Nghiên cứu chế tạo vật liệu nano chitosan làm chất hấp thụ protein ứng dụng trong dẫn truyền thuốc

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN Kết quả và biện luận 47 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1. Phân tích đặc điểm của nguyên liệu chitosan Kết quả khảo sát đặc điểm của nguyên liệu chitosan (DD > 75%) được đánh giá bằng phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC (xem phụ lục 1), phương pháp chụp ảnh FE-SEM, phương pháp đo phổ hồng ngoại FT-IR, phương pháp đo phổ Raman cho thấy như sau: 3.1.1. Phương pháp phân tích GPC Phân tử lượng trung bình số: =nM 162kDa . Phân tử lượng trung bình khối: =wM 497kDa. Phân tử lượng trung bình nhớt: =vM 497kDa. Chỉ số đa phân tán: == n W M MDI 3,07 ; DI > 2. Kết quả nhận được cho thấy mẫu chitosan nguyên liệu có độ đa phân tán cao. Phân tử lượng của chitosan ảnh hưởng rất lớn đến kích thước hạt. Thông thường, phân tử lượng của chitosan càng lớn thì kích thước hạt nano chitosan tạo thành càng lớn. Nhóm của Bing Hu [13] sử dụng chitosan có phân tử lượng lần lượt là 30, 50, 100, 150 và 300kDa, có cùng độ deacetyl hóa là 90% để điều chế hạt nano chitosan tripolyphosphate ở nồng độ chitosan là 1.5mg/ml, tỷ lệ CS/TPP là 6:1, pH là 4,5. Khi phân tử lượng chitosan tăng từ 30 đến 50kDa, kích thước hạt giảm từ 201,4 xuống 169,0nm. Khi phân tử lượng chitosan tăng từ 50kDa đến 150kDa, kích thước hạt không thay đổi đáng kể. Khi phân tử lượng chitosan tăng từ 150kDa đến 300kDa, kích thước hạt tăng nhanh từ 173,3nm đến 309,7nm. Tương tự, nhóm của Q. Gan [12] sử dụng chitosan có phân tử lượng thấp, trung bình và cao, độ deacetyl hóa lần lượt là 86,6%; 84,7% và 82,5% để điều chế Kết quả và biện luận 48 9hạt nano chitosan tripolyphosphate ở nồng độ chitosan là 0,05% (w/v), tỷ lệ CS/TPP là 4:1, pH là 4,0. Kích cỡ hạt thu được đối với phân tử lượng thấp, trung bình và cao lần lượt là 136,2nm; 145,3nm và 155,0nm. Như vậy, với chitosan có phân tử lượng là 497kDa được sử dụng trong đề tài này, ước tính kích thước hạt thu được có thể khá lớn. 3.1.2. Phương pháp chụp ảnh FE-SEM Ảnh FE-SEM (hình 3.1) của chitosan cho thấy hình dạng nguyên liệu chitosan ban đầu là từng lớp polymer với kích thước hạt lớn. Hình 3.1. Ảnh FE-SEM của chitosan khi chưa tạo nối. 3.1.3. Phương pháp nhiễu xạ tia X, phổ FT-IR và phổ Raman Giản đồ nhiễu xạ tia X (phụ lục 7), phổ FT-IR (phụ lục 3) và phổ Raman (phụ lục 5) của chitosan cũng được khảo sát cho thấy phù hợp với các công trình đã công bố trước đây [8], [23]. Các kết quả này sẽ được dùng để so sánh và đánh giá khả năng tạo nối của chitosan và TPP trong quá trình chế tạo hạt nano chitosan ở phần trình bày sau. Kết quả và biện luận 49 3.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến kích thước và sự phân bố hạt nano chitosan 3.2.1. Khảo sát sơ bộ các điều kiện chế tạo hạt nano chitosan Với mục đích tạo ra hạt nano chitosan có kích thước nhỏ, đồng đều, chúng tôi đã tiến hành nhiều thí nghiệm điều chế hạt nano, cố định thời gian khảo sát là 1 giờ, nồng độ CS là 0,5% (w/v) để thực hiện các khảo sát sơ bộ và chọn lựa các thông số thí nghiệm theo tiêu chuẩn sau: 9 Gel tạo thành ở dạng sệt, trong suốt, không tách lớp; 9 Kích thước hạt nano nhỏ, đồng đều (qua ảnh FE-SEM); 9 Quá trình ly tâm tách hạt nano hiệu quả; 9 Quá trình tinh chế hiệu quả (Phổ FT-IR không chứa các mũi của acid acetic còn sót lại, xem phụ lục 4); 9 Phương pháp thực nghiệm đơn giản, dễ thực hiện và có khả năng ứng dụng vào sản xuất. Kết quả thực nghiệm đã lựa chọn được các thông số thí nghiệm thoả mãn các yêu cầu nêu trên: 9 Nồng độ TPP hoặc glutaraldehyde là 0,25% (w/v) (với nồng độ 0,5% và 1% có hiện tượng tách lớp với TPP và tạo bọt với glutaraldehyde); 9 Chỉnh pH dung dịch chitosan bằng dung dịch NaOH 5M (tránh hiện tượng pha loãng dung dịch chitosan khi chỉnh pH bằng NaOH 1M); 9 Cách thực hiện: Nhỏ từ từ TPP hoặc glutaraldehyde vào chitosan (thực hiện ngược lại có hiện tượng tách lớp, lợn cợn); 9 Khuấy từ, tốc độ khuấy mạnh 1500 vòng/phút để tránh tách lớp; 9 Ly tâm tách toàn bộ hạt nano với tốc độ 17000 vòng/phút trong 30 phút; 9 Rửa hạt bằng nước cất đến pH 6,5-7 để loại hoàn toàn acid acetic; Kết quả và biện luận 50 9 Đông cô làm khô hạt ở -80oC; 0,001mBar và 76 giờ; 9 Bảo quản hạt nano chitosan ở 5ºC trong tủ lạnh. Kết quả thí nghiệm chịu ảnh hưởng của nhiều thông số trong suốt quá trình tiến hành thực nghiệm. Sự sai lệch sẽ dẫn đến kết quả không chính xác. Do vậy, các bước khảo sát tiếp theo đều dựa đúng theo các thông số thí nghiệm mà quá trình khảo sát sơ bộ bước đầu đạt được. 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của phương pháp điều chế Trong nội dung này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của hai phương pháp điều chế khác nhau đến kích thước và sự phân bố hạt nano chitosan lần lượt là phương pháp tạo nối ngang cộng hóa trị, sử dụng tác chất glutaraldehyde và phương pháp tạo gel ion (tạo nối ngang ion), sử dụng tác chất tripolyphosphate (TPP) với mục đích tìm ra phương pháp thích hợp tạo ra hạt nano chitosan có kích thước nhỏ để tăng khả năng hấp phụ thuốc. Điều kiện tiến hành thí nghiệm được trình bày ở phần 2.2.2 và giữ cố định các thông số sau: dung dịch chitosan có nồng độ 0,5% (w/v); pH của dung dịch chitosan được chỉnh đến 5,0; TPP hoặc glutaraldehyde có nồng độ 0,25% (w/v) và tỷ lệ khối lượng CS/TPP hoặc CS/glutaraldehyde là 6:1. Khi nhỏ từ từ TPP (glutaraldehyde) vào dung dịch chitosan trong điều kiện khuấy từ tốc độ 1500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ, chúng tôi nhận thấy những dung dịch này trở nên sệt hơn và màu sắc có sự thay đổi tương ứng. Đối với tác chất glutaraldehyde, dung dịch có màu vàng ngà. Đối với tác chất TPP, dung dịch có màu trắng đục. Điều này chứng tỏ đã có phản ứng xảy ra giữa chitosan và các tác chất tạo nối. Đối với tác chất glutaraldehyde, phản ứng có thể diễn ra do những nhóm aldehyde của glutaraldehyde hình thành liên kết imine cộng hóa trị với các nhóm amine của chitosan như hình 3.2. Mặc dù một số tài liệu khẳng định môi trường trung tính hoặc baz là tốt nhất để phản ứng này xảy ra, nhóm của O.A.C. Monteiro Kết quả và biện luận 51 tiến hành phản ứng này trong môi trường acid với pH 3-4 và nhận thấy rằng thời gian 1 giờ là đủ để phản ứng xảy ra hoàn toàn [19]. Hình 3.2. Phản ứng tạo nối ngang cộng hóa trị giữa chitosan và glutaraldehyde. Đối với tác chất TPP, do bản chất phân ly, TPP phân ly trong nước và phóng thích ra ion OH-. Do đó, trong dung dịch TPP đồng thời tồn tại cả ion OH – và ion P3O105- có thể cạnh tranh phản ứng với nhóm NH3+ của chitosan. Theo tài liệu [26], TPP có các giá trị pKa sau: pK1 = 1; pK2 = 2; pK3 = 2,79; pK4 = 6,47 và pK5 = 9,24; CS: pKa = 6,3. Vì thế, tùy thuộc vào giá trị pH, cơ chế tương tác có thể là do sự mất proton hoặc sự tạo nối ngang ion [16]. Kết quả và biện luận 52 Hình 3.3. Cấu trúc hóa học của sodium TPP. Hình 3.4. Cơ chế tương tác giữa CS và TPP. Kết quả và biện luận 53 Cũng có thể xem xét mối quan hệ giữa tinh thể chitosan trước và sau khi xảy ra phản ứng như hình 3.5. â Hình 3.5. Mối quan hệ giữa tinh thể và nối ngang ion: (a) chitosan tinh thể ban đầu; (b) chitosan tạo nối ngang ion thấp; (c) chitosan tạo nối ngang ion cao. Cơ chế cắt mạch để hình thành hạt nhỏ như thế nào ít thấy đề cập trong các tài liệu nói về nano chitosan. Theo M. L. Tsai [29], trong điều kiện khuấy trộn có thể dẫn đến hiện tượng cắt mạch phân tử chitosan. Có thể có hai khả năng như sau: Kết quả và biện luận 54 Hình 3.6. Ảnh hưởng của lực cắt đến sự hình thành hạt nano. Thứ nhất, đối với các phân tử trong quá trình chuyển động bị vướng lại với nhau, quá trình khuấy trộn sẽ cắt những phân tử chitosan này thành những mảnh phân tử ngắn hơn. Những mảnh chitosan bị cắt này sau đó sẽ tham gia vào phản ứng tạo gel ion với những phân tử TPP. Kết quả là hạt nhỏ được hình thành. Thứ hai, đối với các phân tử trong quá trình chuyển động không bị vướng lại với nhau, quá trình khuấy trộn sẽ kéo, tách những phân tử này xa nhau hơn. Chúng phản ứng với những phân tử TPP và hình thành những hạt lớn. Dung dịch sau phản ứng được ly tâm 17000 vòng/phút trong 30 phút thu hạt nano chitosan. Rửa hạt nano nhiều lần bằng nước cất đến pH 6,5-7. Hạt nano chitosan được đông khô bằng máy đông cô TELSTAR LYOQUEST ở nhiệt độ -80oC, áp suất 0,001mBar trong 72 giờ tại Công ty Cổ Phần Xuất Nhập Khẩu Y Tế DOMESCO, Đồng Tháp. Sản phẩm bột nano chitosan được bảo quản trong tủ lạnh. Đối với tác chất glutaraldehyde, bột thu được có màu vàng sậm, phù hợp với kết quả của O.A.C. Monteiro [19]. Đối với tác chất TPP, bột thu được có màu trắng Kết quả và biện luận 55 sáng, phù hợp với kết quả của Lifeng Qi [24], khác với màu trắng ngà của nguyên liệu chitosan ban đầu. Hình 3.7. Ảnh chụp bột nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau (từ trái qua phải): phương pháp tạo gel ion với TPP và phương pháp tạo nối ngang cộng hóa trị với glutaraldehyde. Kết quả bảng 3.1 và hình 3.8 cho thấy đối với tác chất glutaraldehyde, hạt nano thu được có kích thước khá lớn, phân bố kích thước từ 149,03-561,63nm (kích thước trung bình là 281,62nm, bảng 3.1, hình 3.8). Đối với tác chất TPP, kích thước hạt nhỏ và đều hơn, phân bố từ 36,08-94,90nm (kích thước trung bình là 68,89nm, bảng 3.1, hình 3.8). Kích thước hạt nhỏ và phân bố khá đồng đều sẽ có tiềm năng lớn trong hấp phụ protein, thuốc. Kết quả và biện luận 56 Bảng 3.1. Đặc điểm hạt nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau. STT Phương pháp Phân bố kích thước (nm) Kích thước trung bình (nm) 1 Tạo nối ngang cộng hóa trị 149,03-561,63 281,62 2 Tạo gel ion 36,08-94,90 68,89 Hình 3.8. Ảnh FE-SEM của hạt nano chitosan điều chế từ các phương pháp khác nhau (từ trái qua phải): phương pháp tạo nối ngang cộng hóa trị với glutaraldehyde, phương pháp gel ion với TPP. Có thể nói đây là hai phương pháp được sử dụng phổ biến để tạo hạt nano. Khi tác dụng với glutaraldehyde, chuỗi chitosan được tạo nối ngang hóa học hình thành các liên kết cộng hóa trị bền. Khi tác dụng với với một polyanion như TPP, chitosan tạo nối ngang ion yếu hơn chủ yếu do lực tương tác tĩnh điện giữa chitosan mang điện tích dương và polyanion. Do tính độc hại của glutaraldehyde, chỉ phương pháp tạo gel ion được ứng dụng trong dược phẩm [17]. Đây cũng là phương pháp đơn giản, rẻ tiền, hiệu quả cao và không độc hại nên được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo. Kết quả và biện luận 57 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP Tỷ lệ CS/TPP là một nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến kích thước hạt. Nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến kích thước hạt đưa ra các kết luận khác nhau. Theo nhóm của Gan [12], khi tỷ lệ CS/TPP càng tăng thì kích thước hạt càng tăng. Kích thước hạt điều chế được trong khoảng từ 100-250nm. Trong khi đó, nghiên cứu của Bing Hu [13], Paradimitriou [22] lại rút ra kết luận ngược lại, càng tăng tỷ lệ CS/TPP thì kích thước hạt càng giảm. Trong nội dung này, chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ CS/TPP đến kích thước và sự phân bố hạt nano chitosan lần lượt là 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1 với mục đích tìm ra tỷ lệ CS/TPP tạo ra hạt nano chitosan có kích thước nhỏ để tăng khả năng hấp phụ protein, thuốc. Điều kiện tiến hành thí nghiệm được trình bày ở phần 2.2.2 và giữ cố định các thông số sau: dung dịch chitosan có nồng độ 0,5% (w/v); pH của dung dịch chitosan được chỉnh đến 5,0; TPP có nồng độ 0,25% (w/v). Hình 3.9. Ảnh chụp dung dịch huyền phù nano chitosan điều chế từ các tỷ lệ CS/TPP khác nhau (từ trái qua phải): 3:1,4:1, 5:1, 6:1, 7:1. Kết quả và biện luận 58 Theo quan sát, khi nhỏ từ từ dung dịch TPP vào dung dịch chitosan, dung dịch huyền phù nano chitosan trở nên càng lúc càng trắng đục khi tỷ lệ CS/TPP giảm từ 7:1 đến 3:1. Sau 3 ngày bảo quản trong tủ lạnh, các dung dịch huyền phù này bắt đầu tách lớp (hình 3.9), chứng tỏ có sự hình thành những hạt kích thước lớn. Tuy nhiên, ở tỷ lệ CS/TPP là 6:1, dung dịch không bị tách lớp và có màu trắng đục nhạt hơn so với các dung dịch khác chứng tỏ hạt tạo thành có kích thước nhỏ hơn. Kết quả khảo sát này phù hợp với khảo sát của nhóm Paraditrimiou khi thực hiện khảo sát tỷ lệ CS/TPP từ 2:1 đến 5:1. Nhóm này thấy rằng huyền phù nano càng lúc càng đục hơn khi tỷ lệ CS/TPP giảm. Thậm chí, kết cụm xuất hiện khi tỷ lệ CS/TPP giảm xuống 1,5:1 [13], [22]. Kết quả và biện luận 59 Hình 3.10. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 3:1. dtb = 219,24 nm 0 2 4 6 8 10 12 100 150 200 250 300 350 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.11. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là 3:1. dtb = 219,24nm Kết quả và biện luận 60 Hình 3.12. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 4:1. dtb = 190,23 nm 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 150 170 190 210 230 240 260 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.13. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là 4:1. dtb = 190,23nm Kết quả và biện luận 61 Hình 3.14. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 5:1. dtb = 118,57 nm 0 2 4 6 8 10 12 14 60 100 140 180 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.15. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là 5:1. dtb = 118,57nm Kết quả và biện luận 62 Hình 3.16. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 6:1. dtb = 68,89 nm 0 2 4 6 8 10 12 30 40 50 60 70 80 90 100 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.17. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là 6:1. dtb = 68, 89nm Kết quả và biện luận 63 Hình 3.18. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp với tỷ lệ CS/TPP là 7:1. dtb = 113,89 nm 0 2 4 6 8 10 12 50 70 90 110 130 150 170 190 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.19. Phân bố kích thước hạt nano chitosan với tỷ lệ CS/TPP là 7:1. dtb = 113,89nm Kết quả và biện luận 64 Kết quả ảnh FE-SEM cho thấy ở tỷ lệ CS/TPP cao (6:1 và 7:1), kích thước hạt nhỏ, đồng đều và phân bố khá tập trung. Đặc biệt, ở tỷ lệ CS/TPP cao, hạt không có hiện tượng kết dính lại như ở tỷ lệ CS/TPP thấp (3:1, 4:1 và 5:1). Bảng 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến tính chất hạt nano chitosan. Chỉ tiêu theo dõi Tỷ lệ CS/TPP 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 Phân bố kích thước (nm) 119,05- 309,75 156,98- 244,46 63,22- 178,25 36,08-94,90 59,52- 170,45 Kích thước trung bình (nm) 219,24 190,23 118,57 68,89 113,89 0 50 100 150 200 250 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 Tỉ lệ CS/TPP K íc h th ư ớ c hạ t ( nm ) Hình 3.20. Ảnh hưởng của tỷ lệ CS/TPP đến kích thước hạt. Kết quả từ bảng 3.2 và hình 3.20 cho thấy, khi tăng tỷ lệ CS/TPP từ 3:1 đến 6:1, kích thước hạt giảm dần, khá phù hợp với nghiên cứu của Bing Hu [13]. Theo Kết quả và biện luận 65 Bing Hu, khả năng tạo gel của CS với TPP nằm ở sự hình thành những nối ngang nội phân tử và liên phân tử giữa các nhóm amino và các nhóm phosphate. Khi tỷ lệ CS/TPP tăng (nghĩa là hàm lượng TPP nhỏ), TPP có thể chi phối quá trình tạo nối ngang liên phân tử và nội phân tử với CS để tạo thành những đơn hạt nhỏ. Khi tỷ lệ CS/TPP giảm (nghĩa là lượng TPP tăng tương ứng), lượng TPP còn dư sẽ liên kết với những đơn hạt để tạo thành những hạt nano lớn hơn. Tuy nhiên, khi tỷ lệ CS/TPP tăng từ 6:1 đến 7:1, kích thước hạt tăng nhẹ trở lại, hạt không tròn. Có lẽ ở tỷ lệ này, lượng TPP quá ít, không đủ để tạo các liên kết chặt chẽ với các nhóm amino. Ở tỷ lệ CS/TPP là 6:1, hạt thu được có dạng hình cầu và kích thước hạt nhỏ nhất. Điều này phù hợp với dự đoán ban đầu khi quan sát đặc điểm ngoại quan của mẫu sau quá trình điều chế. 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của pH Là một polysaccharide baz yếu, CS không tan trong dung dịch kiềm và trung tính. Tuy vậy, khi được hòa tan trong môi trường acid, CS tan do các nhóm –NH2 ở vị trí C-2 của đơn vị D-glucosamine bị proton hóa. Vì thế, quá trình tạo nối ngang ion để tạo thành hạt nano chitosan phụ thuộc vào pH, tạo cơ hội điều chỉnh những đặc tính của hạt nano CS/TPP [13]. Trong phần này, ảnh hưởng của pH được khảo sát nhằm tìm ra pH thích hợp nhất để tạo hạt nano chitosan. Điều kiện tiến hành thí nghiệm được trình bày ở phần 2.2.2. Tỷ lệ CS/TPP dùng trong khảo sát được chọn là tỷ lệ tạo hạt nhỏ nhất trong phần 3.2.2 là 6:1. Các giá trị pH được khảo sát lần lượt là 4,0; 4,5; 5,0 và 5,5. Kết quả và biện luận 66 Hình 3.21. Ảnh chụp dung dịch huyền phù nano chitosan điều chế ở những điều kiện pH khác nhau (từ trái qua phải): 4,0; 4,5; 5,0; 5,5. Ảnh chụp dung dịch huyền phù nano chitosan (hình 3.21) điều chế tại các giá trị pH khác nhau cho thấy, các dung dịch huyền phù nano chitosan điều chế có màu trắng đục và không tách lớp sau 3 ngày bảo quản, chứng tỏ có sự hình thành những hạt kích thước nhỏ. Khi pH càng tăng, màu của dung dịch huyền phù càng đục cho thấy kích cỡ hạt tăng dần. Kết quả và biện luận 67 Hình 3.22.Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 4,0. dtb = 48,70 nm 0 2 4 6 8 10 12 14 30 40 50 60 70 80 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.23. Phân bố kích thước hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 4,0. d tb = 48,70nm Kết quả và biện luận 68 Hình 3.24. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 4,5. 0 2 4 6 8 10 12 40 50 60 70 80 90 100 110 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.25. Phân bố kích thước hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 4,5. dtb = 64,42nm Kết quả và biện luận 69 Hình 3.26. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 5,0. dtb = 68,89 nm 0 2 4 6 8 10 12 30 40 50 60 70 80 90 100 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.27. Phân bố kích thước hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 5,0. dtb = 68,89nm Kết quả và biện luận 70 Hình 3.28. Ảnh FE-SEM hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 5,5. dtb = 156,88 nm 0 2 4 6 8 10 12 100 120 140 160 180 200 220 240 260 Kích thước (nm) M ật đ ộ (% ) Hình 3.29. Phân bố kích thước hạt nano chitosan khi tổng hợp ở pH 5,5. dtb = 156,88nm Kết quả và biện luận 71 Kết quả ảnh FE-SEM cho thấy ở pH thấp (4,0; 4,5; 5,0), kích thước hạt nhỏ, đồng đều và phân bố khá tập trung. Đặc biệt, ở pH thấp, hạt không có hiện tượng kết dính lại như ở pH cao (5,5). Bảng 3.3. Ảnh hưởng của pH đến tính chất hạt nano chitosan. pH 4,0 4,5 5,0 5,5 Phân bố kích thước (nm) 33,13-73,86 45,55-108,02 36,08-94,90 108,43-253,01 Kích thước trung bình (nm) 48,70 64,42 68,89 156,88 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 3.5 4 4.5 5 pH K íc h th ư ớ c (n m ) 5.5 Hình 3.30. Ảnh hưởng của pH đến kích thước hạt nano chitosan. Kết quả từ bảng 3.3 và hình 3.30 cho thấy, khi tăng pH từ 4,0 đến 5,5, kích thước hạt tăng dần. Kích thước hạt nhỏ nhất (48,70nm) thu được ở điều kiện pH là 4,0 và tỷ lệ CS/TPP là 6:1. Có thể thấy rằng pH ít ảnh hưởng đến kích thước hạt trong khoảng từ 4,0 đến 5,0. Kích thước hạt tăng nhẹ khi pH tăng từ 4,0 đến 4,5. Kích thước hạt ổn định trong khoảng pH từ 4,5 đến 5,0. Tuy nhiên, kích thước hạt Kết quả và biện luận 72 tăng nhanh đột ngột trong khoảng pH từ 5,0 đến 5,5 cho thấy pH cao không thích hợp cho sự hình thành hạt có kích thước nhỏ, ngược với khảo sát của Q.Gan [12] là kích thước hạt nhỏ nhất ở pH 5,5. Điều này có thể giải thích là do ở pH 5,5; sự proton hóa nhóm NH2 trong phân tử CS quá yếu dẫn đến điện thế hạt giảm [13] gây ra hiện tượng tụ hạt (hình 3.28). Kết quả khảo sát kích thước hạt này phù hợp với dự đoán ban đầu khi quan sát đặc điểm ngoại quan của mẫu sau quá trình điều chế. Kích thước và hình dạng hạt nano chitosan một lần nữa được đánh giá thông qua kết quả phân tích TEM. Mẫu được chọn để khảo sát là mẫu có kích thước hạt trung bình nhỏ nhất 48,70nm và khoảng phân bố kích thước hạt là 33,13-73,86nm dựa trên kết quả khảo sát ảnh FE-SEM, điều chế ở tỷ lệ CS/TPP là 6:1 và pH là 4,0. Ảnh TEM (hình 3.31) cho thấy các hạt có dạng hình cầu, kích thước khá nhỏ, đồng đều và phân bố khá riêng lẽ, kích thước hạt trung bình là 54,01nm và khoảng phân bố kích thước hạt là 31,65-91,28nm. Đặc biệt, hầu hết các hạt đều có kích thước từ 50-60nm. Kết quả này khá trùng hợp với kết quả khảo sát ảnh FE-SEM. Dạng hình cầu của các hạt nano chitosan là dạng có hiệu quả nhất trong các ứng dụng của nano chitosan, đặc biệt trong các ứng dụng hấp phụ thuốc do bề mặt cầu có nhiều phương tiếp xúc với thuốc nhất. Kích thước hạt nhỏ và đồng đều thích hợp cho quá trình dẫn truyền thuốc qua niêm mạc và đảm bảo thuốc được dẫn truyền và phóng thích với tốc độ như nhau trong cơ thể. Kết quả khảo sát này gây ra sự bất ngờ bởi vì khi sử dụng nguyên liệu chitosan có phân tử lượng lớn (479kDa), chúng tôi dự tính hạt tạo ra sẽ có kích thước lớn. Thế nhưng, trong suốt quá trình khảo sát, kích thước hạt chỉ dao động trong khoảng 48,70-219,24nm. Hiện tượng này có thể liên quan đến hiện tượng cắt mạch CS trong suốt quá trình khuấy từ hỗn hợp CS và TPP đã được trình bày trong phần 3.3.2 (hình 3.6). Theo đó, lực cắt mạnh (ở đây chúng tôi sử dụng tốc độ khuấy mạnh 1500 vòng/phút) có thể cung cấp đủ năng lượng để bẻ gẫy phân tử CS. Các phân tử CS có mạch càng dài sẽ càng dễ bị vướng mắc vào nhau và chịu ảnh hưởng của lực cắt này mạnh hơn, hình thành hạt nhỏ hơn. Kết quả và biện luận 73 Hình 3.31. Ảnh TEM của hạt nano điều chế ở pH 4,0; tỉ lệ CS/TPP là 6:1. Kết quả và biện luận 74 3.3. Khảo sát đặc tính hóa lý của hạt nano chitosan 3.3.1. Khảo sát sự biến đổi nhóm chức 3.3.1.1. Khảo sát phổ hồng ngoại FT-IR Khảo sát phổ FT-IR của CS, nano CS-TPP nhằm xác định sự biến đổi nhóm chức khi hình thành hạt nano. Phổ FT-IR đạt được trong khoảng tần số 399,255-4000,27cm-1, độ phân giải là 4cm-1. Hình 3.32. Phổ IR của chitosan (a) và hạt nano CS-TPP (b). Bảng 3.4. Những mũi IR chính (cm-1) của CS và nano CS-TPP Tín hiệu nhóm CS, υ/cm-1 Nano CS-TPP, υ/cm-1 υO-H 3423 3397 υC-H 2922 2936 υCO, amide I 1651 1645 υN-H, amide II 1595 1541 υC3-O 1421-1154 1383-1154 υC6-O 1076 1075 υP=O - 1218 Kết quả và biện luận 75 Đối với phổ của CS, mũi phổ ở 3423cm-1 tương ứng với dao động của nhóm NH2 và OH của CS. Mũi ở 1651cm-1 tương ứng với dao động của nhóm CONH2. Mũi ở 1595cm-1 tương ứng với dao động của nhóm NH2. Mũi ở 1076cm-1 tương ứng với dao động của nhóm C-O-C. Đối với phổ của nano CS-TPP, có sự dịch chuyển mũi từ 3423cm-1 sang 3397cm-1. Đồng thời có sự hiện diện của mũi 1218cm-1 tương ứng với dao động của nhóm P=O. Mũi 1651cm-1 biến mất và hai mũi mới xuất hiện ở 1645cm-1 và 1541cm-1 là do liên kết giữa nhóm ammonium và phosphoric [23]. Do vậy, có thể kết luận nhóm ammonium của chitosan đã tạo nối ngang với TPP trong sản phẩm nano CS-TPP. 3.3.1.2. Khảo sát phổ vi tán xạ Raman Khảo sát phổ Raman của CS, nano CS-TPP nhằm xác định sự biến đổi nhóm chức khi hình thành hạt nano. Phổ Raman đạt được trong khoảng tần số 100-4000cm-1. Kết quả và biện luận 76 Hình 3.33. Phổ Raman của chitosan. Hình 3.34. Phổ Raman của hạt nano CS-TPP. Kết quả và biện luận 77 Đối với phổ của CS, mũi phổ ở 3365, 3304cm-1 tương ứng với dao động của nhóm NH2 của CS. Mũi ở 2883cm-1 tương ứng với dao động của nhóm C-C, C-H. Mũi ở 1462, 1379cm-1 tương ứng với dao động của nhóm CH3. Mũi ở 1267cm-1 tương ứng với dao động của nhóm NH-C=O-CH3. Mũi ở 1112cm-1 tương ứng với dao động của nhóm C-O-C [8]. Đối với phổ của nano CS-TPP, mũi NH2 hoàn toàn biến mất, chứng tỏ hầu hết NH2 của CS đều bị proton hóa và tạo nối ngang ion với TPP. Các mũi còn lại trong phổ CS đều hiện diện trong phổ nano CS-TPP. Mặc dù vậy, cường độ các mũi này yếu hơn, không mạnh và sắc nét như trong phổ của CS. Đặc biệt, đường nền dâng cao hơn chứng tỏ sau khi tạo nối để hình thành hạt nano CS-TPP, CS bị cắt mạch làm mức độ tinh thể giảm, dẫn đến tín hiệu mũi không còn sắc nét. 3.3.2. Khảo sát mức độ vô định hình Mức độ tinh thể của nguyên liệu CS ban đầu và hạt nano CS-TPP được đánh giá thông qua giản đồ nhiễu xạ tia X của chúng. Giản đồ nhiễu xạ được đo trong khoảng 2θ từ 4o đến 70o. Kết quả và biện luận 78 Hình 3.35. Giản đồ XRD của CS và nano CS-TPP. Giản đồ nhiễu xạ tia X của CS có hai mũi mạnh ở 2θ là 10,5o và 20,0o, phù hợp với giản đồ nhiễu xạ của CS được công bố trong các tài liệu trước [23], [24], cho thấy mức độ tinh thể cao của CS nguyên liệu. Tuy nhiên, không có mũi nào được tìm thấy trong giản đồ nhiễu xạ của hạt nano CS-TPP sau khi điều chế. Điều này cho thấy cấu trúc tinh thể của CS đã bị phá hủy sau khi tạo nối ngang với TPP. Sự thay đổi cấu trúc có thể do khả năng tạo nối ngang nội phân tử và liên phân tử giữa CS và TPP, làm xáo trộn liên kết mạch phân tử CS, dẫn đến giảm mức độ tinh thể của hạt nano CS-TPP so với CS ban đầu. Một số công trình nghiên cứu còn cho thấy loại quy trình làm khô có thể ảnh hưởng đến mức độ tinh thể của polymer. Piron thấy rằng quy trình đông cô làm giảm mức độ tinh thể, tạo ra cấu trúc mở rộng, làm tăng động học hấp phụ kim loại [23]. Do vậy, sự phá huỷ cấu trúc polymer có thể góp phần làm tăng khả năng hấp phụ protein, thuốc của các hạt nano CS-TPP. Kết quả và biện luận 79 3.4. Khảo sát khả năng hấp phụ protein trên hạt nano chitosan Sự phát triển những hệ thống dẫn truyền những hợp chất đại phân tử sắp đến đem lại thử thách mới cho những nhà khoa học dược. Peptide, protein, oligonucleotid và gen là những hợp chất không bền nên chúng cần được bảo vệ để không bị phân hủy trong môi trường cơ thể. Hơn nữa, hiệu quả của chúng thường bị giới hạn bởi khả năng vượt qua những vách ngăn sinh học và tính hướng đích kém. Vì vậy, tương lai ứng dụng những phân tử này trong điều trị rõ ràng tùy thuộc rất lớn vào việc thiết lập vật liệu dẫn truyền thích hợp đến cơ thể [14]. Trong phần này, chúng tôi sử dụng hạt nano có kích thước 48,70nm, có khối lượng lần lượt là 0,25mg; 0,5mg; 1,0mg; 1,5mg và 2,0mg cho hấp phụ với 1,0mg protein mô hình BSA ở nhiệt độ phòng trong thời gian 60 phút. Tốc độ lắc 250 vòng/phút. Sau đó tiến hành ly tâm hỗn hợp với tốc độ 17000 vòng/phút ở 4oC, 30 phút, thu dịch nổi. Hình 3.36. Ảnh chụp dịch nổi protein sau khi thêm thuốc thử Bradford, sử dụng lượng hạt nano chitosan khác nhau (từ trái qua phải): 0,5; 1,0; 1,5; 2,0mg. Kết quả và biện luận 80 Dịch nổi protein sau khi hấp phụ trên hạt nano chitosan (hình 3.36) ở các liều lượng 0,25; 0,5; 1,0; 1,5 và 2,0mg được pha loãng 10 lần, thêm thuốc thử Bradford, lắc đều trước khi tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 595nm. Sau khi thêm thuốc thử, các dung dịch bắt đầu có màu xanh. Dung dịch có màu xanh càng đậm chứng tỏ lượng protein còn lại càng nhiều. Ảnh chụp cho thấy các dung dịch chuyển màu xanh đậm dần từ trái sang phải tương ứng với lượng protein còn lại tăng dần. Ở liều lượng hạt nano chitosan là 0,5mg, lượng protein còn lại ít nhất tương ứng với dung dịch có màu nhạt nhất. Ở liều lượng hạt nano chitosan là 2,0mg, lượng protein còn lại nhiều nhất tương ứng dung dịch có màu đậm nhất. Ảnh chụp cho phép dự đoán hạt nano chitosan hấp phụ protein hiệu quả ở liều lượng 0,5mg. Mặc dù ở liều lượng 0,25mg nano chitosan, dịch nổi thu được có màu xanh nhưng vì thí nghiệm này được thực hiện thêm sau nên chúng tôi không thu ảnh chụp dịch nổi. Bảng 3.5. Số liệu khảo sát hiệu suất hấp phụ và khả năng hấp phụ protein. Liều lượng nano chitosan (mg) Hiệu suất hấp phụ (%) Khả năng hấp phụ (mg/mg) 0,25 62,14 2,49 0,5 96,41 1,93 1,0 70,00 0,70 1,5 57,45 0,38 2,0 56,14 0,28 Kết quả và biện luận 81 0 20 40 60 80 100 120 0 0.5 1 1.5 2 Liều lượng nano chitosan (mg) H iệ u su ất h ấp p hụ (% ) Hình 3.37. Hiệu suất hấp phụ protein ở những liều lượng hạt nano chitosan khác nhau. Bảng 3.5 và hình 3.37 cho thấy khi liều lượng hạt nano chitosan tăng từ 0,25mg đến 0,5mg thì hiệu suất hấp phụ tăng từ 62,14% đến 96,41%. Khi liều lượng hạt nano chitosan tăng từ 0,5mg đến 2,0mg, hiệu suất hấp phụ lại giảm từ 96,41% xuống 56,14%. Điều này có lẽ là do hai nguyên nhân sau: Thứ nhất, ở liều lượng hạt thấp, do ảnh hưởng của độ nhớt dung dịch là không đáng kể nên protein dễ dàng hấp phụ lên bề mặt hạt, dẫn đến hiệu suất hấp phụ protein tăng khi tăng liều lượng hạt. Ở liều lượng hạt cao, độ nhớt của dung dịch tăng lên đáng kể cản trở sự hấp phụ protein lên trên bề mặt hạt, dẫn đến hiệu suất hấp phụ protein giảm khi tiếp tục tăng liều lượng hạt nano chitosan. Thứ hai, trong điều kiện thí nghiệm có tốc độ lắc mạnh (250 vòng/phút), khi liều lượng hạt thấp, số lần va chạm giữa các hạt thấp. Khi liều lượng hạt càng tăng, số va chạm có hiệu quả giữa các hạt càng tăng. Kết quả là các hạt dính kết lại với nhau tạo thành tập hợp lớn hơn làm diện tích bề mặt hạt giảm dẫn đến hiệu suất hấp phụ protein giảm. Cũng vậy, hiện tượng tốc độ hấp phụ protein trên hạt nano chitosan tăng đến một mức độ nào đó rồi giảm do các hạt nano chitosan dính kết lại Kết quả và biện luận 82 với nhau cũng được Zhen-Xing Tang [25] tìm thấy khi khảo sát tốc độ hấp phụ protein của hạt nano chitosan theo nhiệt độ và theo pH. Khả năng hấp phụ protein cũng giảm dần từ 2,49 xuống 0,28mg/mg khi liều lượng hạt nano tăng từ 0,25mg đến 2mg. Hiệu suất hấp phụ và khả năng hấp phụ protein khá cao của hạt nano chitosan có lẽ do quá trình hấp phụ thực hiện ở pH 5,5. Giá trị pH này cao hơn giá trị pI của BSA tại điểm đẳng điện là 4,7-4,9 [11] nên tại pH này BSA sẽ mang điện tích âm. Do vậy cơ chế tương tác có thể là do lực hút tĩnh điện giữa phân tử protein mang điện tích âm và hạt nano chitosan mang điện tích dương. Khả năng hấp phụ protein mô hình cao của hạt nano chitosan hứa hẹn đem lại một vật liệu dẫn truyền thuốc, protein… mới, an toàn và hiệu quả hơn.