô Liên Thu (2004)[29] thì vi khuẩn Salmonella phân lập được từ thịt lợn mẫn cảm cao với Nofloxacin (90%), Ofloxacin (90%) và Gentamycin (90%). Theo Griggs và cs (1994)[55], khả năng kháng kháng sinh của vi khuẩn nói chung và Salmonella sp. nói riêng là một yếu tố duy trì bản chất gây bệnh của vi khuẩn đối với người và gia súc. Việc lạm dụng kháng sinh để phòng và chữa bệnh cho động vật nói chung, gia cầm và lợn nói riêng đang là một vấn đề bức xúc ở nước ta, gây ra không ít khó khăn cho ngành thú y và cả nhân y. Vì yếu tố kháng kháng sinh và hóa dược của vi khuẩn Salmonella luôn luôn thay đổi theo thời gian, không gian khác nhau ở từng cá thể. Vì vậy, trong từng thời gian nhất định, cần phải làm kháng sinh đồ để xác định chính xác khả năng kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây bệnh, ngoài mục đích lựa chọn kháng sinh mẫn cảm trong điều trị, còn để kiểm tra khả năng gây bệnh và độc lực của chủng vi khuẩn phân lập. 4.5 Kết quả xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được Theo Tsolis và cs (1999)[77], khả năng gây bệnh của vi khuẩn Salmonella ở động vật thường bắt đầu bằng khả năng bám dính của vi khuẩn lên các receptor trên niêm mạc ruột. Sau đó, vi khuẩn xâm nhập vào tế bào biểu mô ruột nhờ các yếu tố xâm nhập có trong cấu trúc của vi khuẩn và giải phóng độc tố. Độc tố đường ruột (Enterotoxin) là yếu tố quan trọng nhất quyết định sinh bệnh lý tiêu chảy cho gia súc, người nói chung và cho lợn nói riêng. Theo Peterson (1980)[64], độc tố đường ruột do vi khuẩn Salmonella sản sinh ra có 2 thành phần: Độc tố thẩm xuất nhanh (Rapid Difution Factor- RDF) có cấu trúc thành phần hoạt tính giống với độc tố chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli nên phần lớn các tác giả còn gọi là độc tố chịu nhiệt ST (Heat Stabile Toxin); Độc tố thẩm xuất chậm có cấu trúc, thành phần hoạt tính giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli nên thường gọi là độc tố không chịu nhiệt LT (Heat Labile Toxin). Ngoài ra, yếu tố kháng kháng sinh cũng đóng vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella. Theo Kleckner và cs (1977)[45] vi khuẩn có sẵn những yếu tố gây bệnh thì khả năng kháng kháng sinh sẽ làm tăng tính gây bệnh của vi khuẩn lên gấp bội. Vì vậy để xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được, chúng tôi đã tiến hành xác định khả năng sản sinh độc tố, yếu tố xâm nhập và khả năng kháng kháng sinh của chúng. Có rất nhiều phương pháp để xác định độc tố đường ruột (enterotoxin), khả năng xâm nhập (invasion) và khả năng kháng kháng sinh (definitive phage type 104) của Salmonella, tuy nhiên phương pháp ưu việt nhất hiện nay được áp dụng rộng rãi trong và ngoài nước để nghiên cứu vi khuẩn Salmonella là phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). Ưu điểm của phương pháp này là độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể thực hiện với số lượng mẫu lớn và cho kết quả nhanh, chính xác trong thời gian ngắn. Trong khuôn khổ của nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng phương pháp PCR để xác định một số yếu tố độc lực của vi khuẩn Salmonella. Các cặp mồi mà chúng tôi sử dụng cho phản ứng PCR để xác định một số yếu tố độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella là: Stn-F và Stn-R dùng để xác định gen sản sinh độc tố đường ruột Stn (cho kích cỡ sản phẩm là 259 bp), InvA-F và InvA-R để xác định gen quyết định yếu tố xâm nhập InvA (cho sản phẩm là 521 bp), 104SR-F và 104SR-R dùng để xác định gen kháng kháng sinh DT104 (cho sản phẩm là 162 bp). Các bước tiến hành phản ứng PCR như đã mô tả ở phần nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7 và hình 4.4. Kết quả cho thấy: Trong tổng số 98 chủng Salmonella được kiểm tra, có 96 chủng mang gen Stn (chiếm tỷ lệ 97,90%), 92 chủng mang gen InvA (chiếm 93,90%) và không có chủng nào mang yếu tố DT104. - 100% các chủng S. choleraesuis được kiểm tra có mang gen Stn và InvA - Trong số 50 chủng S. typhimurium được kiểm tra thì 100% các chủng có chứa gen Stn và 96,0% các chủng có chứa gen InvA - Có 93,70% các chủng S. enteritidis được kiểm tra có gen Stn và 87,50% các chủng có gen InvA. - Không có chủng vi khuẩn nào đem kiểm tra có mang yếu tố DT104. Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được TT Serotyp Số chủng kiểm tra Yếu tố gây bệnh Stn InvA DT104 (+) (%) (+) (%) (+) (%) 1 S. choleraesuis 16 16 100,0 16 100,0 0 0 2 S. typhimurium 50 50 100,0 48 96,0 0 0 3 S. enteritidis 32 30 93,70 28 87,50 0 0 Tổng 98 96 97,90 92 93,90 0 0 100 100 0 100 96.00 0 93.70 87.50 0 0 20 40 60 80 100 120 140 S. choleraesuis S. typhimurium S. enteritidis Stn InvA DT104 Tỷ lệ % Chủng vi khuẩn Hình 4.4 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được khuẩn Salmonella - Giếng 1, 2, 3, 4, 6, 7, 9: InvA dương tính (sản phẩm 521 bp) - Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10: Stn dương tính (sản phẩm 259 bp) - Giếng 11: Đ/C dương InvA và Stn - Giếng 12: Đ/C âm InvA - Giếng 13: Đ/C âm Stn - Giếng 8: Thang chuẩn 1000 bp Từ kết quả này cho thấy: Hầu hết các chủng Salmonella có khả năng sản sinh độc tố đường ruột (97,90%) đều mang yếu tố xâm nhập (93,90%). Theo Finlay và cs (1988)[52]: khả năng xâm nhập vào các tế bào có nhân, vào lớp niêm mạc đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella có độc lực, còn các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào thường là các chủng không có độc lực. Theo Rahman và cs (1992)[69]; Nucera và cs (2006)[63]: gen xâm nhập InvA đã được phát hiện thấy có mặt ở hầu hết các chủng S. enterica. Theo Đỗ Trung Cứ (2001)[4]: 72,7% các chủng Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi Phó thương hàn có sản sinh độc tố chịu nhiệt. Đỗ Trung Cứ và cs (2003)[5] đã kết luận: 81,81% số chủng S. typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố không chịu nhiệt (LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm. Kishima và cs (2008)[58] khi tiến hành kiểm tra khả năng xâm nhập của 16 chủng S. typhimurium phân lập được từ lợn khỏe ở Nhật Bản đã xác định được có tới 7 chủng dương tính, chiếm tỷ lệ 26,9%. Tuy nhiên, kết quả thu được của chúng tôi cao hơn rất nhiều (96%), có thể là do các chủng Salmonella trong nghiên cứu này là phân lập được từ những lợn nghi mắc bệnh Phó thương hàn. Cũng theo Kishima và cs (2008)[58], tỷ lệ mang gen kháng thuốc của các chủng S. typhimurium phân lập được từ lợn khỏe ở Nhật Bản cũng khá cao (16/26 chủng, chiếm tỷ lệ 61,5%). Kết quả nghiên cứu của chúng tôi là hoàn toàn khác biệt. Điều này cũng có thể được giải thích là do nguồn gốc phân lập của các chủng dùng trong nghiên cứu của hai nghiên cứu là khác nhau. Mặc dù các nghiên cứu tiếp theo về các chủng vi khuẩn này là cần thiết, nhưng đây cũng là những tín hiệu đáng mừng vì các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được từ lợn bệnh tại miền Bắc Việt Nam chưa có mang gen kháng kháng sinh. Từ các kết quả này, có thể sơ bộ kết luận: Các chủng vi khuẩn được kiểm tra thuộc 3 loại serotyp phân lập được trong nghiên cứu này đều có mang những yếu tố độc lực cần thiết tham gia vào quá trình gây bệnh ở động vật. 4.6 Kết quả xác định độc lực của một số chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được trên chuột nhắt trắng Selbitz (1995)[72] cho biết: vi khuẩn Salmonella có rất nhiều serotyp, độc lực của mỗi serotyp lại phụ thuộc vào yếu tố gây bệnh. Ở mỗi serotyp, các yếu tố gây bệnh sẽ quyết định thể bệnh cấp tính hoặc mãn tính. Ngoài khả năng gây bệnh ở lợn, chúng còn có khả năng gây bệnh ở nhiều loài động vật cảm nhiễm máu nóng, máu lạnh khác, song vai trò gây bệnh của một số chủng nào đó chỉ được công nhận sau khi tiến hành thử độc lực. Do vậy, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra độc lực của các chủng Salmonella phân lập được trên chuột nhắt trắng. Chúng tôi chọn ngẫu nhiên 20 chủng Salmonella phân lập được thuộc cả 3 serotyp S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis từ 5 địa phương, đánh số từ S1 đến S20 để thử độc lực bằng cách tiêm truyền qua chuột nhắt trắng. Các chủng được nuôi cấy trong môi trường BHI ở 37oC trong 18- 24 giờ, đếm số lượng vi khuẩn có trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp đếm số lượng khuẩn lạc trên thạch. Mỗi chủng tiêm cho 2 chuột, mỗi chuột 0,2 ml (≈ 4 x 107 vi khuẩn) canh trùng vào phúc xoang. Theo dõi thời gian chuột chết. Các chuột chết được tiến hành mổ khám, lấy máu tim để nuôi cấy phân lập lại vi khuẩn. Kết quả được trình bày ở bảng 4.8. Kết quả ở bảng 4.8 cho thấy: Sau khi tiêm canh trùng vi khuẩn Salmonella, tất cả các chủng vi khuẩn đem thử đều gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 8 – 36 giờ sau tiêm, trong đó có 18 chủng gây chết 100% chuột trong thời gian từ 8 - 24 giờ, 2 chủng gây chết chuột sau 24 giờ, đặc biệt có 4 chủng giết chết chuột trước 8 giờ. Mổ khám những chuột chết, lấy máu tim nuôi cấy phân lập vi khuẩn thì đều tìm thấy vi khuẩn Salmonella thuần khiết. Như vậy, có thể thấy các chủng Salmonella phân lập được từ lợn sau cai sữa bị tiêu chảy ở Hà Nội, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng và Thái Bình có độc lực khá cao và là nguyên nhân gây chết cho lợn bị tiêu chảy. Kết quả nghiên cứu này của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của các tác giả khác như: Nguyễn Bá Hiên (2001)[13], Đỗ Trung Cứ và cs (2001)[4] khi kiểm tra độc lực của các chủng Salmonella phân lập được từ lợn bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền núi phía Bắc. Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng Salmonella phân lập được Ký hiệu chủng Số chuột tiêm (con) Liều tiêm (ml) Đường tiêm Số chuột chết (con) Tỷ lệ (%) Thời gian chết (giờ) Phân lập lại VK S1 2 0,2 Phúc xoang 2 100,0 8-16 + S2 2 0,2 2 100,0 <8 + S3 2 0,2 2 100,0 14-16 + S4 2 0,2 2 100,0 <8 + S5 2 0,2 2 100,0 18-24 + S6 2 0,2 2 100,0 24 + S7 2 0,2 2 100,0 16 + S8 2 0,2 2 100,0 <8 + S9 2 0,2 2 100,0 24-36 + S10 2 0,2 2 100,0 16-24 + S11 2 0,2 2 100,0 24 + S12 2 0,2 2 100,0 24-36 + S13 2 0,2 2 100,0 16 + S14 2 0,2 2 100,0 16 + S15 2 0,2 2 100,0 20-24 + S16 2 0,2 2 100,0 20 + S17 2 0,2 2 100,0 <8 + S18 2 0,2 2 100,0 16 + S19 2 0,2 2 100,0 16 + S20 2 0,2 2 100,0 8-16 + 4.7 Kết quả gây bệnh thực nghiệm trên lợn bằng các chủng Salmonella phân lập được Để kiểm tra vai trò gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập được trên bản động vật, chúng tôi đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm trên lợn. Chúng tôi đã chọn 6 chủng vi khuẩn Salmonella, trong đó có 2 chủng S. choleraesuis, 2 chủng S. typhimurium và 2 chủng S. enteritidis. Các chủng này có thời gian giết chết chuột từ 8- 16 giờ, đều có khả năng xâm nhập và đều sản sinh độc tố. Đặc tính của các chủng này được trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9 Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh TT Kí hiệu chủng Cơ quan phân lập Địa điểm Thời gian gây chết chuột (giờ) Yếu tố độc lực Stn InvA DT104 1 HP-S7 Gan Hải Phòng 16 + + - 2 HN-S8 Lách Hà Nội <8 + + - 3 HN-S1 Lách Hà Nội 8-16 + + - 4 HN-S2 Gan Hà Nội <8 + + - 5 HP-S17 Hạch ruột Hải Phòng <8 + + - 6 TB-S18 Gan Thái Bình 16 + + - Thí nghiệm được bố trí như sau: Chọn 14 lợn với tiêu chuẩn: Lợn 35 ngày tuổi, khỏe mạnh, có trọng lượng tương đương nhau, chưa tiêm vacxin phòng bệnh do Salmonella gây ra và âm tính với kháng thể kháng Salmonella. Tiến hành chia làm 2 lô: Lô thí nghiệm có 12 con và lô đối chứng 2 con. Ở lô thí nghiệm, lợn được tiêm đồng thời vào phúc xoang 6 ml và cho uống 10 ml canh trùng các chủng Salmonella tương ứng đã nuôi cấy ở 37oC trong 24 giờ (1 ml canh trùng ≈ 1x 109 vi khuẩn) . Mỗi chủng vi khuẩn gây bệnh cho 2 lợn. Lợn ở lô đối chứng được tiêm và cho uống môi trường nước thịt vô trùng với các liều tương tự. Theo dõi lợn hàng ngày sau khi gây bệnh. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.10. Bảng 4.10 Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi Chủng vi khuẩn Kí hiệu chủng Số lợn gây bệnh (con) Đường gây bệnh Liều canh trùng (ml) Số lợn chết (con) Thời gian chết (giờ) Triệu chứng sau gây bệnh Kết quả phân lập lạiVK S. choleraesuis HP-S7 2 Uống 10 2 28-32 Chết có vết bầm đỏ tím ở rìa tai, chân, bụng, đuôi. S. choleraesuis Xoang PM 6 HN-S8 2 Uống 10 2 48 Chết có vết bầm đỏ tím ở rìa tai, chân, bụng, đuôi. S. choleraesuis Xoang PM 6 S. typhimurium HN-S1 2 Uống 10 2 48-72 Tiêu chảy nặng, chết. S. typhimurium Xoang PM 6 HN-S2 2 Uống 10 2 68-72 Tiêu chảy nặng, chết S. typhimurium Xoang PM 6 S. enteritidis HP-S17 2 Uống 10 2 60-72 Tiêu chảy nặng, chết S. enteritidis Xoang PM 6 TB-S18 2 Uống 10 2 72-96 Tiêu chảy nặng, chết S. enteritidis Xoang PM 6 Đ/C 2 Uống 10 0 - Bình thường - Xoang PM 6 (Ghi chú: 1ml canh trùng ≈ 109 vi khuẩn) Kết quả bảng 3.10 cho thấy: Sau khi gây bệnh, tất cả lợn ở lô thí nghiệm (12/12 con) đều bị chết trong khoảng thời gian từ 28 - 96 giờ. Trong đó, cả 2 chủng vi khuẩn S. choleraesuis đều gây chết 100% lợn thí nghiệm trong vòng 28 - 48 giờ. Điều này chứng tỏ các chủng S. choleraesuis này có độc lực rất cao, gây bệnh cho lợn ở thể cấp tính. Các triệu chứng lâm sàng trước khi lợn chết bao gồm: Cả 4 lợn đều sốt rất cao 42oC, toàn thân nổi mẩn đỏ, nhất là ở những vùng da mỏng như: Rìa tai, mõm, vùng bụng, lợn ỉa chảy, phân dạng nước màu vàng, lẫn máu và chất nhầy. Lợn ốm bỏ ăn, thường uống nhiều nước..... Cả 4 lợn gây bệnh bằng các chủng S. typhimurium đều chết trong vòng 48-72 giờ. Tương tự, 4 lợn gây bệnh bằng các chủng S. enteritidis đều chết trong thời gian 60 - 96 giờ. Tất cả những lợn này đều bị tiêu chảy nặng sau 24 giờ gây bệnh. Tất cả lợn chết đều được mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy chất chứa ruột non, hạch ruột, gan, lách, máu tim nuôi cấy trên các môi trường và đều phân lập lại được đúng loại vi khuẩn đã gây bệnh. Bệnh tích của các lợn chết được mổ khám mà chúng tôi tổng hợp được cũng tương tự những mô tả về bệnh tích của tác giả Phan Thanh Phượng (1988)[23], Phạm Sỹ Lăng và cs (2004)[17]. Theo chúng tôi, trong cơ thể lợn bị tiêu chảy có rất nhiều vi khuẩn Salmonella. Vi khuẩn này tiết ra độc tố, tác động gây rối loạn trung khu điều hòa thân nhiệt và làm cho con vật sốt, tiếp đó Enterotoxin (gồm yếu tố thẩm xuất nhanh, yếu tố thẩm xuất chậm) kích thích niêm mạc ruột, làm quá trình tiêu chảy thêm trầm trọng. Quá trình tiết dịch tiêu hóa bị rối loạn, lợn mất tính thèm ăn hoặc bỏ ăn, kèm theo quá trình mất nước và chất điện giải qua phân, lợn bị tiêu chảy và gầy sút nhanh chóng. Kết quả mổ khám các lợn chết được trình bày ở bảng 4.11 Bảng 4.11 Bệnh tích đại thể các lợn gây bệnh thực nghiệm Cơ quan Bệnh tích Số lợn mổ khám Số lợn có bệnh tích Tỷ lệ (%) Da Tụ máu ở vùng thấp, vùng xa tim, xuất huyết ở ngực, bụng. 12 12 100,0 Phổi Viêm, đỏ lấm tấm, phù, tích nước 12 8 66,66 Dạ dày Niêm mạc viêm đỏ, xuất huyết 12 12 100,0 Ruột non Căng, xuất huyết, niêm mạc sưng. 12 12 100,0 Ruột già Van hồi manh tràng có nốt loét, niêm mạc sưng, xuất huyết. 12 4 33,33 Hạch lâm ba Sưng to, đỏ xuất huyết 12 12 100,0 Gan Sưng, tím sẫm có hoại tử màu trắng 12 8 66,66 Mật Túi mật căng 12 12 100,0 Lách Sưng to, sẫm màu, dai. 12 12 100,0 Thận Sưng, xuất huyết lấm tấm 12 10 83,33 Qua bảng 4.11 chúng tôi thấy: 12/12 lợn mổ khám đều có lá lách sưng to, phần giữa sưng to hơn, dai như cao su, màu xanh thẫm, cắt ra có màu tím, thấy rõ nang lâm ba sưng to. Hạch lâm ba sưng, mềm, đỏ, thường đỏ thẫm từ chu vi lan vào giữa. Thận có điểm xuất huyết đỏ ở vỏ. Gan tụ máu, có nốt hoại tử bằng hạt kê. Niêm mạc dạ dầy và ruột viêm đỏ, có điểm xuât huyết, có khi có nốt loét đỏ bằng hạt đậu. Phổi tụ máu, có các ổ viêm mới. Những bệnh tích trên được quan sát ở tất cả các lợn gây bệnh, tuy mức độ có khác nhau ở từng cá thể và những bệnh tích này cũng gần như trùng hợp với những mô tả của các tác giả trong và ngoài nước như: Nguyễn Vĩnh Phước và cs (1970)[22], Wilcock và Schwartz (1992)[80]. Từ kết quả gây bệnh ở trên cho thấy: Tất cả 6 chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium, S. enteritidis được chọn để gây bệnh đều có độc lực rất cao và đều có khả năng gây bệnh đối với lợn. Vacxin là một chế phẩm sinh học có chứa tác nhân gây bệnh hoặc sản phẩm của nó nhưng đã được vô hoạt bằng formol, cũng có thể giảm độc lực bằng các phương pháp lý, hoá, sinh học nên không còn khả năng gây bệnh, nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. Khi đưa vacxin vào cơ thể thì có khả năng kích thích cơ thể thực hiện đáp ứng miễn dịch, hình thành kháng thể chủ động, giúp cho cơ thể con vật chống lại các tác nhân gây bệnh hay sản phẩm độc của chúng khi xâm nhập vào lần sau. Ngày nay, biện pháp phòng bệnh bằng vacxin có thể coi là biện pháp khả thi nhất để khống chế các bệnh, trong đó có bệnh do Salmonella gây ra. Tuy nhiên, trong quá trình sử dụng vacxin Phó thương hàn của các công ty, xí nghiệp thuốc Thú y sản xuất, chúng tôi thấy, hầu hết các vacxin Phó thương hàn hiện nay chỉ sử dụng duy nhất 1 loại kháng nguyên S. choleraesuis, do đó có khả năng chỉ phòng được bệnh Phó thương hàn thể do serotyp này gây ra ở lợn. Mục tiêu của chúng tôi trong nghiên cứu này là chế tạo 1 loại vacxin đa giá có chứa một số các serotyp thường gặp nhất từ những trường hợp nhiễm bệnh Salmonella ở lợn ở một số tỉnh phía Bắc. Căn cứ vào kết quả phân lập, kết quả giám định các đặc tính sinh vật hóa học, kết quả xác định các yếu tố gây bệnh và gây bệnh thực nghiệm trên bản động vật, chúng tôi đã chọn 3 chủng Salmonella, gồm 1 chủng S. choleraesuis, 1 chủng S. typhimurium và 1 chủng S. enteritidis phân lập từ lợn mắc bệnh có độc lực cao, có cấu trúc kháng nguyên ổn định và mang một số yếu tố gây bệnh để sản xuất thử nghiệm vacxin phòng bệnh Salmonella cho lợn. Theo Laval (2000)[16] tiêu chí để chọn một vacxin tốt phòng bệnh cho động vật cần phải đạt các yêu cầu sau đây: - Không được gây phản ứng toàn thân; Có thể gây phản ứng cục bộ, nhưng những biểu hiện của phản ứng cục bộ phải biến mất trong vòng 24 giờ sau khi tiêm phòng. - Ngăn cản hoặc làm giảm sự nhân lên của bệnh nguyên khi sơ nhiễm. - Ngăn không cho xảy ra bệnh hoặc làm giảm cường độ của nó sau khi nhiễm. - Hiệu lực phòng bệnh cao và kéo dài. - Sử dụng và bảo quản dễ dàng, giá thành rẻ. Chúng tôi đã chế tạo vacxin dạng vô hoạt có bổ trợ keo phèn theo quy trình thường quy của Bộ môn Vi trùng - Viện thú y. Các chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis được nuôi cấy riêng rẽ theo 3 lô khác nhau bằng phương pháp lên men, sục khí. Sau 8 - 10 giờ lên men, sục khí, lấy mẫu kiểm tra thuần khiết bằng nhuộm Gram và kiểm tra đậm độ vi khuẩn trong 1 ml canh trùng bằng phương pháp đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch, sau đó tiến hành vô hoạt vi khuẩn bằng Formol với nồng độ 0,5%. Kết quả được trình bày ở bảng 4.12 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin Lô vacxin Chỉ tiêu kiểm tra Đậm độ (109 vk/ml) Thuần khiết Vô trùng S. choleraesuis 19 Đạt Đạt S. typhimurium 22 Đạt Đạt S. enteritidis 16 Đạt Đạt Kết quả cho thấy: - Đậm độ vi khuẩn của lô S. choleraesuis đạt khoảng 19x109 vi khuẩn/ml canh trùng, lô S. typhimurium là 22x109 vi khuẩn/ml canh trùng, còn lô canh trùng S. enteritidis là 16x109 vi khuẩn/ml. Với số lượng vi khuẩn yêu cầu trong 1 ml canh trùng để chế tạo vacxin phải đạt tối thiểu 1,5x109 vi khuẩn thì các lô canh trùng nuôi cấy đều đủ tiêu chuẩn chế vacxin. - Cả 3 lô canh trùng đều đạt chỉ tiêu thuần khiết và canh trùng sau khi diệt Formol 0,5% đều đạt chỉ tiêu vô trùng khi kiểm tra trên các loại môi trường: Thạch máu, thạch nấm, nước thịt thường, nước thịt yếm khí,… Từ kết quả kiểm tra này cho thấy, cả 3 lô canh trùng đều đạt các chỉ tiêu cần thiết để có thể sử dụng làm vacxin. 4.8.2 Kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực vacxin trên chuột thí nghiệm. Sau khi đã kiểm tra canh trùng của các chủng vi khuẩn S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis đều đạt các tiêu chuẩn dùng làm vacxin, tiến hành trộn lẫn các lô canh trùng với nhau theo tỷ lệ 1:1:1 để đạt được một loại canh trùng đồng nhất, điều chỉnh nồng độ của canh trùng, rôi bổ sung keo phèn với tỷ lệ 1/5 để đảm bảo 1ml vacxin có chứa 4 – 5x109 vi khuẩn. Vacxin được ra chai (20 ml/chai), đóng nút, gắn paraffin, dán nhãn, sau đó tiến hành lấy mẫu để kiểm tra an toàn và hiệu lực trên động vật thí nghiệm. - Kiểm tra an toàn trên chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, tiêm vacxin với liều 0,5 ml/con vào phúc xoang và 5 chuột được tiêm 0,2 ml/con nước trong ở phía trên lọ vacxin vào tĩnh mạch đuôi. Theo dõi sau 7 ngày cho thấy tất cả chuột được tiêm vacxin đều sống khỏe mạnh, không con nào có biểu hiện phản ứng sau khi tiêm. Điều này đã khẳng định rằng vacxin đã đạt yêu cầu về độ an toàn trên động vật thí nghiệm và có thể tiến hành kiểm tra hiệu lực của vacxin trên động vật thí nghiệm. - Kiểm tra hiệu lực bảo hộ của vacxin trên chuột nhắt trắng: Chọn 10 chuột khỏe mạnh, mỗi chuột tiêm 0,2 ml vacxin vào dưới da và 5 chuột đối chứng không tiêm vacxin. Sau 21 ngày, tiến hành thử thách với hỗn hợp canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis với liều 10LD50 tương ứng với liều 0,5ml/con cho tất cả chuột thí nghiệm và chuột đối chứng. Kết quả thu được trình bày ở bảng 4.13. Bảng 4.13 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng Lô vacxin Số chuột tiêm (con) Liều tiêm vacxin (ml) Liều công (ml) Thời gian theo dõi Số chuột chết (con) Số chuột sống Tỷ lệ bảo hộ (%) TN 10 0,2 0,5 7 ngày 0 10 100 Đ/C 5 0 0,5 24-48 giờ 5 0 0 Kết quả cho thấy: Ở lô thí nghiệm, chuột được tiêm vacxin với liều 0,2 ml/con, sau 21 ngày, chuột có miễn dịch nên đều sống khỏe mạnh khi thử thách cường độc với hỗn hợp canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis tương ứng với chủng sản xuất vacxin và được đánh giá là 100% số chuột được bảo hộ. Trong khi đó, cả 5 chuột ở lô đối chứng không được tiêm vacxin, sau khi công cường độc với liều tương tự đều bị chết trong vòng 24 giờ (tỷ lệ chết 100%) và đều phân lập lại được vi khuẩn Salmonella từ máu tim. Tổng hợp các kết quả kiểm tra an toàn và hiệu lực bảo hộ của vacxin trên chuột bạch của lô vacxin chế thử, so sánh với tiêu chuẩn của Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc và vacxin Quốc gia về kiểm nghiệm vacxin chết có bổ trợ keo phèn, cho phép đánh giá: Lô vacxin đạt chỉ tiêu an toàn 100% và có hiệu lực bảo hộ cao trên chuột bạch (100%), đủ tiêu chuẩn để tiến hành kiểm tra các bước tiếp theo để đánh giá hiệu quả sử dụng của vacxin trên bản động vật. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận 1. Tỷ lệ trung bình phân lập được vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và bệnh phẩm thu thập từ 5 địa phương khác nhau là 54,73%. 2. Tỷ lệ phân lập được Salmonella cao nhất ở hạch màng treo ruột (52,94%), chất chứa ruột non (50,00%) sau đó là lách (41,18%), gan (32,35%), và thấp nhất là máu tim (23,53%). 3. Các chủng Salmonella phân lập được mang đầy đủ các đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella như các tài liệu trong và ngoài nước đã mô tả. 4. Kết quả xác định serotyp cho thấy: 12,31% là S. choleraesuis, 38,46% là S. typhimurium, 24,62% là S. enteritidis, 9,23% là S. derby, 6,15% là S. rissen, 1,54% là S. anatum, 7,69% là S. stanley. 5. Các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được mẫn cảm với Ofloxacin và Nofloxacin (100%), tiếp đến là Ciprofloxacin (90%) và Neomycin (80%). Kháng hoàn toàn với Trimethoprim + Sulfamethoxazole (100%) và kháng cao với một số kháng sinh như: Cefazolin (80%) và Spectinomycin (75%). 6. 100% các chủng S. choleraesuis được kiểm tra có mang gen Stn và InvA; 100% các chủng S. typhimurium có mang gen Stn và 96,0% các chủng có mang gen InvA; 93,7% các chủng S. enteritidis có mang gen Stn và 87,50% các chủng gen InvA. Không có chủng vi khuẩn nào mang gen DT104. 7. Tất cả các chủng vi khuẩn đem thử đều có độc lực cao, gây chết 100% chuột thí nghiệm trong vòng 8 - 36 giờ sau khi tiêm. 8. Cả 6 chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh cho lợn đều có độc lực cao, giết chết hết lợn thí nghiệm trong vòng 28 - 96 giờ. 9. Cả 3 lô canh trùng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis dùng chế tạo vacxin đều đạt các chỉ tiêu về: Đậm độ, thuần khiết, vô trùng, đủ tiêu chuẩn dùng làm vacxin. 10. Lô vacxin được chế từ 3 chủng S. choleraesuis, S. typhimurium và S. enteritidis đạt chỉ tiêu an toàn 100% và có hiệu lực bảo hộ 100% trên chuột nhắt trắng. 5.2 Đề nghị Tiếp tục xác định hiệu lực và độ dài miễn dịch của vacxin trên lợn, nhằm đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của vacxin trên lợn và nghiên cứu thử nghiệm trên diện rộng để áp dụng vào sản xuất.  TÀI LIỆU THAM KHẢO I. TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Võ Thị Trà An, Nguyễn Ngọc Tuân, Lê Hữu Ngọc (2006), “Tình hình nhiễm Salmonella trong phân và thân thịt (bò, heo, gà) tại một số tỉnh phía Nam”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 37-42. 2. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn tại vùng Tây Nguyên và khả năng phòng trị. Luận án PTS khoa học nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. 3. Phùng Quốc Chướng (2005), “Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của một số thuốc kháng sinh của vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật nuôi tại ĐăkLăk”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 53. 4. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên (2001), “Kết quả phân lập và xác định một số yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella spp gây bệnh Phó thương hàn lợn ở một số tỉnh miền núi phía Bắc”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 3, tr. 10-17. 5. Đỗ Trung Cứ, Trần Thị Hạnh, Nguyễn Quang Tuyên, Đỗ Thị Lan Phương (2003), “Xác định một số yếu tố gây bệnh của Salmonella Typhimurium phân lập từ lợn bị tiêu chảy ở một số tỉnh miền núi phía Bắc”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 33-37. 6. Đỗ Trung Cứ (2004), Phân lập và xác định yếu tố gây bệnh của Salmonella ở lợn tại một số tỉnh miền núi phía Bắc và biện pháp phòng trị. Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia. 7. Đỗ Đức Diên (1999), Vai trò của E. coli và Salmonella trong hội chứng tiêu chảy lợn con ở Kim Bảng (Hà Nam) và thử nghiệm một số giải pháp phòng trị. Luận án Thạc sỹ Nông nghiệp. 8. Trần Quang Diên (2002), Nghiên cứu tình hình nhiễm, đặc tính gây bệnh của Salmonella gallinarum pullorum trên gà công nghiệp và chế kháng nguyên chẩn đoán. Luận án Tiến sỹ nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 9. Trương Văn Dung, Yoshihara shinobu (2002), Cẩm nang chẩn đoán tiêu chuẩn về các bệnh gia súc ở Việt Nam. Viện Thú y Quốc gia và Tổ chức hợp tác quốc tế Nhật Bản. 10. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ (1995), Bệnh đường tiêu hóa ở lợn. NXB Nông nghiệp, tr. 63- 96. 11. Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella trên lợn ở tuổi giết thịt”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, số 3, tr. 89-93. 12. Trần Thị Hạnh và cộng sự (2009), “Tỷ lệ nhiễm Salmonella spp. tại cơ sở giết mổ lợn công nghiêp và thủ công nghiệp”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 51-56. 13. Nguyễn Bá Hiên (2001), Một số vi khuẩn đường ruột thường gặp và biến động của chúng ở gia súc khỏe mạnh và bị tiêu chảy nuôi tại vùng ngoại thành Hà Nội. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Trường Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 14. Archie Hunter (2002), Sổ tay dịch bệnh động vật. Công ty in Thống nhất, Hà Nội. 15. Nguyễn Văn Lãm (1968), “Chế vacxin Phó thương hàn lợn con”. Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1968- 1978, NXB Nông nghiệp, tr. 250- 289 16. Laval A (2000), “Dịch tễ Salmonellosis”. Báo cáo tại hội thảo về bệnh lợn tại Viện Thú y – Hà Nội tháng 6/2000, Tài liệu dịch của Trần Thị Hạnh – Viện Thú y. 17. Phạm Sỹ Lăng, Phan Địch Lân, Trương Văn Dung (2004), Bệnh phổ biến ở lợn và biện pháp phòng trị. NXB Nông nghiệp. 18. Hồ Văn Nam, Nguyễn Thị Đào Nguyên, Trương Quang, Phùng Quốc Chướng, Chu Đức Thắng, Phạm Ngọc Thạch (1997), “Tình hình nhiễm Salmonella và vai trò của Salmonella trong bệnh viêm ruột ỉa chảy ở lợn”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 2, tr. 39-45. 19. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở (1989), “Kết quả điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn”. Kết quả nghiên cứu khoa học kỹ thuật Thú y (1985-1989). Viện Thú y, NXB nông nghiệp, Hà nội 1989, tr. 50-53. 20. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú (1989), “Enterobacteria in diarrhoea pig”. Kết quả 20 năm nghiên cứu của Viện Thú y (1969 – 1989), Hà Nội, tr. 43. 21. Cù Hữu Phú, Nguyễn Ngọc Nhiên, Vũ Bình Minh, Đỗ Ngọc Thuý (2000), “Phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella ở lợn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hoá học của các chủng vi khuẩn phân lập được và biện pháp phòng trị”. Kết quả nghiên cứu Khoa học kỹ thuật thú y (1996-2000), NXB Nông nghiệp, Hà Nội, tr. 171-176. 22. Nguyễn Vĩnh Phước (1970), Vi sinh vật học thú y. NXB Đại học và trung học chuyên nghiệp Hà Nội. 23. Phan Thanh Phượng (1988), Phòng và chống bệnh Phó thương hàn lợn. NXB Nông thôn, Hà Nội. 24. Hoàng Thị Phi Phượng, Trần Thị Hạnh (2004), “Ảnh hưởng của thức ăn gây nhiễm E.coli và Salmonella đến biến đổi bệnh lý và một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa máu ở lợn sau cai sữa”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 36-41. 25. Lê Minh Sơn (2003), Nghiên cứu một số vi khuẩn gây ô nhiễm thịt lợn vùng hữu ngạn sông Hồng. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp. 26. Lê Văn Tạo (1993), “Phân lập, định danh vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”. Báo cáo khoa học mã số KN 02 – 15, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 27. Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập và định typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”. Tạp chí Nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, số 11, tr. 430- 431 28. Nguyễn Như Thanh. 2001. Vi sinh vật Thú y. NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 29. Tô liên Thu (2004), “Tình trạng kháng kháng sinh của vi khuẩn Salmonella và E.coli phân lập được từ thịt lợn và thịt gà tại vùng đồng bằng Bắc bộ”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 4, tr. 29 – 35. 30. Tô Liên Thu (2005), Nghiên cứu tình trạng ô nhiễm một số vi khuẩn vào thịt lợn, thịt gà sau giết mổ ở Hà Nội và một số phương pháp làm giảm sự nhiễm khuẩn trên thịt. Luận án Tiến sỹ Nông nghiệp, Viện Thú y Quốc gia Hà Nội. 31. Tạ Thị Vịnh, Đặng Khánh Vân (1996), “Bước đầu thăm dò và xác định E.coli và Salmonella trên lợn bình thường và lợn mắc hội chứng tiêu chảy tại Hà Tây và Hà Nội”. Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, số 1, tr. 41- 44. II. TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 32. Asai T, Otagiri Y, Osumi T, Namimatsu T, Hirai H and Sato S (2002), “Isolation of Salmonella from Diarrheic Feces of Pig”. J. Vet. Med. Sci. 64, 2, p. 159- 160. 33. Barners D.M, Sorensen K.D (1975), ”Salmonellosis”. Diseases of Swine, 4th Edition. Iowa State University press, p. 12-18. 34. Benjamin W.H, Turnbough C.N, Posey B.S and Briles D.E (1985), “The ability of Salmonella typhimurium to produce siderophore enterobactin, avirulence factors”. Infect. Immun, 50, p. 392-397. 35. Berends B.R, Van Kanpen F, Snijders J.M.A and Mossel D.A.A (1997), “Identification and quantification of risk factors regarding Salmonella spp. on fork carcasses”. Int. J. Food Microbiol, 36, p. 199-206. 36. Berends B.R, Van Knapen F, Mossel D.A.A, Burt S.A and Snij J.M.A (1998), “Impact on human health of Salmonella spp. on pork in the Netherlands and the anticipated effects of some currently proposed control strategies”. Int. J. Food Mcrobiol, 44, p. 219-229. 37. Bergey’s (1994), Manual of determinative Bacteriology, 9th Edition, by the Williams and Wilkings Company. 38. Borch E, Nesbakken T and Christensen H (1996), “Hazard identification in swine slaughter with respect to foodborne”. Bacteria Int. J. Food Microbiol, 30, p. 9-25. 39. Bradley S.G (1979), “Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins”. Ann. Rev. Microbiol, 33, p. 67-94. 40. Bryan F (1988), “Risks associated with vehicles of foodborne pathogens and toxins”. J. Food Prot, 51, p. 498-508. 41. Chiu C.H and Ou J.T (1996), “Rapid identification of Salmonella serovars in feces by specific detection of the virulence genes, invA and spvC, by an enrichment broth culture – multiplex PCR combination assay”. J. Clin. Microbiol, 34, p. 2619-2622. 42. Chiu C.H, Su L.H and Chu C (2004), “Samonella enterica serotype Choleraesuis: Epidemiology, Pathogenesis, Clinical Disease and Treatment”. Clinical Microbiology Reviews 2, p. 311-322. 43. CIRAD “Training Course Salmonella”, 23 – 37 October 2006. 44. Clarke G.J, Wallis T.S, Starkey W.J, Collins J, Spencer A.J, Daddon G.J, Osborne M.P, Candy D.C and Stephen I (1988), “Expression of an antigen in strains of Salmonella typhimurium with antibodies tocholeratoxin”. Med. Microbiol, 25, p. 139-146. 45. Cleckner N, Roth J.R, Bostein D (1977), “Genetic engineering invivo using translocatable drug – resistance elements new methods in bacterial genetics”. Hol. Sen. Gonet , 116, p. 125 – 159. 46. Cloeckaert A, Praud K, Doublet B, Demartin M and Weill F.X (2006), “Variant Salmonella genomic island J – L antibiotic resistance gene cluster in Salmonella enterica serovar Newport”. Antimicrob. Agents Chemother, 50, p. 3944-3946. 47. Cortez A.L.L, Carvalho A.C.F.B, Ikuno A.A, Bürger K.P and Vidal – Martins A.M.C (2006), “Identification of Salmonella spp. isolates from chicken abattoirs by multiplex – PCR”. Res. Vet. Sci, 81, p. 340-344. 48. Crosa J.H, Brenner D.J, Ewing W.H and Falkow S (1973), “Molecular relationship among Salmonella”. J. Bacteriol, 115, p. 307-315. 49. Ewing, Edward (1970), Indentification of Enterobacteriaceae. Edicion Revolucionnalria, Instituto Cubano Del libro 19 No 1002, Vedado Habana. 50. Euzéby J.P (1999), “Revised Salmonella nomenclature”: designation of Salmonella enterica. (ex. Kauffmann and Edwards 1952) Le Minor and Propoff 1987 sp. nov., nom. rev. as the neotype species of the genus Salmonella Lignieres 1900 (Approved Lists 1980), rejection of the name Salmonella choleraesuis (Smith 1894) Weldin 1927 (Approved Lists 1980), and conservation of the name Salmonella typhi (Schroeter 1886) Warren and Scott 1930 (Approvied Lists 1980), Request for an opinion. Int. J. Sist. Bacteriol, 49, p. 927-930. 51. Farmer J.J (1995), “Enterobacteriaceae: Introduction and identification”. p. 438-449. In Murray P.R, Baron E.J and Pfaller M.A (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 6th Edition, American Society for Microbiology, Washington D.C. 52. Finlay B.B and Falkow (1988), “Virulence factors associated with Salmonella species”. Microbiological Sciences Vol. 5, No.11. 53. Frost A.J, Bland A.P, Wallis T.S (1997), “The early dynamic respose of the calf ileal ephithelium to Salmonella typhimurium”. Vet – Pathol, 34, p. 369-386. 54. Gray J.T, Fedorka-Gray P.J and Stabel T.S (1995), “Influence of inoculation route on the carrier state of Salmonella choleraesuis in swine”. Vet. Microbiol, 47, p. 43 – 49. 55. Griggs D.J, Hall M.C, Jin Y.F, and Piddock I.J.V (1994), “Quinolon resistantce in Veterinary Isolates of Salmonella”. J. Antimicrobiological Chemotherapy, p. 1173-1189. 56. Jones J.W, Richardson A.L (1981), “The attachment to invasion of helacells by Salmonella typhimurium the contribution of manose sensitive and manose – sensitive haemaglutinate activities”. J. Gen. Microbiol, V127, p. 361-370. 57. Khakhria R and Johnson W (1995), “Prevalence of Salmonella serotypes and phage types in Canada”. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 26 (Suppl. 2) p. 42-44. 58. Kishima M, Uchida i, Namimatsu T, Osumi T, Takahashi S, Tanaka K, Aoki H, Matsuura K and Yamamoto K (2008), “Nationwide Surveillance of Salmonella in the Faeces of Pigs in Japan”. 59. Krause M, Fang F.C, Gedaily A.E, Libby S and Guiney D.G (1995), “Mutational Ananysis of SpvR Binding to DNA in the Regulation of the Salmonella Plasmid Virulence Operon”. Academic Press. Inc. Plasmid, 34, p. 37-47. 60. Morris I.A, Wray C, Sojka W.J (1976), “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a get E mutant of Salmonella typhymurium”. Bristh J. of Exp, Path 57. 61. NCCLS (2000), Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests. Approved standard, seventh edition edn. Pennsylvania, USA: The National Committe for Clinical Laboratory Standards, p. 5-10. 62. Nielsen B and Wegener H.C (1997), “Public health and pork and fork products: regional perspectives of Denmark”. Rev. Sci. Tech, 16, p. 513-524. 63. Nusera D.M, Maddox C.W, Hoien-Dalen P and Weigel R.M (2006), “Comparison of API 20E and invA PCR for identification of Salmonella enterica isolates from swine production units”. J. Clin. Microbiol, 44, p. 3388-3390. 64. Peteron J.W (1980), “Salmonella toxin”. Pharm Ather, VII, p. 719-724. 65. Plonait H, Bickhardt (1997), Salmonella infectionand Salmonella lehrbuchder Schweine Krankheiten. Parey Buchverlag, Berlin, p. 334 – 338. 66. Popoff M.Y (2001), Antigenic formulas of the Salmonella serovas. , 8th edition. WHO Collaborating Centre for reference and Research on Salmonella Institus Pasteur, Paris, France, p. 156. 67. Pritchett L.C, Konkel M.E, Gay J.M and Besser T.E (2000), “Identification of DT 104 and U 302 phage types among Salmonella enterica serotype Typhimurium isolates by PCR”. J. Clin. Microbiol, 38, p. 3484-3488. 68. Quinn P.J, Carter M.E, Makey B, Carter G.R (2002), Clinical veterinary microbiology. Wolfe Pulishing, London WC1 H9LB, England, p. 209-236. 69. Rahman K, De Grandis S.A, Clarke R.C, McEwen S.A, Galán J.E, Ginocchio C, Curtiss III R and Gyles C.L (1992), “Amplification of a invA gene sequence of Salmonella typhimurium by polymerase chain reaction as a specific method of Salmonella”. Mol. Cell. Probes, 6, p. 271-279. 70. Saitoh M, Tanaka K, Nishimori K, Makino S, Kanno T, Ishihara R, Hatama S, Kitano R, Kishima M, Sameshima T, Akiba M, Nakazawa M, Yokomizo Y and Uchida I (2005), “The artAB genes encode a putative ADP- ribosyltransferase toxin homologue associated with Salmonella enterica serova Typhimurium DT104”. Microbiology , 151, p. 3089-3096. 71. Schwartz K.J (1999), “Salmonellosis”. In: Straw, B. E., S. D Allaire, W. L. Mengeling, and D. J. Taylo (eds), Disease of Swine, p. 535-551. Iowa State University Press, Ames. 72. Selbitz H.J (1995), Grundsaetzliche Sicherheisanfornderungen bein Einsatz von lebendimpfstoffen bei lebensmittelliefernden Tieren. Berl Much. Tieruzl. Wschr, 144, p. 428-423. 73. Skyberg J.A, Logue C.M and Nolan L.K (2006),“Virulence genotyping of Salmonella spp. with multiplex PCR“. Avian Dis, 50, p. 77-81. 74. Su L.H, Chiu C.H, Kuo A.J, Chia J.H, Sun C.F, Leu H.S and Wu T.L (2001), “Secular trends in incidence and antimicrobial resistance among clinical isolates of Salmonella at a university hospital in Taiwan, 1983-1999”. Epidemiol Infect, 127, p. 207-213. 75. Suzuki S, Komase K, Matsui H, Abe A, Kawahara K, Tamura Y, Kijima M, Danbara H, Nakamura M and Sato S (1994), “Virulence region of plasmid pNL2001 of Salmonella enteritidis”. Microbiology, 140, p. 1307-1318. 76. Timoney J.F, Gillespie J.H, Baelough J.E, Hagan and Bruner’s (1988), “Microbiology and infection disease of domentic animals”, Inthca and London Comstock Publising Associates, A Division of cornell University press, p. 209-230. 77. Tsolis R.M, Adams L.G, Fitcht T.A and Baumler A.J (1999), “Contribution of Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence factors to diarrheal disease in calves. Infect”. Immun, 67, p. 1879-1885. 78. Valtonen M.V (1977), “Role of phagocytosis in mouse virulence of Salmonella typhimurium recombinmant with O- antigen 6, 7 or 4, 12.” Infect. Immun, 18, p. 574. 79. Weinstein D.L, Carsiotis M, Lissner CH.R, Osrien A.D (1984), “Flagella help Samonella typhimurium survive within murine macrophages”. Infection and Immuniti, 46. p. 819-825. 80. Wilcock B.P, Schwartz K.J (1992), “Salmonella”. Disease of Swine, 7th Edition, p. 570-583. 81. Wilcock B.P (1995), “Salmonellosis”. Disease of Swine, Sixth Edition, Iowa state University Press, U.S.A, p. 508-518. Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o tr­êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi ----------eêf---------- VĂN THỊ HƯỜNG NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN Salmonella PHÂN LẬP ĐƯỢC TỪ LỢN SAU CAI SỮA BỊ TIÊU CHẢY VÀ CHẾ TẠO THỬ NGHIỆM VACXIN PHÒNG BỆNH LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh : THó Y M· sè : 60.62.50 Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS.TS. CÙ HỮU PHÚ Hµ Néi - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, Ngày tháng 9 năm 2009 Tác giả Văn Thị Hường LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cùng với sự lỗ lực cố gắng của bản thân, tôi xin được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy: PGS.TS. Cù Hữu Phú, người đã trực tiếp hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn. Tôi xin được chân thành cảm ơn tới thầy: TS. Nguyễn Hữu Nam, các thầy cô trong bộ môn Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y; Viện sau Đại học – Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tận tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn tới các chuyên gia: GS. Koichi Takeshi, GS. Makino Sou-ichi, Khoa Thú y ứng dụng và Thú y cộng đồng- Trường Đại học Nông nghiệp và Thú y Obihiro, Nhật Bản đã giúp tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Thú y, các anh, chị, em Bộ môn Vi trùng- Viện Thú y, Lãnh đạo công ty giống chăn nuôi Hà Nôi, Hưng Yên, Bắc Ninh, Hải Phòng, Thái Bình và các bạn đồng nghiệp đặc biệt là gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Hà nội, ngày tháng 09 năm 2009 Văn Thi Hường MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các từ viết tắt vii Danh mục bảng viii Danh mục hình ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate BHI Brain Heart Infusion BPW Buffered Pepton Water CHO Chinese Hamster Ovary Cell CIRAD Centre de Cooperation Internationale en Recherche Agronomique pour le Developpement DHL Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose DNA Deoxyribonucleic Acid DPF Delayer Permebility Factor DT104 Definitive phage type 104 EDTA Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ETEC Enterotoxigenic E. coli GDP Guanin diphosphate GTP Guanin triphosphate InvA Invasion A LIM Lysine Indole Motility LPS Lipopolysaccharide LT Heat- Labile Toxin mARN Messenger Acide RiboNucleotide RPF Rapid Permebility Factor ST Heat- stabile Toxin Stn Salmonella toxin TSI Triple- Sugar- Iron PCR Polymerase Chain Reaction RV Rappaports Vassiliadis DANH MỤC BẢNG STT Tªn b¶ng Trang 3.1 Bảng đánh giá mức độ mẫn cảm của vi khuẩn với một số loại kháng sinh 39 3.2 Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm dùng để xác định một số yếu tố gây bệnh của các chủng Salmonella phân lập được 40 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella từ các mẫu phân và bệnh phẩm 45 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng của lợn bệnh 47 4.3 Kết quả kiểm tra một số đặc tính nuôi cấy của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 51 4.4 Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 53 4.5 Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 57 4.6 Kết quả kiểm tra mức độ mẫn cảm với một số loại kháng của các chủngvi khuẩn Salmonella phân lập được 60 4.7 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 63 4.8 Kết quả kiểm tra độc lực của một số chủng Salmonella phân lập được 67 4.9 Các chủng vi khuẩn Salmonella chọn gây bệnh 68 4.10 Kết quả gây bệnh thực nghiệm Salmonella trên lợn 35 ngày tuổi 69 4.11 Bệnh tích đại thể các lợn gây bệnh thực nghiệm 71 4.12 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu các lô vacxin 74 4.13 Kết quả thử hiệu lực của vacxin trên chuột nhắt trắng 75 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 3.1 Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm và phân 35 3.2 Quy trình sản xuất vacxin vô hoạt bổ trợ keo phèn 43 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn Sallmonella từ mẫu phân và bệnh phẩm 45 4.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Salmonella ở một số cơ quan phủ tạng của lợn bệnh 47 4.1 Ruột lợn bi viêm do vi khuẩn Salmonella gây ra. 50 4.2 Lách sưng to ở lợn mắc bệnh do Salmonella gây ra 50 4.3 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường CHROM 53 4.4 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường DHL 54 4.5 Phản ứng lên men đường của vi khuẩn Salmonella 54 4.6 Vi khuẩn Salmonella trên môi trường TSI 55 4.3. Kết quả xác định serotyp của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 57 4.4 Kết quả kiểm tra một số yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được 63 4.7 Kết quả của phản ứng PCR xác định yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Salmonella 64 4.8 Gây bệnh thực nghiệm cho lợn 72