Nấm mốc và độc tố Aflatoxin

, acit hữu cơ (acit oxalic, citric, gluconic...), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzim và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược ... đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Ngoài ra, nấm còn giử vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại độ mầu mỡ cho đất trồng. Một số loài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người, Microsporum gây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh trên chim; Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá. Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora.... đặc biệt nấm Aspergilus flavus và Aspergillus fumigatus phát triển trên ngũ cốc trong điều kiện thuận lợi sinh ra độc tố aflatoxin. Bên cạnh tác động gây hại, một số loài nấm mốc rất hữu ích trong sản xuất và đời sống như nấm ăn, nấm dược phẩm (nấm linh chi, Penicillium notatum tổng hợp nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin...), nấm Aspergillus niger tổng hợp các acit hữu cơ như acit citric, acit gluconic, nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin và một số loài nấm thuộc nhóm Phycomycetina hay Deuteromycetina có thể ký sinh trên côn trùng gây hại qua đó có thể dùng làm thiên địch diệt côn trùng. Ngoài ra, những loài nấm sống cộng sinh với thực vật như Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ cây hút được nhiều hơn lượng phân vô cơ khó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng. 2 Độc tố 2.1 Loại độc tố điển hình đối với chủng nấm mốc Aspergillus flavus và A. parasiticus là hai loài nấm mốc quan trọng trong các lòai nấm mốc có khả năng tạo độc tố mycotoxin gây ngộ độc thực phẩm. Độc tố mycotoxin có thể được tạo ra từ nhiều chuẩn của hai loài này được gọi chung là aflatoxin có khả năng gây ung thư. Các nấm mốc này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 7 – 40oC và tối ưu ở 24 – 28oC, do vậy có khả năng tăng tưởng tốt trên các lọai ngũ cốc, nông sản( lúa, gạo, bắp ...) không được phơi sấy tốt, đặc biệt là các nước nhiệt đới với điều kiện độ ẩm và nhiệt độ không khí cao. Từ các nguyên liệu này, nấm mốc và độc tố có thể nhiễm vào thực phẩm gây ngộ độc cho người. Ở các chủng có khả năng dinh độc tố, sau khi tăng tưởng 1 – 3 ngày độc tố đượ tạo ra và tiến vào cơ chất. Bốn loại aflatoxin được tạo ra bởi Aspergillus flavus và A. parasiticus là aflatoxin B1, B2 phát huỳnh quang màu xanh (blue) va G1, G2 phát huỳnh quang màu lục (green). Khi ăn cỏ hoặc thức ăn chứa B1 hoặc B2, bò sữa có thể chuyển hóa chúng thành các độc tố aflatoxin M1, M2 hiện diện trong sữa bò. Do aflatoxin là chất gây ung thư mạnh nên được kiểm tra nghiêm ngặt. Hầu hết các nước đều có NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 8 tiêu chuẩn quốc gia về hàm lượng tối đa cho phép sự hiện diện của độc tố này trong nông sản, thực phẩm, thường la 10ppb. Hình 2.1: Nấm sợi Aspergillus flav 2.2 Cơ chế tác dụng của độc tố trong cơ thể con người và súc vật 2.2.1 Trên súc vật thí nghiệm: biểu hiện ở 4 nhóm bệnh chính Những phá hủy có tính chất cấp tính ở gan - thể hiện một nhiễm độc cấp tính. Thường là do Aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong đó độc tố có độc tính mạnh nhất là B1, sau đó đến G1, rồi đến B2, và sau cùng là G2. Bên cạnh gan, các cơ quan khác như: phổi, thận, mạc treo, túi mật... cũng bị tổn thương ít nhiều. - Hiện tượng xơ gan: sau một nhiễm độc cấp tính như trên có hai khả năng có thể diễn ra: Một là các tổ chức mới ở gan sẽ được tái tạo dần dần và gan trở lại hồi phục hoàn toàn. Hai là chuyển thành xơ gan. - Ung thư gan: liều gây ung thư gan trên chuột nhắt trắng là 0,4ppm, tức là cho chuột ăn hàng ngày với liều 0,4mg aflatoxin/kg thức ăn. Sau 2-3 tuần có thể gây ung thư gan. Riêng Aflatoxin B1 liều gây ung thư gan có thể là 10ppm tức là mỗi ngày cho chuột ăn 10mg/kg thức ăn. - Hiện tượng gây viêm sưng nặng nề dẫn đến hoại tử các tổ chức và nội tạng . 2.2.2 Trên người - Năm 1986, Payet và cộng sự đã quan sát trên 2 trẻ em bị suy dinh dưỡng Kwashiorkor, được nuôi bằng thức ăn bổ sung đạm dưới dạng bột lạc, không may bột lạc này đã bị nhiễm độc tố Aflatoxin. Trẻ đã ăn mỗi ngày 70-100g bột lạc bị nhiễm Aflatoxin với hàm lượng 0,5-1ppm ăn kéo dài trong 10 tháng, đến khi trẻ 4 NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 9 tuổi thì thấy xuất hiện các triệu chứng rối loạn chức năng gan. Sinh thiết gan thấy có hiện tượng loét mô gan ở cả 2 trẻ. - Bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu là bệnh không do độc tố nấm Anatoxin gây ra, lần đầu tiên xuất hiện ở Xiberi (Liên Xô cũ) và một số vùng khác thuộc Liên Xô. Ở những vùng này thức ăn cơ bản là kê, lúa mì, lúa mạch. Sau này, các công trình nghiên cứu đã xác định tác nhân gây bệnh là nấm fusarium. Về lâm sàng bệnh thường tiến triển theo 3 giai đoạn: Giai đoạn 1: Kéo dài 3-6 ngày, biểu hiện đầu tiên là viêm niêm mạc miệng, họng... sau đó lan xuống dạ dày, ruột. Sang ngày thứ 3 có đi ngoài nhiều lần, đau bụng, nôn mửa. Giai đoạn 2: còn gọi là giai đoạn bất sản của hệ bạch huyết và cơ quan tạo máu, kéo dài 15-30 ngày. Xét nghiệm máu: Bạch cầu giảm, tiểu cầu giảm và thiếu máu rõ rệt. Sự chuyển hóa aflatoxin trong cơ thể Điều đầu tiên chúng ta cần biết aflatoxin là tinh thể trắng, bền với nhiệt, không bị phân hủy khi đun nấu ở nhiệt độ thông thường (ở 120oC phải đun 30 phút mới mất tác dụng độc) do vậy nó có thể tồn tại trong thực phẩm không cần sự có mặt của nấm mốc tương ứng; đồng thời nó rất bền với các men tiêu hóa. Tuy nhiên nó lại không bền dưới ánh sáng mặt trời và tia tử ngoại, nên việc khử độc thực phẩm sẽ có nhiều biện pháp hơn. Có 17 loại aflatoxin khác nhau, nhưng thường gặp và độc nhất là aflatoxin B1. Aflatoxin B1 là phân tử ái mỡ, có trọng lượng phân tử thấp, dễ dàng được hấp thu sau khi ăn, sự hấp thu là hoàn toàn. Khi đến ruột non, aflatoxin B1 sẽ được nhanh chóng hấp thu vào máu tĩnh mạch mạc treo, sự hấp thu ở ruột non và tá tràng là nhiều nhất. Niêm mạc ống tiêu hóa có khả năng chuyển dạng sinh học aflatoxin B1 nhờ sự gắn kết với protein – đây là con đường chính để giải độc aflatoxin B1 cho gan. Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, aflatoxin được tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách... Trong vòng 24 giờ có khoảng 80% bị đào thải theo đường tiêu hóa qua mật, đường tiết niệu qua thận và đáng chú ý nó còn bài tiết qua cả sữa. Độc tính trên động vật thí nghiệm Nhiễm độc các aflatoxin gây một loạt các triệu chứng cấp tính và mạn tính. Nhiễm độc cấp thường biểu hiện bằng cái chết của các động vật thí nghiệm với các triệu chứng thường gặp là hoại tử nhu mô gan, chảy máu ở gan và viêm cầu thận cấp. Nhiễm độc mạn tính thường biểu hiện bằng ăn kém ngon, chậm lớn, gan tụ máu, chảy máu và hoại tử nhu mô. Loại mạn tính tác động tới yếu tố di truyền tương ứng với 3 kiểu gây ung thư, gây quái thai và gây đột biến. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 10 Độc tính của aflatoxin trên người Bệnh do nhiễm aflatoxin cấp tính đã được thông báo ở các nước, với các biểu hiện chủ yếu là suy chức năng gan cấp, xơ gan và hoại tử nhu mô gan. Bên cạnh các nghiên cứu về vai trò của virut viêm gan, ký sinh trùng, dinh dưỡng, các chất độc... đối với ung thư gan, các nhà khoa học cũng đang tập trung nghiên cứu về vai trò của aflatoxin với căn bệnh phổ biến này. Trên người, một loạt các nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc ung thư gan nguyên phát tăng ở những vùng có tỷ lệ phơi nhiễm cao với aflatoxin, nhưng cơ chế tác động của aflatoxin gây ung thư gan ở người như thế nào vẫn còn nhiều tranh cãi, tuy nhiên đã tìm thấy sự gắn kết của aflatoxin B1 với AND của tế bào gan ở những bệnh nhân bị ung thư gan nguyên phát, phức hợp này còn được tìm thấy trong máu ngoại vi, trong máu rau thai và máu dây rốn của các sản phụ có phơi nhiễm với aflatoxin B1. Bên cạnh đó còn có sự liên quan giữa phơi nhiễm aflatoxin B1 với sự đột biến gen ở các bệnh nhân này, mà nhiều nhất là sự đột biến gen p53 – một gen kiểm soát sự chết tế bào theo chương trình, khi đột biến gen này sẽ làm đời sống tế bào tăng lên kéo theo nguy cơ tế bào sẽ chuyển thành ác tính. Cho đến nay, người ta tạm thời công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của aflatoxin qua 5 giai đoạn. - Tác động qua lại với AND và ức chế các polymeraza chịu trách nhiệm tổng hợp AND và ARN. - Ngừng tổng hợp AND. - Giảm tổng hợp AND và ức chế tổng hợp ARN truyền tin. - Biến đổi hình thái nhân tế bào. - Giảm tổng hợp protein. Hậu quả của quá trình tác động sinh hóa lên tế bào gan này là gây ung thư biểu mô tế bào gan. Như vậy, aflatoxin có khả năng gây độc tính cấp và mạn ở các loài động vật và con người. Độc tính nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan nguyên phát. Các nhà khoa học đã gây được ung thư gan nguyên phát trên thực nghiệm bằng cách cho các con vật ăn thức ăn có aflatoxin. Một loạt các nghiên cứu cũng cho thấy sự phơi nhiễm aflatoxin tăng liên quan đến sự gia tăng mắc bệnh ung thư gan nguyên phát trên người. Do vậy vấn đề bảo quản lương thực thực phẩm, an toàn lương thực thực phẩm, không sử dụng các thực phẩm đã bị hỏng, bị nấm mốc là một vấn đề hết sức quan trọng có ý nghĩa trong việc hạn chế tần suất xuất hiện bệnh ung thư gan nguyên phát. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 11 3 Cơ chế sinh tổng hợp độc tố Aflatoxin là sản phẩm của quá trình trao đổi chất thứ cấp của A. flavus và A.parasiticus. Các gene liên quan đến quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin có trong bộ đơn trong hệ gene của những loài nấm sợi. Những nghiên cứu trực tiếp đi sâu về sinh học phân tử của quá trình sinh tổng hợp. Cặp gen sinh tổng hợp acid béo (fatty acid synthase) được xác định có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp. 2 gene này đặc trưng cho dòng cytochrome P450 monooxygenase. Các độc tố này thường được thấy trước quá trình thu hoạch bắp, cây bông, đậu phụng. Aflatoxin ảnh hưởng lớn đến thức ăn và công ngành công nghiệp hạt giống vì nó có độ độc cao và có khả năng gây ung thư. Aflatoxin B1 liên quan đến quá trình chuyển G – T ở codon 249 của hệ gene Gen đầu tiên được tìm ra có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp aflatoxin là vào năm 1992. Kể từ đó ngành sinh học phân tử tiến hành nghiên cứu về bộ gen tổng hợp aflatoxin từ A. Flavus và A. parasiticus nhanh và chính xác hơn. Bộ gen trong A. Flavus nằm trong 4.9 mb chromosome. Tác giả Prieto et al chỉ ra rằng việc bổ sung vào bộ gene loại bỏ các đột biến của A. flavus là các gen được tổng hợp aflatoxin ở trong gần 90kb đoạn gen vô tính DNA. Yu et al đã sắp xếp lại từng bộ gen trong A. Flavus và A. parasiticus, và ước lượng kích thước của mỗi bộ khoảng 75kb. Các vị trí liên quan trong bộ và các nucleotide tạo thành của các bộ gene tương đối giống nhau giữa 2 loài, mặc dù A.parasiticus có bản sao bổ sung của một vài gen xác định có một số ít phần trong gene nhân đôi. Việc tìm hiểu về quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin dựa vào hệ gene trong A.nidulans có liên quan đến quá trình sinh tổng hợp sterigmatocystin. qua đó xác định được tỉ lệ của các gen sinh tổng hợp aflatoxin cũng tâp trung thành bộ. Toàn bộ nucleotide được tạo thành của A.nidulans cũng như 25 quá trình chuyển đổi để tạo thành cuống đính bào tử đã được xác định, Việc sắp xếp các gen trong nhóm này khác với việc sắp xếp các gen trong bộ tạo Aflatoxin nhưng các acid amin bị giảm đi là giống nhau. Sinh tổng hợp acid Norsolorinic : Polyketide là viên gạch cấu trúc cơ bản tạo AFB1 liên quan đến quá trình kéo dài 1 đơn vị hexanoate bởi enzyme polyketide synthase (PKS) mà enzyme này là do tập hợp của 7 đơn vị acetyl từ malonyl CoA mà không qua sự khử Ketone tạo noranthrone. Việc tổng hợp acid norsolorinic là giai đoạn trung gian bền vững, được tạo thành sau quá trình oxi hóa noranthrone từ enzyme oxidase. PKS và enzyme tổng hợp acid béo (FAS) được lấy từ bộ gen có chứa pksA (pksL1) và fas1. Tác giả Chang đã cho thấy pksA được xác định thông qua quá trình chuyển mạch NA của NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 12 A. parasiticus với phần DNA tham gia tổng hợp AFlatoxin. Gần 5% chất vận chuyển bị mất khả năng sản xuất NA khi chất vận chuyển bị phá vỡ trong gene pksA. Việc phá vỡ gene của pksL1 là do trong chất vận chuyển không liên kết với Aflatoxin hay NA được xác định qua quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin. Gene FAS, fas, được xác định bằng việc thêm vào A.parasiticus mạch, không sản sinh ra Aflatoxin hay sản phẩm trung gian. Thí nghiệm loại bỏ gene thêm vào là lúc đầu fas1 tham gia tạo NA và gene đó không cần thiết cho quá trình trưởng thành của nấm. Gene FAS thứ 2, fas2, nằm sát fas1 làm nhiệm vụ như nhóm phụ tạo chức năng cho FAS. Việc phân tích để tạo nucleotide xác định motif thông thường để biết PKS và FAS có trong sản phẩm gene, có tên là enzyme –cetoacyl synthase, acyltransferase và protein chất mang acyl. Gene FAS cũng chứa enzyme –ketoacyl reductase, enoyl reductase và anoyl hydrase. Thiếu enzyme ketoreductase trong PKS bao gồm thiếu bước khử trong phản ứng PKS sản xuất noranthrone. 3.1 Norsolorinic acid-averatin Việc chuyển từ NA thành averatin (AVN) thông qua enzyme ketoreductase Tương ứng là việc bổ sung vào lỗ hổng do đột biến của A.parasiticus qua viêc tập hợp NA và aflatoxin. Nor1 mã hóa 1 protein 29kDa có acid amin tương tự như enzyme dehydrogenase có liên kết NADPH. Tương tự NA đột biến ban đầu, chất vận chuyển cắt đứt nor1 không tam gia sinh tổng hợp aflatoxin, người ta dự đoán là có NA-reductase khác. Thực tế thì enzyme reductase thứ 2 này có khả năng chuyển NA thành AVN khi nghiên cứu in vitro tạo dạng đồng nhất và cho protein phụ khoảng 40kb. Sử dụng kháng thể đơn tính kháng lại enzyme reductase này. Cary et al xác định cDNA đơn tính tương đương với gen norA nằm trong bộ gene của Aflatoxin có trong loài A. parasiticus cũng như loài A.flavus. Các chuỗi acid amin của NOR1 và NORA có độ đồng nhất thấp (22%) nhưng cả 2 loại đều có motif xác định enzyme loại dehydrogenase với phần liên kết adenine nucleotide. Để loại bỏ 2 bản sao của norA trong A.parasiticus chưa xác định được. Tuy nhiên, người ta chưa xác định chính xác chức năng các gene này. Averatin-versicolorin A: Gene liên quan đến quá trình chuyển AVN thành versicolorin A (VER A) xác định gene trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin. Qua việc sử dụng các đoạn đột biến, chất ức chế và các chất trung gian phóng xạ, thì quá trình trao đổi chất trong quá trình chuyển đổi này sẽ quyết định: AVN  Averufanin (AVNN)  Averufin (AVF)  1- hydrocyversicolorone (HVN)  versiconal hemiacetal cetate (VHA)  Versiconal (VHOH)  NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 13 versicolorin B (VERB) VER A (hình 1). Sử dụng cDNA vô tính, Yu et al đã loại bỏ được gene tương ứng trong bộ gene tổng hợp Aflatoxin của A.parasiticus và thu đươc chất vận chuyển tích lũy với AVN. Gene avnA mã hóa 56.3 kDa cytochrome P450 monooxygenase, gene có liên quan đến quá trình chuyển AVN thành AVNN. Prieto et al thay đổi gen đột biến của A. flavus thiếu toàn bộ bộ gen Aflatoxin thành 2 phage cos (5E6 và 8B9) và lấy lại chất vận chuyển tham gia với AVF. Thêm vào phage cos thứ 3 sẽ giữ được quá trình sinh tổng hợp aflatoxin trong gene đột biến này, người ta cho rằng có 1 gene liên quan đến quá trình chuyển AVF thành VHA nằm ở phage cos 13B9. Gene avf1 nằm trong phần 7kb trên phage cos 13B9. Kết quả phân tích cho thấy phần DNA chứa 2 loại gene, aflB và aflW, mã hóa protein với các acid amin tương ứng với stc B và stcW. Quá trình chuyển VHOH thành VER A rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp Aflatoxin vì hệ thống dihidrobisfuran sẽ được tạo thành trong bước này. Dihyrobisfuran là cần thiết cho quá trình đột biến tự nhiên của Aflatoxin B1. Liên kết đôi giữa vị trí 2 và 3 trong phần difuran là do enzyme cytochrome P450 hay lipozygenase tạo ra nhóm epoxide linh động có trong thận và gan. Các enzyme dehydrative cyclization, là quá trình oxy hóa VER B thành VER A cùng enzyme versicolorin B synthase (VBS), tạo dihydrobisfuran. Gene mã hóa VBS , vbs, tương ứng với mồi PCR được tạo ra dựa vào phần peptide của enzyme . Sản phẩm gene vbs cho thấy khả năng đồng nhất đặc trưng của các enzyme tự do flavin oxydase và dehydrogenase. Các nghiên cứu gần đây cho thấy cấu trúc của Aflatoxin B2 đúng hơn AFB2 khi nó thiếu liên kết đôi trong cấu trúc của bifuran. 3.2 Versicolorin A – sterigmatocystin Sterigmatocystin được tạo thành từ VERA thông qua một số phản ứng enzyme gồm: phản ứng oxy hóa, khử ceton, decarboxyl hóa và methyl hóa. Việc thêm gene vào VER A của A.parasiticus dẫn đến việc cô lập được ver1A mã hóa 1 NADPH – ketoreductase. Gene thứ 2, ver1B, trong A.parasiticus có 95% tương đồng với ver1 A và không nằm trong bộ gene. 3.3 Quá trình chuyển Sterigmatocystin thành Aflatoxin: Sterigmatoxystin được chuyển thành O-methylsterigmatocystin (OMST) bởi enzyme O-methyltransferase 40 kDa. Huyết thanh miễn dịch được đưa vào chống lại protein được dùng để che chắn cDNA và tách omt1. Các acid amin từ cDNA xác định OMT1 có trong chuỗi amino nhờ liên kết S-adenosylmethionine. Cả A. flavus và A.parasiticus đều chứa 1 bản sao của omt1. Đoạn gene chuyển OMST thành AFB1 của A. flavus xóa đi bộ gene Aflatoxin. Chất vận chuyển chứa phage cos không sản sinh ra Aflatoxin hay bất kỳ chất trung gian nào nhưng có chuyển OMST thành AFB1. Gen ord1 chịu trách nhiệm hoạt hóa NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 14 enzyme nằm ở phần gene DNA 3.3kb trên phage cos 8B9. Sản phẩm của ORD1 là cytochrome P450 mono oxygenase (CYP64) 4 Phương pháp xác định độc tố 4.1 Phương pháp truyền thống 4.1.1 Dùng Kit để xác định Aflatoxin trong thực phẩm Kit xác định Aflatoxin - Agri-Screen xác đinh Aflatoxin - Reveal xác định Aflatoxin - Veratox xác định Aflatoxin - Veratox xác định Aflatoxin thử nghiệm đơn (AST) - Veratox xác định Aflatoxin độ nhạy cao 4.1.2 Dùng VERATOX 4.1.2.1 Mục đích sử dụng Veratox xác định Aflatoxin AST (thử nghiệm đơn Aflatoxin) sử dụng để phân tích định lượng Aflatoxin trong các mặt hàng như ngũ cốc, bột ngũ cốc, hỗn hợp protein trong ngũ cốc, hỗn hợp ngũ cốc/ đậu phộng, lúa mỳ, gạo, sữa, tương, hạt bông, bột hạt bông, đậu phộng, bơ đậu phộng và hỗn hợp khác. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 15 4.1.2.2 Nguyên tắc Thí nghiệm này dùng phương pháp cạnh tranh trực tiếp Elisa có thể xác định chính xác nồng độ Aflatoxin tới cỡ phần tỉ (ppb). Aflatoxin được chiết được chiết từ mẫu nền với dung dịch methanol bằng cách đánh đều và lọc. Độc tố được chiết ra trong lọc là mẫu đwocj trộn với độc tố găn enzyme (tiếp hợp). Dung dịch hỗn hợp này được chuyển tới những giếng tẩm kháng thể, tại đây độc tố tự do và chất tiếp hợp cạnh tranh để liên kết . Sau khi rửa, chất nền được thêm vào, độ hấp thụ của mẫu và mẫu so sánh 20ppb được đọc so sánh với đường chuẩn. Kết quả mẫu được tính toán sau đó. 4.1.2.3 Phương pháp Thêm 100 ml chất tiếp hợp vào mỗi giếng trộn. Thêm 100 ml mẫu so sánh vào giếng thứ nhất. Thêm 100 ml của mẫu đầu tiên vào giếng thư hai và thứ ba. Trộn đều. Chuyển 100 ml vào mỗi giếng kháng thể. Ủ khoảng 5 phút. Trút dung dịch từ giếng kháng thể Rửa sạch với nước loại ion Thấm khô bằng giấy thấm. Chuyển 100 ml chất nền từ thuyền thuốc thử vào mỗi giếng kháng thể sử dụng pipet 12 kênh. Chuyển 100 ml chất hãm đỏ từ thuyền thuốc thử vào các giếng kháng thể. Kết quả đọc bằng cách sử dụng bộ đọc giếng với kính lọc 650 nm. Thông số kỹ thuật của sản phẩm Giới hạn xác định thấp nhất :5 ppb Khoảng địmh lượng: 5 ppb - 320 ppb Mẫu so sánh: 20 ppb Thời gian thử: 10 phút Kháng thể phản ứng Tổng Aflatoxin (B1, B2, G1, G2) Số test/kit 16 Phê chuẩn USDA/GIPSA # 94-10 NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 16 4.1.2.4 Cách tiến hành: B1:Xử lý mẫu: B2: Tiến trình thí nghiệm B3:Đọc kết quả NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 17 4.1.3 Dùng Reveal 4.1.3.1 Mục đích sử dụng Reveal xác định Aflatoxin với mục đích sàng lọc Aflatoxin trong ngũ cốc. 4.1.3.2 Nguyên tắc Reveal xác định Aflatoxin sử dụng phương pháp màu miễn dịch dòng Lateral bậc đơn trên cơ sở sự cạnh tranh dạng miễn dịch. Dịch chiết được thấm qua vùng thuốc thử, có chứa kháng thể đặc biệt với Aflatoxin tiếp hợp với những tiểu phẩm màu. Nếu Aflatoxin có mặt, nó sẽ bắt các phức kháng thể tiểu phần. Các phức tiểu phần kháng thể-Aflatoxin sẽ thấm vào màng có chứa trong phần Aflatoxin tiếp hợp tới chất mang protein. Vùng này sẽ bắt tất cả các kháng thể Aflatoxin không tạo phức, cho phép các tiểu phần tập trung và hình thành đường màu. 4.1.3.3 Phương pháp Mẫu phải được chiết trước khi thử: NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 18 1.Chuyển số cốc mẫu thích hợp và đặt nó vào trong cốc phá mẫu. 2.Sử dụng pipet và đầu pipet mới, thêm 200 ml chất pha loãng vào cốc mẫu. 3.Sử dụng đầu pipet mới thêm 200ml mẫu chiết vào cốc mẫu. 4.Đặt thanh thử aflatoxin mới và mẫu ở cuối của cốc mẫu. 5.Để thanh thử có thể phát triển trong cốc 3 phút. 6.Loại bỏ thanh và đọc kết quả bằng mắt ngược lại với nền trắng hay máy đọc Accuscan Reveal của Neogen. Thông số kỹ thuật của sản phẩm: Độ nhạy: 20 ppb Thời gian thử: 3 phút Kháng thể phản ứng AflatoxinB1 Bảo quản : nhiệt độ phòng, 18-300C Số test/kit: 25 4.1.3.4 Các bước tiến hành B1: Xử lý mẫu B2:tiến hành kiểm nghiệm NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 19 B3:đọc kết quả SO SÁNH GIỮA CÁC KIT Veratox Agri-Screen Reveal Độ nhạy 20.88ppb 20ppb >20ppb Thời gian thí nghiệm 6 phút 4 phút 4 phút Ứng dụng Tất cả mặt hàng Tất cả mặt hàng Cho bắp Hạn sử dụng 8 tháng/2-8oC 6 tháng/2-8oC 1năm/nhiệt độ phòng Số lần test tối đa 36-44 12-20 25 4.1.4 Dùng thử nghiệm sinh hóa phát hiện độc tố Aflatoxin 4.1.4.1 Thử nghiệm trên vịt con 1 ngày tuổi Các thí nghiệm đầu tiên chứng minh tính độc của các Aflatoxin được tiến hành trên vịt con 1 ngày tuổi (nặng khoảng 50g). NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 20 Người ta chỉ xử lý lạc hoặc các sản phẩm có nguồn gốc từ lạc bằng cloroform rồi chiết các chất hòa tan bằng methanol. Sau khi tinh chế bằng phân chia giữa các dung môi không hòa lẫn (methanol: nước: ether dầu hỏa – 10:1:10), cặn được hòa thành nhủ tương trong nước (sao cho nồng độ cuối cùng của 1ml tương đương với 40g mẫu ban đầu) sau đó đưa vào cổ họng vịt con bằng ống chất dẻo. Ngày đầu tiên cho vịt nuốt một lượng chất chiết bằng 10g mẫu ban đầu, rồi tăng dần liều lượng lên để trong 4 ngày con vật đã tiếp nhận một lượng tương đương 80g. Mẫu thử được xem là rất độc khi con vật chết sau 7 ngày kể từ ngày bắt đầu thí nghiệm, độc vừa hoặc ít tùy theo tổn thương nhiều hay ít ở gan của những con vịt còn sống, được đem giải phẩu ở ngày thứ 7. Vịt là một loài đặc biệt mẫn cảm với độc tố Aflatoxin nên như vậy ta có thể phát hiện bằng pp sinh học những lượng Aflatoxin rất nhỏ. Thử nghiệm “vịt một ngày tuổi” được dùng rất nhiều, nó cho phép phát hiện các Aflatoxin bằng cách: * Biết liều gây chết của con vật đó: - Aflatoxin B1 : 0.36mg/kg Aflatoxin B2 : 1.69 mg/kg - Aflatoxin G1 : 0.78mg/kg Aflatoxin G2 : 2.45 mg/kg * Biết được con vật đã tiếp nhận một liều Aflatoxin ít nhất 0.04mg/kg thì thấy các ống mật phát triển dị thường Tuy nhiên cách thử đó cũng có một số bất tiện: phải tổ chức nuôi vịt và con vật có thể nôn liều thuốc độc mà ta vừa cho uống. 4.1.4.2 Thử nghiệm trên phôi gà Thử nghiệm trên phôi gà là thử nghiệm bằng sinh vật được dùng nhiều sau thử nghiệm “vịt con”. Tiến hành thử nghiệm bằng cách tiêm nước chiết vào buồn khí hoặc vào lòng đỏ trứng gà Leghorn trắng đã thụ tinh và ấp trong 5 ngày (một số tác giả tiêm trước khi ấp hoặc sau khi ấp 9 ngày). Phôi gà rất mẫn cảm với Aflatoxin, chết trong 2 ngày sau khi nhiễm, nếu mẫu thử tiêm vào trên 0.3µg Aflatoxin. Thử nghiệm này có độ mẫn cảm gấp 200 lần hơn thử nghiệm bằng vịt con. Liều gây chết DL50 khi tiêm aflatoxin vào buồn khí như sau: Aflatoxin B1 : 0.025 µg/ trứng Aflatoxin B2 : 0.125 µg/ trứng Aflatoxin G1 : 1.2µg/ trứng Aflatoxin G2 : 2.7µg/ trứng NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 21 Aflatoxin M1 : 0.2µg/ trứng. 4.1.4.3 Thử nghiệm trên ấu trùng giáp xác Loài Artemia salina: Thử nghiệm tiến hành trong vòng 24 giờ. Không cần thiết bị đắt tiền và nuôi dưỡng sinh vật. Trứng tôm được sống được qua nhiều năm nếu được bảo quản khô ráo. Các trứng này ở 27 oC và nước mặn ( tỉ trọng 1.02) sẽ nở trong vòng 25 giờ. Ta chọn lọc ấu trùng cùng một sức sống bằng cách cho chúng bơi từ một điểm tối tới một điểm sáng. Các Aflatoxin nghi ngờ có trong mẫu được chiết bằng cloroform, sau đó loại bỏ chất này bằng đun cách thủy. Dùng pipet lấy khoảng 30 - 50 ấu trùng và 0.5 ml nước cho vào mặt kính đồng hồ có nước chiết cần thử. Sau 24 giờ và ở 37.5o C tính phần trăm số ấu trùng chết. Bằng cách này người ta đã xác định rằng trong các điều kiện trên hàm lượng 0.5g/ml aflatoxin B1 đã giết chết 60% số ấu trùng. Nồng độ gấp đôi như vậy giết chết 90% ấu trùng. 4.1.4.4 Thử nghiệm trên cá vàng Cá Brachydanio rerio có trứng trong suốt, cho phép ta dễ dàng theo dõi sự tiến triển của nó. Đặt ấu trùng vào nhiệt độ môi trường xung quanh 3-4 ngày: Chúng có một noãn hoàng phôi lớn, chúng không cần phải nuôi dưỡng hoặc chăm sóc đặc biệt. Đối với chúng aceton ở nồng độ thấp không độc.. người ta đã xác định rằng hàm lượng Aflatoxin B1 0.1µg/ml (pha chế với 0.8% aceton) sau 30 phút gây ra ở ấu trùng những hoạt động bất thường, sau 5 giờ đưa đến tình trạng hấp hối, sau 20 giờ lòng đỏ bị thẫm màu và đuôi xoắn lại, sau 24 – 35 giờ thì lòng đỏ vỡ và chết 4.1.4.5 Thử nghiệm trên nòng nọc Nhái Rana temporaria khi ăn phải Aflatoxin chỉ bị xung huyết ở gan, nhưng nòng nọc của chúng chết ở nồng độ Aflatoxin trên 2µg/ml. Dưới nồng độ này không thể biến nhái trở thành nhái trưởng thành. Nòng nọc của Bufo melanostriclus, Racophorus leucomyslax maculatus và Uperodon sp thì bị chết và người ta nhận thấy gan và thận của chúng bị hư. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 22 4.2 Phương pháp hiện đại 4.2.1 Phương pháp đo mật độ huỳnh quang 4.2.1.1 Nguyên lý của phương pháp Aflatoxin được chiết tách từ mẫu thử bằng clorofoc. Dịch chiết được lọc và một phần dịch lọc được làm sạch qua cột silicagen. Làm bay hơi dung dịch rửa giải và hoà cặn với clorofoc hoặc hỗn hợp benzen – axetonitril. Sau đó chấm một phần xác định mẫu thử lên bản mỏng,chạy sắc ký và so sánh Rf, màu sắc vết sắc ký của mẫu phân tích với vết aflatoxin chuẩn dưới đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. Lượng aflatoxin có thể xác định bằng mắt hay bằng máy đo mật độ huỳnh quang. Đối tượng áp dụng của phương pháp : Xác định hàm lượng aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sản phẩm ngũ cốc, đậu đỗ, hạt có dầu. 4.2.1.2 Dụng cụ, hoá chất, thuốc thử 4.2.1.2.1 Dụng cụ - Máy xay nghiền mẫu - Máy lắc hoặc máy khuấy từ - Cân phân tích - Máy cất quay chân không. - Bếp cách thuỷ. - Đèn tử ngoại có bước sóng 365nm. - Quang phổ kế UV-VIS. - Máy đo mật độ huỳnh quang. - Các trang bị của sắc ký lớp mỏng. - Cột sắc ký thuỷ tinh, đường kính trong 22mm, dài 300mm, có khoá nút mài thuỷ tinh hoặc teflon và bình đựng dung môi phía trên, dung lượng 250ml. - Bình nón nút mài 250ml, 500ml. - ống đong 50ml, 100ml. - Phễu lọc, đường kính 8 – 10 cm. - Micropipet Hamilton:20 m l, 50 m l - Bản mỏng kích thước 20 x 20 cm tráng sẵn lớp mỏng Silicagel 60-G NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 23 4.2.1.2.2 Hoá chất, thuốc thử Tất cả các hoá chất đều phải là loại tinh khiết phân tích (TKPT) nếu không có các chỉ dẫn riêng nào khác. - Axê tôn - Clorofoc - n – Hexan - Ete êtylic khan - Metanol - Axetonitril - Toluen - Natri sunfat khan - Celite 545, đất điatomit - Axit sunfuric 50% (v/v) - Axit trifluoraxectic - Khí nitơ - Bông hút nước (được loại béo bằng clorofoc) hoặc bông thuỷ tinh. - Các hệ dung môi khai triển sắc ký. - Clorofoc/ axeton: 9/1 (v/v) ( theo tỷ lệ thể tích) - Ete êtylic/ metanol/ nước: 94/4, 5/1,5/1 (v/v/v/v) - Clorofoc/ axeton/ isopropanol/ nước: 88/12/1, 5/1 (v/v/v/v) - Toluen/ êtyl axetat/ axit focmic: 6/3/1 (v/v/v) - Silicagel G – 60 dùng cho sắc ký cột, cỡ hạt 0,063 ¸ 0,2 mm. Hoạt hoá bằng cách sấy khô ở 105 o C trong một giờ, sau đó trút vào bình tam giác nút nhám, thêm nước với tỷ lệ 1ml nước cho 100g silicagel, đậy nút, lắc đến khi trộn hoàn toàn đều, bảo quản 15 giờ trong bình kín. - Chuẩn bị dung dịch aflatoxin chuẩn (điều kiện tiến hành: trong phòng mát, tránh ánh sáng): - Dung dịch aflatoxin chuẩn gốc (dung dịch A): - Dùng ống chuẩn 1 mg, mỗi loại aflatoxin chuẩn B1, B2, G1, G2 lần lượt cho vào 4 bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v) (nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn là 10 m g/ml). NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 24 - Dung dịch aflatoxin chuẩn làm việc (dung dịch B): Cho vào một bình định mức 10ml lần lượt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (từ dung dịch A ở trên), định mức đến 10ml bằng hỗn hợp toluen – axetonitril 98: 2 (v/v), nồng độ dung dịch là 0,5 m g/ml đối với B1, G1, và 0,1 m g/ ml đối với B2, G2. Cần kiểm tra lại nồng độ dung dịch aflatoxin chuẩn (dung dịch A m g/ml) bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, bước sóng 350nm, tính kết quả theo công thức:   1000/ m AC mg ml e    Trong đó: m – Khối lượng phân tử aflatoxin A – Mật độ quang ở bước sóng hấp thụ. e - Độ hấp thụ phân tử của aflatoxin Aflatoxin m Dung môi benzen – axetonitril (v/v) l max (nm) e benzen – axetonitril (v/v) l max (nm) B1 312 98: 2 350 19800 B2 314 98: 2 350 20900 G1 328 98: 2 350 17100 G2 330 98: 2 350 18200 Bảo quản: ở nhiệt độ thấp hơn 00C, dung dịch A để được 6 tháng và dung dịch B để được hai tuần trước khi dùng hoạt hoá ở 1100C trong 1 giờ. 4.2.1.3 Phương pháp tiến hành: (Điều kiện tiến hành: ở phòng mát, tránh ánh nắng ) 4.2.1.3.1 Chuẩn bị mẫu: Nghiền mẫu sao cho có thể qua được rây có lỗ cỡ 1mm. Chú thích: Với các mẫu thử có hàm lượng chất béo lớn hơn 5%, cần loại chất béo bằng cách chiết với dung môi ête dầu hoả (độ sôi 40 – 600C) sau khi đã hoàn thành công đoạn nghiền mẫu. 4.2.1.3.2 Tiến hành xét nghiệm Chiết suất: Cân 50g mẫu đã nghiễn nhỏ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiếp 25ml nước, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đậy nút chặt. Lắc trong 30 phút bằng máy lắc quay tròn hay máy khuấy từ (hoặc lắc kỹ bằng tay) rồi lọc qua giấy lọc gấp cạnh, bỏ NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 25 10ml dịch lọc đầu, sau đó lấy 50ml dịch lọc tiếp theo (tương đương 10g mẫu thử). Nếu tốc độ dịch lọc xuống chậm, chuyển sang phễu Bucher có chứa 1 lớp celite 545 dày 5mm trên giấy lọc và lọc hút chân không. Làm sạch mẫu bằng cột sắc ký: Chuẩn bị cột sắc ký: Cho một ít bông vào đáy cột sắc ký, thêm 5g natri sunfat khan. Đổ clorofoc đến 2/3 cột, sau đó cho 10 g silicagel dùng cho sắc ký cột (5.1.2.2.2.15), vừa cho vừa gõ nhẹ thành cột cho silicagel lắng đều, dùng đũa thuỷ tinh khuấy nhẹ để tránh bọt khí. Mở khoá cho clorofoc chảy xuống từ từ. Khi tốc độ lắng của silicagel chậm lại, rút hết clorofoc chỉ để lại một lớp 5cm phía trên lớp silicagel. Thêm từ từ 15g natri sunfat khan, sau đó rút bớt clorofoc đến gần sát lớp natri sunfat khan trên. Cột silicagel thu được phải mịn, không có bọt khí và chú ý không để cột bị khô kể từ lớp natri sunfat khan trên. Trộn 50ml dịch lọc trên với 150ml n – hexan, đổ cẩn thận vào cột sắc ký đã chuẩn bị như trên. Loại bỏ dung dịch chảy ra. Cho tiếp 150ml ête êtylic khan, loại bỏ dung dịch chảy ra. Chú ý không để cột bị khô, lưu lượng dòng chảy khoảng 8 – 12ml /phút. Dung dịch rưả giải aflatoxin trên bằng 150ml hỗn hợp metanol – clorofoc (3 : 97). Lấy toàn bộ dịch chảy ra từ khi bắt đầu cho dung dịch rửa giải cho đến hết. Lưu lượng dòng chảy như trên. Làm bay hơi dung dịch rửa bằng máy cất quay chân không ở nhiệt độ thấp hơn 500 C cho đến khi còn khoảng 2 – 3 ml. Chuyển sang ống nghiệm 10ml, tráng rửa bình cầu bằng clorofoc và làm bay hơi đến khô trên nồi cách thuỷ ở nhiệt độ thấp hơn 500C, tốt nhất dưới luồng khí nitơ nhẹ cặn còn lại trong ống nghiệm là mẫu phân tích. Đậy kín ống nghiệm có cặn để chạy sắc ký lớp mỏng. Sắc ký lớp mỏng một chiều: Chuẩn bị: Hoà cặn thu được ở trên bằng 0,5ml hỗn hợp benzen – axetonitril (98: 2) và lấy dịch này để chấm lên bản sắc ký. Với bản mỏng tráng sẵn trước khi chấm sắc ký phải cạo sạch lớp silicagel ở hai cạnh bên tấm sắc ký với chiều rộng 0,5cm. Sau đó cách cạnh đáy 2 cm, dùng mao quản hay micropipet chấm các vết dung dịch chuẩn aflatoxin và dung dịch mẫu thử như sau: - Lấy 2; 5;10; 20 m l dung dịch chuẩn B (5.1.2.2.2.16.2). - Lấy 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch chuẩn B (5.1.2.2.2.16.2). - Lấy 10, 20 m l dịch chiết. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 26 - Với từng thể tích như trên, 4 dung dịch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuẩn có thể được chấm chồng lên nhau. Khai triển bản sắc ký ở chỗ tối với hệ dung môi clorofoc – axeton (9: 1). Sau khi tiếp tuyến dung môi chạy lên khoảng 10cm (khoảng 30 phút), lấy bản sắc ký ra để bay hơi dung môi ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau đó soi dưới đèn tử ngoại với bước sóng 365 nm. Các vết aflatoxin B1, B2 có huỳnh quang màu xanh da trời; G1, G2 có huỳnh quang màu xanh lá cây. Nếu mẫu thử có aflatoxin sẽ xuất hiện các vết cùng giá trị Rf với các vết aflatoxin chuẩn. Rf của các vết aflatoxin trong hệ dung môi clorofóc - axêtôn (9:1) có trị số trung bình như sau: Aflatoxin B 1 : 0,72 Aflatoxin B 2 : 0,67 Aflatoxin G 1 : 0,59 Aflatoxin G 2 : 0,54 4.2.1.3.3 Thử nghiệm khẳng định sự có mặt của aflatoxin: -Phun dung dịch axit sunfuric 50% (v/v) lên bản sắc ký, huỳnh quang của các vết aflatoxin sẽ chuyển sang màu vàng dưới tia tử ngoại có bước sóng 365nm. -Rót dung dịch iốt 5 – 10% trong ête lên một tấm thuỷ tinh 20 x 20cm, dàn đều ở khu vực giữa, để cho ête bay hơi hết còn lại một lớp iốt mỏng. Đặt úp tấm thuỷ tinh này lên bản sắc ký đã triển khai, cách khoảng 1 cm trong thời gian 20 – 30 giây. Lấy bản sắc ký ra quan sát dưới đèn tử ngoại, nếu huỳnh quang của chất chuẩn và dung dịch thử không mất đi, chứng tỏ sự có mặt của aflatoxin. -Chia bản mỏng silicagel 20 x 20 cm làm hai phần bằng nhau (cách 10cm ở giữa), chấm các vết dịch chiết mẫu thửvà dung dịch aflatoxin chuẩn như sau: Phần 1: Bên trái, chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) Phần 2: Bên phải,chấm 4 vết như sau. - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) - 10 m l dịch chiết - 10 m l dịch chiết với 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 27 - 10 m l dung dịch aflatoxin chuẩn (5.1.2.2.2.16.2) Chấm xong dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay hết. Nhỏ lên 4 vết chấm ở phần 1 bên trái, mỗi vết một giọt axít trifluoraxetic. Che phần 1 (bên trái) bằng một tấm thuỷ tinh khác, phun lên phần 2 (bên phải) dung dịch axitsunfuric 50% (v/v). Dùng máy sấy nhẹ làm khô các vết chấm rồi mới cho vào bình khai triển. Dung môi khai triển: Nước/metanol/ete etylic – 1/3/96 (v/v). Khi dung môi lên khoảng 13 cm, lấy bản sắc ký ra để khô ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng, soi dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 365 nm, cách đèn 10 cm. 4.2.1.3.4 Đánh giá kết quả - Nửa bên trái: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có) sẽ cùng có trị số Rf ngắn hơn bình thường, vẫn giữ nguyên màu huỳnh quang xanh . - Nửa bên phải: Các vết huỳnh quang aflatoxin của dung dịch aflatoxin chuẩn và của vết dịch chiết (nếu có)sẽ cùng có trị số Rf bình thường, và màu huỳnh quang xanh chuyển sang màu vàng. 4.2.1.3.5 Định lượng - Bằng mắt: Xác định hàm lượng aflatoxin trong dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Vết huỳnh quang của vết chấm dung dịch aflatoxin chuẩn chồng lên vết dịch chiết phải mạnh hơn huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết và phải trùng nhau. Nếu mật độ huỳnh quang của vết 10 m l dịch chiết đậm hơn mật độ huỳnh quang của vết 20 m l dung dịch chuẩn thì phải pha loãng dịch chiết và tiến hành làm sắc ký lớp mỏng lại. - Tính kết quả Hàm lượng aflatoxin (C) tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu được tính theo công thức: S Y VC W X     Trong đó: S – Nồng độ aflatoxin của dung dịch chuẩn mg/ml (Dung dịch B ) V – Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, ml. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 28 W – Khối lượng của mẫu thử, (tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột) g. X – Thể tích dịch chiết có mật độ huỳnh quang giống thể tích Y của dung dịch chuẩn chấm trên bản mỏng, ml. Y – Thể tích dung dịch chuẩn có mật độ huỳnh quang giống thể tích X của dịch chiết chấm trên bản mỏng, ml. - Bằng máy đo mật độ huỳnh quang. Bước sóng kích thích là 365nm và bước sóng phát xạ là 443 nm. Định lượng aflatoxin trên các chấm của dịch chiết bằng cách so sánh mật độ huỳnh quang của vết dịch chiết với mật độ huỳnh quang của vết dung dịch chuẩn. Tính kết quả. Hàm lượng aflatoxin (C), tính bằng microgam trong 1 kilogam mẫu thử tính như sau: m s A S V YC A W X       Trong đó: Am - mật độ huỳnh quang của vết mẫu. As - mật độ huỳnh quang của vết chuẩn. X – Thể tích của dịch chiết chấm lên bản mỏng ( m l ). Y – Thể tích của dịch chuẩn chấm lên bản mỏng ( m l ). S – Hàm lượng aflatoxin của dung dịch chuẩn,( ng). V– Thể tích cuối cùng của dịch chiết kể cả những lần pha loãng nếu có, ( m l). W – Khối lượng của mẫu thử, tương ứng với thể tích dịch chiết khi tiến hành làm sạch qua cột,( g). 4.2.1.4 Độ nhạy của phương pháp : 5 m g / kg (5 ppm) - Hệ số thu hồi của phương pháp : 90 ± 5%. - Sai số trung bình của phương pháp : ± 10%. 4.2.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 4.2.2.1 Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn này qui định phương pháp xác định hàm lượng độc tố aflatoxin (B1, B2, G1, G2) trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (sau đây gọi tắt là HPLC). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 1,5 mg/kg. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 29 4.2.2.2 Phương pháp tham chiếu Tiêu chuẩn này được xây dựng dựa theo phương pháp chuẩn số 49.2.05 của Hiệp hội các nhà hoá học phân tích (AOAC) công bố năm 1997. 4.2.2.3 Nguyên tắc Aflatoxin có trong mẫu thủy sản bao gồm các nhóm B1, B2, G1 và G2 được chiết tách ra bằng clorofom. Dịch chiết đựơc làm sạch bằng phương pháp chiết pha rắn (SPE) trên silicagel. Hàm lượng aflatoxin có trong dịch chiết được xác định trên hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang theo phương pháp ngoại chuẩn. 4.2.2.4 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, chất chuẩn và dung dịch thử 4.2.2.4.1 Thiết bị, dụng cụ 5.2.2.4.1.1 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang. 5.2.2.4.1.2 Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ 5 đến 10 [NAD1]mm. 5.2.2.4.1.3 Màng lọc mao quản kích thước 0,4 mm. 5.2.2.4.1.4 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10 000 vòng/ phút. 5.2.2.4.1.5 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g. 5.2.2.4.1.6 Máy ly tâm tốc độ 5 000 vòng/phút. 5.2.2.4.1.7 Bể siêu âm. 5.2.2.4.1.8 Hệ thống cô quay chân không. 5.2.2.4.1.9 Cột thủy tinh có khóa teflon, kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 mm. 5.2.2.4.1.10 Ống ly tâm thủy tinh dung tích 250 ml. 5.2.2.4.1.11 Bình cầu thủy tinh dung tích 100 ml và 250 ml. 5.2.2.4.1.12 Bình định mức dung tích 5 ml và 10 ml. 4.2.2.4.2 Hóa chất 5.2.2.4.2.1 Nước cất loại dùng cho HPLC. 5.2.2.4.2.2 Metanol loại dùng cho HPLC. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 30 5.2.2.4.2.3 Clorofom loại dùng cho HPLC. 5.2.2.4.2.4 Axetonitril loại dùng cho HPLC. 5.2.2.4.2.5 n-hexan tinh khiết loại dùng cho phân tích. 5.2.2.4.2.6 Ete etylic tinh khiết. 5.2.2.4.2.7 Sulfat natri khan. 5.2.2.4.2.8 Silicagel cỡ hạt từ 60 đến 200 mesh. 5.2.2.4.2.9 Silicagel đã được hoạt hóa: cân 50,0 g silicagel tinh khiết (4.2.8) để vào tủ sấy trong 2 giờ ở nhiệt độ 110oC. Sau đó để nguội về nhiệt độ của phòng trong bình hút ẩm và ngâm trong clorofom 15 phút trước khi nhồi cột. 4.2.2.4.3 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử 5.2.2.4.3.1. Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100,0 mg/l), B2 (nồng độ 20,0 mg/l), G1 (nồng độ 100 mg/l) và G2 (nồng độ 20 mg/l). 5.2.2.4.3.2 Chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp aflatoxin có nồng độ (như Ðiều 5.2.2.4.3.1) trong metanol từ các ống chuẩn. Tùy theo nồng độ các aflatoxin có trong ống chuẩn, dùng bình định mức và lượng metanol thích hợp. 5.2.2.4.3.3 Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l) và G2 (2,0 mg/l): hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp (5.2.2.4.3.1) vào bình định mức 10 ml (5.2.2.4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng metanol (5.2.2.4.2.2). 5.2.2.4.3.4 Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0,0 ml, 1,0 ml, 2,0 ml, 4,0 ml, 8,0 ml và 10,0 ml dung dịch chuẩn trung gian (5.2.2.4.3.3) vào các bình định mức 10 ml (5.2.2.4.1.12) rồi định mức tới vạch bằng metanol. Các dung dịch chuẩn thu được có nồng độ aflatoxin lần lượt như sau: a. Chuẩn 1 : B1 (0,0 mg/l), B2 (0,0 mg/l), G1 (0,0 mg/l), G2 (0,0 mg/l). b. Chuẩn 2 : B1 (1,0 mg/l), B2 (0,2 mg/l), G1 (1,0 mg/l), G2 (0,2 mg/l). c. Chuẩn 3 : B1 (2,0 mg/l), B2 (0,4 mg/l), G1 (2,0 mg/l), G2 (0,4 mg/l). d. Chuẩn 4 : B1 (4,0 mg/l), B2 (0,8 mg/l), G1 (4,0 mg/l), G2 (0,8 mg/l). đ. Chuẩn 5 : B1 (8,0 mg/l), B2 (1,6 mg/l), G1 (8,0 mg/l), G2 (1,6 mg/l). e. Chuẩn 6 : B1 (10,0 mg/l), B2 (2,0 mg/l), G1 (10,0 mg/l), G2 (2,0 mge) 5.2.2.4.3.5 Dung dịch pha động: pha hỗn hợp các dung môi axetonitril, metanol và nước cất loại dùng cho HPLC theo tỉ lệ về thể tích là 2 : 2 : 6. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 31 4.2.2.4.4 Cách tiến hành 5.2.2.5.1 Chuẩn bị mẫu thử 5.2.2.5.1.1 Dùng cân phân tích (5.2.2.4.1.5) cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml (5.2.2.4.1.10). 5.2.2.5.1.2 Thêm 100,0 ml clorofom (5.2.2.4.2.3) vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể (5.2.2.4.1.4). Sau đó, ly tâm ống bằng máy ly tâm (5.2.2.4.1.6) trong khoảng 5 phút ở tốc độ 5000 vòng/phút. Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml (5.2.2.4.1.11). 5.2.2.5.2 Chuẩn bị mẫu trắng Mẫu trắng được định nghĩa là mẫu thủy sản đã được xác định không có aflatoxin. Tiến hành chuẩn bị mẫu trắng giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại (Ðiều 5.2.2.5.1) 5.2.2.5.3 Chuẩn bị mẫu để xác định độ thu hồi Thêm 2,0 ml dung dịch chuẩn 3 (5.2.2.4.3.4.c) vào 10,0 g mẫu trắng. Ðồng nhất mẫu bằng máy nghiền đồng thể (5.2.2.4.1.4). Tiến hành chuẩn bị mẫu giống như chuẩn bị với mẫu thử theo qui định tại (Ðiều 5.2.2.5.1). Phải chuẩn bị mẫu xác định độ thu hồi đồng thời với chuẩn bị mẫu thử và mẫu trắng. 5.2.2.5.4 Làm sạch dịch chiết 5.2.2.5.4.1 Chuẩn bị cột Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon (4.1.9). Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan (4.2.7), 20,0g silicagel đã hoạt hóa (4.2.8), 15 g sulfat natri khan (4.2.7). Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm. 5.2.2.5.4.2 Làm sạch dịch chiết 5.2.2.5.4.2.1 Cô dịch chiết thu được (5.2.2.5.1.2) trên hệ thống cô quay chân không (5.2.2.4.1.8) còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 400C. Dùng pipet chuyển dung dịch từ NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 32 bình cầu (5.2.2.5.1.2) vào cột làm sạch đã chuẩn bị (5.2.2.5.4.1) và tráng rửa bình cầu bằng clorofom. Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột khoảng từ 1,0 đến 1,5 ml/phút. Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel. 5.2.2.5.4.2.2 Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan (5.2.2.4.2.5), 50,0 ml ete etylic (5.2.2.4.2.6). Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 1,0 ml/phút. Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột. 5.2.2.5.4.2.3 Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 1,0 ml/phút. Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml (5.2.2.4.1.11). Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không (5.2.2.4.1.8) ở nhiệt độ 40o C cho đến khô hoàn toàn. Hoà tan cặn bằng 5,0 ml (V) dung dịch pha động (5.2.2.4.3.5) trong bình định mức 5 ml (5.2.2.4.1.12). Tiến hành phân tích hàm lượng các aflatoxin trên HPLC theo qui định tại( Ðiều 5.2.2.5.5) 5.2.2.5.4.2.4 Tiến hành làm sạch mẫu trắng (5.2.2.5.2) và mẫu để xác định độ thu hồi (5.2.2.5.3) giống như với mẫu thử (5.2.2.5.1) theo qui định tại (Ðiều 5.2.2.5.4.2.1, Ðiều 5.2.2.5.4.2.2 và Ðiều 5.2.2.5.4.2.3.) 5.2.2.5.5 Tiến hành phân tích trên HPLC 5.2.2.5.5.1 Ðiều kiện phân tích a. Cột sắc ký : RP-LC 18, kích thước L x ID là 25 cm x 4,6 mm, đường kính hạt 5 -10 [NAD2]mm. b. Nhiệt độ cột : 35oC. c. Pha động : Hỗn hợp gồm: axetonitril, metanol và nước cất (5.2.2.4.3.5) d. Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút. đ. Bước sóng cài đặt cho đầu dò huỳnh quang là: (kích hoạt) E x 365 nm, (phát xạ) Em 455 nm. e. Thể tích tiêm: 20 ml. 5.2.2.5.5.2 Tiêm các dung dịch chuẩn (5.2.2.4.3.4) vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao. Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình. Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b). NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 33 5.2.2.5.5.3 Tiêm dung dịch mẫu thử, dung dịch mẫu trắng và dung dịch xác định độ thu hồi vào hệ thống HPLC. Mỗi dung dịch mẫu tiêm 2 lần. Tính giá trị trung bình. 5.2.2.5.6 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 5.2.2.5.6.1 Ðộ lặp lại của 2 lần tiêm Ðộ lệch chuẩn (CVs) tính theo diện tích pic sắc ký của 2 lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 %. 5.2.2.5.6.2 Ðộ thu hồi (R) Ðộ thu hồi được xác định bằng cách sử dụng 10 mẫu trắng đã cho vào một lượng dung dịch aflatoxin chuẩn đã biết hàm lượng chính xác (5.2.2.5.3). Ðộ thu hồi tính được phải nằm trong khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90 %. 5.2.2.5.6.3 Ðường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan quy hồi tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,99. 5.2.2.6 Tính kết quả Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được (5.5.2). Với đường chuẩn ở dạng y = ax +b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau: ( / ) Y bC mg kg F a    Trong đó: - C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu, tính theo mg/kg - Y là hiệu số giữa diện tích pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tính theo đơn vị diện tích - a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b, được xác định theo (Ðiều 5.2.2.5.5.2.) - F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch V (5.2.2.5.4.2) và khối lượng mẫu m (5.2.2.5.1.1) sử dụng. 4.2.2.5 Kết luận Độc tố nấm Aflatoxin có thể làm cho người nhiễm bị ung thư gan, hết sức nguy hiểm. Do đó, việc phòng ngừa rất quan trọng vì vẫn chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu dành riêng cho bệnh này... NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 34 5 Biện pháp phòng nhiễm độc tố Aflatoxin Hiện nay thuốc chữa bệnh đặc hiệu không có, vì vậy biện pháp phòng bệnh là quan trọng. Aflatoxin là một độc tố khá bền vững với nhiệt. Vì vậy biện pháp đun sôi thông thường không có tác dụng đối với độc tố. Ðể đề phòng ngộ độc, biện pháp áp dụng là vấn đề bảo quản tốt các loại lương thực thực phẩm, trong đó chủ yếu là thực phẩm thực vật. - Với lương thực như gạo, ngô, mì: Yêu cầu bảo quản là giữ khô, thoáng mát để không bị nhiễm mốc. - Với những thực phẩm thực vật khô như lạc, vừng, cà phê... là những thực phẩm dễ hút ẩm và dễ mốc. Muốn bảo quản tốt cần được phơi khô, giữ nguyên vỏ, chứa trong các dụng cụ sạch, kín nếu để lâu, thỉnh thoảng phải đem phơi khô lại. Yêu cầu độ ẩm của hạt là dưới 15%. - Với nước chấm như xì dầu, tương: Những thông báo kết quả đầu tiên ở nước ta cho thấy độ nhiễm Aflatoxin trong nước chấm là đáng lo ngại. Vì vậy việc kiểm tra vệ sinh các xí nghiệp sản xuất nước chấm và các cửa hàng mua bán là cần thiết và phải được tiến hành thường xuyên. Nội dung kiểm tra cần làm: Kiểm tra vệ sinh môi trường (chủ yếu là không khí). Kiểm tra vệ sinh nước chấm. Ngoài các chỉ tiêu vệ sinh đã được qui định cho một mẫu nước chấm và một mẫu không khí, còn phải chú ý phát hiện sự có mặt của các chủng nấm sinh độc tố như: Aspergillus flavus, parasiticus và fumigatus. NẤM MỐC VÀ ĐỘC TỐ AFLATOXIN 35 6 Tài liệu tham khảo [1]. Abdollahi, A., and R. L. Buchanan, Regulation of aflatoxin, 1981 [2]. ADAMS, M.R., Et Al, Food microbiology, RSC, UK, 2002. [3]. Bhatnagar, D., S. P. McCormick, L. S. Lee, and R. A. Hill. 1987, Identification of O- methylsterigmatocystin as an aflatoxin B1/Gl precursor in Aspergillus parasiticus, Appi. Environ. Microbiol. [4]. GS.TS Nguyễn Thị Hiền, GS.TS Phan Thị Kim, Ts. Trương Thị Hòa, Th.S Lê Thị Lan Chi, Vi sinh vật nhiễm tạp trong lương thực - thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội, 2009. [5]. Lê Ngọc Tú, Độc tố học và an toàn thực phẩm, NXB Khoa học – Kỹ thuật Hà Nội, 2006. [6]. Maggon, K. K., S. K. Gupta, and T. A. Venkitasubramanian 1977, Biosynthesis of aflatoxins. Bacteriol. Rev. 41:822-855. [7]. M. Herzberg (ed.), Toxic micro-organisms, UJNR Joint Panels on Toxic Micro-organisms and U.S. Department of the Interior, Washington, D.C. [8]. Vandegraft, and G. Shannon, Production of various aflatoxins, 1968. [9]. http:// www.biochem.duke.edu.