Luận văn Phân lập các hợp chất chính có tác dụng chống oxi hóa trong lá chùm ngây (moringa oleifera lam.)

C. Đồng thời, isoquercitrin (chất II) cũng đã được phát hiện trong lá Chùm Ngây từ rất sớm, xem như một trong những flavonoid chủ yếu của lá Chùm Ngây. Isoquercitrin cũng chiếm tỉ lệ khá cao trong thành phần hóa học của nhiều loài cây 76 quen thuộc như lá Hồng Sen (Nelumbo lucifera) – chiếm 5,75%, lá Nho Đen Hy Lạp (Ribes nigrum) – chiếm 5,5%, hay lá giấp cá (Houttuynia cordata), quả nho Concord (Vitis labrusca), lá các loài É Lá Chụm (Hyptis fasciculata), quả Việt Quất (Vaccinium myrtillus), lá cây Đỗ Trọng (Eucommia ulmoides), cây Trắc Bá (Thuja orientalis) [12, 22, 31, 34, 51] Hoạt tính chống oxy hóa của isoquercitrin rất mạnh, được khảo sát là có tác dụng oxy hóa mạnh nhất trong cây Trắc Bá [34]. Ngoài ra, isoquercitrin còn những hoạt tính sinh học nổi trội như là: ức chế thành lập AGEs (Advanced Glycation End-products), là tác nhân quan trọng trong bệnh đái tháo đường; làm giảm sự tăng sinh tế bào glioblastoma và làm thay đổi sự nhận biết của thụ quan beta-catenin của tế bào [12, 21, 35] Kết quả xác định 2 hợp chất chống oxy hóa trên từ lá cây Chùm Ngây là một bằng chứng khoa học về khả năng chống oxy hóa của lá Chùm Ngây và cũng là một cơ sở dữ liệu cụ thể làm tiền đề cho những nghiên cứu về các hoạt tính khác có liên quan của lá Chùm Ngây như chống ung thư, chữa tiểu đường, kháng viêm 3.6 Tái đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các hợp chất phân lập được 3.6.1. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH 2 hợp chất phân lập được từ phân đoạn etyl acetat của Chùm Ngây được tiến hành tái đánh giá hoạt tính quét gốc tự do DPPH theo mục 2.2.6.1. Kết quả khảo sát được trên khoảng tuyến tính giữa nồng độ chất thử và khả năng quét gốc tự do DPPH được thể hiện trong bảng 3.23, 3.24 và hình 3.22 và 3.24. Bảng 3.23: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên vitexin Vitexin Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,871 1 100 25 0,658 24,455 2 200 50 0,547 37,199 77 3 400 100 0,355 59,242 4 800 200 0,068 92,193 5 1000 250 0,060 93,111 Hình 3.23: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin Bảng 3.24: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên isoquercitrin Isoquercitrin Ống Nồng độ (μg/ml) OD trung bình HTCO (%) Mẫu Phản ứng Chứng 0 0 0,859 1 10 2,5 0,725 15,600 2 15 3,75 0,615 28,405 3 20 5 0,550 35,972 4 25 6,25 0,478 44,354 5 30 7,5 0,345 59,837 6 35 8,75 0,268 68,801 7 40 10 0,215 74,971 78 Hình 3.24: Hoạt tính quét gốc tự do DPPH của Isoquercitrin. Từ giá trị khảo sát được trong khoảng tuyến tính như trên của 2 chất, ta tính được IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của 2 chất, đối chiếu với kết quả IC50 của cao phân đoạn etyl acetat và vitamin C, kết quả thể hiện như bảng 3.25 và hình 3.25. Bảng 3.25: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do của vitexin và isoquercitrin Mẫu Giá trị IC50 (μg/ml) Vitexin (Chất I) 85,18 Isoquercitrin (Chất II) 6,64 Cao etyl acetat 24,59 Vitamin C 7,41 79 Hình 3.25: Giá trị IC50 về hoạt tính quét gốc tự do DPPH của vitexin và isoquercitrin so với Vitamin C. Trong phản ứng của chất chống oxy hóa với DPPH, gốc tự do bền DPPH có màu tím sẽ được chuyển đổi thành α-α-diphenyl-β-picryl hydrazin không màu. Chất chống oxy hóa sẽ chuyển một H+ cho DPPH, do đó trung hòa được gốc tự do này. Kết quả khảo sát các phân đoạn cao cho thấy, cao etyl acetat có hoạt tính quét gốc tự do cao nhất, với IC 50 là 24,59 μg/ml vì đây là phân đoạn tập trung nhiều hợp chất phenolic nhất. Khảo sát 2 hợp chất phân lập được từ phân đoạn này là vitexin và isoquercitrin nhận nhấy: - Cả hai chất vitexin và isoquercitrin đều thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH. - Vitexin có IC50 là 85,18 μg/ml, và isoquercitrin có IC50 là 6,64μg/ml. Isoquercitrin có hoạt tính quét gốc tự do DPPH mạnh hơn rất nhiều so với vitexin. Điều đó thể hiện khả năng nhường H+ của isoquercitrin cao hơn vitexin. So sánh về mặt cấu tạo, isoquercitrin có nhiều nhóm OH hoạt động 80 hơn vitexin. Chính những nhóm OH hoạt động này quyết định hoạt tính quét gốc tự do của chúng. - Isoquercitrin cũng thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH mạnh hơn cao phân đoạn etyl acetat. Kết quả SKLM cho thấy vết của isoquercitrin to và đậm, thể hiện chúng chiếm một tỉ lệ khá cao trong phân đoạn này. Mặt khác, giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của isoquercitrin thấp hơn cao phân đoạn etyl acetat gần 4 lần. Như vậy có thể kết luận isoquercitrin đóng vai trò chủ đạo, quyết định hoạt tính chống oxy hóa của phân đoạn etyl acetat từ lá Chùm Ngây. Vitexin lại có IC50 cao hơn phân đoạn etyl acetat, thể hiện hoạt tính thấp hơn, góp một phần vai trò trong hướng đáp ứng chống oxy hóa của phân đoạn. - Isoquercitrin cũng thể hiện hoạt tính quét gốc tự do DPPH xấp xỉ với vitamin C (IC50=7,41μg/ml), thậm chí còn có phần nổi trội hơn. Kết quả này cho thấy tiềm năng khai thác isoquercitrin từ lá Chùm Ngây phát triển thành thuốc chống oxy hóa tương tự như vitamin C. 3.6.2. Khảo sát năng lực khử 2 chất phân lập được cũng đồng thời được tiến hành thẩm định khả năng chống oxy hóa bằng khảo sát năng lực khử. Siddhuraju đã công bố năng lực khử của một phức hợp nào đó có liên quan đến hoạt tính chống oxy hóa của phức hợp đó [48]. Năng lực khử của một chất là khả năng nhường điện tử của chất đó khi tham gia phản ứng phả oxy hóa – khử. Do đó, năng lực khử thường được sử dụng như một chỉ thị để đánh giá hoạt động chuyển electron từ chất có khả năng chống oxy hóa cho các tác nhân oxy hóa, đưa chúng về trạng thái cân bằng. Đánh giá năng lực khử cho phép sơ bộ đánh giá được tiềm năng chống oxy hóa của một chất. Tiến hành thí nghiệm như đã trình bày ở mục 2.2.6.2. Kết quả thu được như bảng 3.26 và hình 3.26 81 Bảng 3.26: Năng lực khử của vitexin và isoquercitrin Mẫu Năng lực khử (ΔOD) 200 μg/ml 400 μg/ml 600 μg/ml 800 μg/ml 1000 μg/ml Vitexin 0,192 0,418 0,443 0,472 0,512 Isoquercitrin 0,293 0,630 0,983 1,262 1,636 Vitamin C 0,462 0,952 1,398 1,986 2,308 Hình 3.26: Năng lực khử của vitexin, isoquercitrin và Vitamin C. Phân tích kết quả thu được cho thấy: - Vitexin, isoquercitrin và vitamin C đều có năng lực khử tăng khi tăng nồng độ chất thử nghiệm. - Năng lực khử của isoquercitrin luôn cao hơn vitexin tại các nồng độ như nhau trong khoảng giá trị khảo sát. Đồng thời, khi nồng độ càng tăng thì khoảng chênh lệch giữa năng lực khử của isoquercitrin so với vitexin càng tăng. Có thể kết luận năng lực khử của isoquercitrin cao hơn vitexin. Cả 2 chất đều là những chất nhường điện tử tốt và có thể làm ngừng chuỗi phản 82 ứng của các gốc tự do bằng cách biến đổi các gốc tự do thành những sản phẩm bền. - So với chứng dương, năng lực khử của vitexin và isoquercitrin đều thấp hơn vitamin C. Ở nồng độ 1000 μg/ml, năng lực khử của vitexin chỉ bằng 22,18% và của isoquercitrin bằng 70,71% so với vitamin C. So sánh với kết quả khảo sát hoạt tính quét gốc tự do DPPH, vitamin C có năng lực khử cao hơn nhưng lại có hoạt tính quét gốc tự do DPPH thấp hơn so với isoquercitrin. Năng lực khử được khảo sát dựa trên khả năng nhường electron và hoạt tính quét gốc tự do DPPH dựa trên khả năng cho H+. Như vậy isoquercitrin là hợp chất có khả năng nhường H+ tốt hơn vitamin C, nhưng khả năng nhường electron thấp hơn vitamin C. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH và năng lực khử của một chất đều phụ thuộc vào số gốc OH tự do mang H linh động và khả năng phân cực của liên kết O-H trong cấu trúc phân tử của chất thử nghiệm. 3.6.3 Khảo sát hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do Bên cạnh năng lực khử, 2 chất thử nghiệm cũng được khảo sát khả năng quét gốc tự do theo một cơ chế khác, cơ chế quét gốc hydroxyl tự do. Hydroxyl tự do (OH.) là gốc tự do có tính oxy hóa rất mạnh nhờ mang 1 điện tử tự do có điện thế khử lên đến 2310 mV nên có khả năng tác động lên các cơ thể sống một cách nhanh chóng, mà cụ thể là tác động lên lipid, polypeptide, protein và DNA, đặc biệt là thiamine và guanosine (Kiara, 2004). Hydroxyl tự do cũng là gốc tự do khá phổ biến trong các cơ thể sống, được sinh ra trong các phản ứng hóa sinh của cơ thể trong suốt chu trình sống. Chất có khả năng kháng gốc hydroxyl tự do, nghĩa là có khả năng phân hủy các gốc hydroxyl tự do sinh ra từ phản ứng trên, được xem như có khả năng chống oxy hóa. Kết quả thu được về khả năng kháng gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin được đối chiếu với vitamin C như bảng 3.27 và hình 3.27. 83 Bảng 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin. Mẫu Khả năng kháng hydroxyl tự do (%) 200 µg/ml 400 µg/ml 600 µg/ml 800 µg/ml 1000 µg/ml Vitexin (chất I) 47,649 55,016 60,502 65,204 70,141 Isoquercitrin (chất II) 46,730 49,961 53,349 57,526 60,441 Vitamin C 2,536 6,809 11,085 17,260 21,378 Hình 3.27: Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin. Từ giá trị khảo sát trên, ta có thể tính được giá trị IC50 tương đối về khả năng quét gốc hydroxyl tự do của chất I và chất II như bảng 3.28 và hình 3.28. 84 Bảng 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do của vitexin và isoquercitrin Mẫu Giá trị IC 50 (μg/ml) Vitexin (Chất I) 248,152 Isoquercitrin (Chất II) 394 Vitamin C 2183 Hình 3.28: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc hydroxyl tự do Kết quả khảo sát được cho thấy khả năng quét gốc hydroxyl tự do của cả vitexin và isoquercitrin đều mạnh hơn rất nhiều so với vitamin C (IC50 lần lượt là 248,152µg/ml, 394µg/ml và 2183µg/ml). Vitexin có khả năng quét gốc tự do DPPH và năng lực khử đều thấp hơn so với isoquercitrin, nhưng hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do cao hơn isoquercitrin. Điều này chứng tỏ khả năng quét gốc hydroxyl tự do của một chất chống oxy hóa được quyết định bởi một cơ chế khác. 85 Những khảo sát tái đánh giá hoạt tính chống oxy hóa cho thấy cả 2 chất phân lập được từ phân đoạn ethyl acetat của lá Chùm Ngây đều có khả năng chống oxy hóa theo nhưng cơ chế khác nhau, và đều có tiềm năng phát triển thành thuốc hay thực phẩm chức năng có công dụng chống oxy hóa. 86 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận 4.1.1. Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu Xác định giảm khối lượng do sấy khô là 78,13 %. Độ ẩm bột dược liệu là 8,857 %. Độ tro toàn phần là 13,297 %. Tro không tan trong HCl là 0,363 %. Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật, trong là Chùm Ngây có các hợp chất tinh dầu, acid béo, carotenoid, triterpenoid, alkaloid, anthraquinon, coumarin, tanin, flavonoid, saponin, chất khử, acid hữu cơ và polyuronic. 4.1.2. Quy trình chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn Đã thiết lập quy trình chiết cao cồn tổng lá Chùm Ngây, từ 10 kg nguyên liệu lá tươi thu được 600 g cao tổng. Bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng, thu được 4 cao phân đoạn: Cao eter 168 g, cao cloroform 2,63 g, cao etyl acetat 28,40g, cao nước 120 g. 4.1.3. Định lượng phenolic tổng và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn ¾ Định lượng phenolic tổng: - Hàm lượng phenolic tổng trong cao cồn tổng là 108,011μg GAE/mg. - Hàm lượng phenolic tổng trong cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 44,528 μg GAE/mg, 110,914 μg GAE/mg, 271,822 μg GAE/mg, 90,881μg GAE/mg. Hàm lượng phenolic tổng tập trung nhiều nhất trong phân đoạn etyl acetat. ¾ Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa thông qua cơ chế quét gốc tự do DPPH: Giá trị IC50 về khả năng quét gốc tự do DPPH của cao cồn tổng, cao eter, cao cloroform, cao etyl acetat và cao nước lần lượt là 95,26 μg/ml, 287,79 μg/ml, 148,35 μg/ml, 24,59 μg/ml và 206,69 μg/ml. Kết quả cho thấy phân đoạn etyl acetat là phân đoạn có hoạt tính chống oxi hóa cao nhất. 4.1.4. Phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa Từ phân đoạn etyl acetat, tiến hành phân lập được 2 hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa là vitexin (25 mg) và isoquercitrin (200 mg). 87 Chùm Ngây là đối tượng đang được quan tâm nghiên cứu nhiều trên thế giới cũng như trong nước. Tuy nhiên đây là nghiên cứu đầu tiên trong nước được công bố đã phân lập được chính xác 2 trong số các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa trong lá Chùm Ngây. 4.1.5. Tái đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các chất phân lập ¾ Hoạt tính quét gốc tự do DPPH: Giá trị IC50 của vitexin và isoquercitrin là 85,18 μg/ml và 6,64 μg/ml. Isoquercitrin có hoạt tính cao hơn vitexin và cao hơn chứng dương vitamin C. ¾ Khảo sát năng lực khử: Ở nồng độ 1000 μg/ml, vitexin đạt được 21,66 % năng lực khử của vitamin C và isoquercitrin đạt được 70% năng lực khử của Vitamin C. ¾ Hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do: Giá trị IC50 của vitexin và isoquercitrin và vitamin C lần lượt là 248,152µg/ml, 394µg/ml và 2183µg/ml. Kết quả cho thấy vitexin có hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do cao nhất, cao hơn vitamin C. Có thể thấy isoquercitrin trong Chùm Ngây có tiềm năng làm thuốc hay thực phẩm chức năng chống oxi hóa. 4.2. Đề nghị Tiếp tục phân lập các hợp chất có hoạt tính oxi hóa còn lại trong phân đoạn etyl acetat và xác định thành phần có hoạt tính chống oxi hóa không liên quan đến nhóm phenolic. Tìm hiểu mối tương quan giữa các phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của mẫu thử theo các cơ chế khác nhau. Nghiên cứu hiệu quả phòng và chữa trị của lá Chùm Ngây cũng như các chất phân lập được đối với các bệnh liên quan đến sự oxy hóa như tim mạch, tiểu đường, kháng viêm PHỤ LỤC Bảng 1: : Mối tương quan giữa hàm lượng acid gallic và giá trị OD 758 nm. Hàm lượng acid gallic (μg) OD (758 nm) OD trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 10 0,130 0,132 0,135 0,132 ± 0,007 20 0,284 0,284 0,288 0,285 ± 0,005 30 0,410 0,411 0,410 0,410 ± 0,002 40 0,581 0,583 0,582 0,582 ± 0,002 50 0,682 0,685 0,687 0,685 ± 0,007 Bảng 2: xác định hàm lượng phenolic tổng trên cao tồng cồn và cao phân đoạn. Mẫu OD (758nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Cao tổng 0,484 0,485 0,481 0,483 ± 0,005 Cao Ether 0,223 0,221 0,220 0,221 ± 0,005 Cao Cloroform 0,523 0,524 0,522 0,523 ± 0,002 Cao Ethyl acetate 0,310 0,309 0,308 0,309 ± 0,002 Cao Nước 0,408 0,409 0,406 0,408 ± 0,005 Bảng 3: thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao tổng cồn Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,808 1 50 0,689 0,687 0,690 0,689 ± 0,005 2 100 0,641 0,642 0,640 0,641 ± 0,002 3 200 0,541 0,543 0,542 0,542 ± 0,002 4 300 0,452 0,453 0,451 0,452 ± 0,002 5 400 0,398 0,400 0,397 0,398 ± 0,005 6 500 0,293 0,291 0,290 0,291 ± 0,005 7 600 0,243 0,240 0,241 0,241 ± 0,005 Bảng 4: thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao Eter. Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,836 1 200 0,755 0,757 0,756 0,756 ± 0,002 2 400 0,699 0,702 0,705 0,702 ± 0,007 3 600 0,601 0,599 0,600 0,600 ± 0,002 4 800 0,518 0,519 0,519 0,519 ± 0,002 5 1000 0,464 0,463 0,465 0,464 ± 0,002 6 1200 0,406 0,402 0,404 0,404 ± 0,005 7 1400 0,341 0,347 0,344 0,344 ± 0,007 Bảng 5: thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao Cloroform. Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,773 1 200 0,559 0,560 0,558 0,559 ± 0,002 2 300 0,520 0,521 0,516 0,519 ± 0,007 3 400 0,462 0,462 0,459 0,461 ± 0,005 4 500 0,414 0,414 0,415 0,414 ± 0,002 5 600 0,400 0,390 0,380 0,390 ± 0,025 6 700 0,341 0,342 0,346 0,343 ± 0,007 7 800 0,310 0,300 0,290 0,300 ± 0,025 Bảng 6: thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao Etyl acetate. Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,794 1 50 0,561 0,562 0,561 0,561 ± 0,002 2 75 0,493 0,494 0,498 0,495 ± 0,007 3 100 0,385 0,386 0,384 0,385 ± 0,002 4 125 0,270 0,270 0,300 0,280 ± 0,042 5 150 0,217 0,219 0,218 0,218 ± 0,002 6 175 0,141 0,142 0,145 0,143 ± 0,005 7 200 0,084 0,082 0,081 0,082 ± 0,005 Bảng 7: thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên cao nước. Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,836 1 200 0,768 0,767 0,769 0,768 ± 0,002 2 300 0,700 0,702 0,707 0,703 ± 0,010 3 400 0,639 0,640 0,635 0,638 ± 0,007 4 500 0,578 0,576 0,579 0,578 ± 0,005 5 600 0,557 0,557 0,554 0,556 ± 0,005 6 700 0,480 0,490 0,500 0,490 ± 0,025 7 800 0,432 0,431 0,433 0,432 ± 0,002 Bảng 8: thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên chứng dương Vitamin C. Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,791 1 10 0,672 0,673 0,671 0,672 ± 0,002 2 15 0,634 0,634 0,630 0,633 ± 0,005 3 20 0,551 0,552 0,556 0,553 ± 0,007 4 25 0,487 0,484 0,484 0,485 ± 0,005 5 30 0,370 0,390 0,380 0,380 ± 0,025 6 35 0,303 0,301 0,302 0,302 ± 0,002 7 40 0,237 0,240 0,239 0,239 ± 0,005 Bảng 9: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên chất I Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,791 1 100 0,659 0,657 0,658 0,658 ± 0,002 2 200 0,545 0,549 0,548 0,547 ± 0,005 3 400 0,354 0,356 0,355 0,355 ± 0,002 4 800 0,068 0,067 0,068 0,068 ± 0,002 5 1000 0,059 0,063 0,058 0,060 ± 0,007 Bảng 10: Thông số thử hoạt tính quét gốc tự do DPPH trên chất II Ống Nồng độ (μg/ml) OD (516 nm) OD trung bìnhLần 1 Lần 2 Lần 3 Chứng 0 0,791 1 10 0,726 0,727 0,722 0,725 ± 0,007 2 15 0,616 0,615 0,614 0,615 ± 0,002 3 20 0,540 0,550 0,560 0,550 ± 0,025 4 25 0,477 0,478 0,479 0,478 ± 0,002 5 30 0,344 0,346 0,345 0,345 ± 0,002 6 35 0,266 0,268 0,270 0,268 ± 0,005 7 40 0,215 0,216 0,215 0,215 ± 0,002 Bảng 11: thông số thử năng lực khử trên chất I Nồng độ (μg/ml) OD (700 nm) OD trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 0,293 0,292 0,291 0,292 ± 0,001 200 0,484 0,486 0,482 0,484 ± 0,002 400 0,750 0,700 0,680 0,710 ± 0,036 600 0,737 0,736 0,732 0,735 ± 0,003 800 0,768 0,761 0,763 0,764 ± 0,004 1000 0,801 0,803 0,808 0,804 ± 0,004 Bảng 12: thông số thử năng lực khử trên chất II Nồng độ (μg/ml) OD (700 nm) OD trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 0,214 0,217 0,217 0,216 ± 0,002 200 0,512 0,507 0,508 0,509 ± 0,003 400 0,842 0,848 0,848 0,846 ± 0,003 600 1,199 1,200 1,198 1,199 ± 0,001 800 1,473 1,480 1,481 1,478 ± 0,004 1000 1,851 1,852 1,853 1,852 ± 0,001 Bảng 13: Thông số thử năng lực khử trên vitamin C Nồng độ (μg/ml) OD (700 nm) OD trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 0 0,619 0,618 0,614 0,617 ± 0,003 200 1,079 1,078 1,080 1,079 ± 0,001 400 1,574 1,568 1,565 1,569 ± 0,005 600 2,014 2,014 2,017 2,015 ± 0,002 800 2,601 2,601 2,607 2,603 ± 0,003 1000 2,921 2,924 2,929 2,925 ± 0,004 Bảng 14: Thông số thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do trên chất I Nồng độ (μg/ml) OD (520 nm) OD trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đối chứng 1,390 1,395 1,397 1,394 ± 0,004 0 0,119 0,120 0,115 0,118 ± 0,003 200 0,725 0,727 0,726 0,726 ± 0,001 400 0,825 0,818 0,818 0,820 ± 0,004 600 0,870 0,900 0,009 0,890 ± 0,017 800 0,950 0,960 0,940 0,950 ± 0,010 1000 1,015 1,014 1,010 1,013 ± 0,003 Bảng 15: Thông số thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do trên chất II Nồng độ (μg/ml) OD (520 nm) OD trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đối chứng 1,407 1,408 1,120 1,409 ± 0,003 0 0,160 0,150 0,110 0,140 ± 0,026 200 0,734 0,732 0,733 0,733 ± 0,001 400 0,776 0,773 0,773 0,774 ± 0,002 600 0,815 0,814 0,822 0,817 ± 0,004 800 0,875 0,874 0,864 0,871 ± 0,006 1000 0,901 0,909 0,911 0,907 ± 0,005 Bảng 16: thông số thử hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do trên Vitamin C Nồng độ (μg/ml) OD (520 nm) OD trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Đối chứng 1,390 1,391 1,383 1,388 ± 0,004 0 0,128 0,122 0,125 0,125 ± 0,003 200 0,158 0,159 0,155 0,157 ± 0,002 400 0,213 0,214 0,207 0,211 ± 0,004 600 0,266 0,267 0,263 0,265 ± 0,002 800 0,343 0,342 0,344 0,343 ± 0,001 1000 0,400 0,396 0,390 0,395 ± 0,005 01234567891011121314 1 . 2 3 1 . 0 9 1 . 0 7 1 . 0 3 1 . 1 2 2 . 0 6 1 . 0 0 0 . 9 8 2 . 0 3 1 . 7 1 1 . 0 1 2 . 4 9 6 5 2 . 5 0 0 0 2 . 5 0 3 5 3 . 3 0 3 8 3 . 3 6 2 9 3 . 3 8 0 5 3 . 5 1 8 5 3 . 5 3 0 4 3 . 5 4 1 6 3 . 8 2 4 9 3 . 8 4 3 8 3 . 8 6 2 2 4 . 5 5 9 1 4 . 6 8 4 7 4 . 7 0 4 1 4 . 9 3 0 3 4 . 9 5 0 4 6 . 2 7 1 2 6 . 7 6 7 5 6 . 8 8 4 8 6 . 9 0 1 7 8 . 0 1 3 2 8 . 0 3 0 1 1 3 . 1 5 6 9 CHAT 1-DMSO-1H 0102030405060708090100110120130140150160170180190200 3 9 . 0 1 5 1 3 9 . 1 8 1 9 3 9 . 3 4 8 7 3 9 . 5 1 5 6 3 9 . 6 8 2 4 3 9 . 8 4 9 1 3 9 . 9 4 3 2 4 0 . 0 1 5 5 6 1 . 2 6 0 7 7 0 . 5 4 2 3 7 0 . 8 1 5 2 7 3 . 3 0 8 9 7 8 . 6 1 5 4 8 1 . 7 1 2 3 9 8 . 0 8 2 6 1 0 2 . 3 6 5 1 1 0 3 . 9 6 3 5 1 0 4 . 5 5 0 5 1 1 5 . 7 2 6 5 1 2 1 . 5 3 7 8 1 2 8 . 8 1 0 0 1 5 5 . 9 0 4 7 1 6 0 . 3 1 9 2 1 6 1 . 0 2 8 5 1 6 2 . 4 9 4 2 1 6 3 . 8 4 9 4 1 8 1 . 9 6 5 1 CHAT 1-DMSO-13C ppm 123456789 ppm 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz MC2 QF SI 1024 PC 1.00 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz SI 1024 FnMODE QF SW 13.350 ppm FIDRES 52.163410 Hz SFO1 500.133 MHz TD 128 ND0 1 P16 1000.00 usec GPZ1 10.00 % GPNAM1 SINE.100 ====== GRADIENT CHANNEL ===== SFO1 500.1330069 MHz PL1W 17.15925598 W PL1 1.00 dB P1 11.50 usec P0 11.50 usec NUC1 1H ======== CHANNEL f1 ======== IN0 0.00014975 sec D16 0.00020000 sec D13 0.00000400 sec D1 1.20000005 sec D0 0.00000300 sec TE 300.0 K DE 6.50 usec DW 74.800 usec RG 64 AQ 0.1532404 sec FIDRES 3.263912 Hz SWH 6684.492 Hz DS 16 NS 32 SOLVENT DMSO TD 2048 PULPROG cosygpqf PROBHD 5 mm PABBO BB− INSTRUM spect Time 5.04 Date_ 20110809 PROCNO 1 EXPNO 7 NAME CHAT1−DMSO 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm CHAT1−DMSO DEPT90 DEPT135 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm ppm 1234567891011121314 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 CHAT1−DMSO−HMBC ppm 4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5 ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 CHAT1−DMSO−HMBC ppm 123456789 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 01234567891011121314 2 . 2 8 2 . 6 1 1 . 2 0 0 . 9 9 1 . 2 2 0 . 9 8 0 . 9 9 1 . 0 4 1 . 0 1 1 . 0 0 1 . 0 8 2 . 0 5 1 . 0 3 2 . 4 9 2 7 2 . 4 9 6 4 2 . 5 0 0 0 2 . 5 0 3 7 2 . 5 0 7 3 3 . 0 9 3 6 3 . 2 3 6 8 3 . 2 6 9 8 3 . 3 2 6 0 3 . 5 7 0 8 3 . 5 9 2 4 4 . 1 8 9 6 4 . 8 9 1 7 4 . 9 9 8 4 5 . 2 2 1 1 5 . 4 4 2 6 5 . 4 5 7 5 6 . 1 9 9 4 6 . 2 0 3 5 6 . 4 0 0 6 6 . 4 0 4 7 6 . 8 3 6 1 6 . 8 4 8 4 6 . 8 5 4 2 7 . 5 6 4 2 7 . 5 6 8 7 7 . 5 7 7 0 7 . 5 8 1 1 7 . 5 8 6 8 1 2 . 6 2 1 4 CHAT 2-DMSO-1H 0102030405060708090100110120130140150160170180190200 3 9 . 0 1 9 0 3 9 . 1 8 5 9 3 9 . 3 5 2 9 3 9 . 5 2 0 0 3 9 . 6 8 7 0 3 9 . 7 8 0 1 3 9 . 8 5 3 9 4 0 . 0 2 0 6 6 0 . 9 7 2 4 6 9 . 9 4 1 4 7 4 . 0 6 3 9 7 6 . 4 9 4 4 7 7 . 4 2 3 5 9 3 . 4 2 3 6 9 8 . 5 8 1 8 1 0 0 . 9 6 4 4 1 0 3 . 9 5 1 4 1 1 5 . 1 5 2 1 1 1 6 . 1 8 7 2 1 2 1 . 1 4 7 4 1 2 1 . 5 1 5 1 1 3 3 . 3 5 0 4 1 4 4 . 7 2 1 2 1 4 8 . 3 7 1 2 1 5 6 . 1 5 9 9 1 5 6 . 2 7 3 9 1 6 1 . 1 8 9 1 1 6 4 . 0 3 0 7 1 7 7 . 3 9 0 5 CHAT 2-DMSO-13C ppm 12345678 ppm 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz MC2 QF SI 1024 PC 1.00 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz SI 1024 FnMODE QF SW 13.350 ppm FIDRES 52.163410 Hz SFO1 500.133 MHz TD 128 ND0 1 P16 1000.00 usec GPZ1 10.00 % GPNAM1 SINE.100 ====== GRADIENT CHANNEL ===== SFO1 500.1330069 MHz PL1W 17.15925598 W PL1 1.00 dB P1 11.50 usec P0 11.50 usec NUC1 1H ======== CHANNEL f1 ======== IN0 0.00014975 sec D16 0.00020000 sec D13 0.00000400 sec D1 1.20000005 sec D0 0.00000300 sec TE 300.0 K DE 6.50 usec DW 74.800 usec RG 64 AQ 0.1532404 sec FIDRES 3.263912 Hz SWH 6684.492 Hz DS 16 NS 64 SOLVENT DMSO TD 2048 PULPROG cosygpqf PROBHD 5 mm PABBO BB− INSTRUM spect Time 0.58 Date_ 20110810 PROCNO 1 EXPNO 5 NAME CHAT2−DMSO 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm CHAT2−DMSO DEPT90 DEPT135 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm ppm 1234567891011121314 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 HMBCGP ppm 23456789 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 01234567891011121314 1 . 2 3 1 . 0 9 1 . 0 7 1 . 0 3 1 . 1 2 2 . 0 6 1 . 0 0 0 . 9 8 2 . 0 3 1 . 7 1 1 . 0 1 2 . 4 9 6 5 2 . 5 0 0 0 2 . 5 0 3 5 3 . 3 0 3 8 3 . 3 6 2 9 3 . 3 8 0 5 3 . 5 1 8 5 3 . 5 3 0 4 3 . 5 4 1 6 3 . 8 2 4 9 3 . 8 4 3 8 3 . 8 6 2 2 4 . 5 5 9 1 4 . 6 8 4 7 4 . 7 0 4 1 4 . 9 3 0 3 4 . 9 5 0 4 6 . 2 7 1 2 6 . 7 6 7 5 6 . 8 8 4 8 6 . 9 0 1 7 8 . 0 1 3 2 8 . 0 3 0 1 1 3 . 1 5 6 9 CHAT 1-DMSO-1H 0102030405060708090100110120130140150160170180190200 3 9 . 0 1 5 1 3 9 . 1 8 1 9 3 9 . 3 4 8 7 3 9 . 5 1 5 6 3 9 . 6 8 2 4 3 9 . 8 4 9 1 3 9 . 9 4 3 2 4 0 . 0 1 5 5 6 1 . 2 6 0 7 7 0 . 5 4 2 3 7 0 . 8 1 5 2 7 3 . 3 0 8 9 7 8 . 6 1 5 4 8 1 . 7 1 2 3 9 8 . 0 8 2 6 1 0 2 . 3 6 5 1 1 0 3 . 9 6 3 5 1 0 4 . 5 5 0 5 1 1 5 . 7 2 6 5 1 2 1 . 5 3 7 8 1 2 8 . 8 1 0 0 1 5 5 . 9 0 4 7 1 6 0 . 3 1 9 2 1 6 1 . 0 2 8 5 1 6 2 . 4 9 4 2 1 6 3 . 8 4 9 4 1 8 1 . 9 6 5 1 CHAT 1-DMSO-13C ppm 123456789 ppm 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz MC2 QF SI 1024 PC 1.00 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz SI 1024 FnMODE QF SW 13.350 ppm FIDRES 52.163410 Hz SFO1 500.133 MHz TD 128 ND0 1 P16 1000.00 usec GPZ1 10.00 % GPNAM1 SINE.100 ====== GRADIENT CHANNEL ===== SFO1 500.1330069 MHz PL1W 17.15925598 W PL1 1.00 dB P1 11.50 usec P0 11.50 usec NUC1 1H ======== CHANNEL f1 ======== IN0 0.00014975 sec D16 0.00020000 sec D13 0.00000400 sec D1 1.20000005 sec D0 0.00000300 sec TE 300.0 K DE 6.50 usec DW 74.800 usec RG 64 AQ 0.1532404 sec FIDRES 3.263912 Hz SWH 6684.492 Hz DS 16 NS 32 SOLVENT DMSO TD 2048 PULPROG cosygpqf PROBHD 5 mm PABBO BB− INSTRUM spect Time 5.04 Date_ 20110809 PROCNO 1 EXPNO 7 NAME CHAT1−DMSO 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm CHAT1−DMSO DEPT90 DEPT135 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm ppm 1234567891011121314 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 CHAT1−DMSO−HMBC ppm 4.04.55.05.56.06.57.07.58.08.5 ppm 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 170 175 180 185 CHAT1−DMSO−HMBC ppm 123456789 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 01234567891011121314 2 . 2 8 2 . 6 1 1 . 2 0 0 . 9 9 1 . 2 2 0 . 9 8 0 . 9 9 1 . 0 4 1 . 0 1 1 . 0 0 1 . 0 8 2 . 0 5 1 . 0 3 2 . 4 9 2 7 2 . 4 9 6 4 2 . 5 0 0 0 2 . 5 0 3 7 2 . 5 0 7 3 3 . 0 9 3 6 3 . 2 3 6 8 3 . 2 6 9 8 3 . 3 2 6 0 3 . 5 7 0 8 3 . 5 9 2 4 4 . 1 8 9 6 4 . 8 9 1 7 4 . 9 9 8 4 5 . 2 2 1 1 5 . 4 4 2 6 5 . 4 5 7 5 6 . 1 9 9 4 6 . 2 0 3 5 6 . 4 0 0 6 6 . 4 0 4 7 6 . 8 3 6 1 6 . 8 4 8 4 6 . 8 5 4 2 7 . 5 6 4 2 7 . 5 6 8 7 7 . 5 7 7 0 7 . 5 8 1 1 7 . 5 8 6 8 1 2 . 6 2 1 4 CHAT 2-DMSO-1H 0102030405060708090100110120130140150160170180190200 3 9 . 0 1 9 0 3 9 . 1 8 5 9 3 9 . 3 5 2 9 3 9 . 5 2 0 0 3 9 . 6 8 7 0 3 9 . 7 8 0 1 3 9 . 8 5 3 9 4 0 . 0 2 0 6 6 0 . 9 7 2 4 6 9 . 9 4 1 4 7 4 . 0 6 3 9 7 6 . 4 9 4 4 7 7 . 4 2 3 5 9 3 . 4 2 3 6 9 8 . 5 8 1 8 1 0 0 . 9 6 4 4 1 0 3 . 9 5 1 4 1 1 5 . 1 5 2 1 1 1 6 . 1 8 7 2 1 2 1 . 1 4 7 4 1 2 1 . 5 1 5 1 1 3 3 . 3 5 0 4 1 4 4 . 7 2 1 2 1 4 8 . 3 7 1 2 1 5 6 . 1 5 9 9 1 5 6 . 2 7 3 9 1 6 1 . 1 8 9 1 1 6 4 . 0 3 0 7 1 7 7 . 3 9 0 5 CHAT 2-DMSO-13C ppm 12345678 ppm 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz MC2 QF SI 1024 PC 1.00 GB 0 LB 0.00 Hz SSB 0 WDW SINE SF 500.1300000 MHz SI 1024 FnMODE QF SW 13.350 ppm FIDRES 52.163410 Hz SFO1 500.133 MHz TD 128 ND0 1 P16 1000.00 usec GPZ1 10.00 % GPNAM1 SINE.100 ====== GRADIENT CHANNEL ===== SFO1 500.1330069 MHz PL1W 17.15925598 W PL1 1.00 dB P1 11.50 usec P0 11.50 usec NUC1 1H ======== CHANNEL f1 ======== IN0 0.00014975 sec D16 0.00020000 sec D13 0.00000400 sec D1 1.20000005 sec D0 0.00000300 sec TE 300.0 K DE 6.50 usec DW 74.800 usec RG 64 AQ 0.1532404 sec FIDRES 3.263912 Hz SWH 6684.492 Hz DS 16 NS 64 SOLVENT DMSO TD 2048 PULPROG cosygpqf PROBHD 5 mm PABBO BB− INSTRUM spect Time 0.58 Date_ 20110810 PROCNO 1 EXPNO 5 NAME CHAT2−DMSO 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm CHAT2−DMSO DEPT90 DEPT135 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 ppm ppm 1234567891011121314 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 HMBCGP ppm 23456789 ppm 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục từ viết tắt Danh mục bảng biểu Danh mục hình ảnh Mở đầu ........................................................................................................................ 1 Chương 1: Tổng quan tài liệu .................................................................................. 3 1.1 Tổng quan về cây Chùm Ngây .............................................................................. 3 1.1.1 Danh pháp và phân loại ...................................................................................... 3 1.1.2 Hình thái học ...................................................................................................... 3 1.1.3 Sinh thái học và phân bố .................................................................................... 5 1.1.4 Thành phần hóa học ........................................................................................... 5 1.1.5 Công dụng và bộ phận dùng .............................................................................. 7 1.2 Tình hình nghiên cứu cây Chùm Ngây ................................................................. 9 1.2.1 Trên thế giới ....................................................................................................... 9 1.2.2 Tại Việt Nam .................................................................................................... 12 1.3 Gốc tự do và chất chống oxi hóa ......................................................................... 13 1.3.1 Gốc tự do .......................................................................................................... 13 1.3.2 Chất chống oxi hóa........................................................................................... 14 1.4 Tổng quan về hợp chất flavonoid ........................................................................ 16 1.4.1 Sơ lược về hợp chất thứ cấp flavonoid ............................................................ 16 1.4.1 Chiết xuất flavonoid ......................................................................................... 19 Chương 2: Vật liệu – Phương pháp ....................................................................... 22 2.1 Vật liệu ................................................................................................................ 22 2.1.1 Nguyên liệu ...................................................................................................... 22 2.1.2 Dung môi, hóa chất .......................................................................................... 22 2.1.3 Thiết bị ............................................................................................................. 22 2.2 Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 23 2.2.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu .................................................................... 23 2.2.1.1 Xác định độ ẩm bột dược liệu ....................................................................... 23 2.2.1.2 Xác định độ tro toàn phần ............................................................................. 23 2.2.1.3 Xác định độ tro không tan trong acid chloric ............................................... 24 2.2.1.4 Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ..................................................... 24 2.2.2 Phương pháp chiết xuất dược liệu và thu phân đoạn cao ................................. 25 2.2.2.1 Chiết xuất cao toàn phần .............................................................................. 25 2.2.2.2Chiết cao phân đoạn từ cao toàn phần .......................................................... 26 2.2.3 Khảo sát các cao phân đoạn ............................................................................. 26 2.2.3.1 Định tính cao phân đoạn bằng phương pháp hóa học ................................. 27 2.2.3.2 Sắc ký lớp mỏng ............................................................................................ 30 2.2.3.3Phương pháp định lượng phenolic tổng ........................................................ 31 2.2.4 Phân lập các hợp chất chống oxi hóa ............................................................... 33 2.2.4.1 Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng .............................................................................................................. 33 2.2.4.2 Sắc ký cột nhanh – cột khô ............................................................................ 34 2.2.4.3 Sắc ký cột cổ điển .......................................................................................... 35 2.2.5 Đánh giá hoạt tính chống oxi hóa .................................................................... 36 2.2.5.1 Phương pháp quét gốc tự do DPPH ............................................................. 36 2.2.5.2 Phương pháp xác định năng lực khử ............................................................ 38 2.2.5.3 pháp thử hoạt tính quét gốc hydrxyl tự do .................................................... 39 Chương 3: Kết quả - Biện luận .............................................................................. 42 3.1. Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu ...................................................................... 42 3.1.1. Xác định độ tinh khiết của nguyên liệu........................................................... 42 3.1.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật ......................................................... 43 3.2. Chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn ........................................................ 44 3.2.1. Kết quả chiết xuất cao toàn phần .................................................................... 44 3.2.2. Kết quả chiết cao phân đoạn ........................................................................... 45 3.3. Kết quả khảo sát các cao phân đoạn .................................................................. 47 3.3.1. Kết quả định tính hóa học các cao phân đoạn ................................................. 47 3.3.2 Kết quả định lượng phenolic ............................................................................ 48 3.3.3. Kết quả sắc ký lớp mỏng các phân đoạn tổng các cao phân đoạn .................. 50 3.3.4. Kết quả sàng lọc hoạt tính chống oxi hóa các cao phân đoạn ......................... 53 3.4. Phân lập các hợp chất ......................................................................................... 62 3.4.1. Xác định các thành phần có hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng ................................................................................................................... 62 3.4.2. Sắc ký nhanh – cột khô (Dry – column flash chromatography) ..................... 65 3.4.3. Sắc ký cột cổ điển ........................................................................................... 68 3.5 Xác định cấu trúc của hợp chất tinh khiết. .......................................................... 72 3.6 Tái đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các hợp chất phân lập được .............. 76 3.6.1. Hoạt tính quét gốc tự do DPPH ...................................................................... 76 3.6.2. Khảo sát năng lực khử ..................................................................................... 80 3.6.3 Khảo sát hoạt tính quét gốc hydroxyl tự do ..................................................... 82 Chương 4: Kết luận – Đề nghị ............................................................................... 86 4.1 Kết luận ............................................................................................................... 86 4.1.1 Xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu .................................................................... 86 4.1.2 Quy trình chiết xuất dược liệu và thu cao phân đoạn ...................................... 86 4.1.3 Định lượng phenolic tổng và khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn ........................................................................................................................... 86 4.1.4 Phân lập các hợp chất có hoạt tính chống oxi hóa ........................................... 86 4.1.5 Tái đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các chất phân lập ............................ 87 4.2 Đề nghị ................................................................................................................ 87 Tài liệu tham khảo ..................................................................................................... 88 Phụ lục   88 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Đỗ Huy Bích và cộng sự (1999), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, NXB Y học, tr 458-460. [2] Võ Văn Chi (1999), Tự điển cây thuốc Việt Nam, NXB Y học. [3] Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ (2000), Bài giảng chiết xuất dược liệu, Trường ĐH Y dược TPHCM. [4] Nguyễn Thị Hiền (2010), Nghiên cứu khả năng kháng oxy hóa của các phân đoạn cao chiết từ trà xanh (Camellia sinensis), Luận văn thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Khoa hoc Tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. [5] Trần Hùng (2006), Phương pháp nghiên cứu Dược liệu, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. [6] Lê Văn Huấn (2010), Tìm hiểu hàm lượng Flavonoid trong lá cây Chùm ngây Moringa oleifera Lam., Khóa luận tốt nghiệp cử nhân sinh học, trường Đại học Khoa học tự nhiên TP. Hồ Chí Minh. [7] Trần Việt Hưng, Võ Duy Huấn (1998), Cây thực phẩm và cây thuốc Chùm ngây, Báo thuốc và sức khỏe, số 337, trang 18. [8] Nguyễn Thị Thu Hương (2010), Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa theo hướng bảo vệ gan của nấm Linh chi đỏ Ganoderma lucidum, Tạp chí Y học TP.HCM, tập 14 số 2, tr.131-132. [9] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM. [10] Ngô Văn Thu (1998), Bài giảng dược liệu Tập 1, Bộ Y tế và Bộ Giáo dục Đào tạo, trang 86 – 92. Tài liệu tiếng nước ngoài   89 [11] Ali K. Atoui, Abdelhak M., George B., Panagiotis K. (2005), Tea and Herbal infusion: Their antioxidant activity and phenolic profile, Food Chemistry, 89, pp. 27 – 36. [12] Amado N. G., Cerqueira D. M., Menezes F. S., da Silva J. F., Neto V. M., Abreu J. G. (2009), Isoquercitrin isolated from Hyptis fasciculata reduces glioblastoma cell proliferation and changes beta-catenin cellular localization, Anticancer Drugs, 20 (7). [13] Anwar F., Latif S., Ashraf M., Gilani A. H. (2007), Moringa oliefera: a food plant with multiple medicinal uses, Phytother Res., 21, pp. 17-25. [14] Bharali R., Tabassum J., Azad M. R. (2003), Chemomodulatory effect of Moringa oleifera Lam. on hepatic carcinogen metabolizing enzymes, antioxidant parameters and skin papillomagenesis in mice, Asia Pacific J Cancer, 4, pp. 131 – 139. [15] Bhattarai H. D., Babita P., Soon Gyu Hong, Hong Kum Lee, Joung Han Yim (2008), Thin layer chromatography analysis of antioxidant constituents of lichens from Antarctica, Journal of Natural Medicine, 62, pp. 481 – 484. [16] Caceres A. B., Cabrera, O. Mollinedo, Imendia A. (1991), Preliminary screening of antimicrobial activity of Moringa oleifera”, J Ethnopharmacol, 33, pp. 213 – 216. [17] Costa - Lotufo L. V., Mahmud T. H. K., Arjumand A., Diego V. W., Paula C. J., Claudia P. (2005), Studies of the anticancer potential of plants used in Bangladeshi folk medicine, Journal of Ethnopharmacology, 99, pp. 21-30. [18] Pilaipark Chumark, Panya K., Yupin S., Srichan P., Noppawan M. (2008), The in vitro and ex vitro antioxidant properties, hypolipidaemic and antitherosclerotic activities of water extract of Moringa oleifera Lam. leave, Journal of Ethnopharmacology, 119, pp. 439 – 436.   90 [19] Dangi S. Y., Jolly C. I., Narayanan (2002), Antihypertensive activity of the total alkaloids from the leave of Moringa oleifera, Pharm Biol, 40, pp. 144 – 148. [20] Das B. R., P. A. Kurup, P. L. Narashima Rao, A. S. Ramaswamy (1957), Antibacterial activity and chemical structure of compounds related to pterygospermin, India J Med Res, 45, pp. 191 – 196. [21] Deepralard K., Kazuko Kawanishi, Masataka Moriyasu, Thitima P., Rutt Suttisri (2009), Flavonoid glycosides from the leave of Uvaria rufa with advanced glycation end – products inhibitory activity, Thai J. Pharm. Sci., 33, pp. 84 – 90. [22] Deng S., Deng Z., Fan Y., Li J., Xiong D., Liu R. (2009), Isolation and purification of three flavonoid glycosides from the leaves of Nelumbo nucifera (Lotus) by high-speed counter-current chromatography, J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 877 (24). [23] Duarte J., Perez-Palencia R., Varqas F., Ocete M. A., Zarzuelo A., Tamarqo J. (2001), Antihypertensive effects of the flavonoid quercetin in spontaneously hypertensive rats, Br. J. Pharmacol, 24, pp. 117 – 133. [24] Duarte J., Francisco P. (2001), Natural Products Chemistry, 25, pp. 565 – 603. [25] Eward R. and Gatehouse J. A. (1999), Secondary metabolism in plant biochemistry and molecular biology, John Wiley and Sons. New York, 2, pp. 193 – 218. [26] Faizi S., Siddiqui B. S., Saleem R., Aftab K., Gilani A. H. (1994), Isolation and structure elucidation of new nitrile and mustard oil glycosides from Moringa oleifera and their effect on blood pressure, Journal of Natural Product, 57 (9), pp. 1256-1261.   91 [27] Faizi S., Siddiqui B. S., Saleem R., Aftab K., Gilani A. H. (1995), Fully acetylated carbamate and hypotensive thiocarbamate glycosides from Moringa oleifera, Phytochemistry, 38 (4), pp. 957-963. [28] Gilani A. H., Janbaz K. H., Shah B. H. (1997), Quercetin exhibits hepatoprotective activity in rats, Biochem Soc Trans, pp 25 – 85. [29] Guevara A., Varqas C., Sakurai H., Fujiwara Y., Hashimoto K., Maoka T., Kozuka M., Ito Y., Tokuda H., Nishino H. (1999), An antitumor promoter from Moringa oleifera Lam., Mutation Research, 440, pp. 181-188. [30] Harborne J. B., Tomas – Barberan F. A. (1991), Ecological Chemistry and Biochemistry of Plant Terpenoid, Oxford Science Publication, pp. 159 – 208. [31] He D., Huang Y., Amatjan A., Dongyu Gu, Yi Yang, Haji A. A., Yoichiro Ito (2010), Separation and purification of Flavonoids from Black Currant Leaves by High – Speed Countercurrent Chromatography and Preparative HPLC, Chromatogr Relat Technol, 33, pp 615 – 628. [32] Bo Jiang, Hongyan Zhang, Changjian Liu, Yanying Wang, Shengdi Fan (2009), Extraction of water – solube polysaccharide and antioxidant activity from Ginkgo biloba leaves, Med Chem Res. [33] Jianping Liu, Xing J., Fei Y. (2008), Green tea (Camellia sinensis) and cancer prevention: a systematic review of randomized trials and epidemiological studies, Chinese Medicine, 13. [34] Jung S. H., Kim B. J., Lee E. H., Osborne N. N. (2010), Isoquercitrin is the most effective antioxidant in the plant Thuja orientalis and able to counteract oxidative-induced damage to a transformed cell line (RGC-5 cells), Neurochem Int., 55 (7) [35] Kim H. Y., Moon B. H., Lee H. J., Choi D. H. (2004), Flavonol glycosides from the leaves of Eucommia ulmoides O. with glycation inhibitory activity, J. Ethnopharmacol, 93, pp. 227 – 230.   92 [36] P. Sudhir Kumar, Debasis M., Goutam G., Chandra S. Panda (2010), Medicinal uses and pharmacological properties of Moringa oleifera, International Journal of Phytomedicine, 2, pp. 210 – 216. [37] Lagnika L., Weniger B., Vonthron-Senecheaub C., A. Sanni (2009), Antiprotozoal activities of compounds isolated from Croton lobatus L., Afr. J. Infect. Dis., 3(1), pp 1 – 5. [38] Li TR, Yang ZY, Wang BD. (2007), Synthesis, characterization and antioxidant of naringenin schiff base and its Cu (II), Ni(II), Zn (II) complexes, Chem Pharm Bull, 55, pp 26 – 28. [39] Manguro L. O. A., Lemmen P. (2007), Phenolic of Moringa oleifera leave, Natural Product Research, 21 (1), pp. 56-68. [40] Mehta L. K., Balaraman R., Amin A. H., Bafna P. A., Gulati O. D. (2003), Effect of fruit of Moringa oleifera on lipid profile of normal and hypercholesterolaemic rabbits, Journal of Ethnopharmacology, 86, pp. 19 – 195. [41] Nikkon F., Zahangir Alam Saud, M. Habibur Rahman, Md. Ekramul Haque (2003), In vitro antimicrobial activity of the compound isolated from chloroform extract of Moringa oleifera Lam., Pak J Biol Sci, 22, pp 1888 – 1890. [42] Pal S. K., Pulok K. Mukherjee, B. P. Saha (1995), Studies on the antiulcer activity of Moringa oleifera leaf extract on gastric ulcer models in rats, Phytother Res, 9, pp 463 – 465. [43] Ping-Hsien Chuang, Lee C. W., Chou J. Y., Muruqan M., Sheih B. J., Chen H. M. (2005), Anti-fungal activity of crude extracts and essential oil of Moringa oleifera Lam., Bioresource Technology 98, pp. 232 – 236.   93 [44] Rajanandh M. G., Kavitha J. (2010), Quantitative Estimation of β-Sitosterol, Total Phenolic and Flavonoid Compounds in the Leaves of Moringa oleifera, International Journal of PharmTech Research, 2 (2), pp 1409 – 1414. [45] Ramachandran C., K. V. Peter, P. K. Gopalakrishnan (1980), Drumstick (Moringa oleifera): A Multipurpose Indian Vegetable, Economic botany, 34, pp. 277 – 283. [46] Sabale V. (2008), Moringa oleifera (Drumstik): An overview, Pharmacognosy review, 2 (4), pp. 7 – 13. [47] Shanker K., Gupta M. M., Srivastava S. K., Bawankule D. U., Pal A., Khanuja S. P. S. (2006), Determination of bioactive nitrile glycoside(s) in drumstick (Moringa oleifera) by reverse phase HPLC, Food Chemistry, 105, pp. 376-382. [48] Siddhuraju P., Becker K. (2003), Antioxidant properties of various solvent extracts of total phenolic constituents from three different agroclimate origins of drumstik tree (Moringa oleifera Lam.) leaves, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, pp. 2144-2155. [49] Singh A., Samir M., Ravi S. (2008), Anti – inflammatory and Analgesic Agents from Indian Medicinal Plants, International Journal of Integrative Biology. [50] Vidya Sabale (2008), Moringa oleifera (Drumstick): An overview, Pharmacognosy review, 2 (4), pp 7 – 13. [51] Williams B. L., Simon H. Wender (1952), The isolation and identification of quercetin and isoquercitrin from grapes (Vitis vinifera), J. Am. Chern. Soc. 74:4372 [52] Zhou X., Peng J., Guorong Fan (2005), Isolation and purification of flavonoid glycosides from Trollius ledebouri using high-speed counter-current chromatography by stepwise increasing the flow-rate of the mobile phase, J Chromatoqr A., 1092 (2), 216 – 221.   94 [53] Zhou Y. J, Liu Y. E., Cao J. Zeng G., Shen C.,Li Y., Zhou M., Chen Y. (2009), Vitexins, Nature-Derived Lignan Compounds, Induce Apoptosis and Suppress Tumor Growth, Clin Cancer Res, 15(16),5161–9. [54] Zucolotto S. M., Carize F., Flavio H. R., Freddy A. Ramos, Leonardo C., Carmenza D., Eloir P. S. (2011), Analysis of C – glycosyl Flavonoids from South American Passiflora Species by HPLC-DAD and HPLC-MS, Phytochem Anal, 10.