Nghiên cứu cố định enzyme amylase

ng hấp phụ không đặc trưng các chất từ môi trường phản ứng. Sự định vị enzyme giúp cho dẫn xuất enzyme không tan có tính bền nhiệt cao hơn enzyme tan. Chất mang có tác dụng hạn chế sự biến tính của enzyme trong các dung môi, làm đứt liên kết hydro và liên kết kỵ nước. Ảnh hưởng của pH Điện tích của chất mang có ảnh hưởng đáng kể đến pH tối ưu của enzyme không tan, pH tối ưu của enzyme không tan có thể chuyển dịch phía kiềm hay phía acid so với pH tối ưu của enzyme tan. Ảnh hưởng của tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào: Kích thước lỗ chất mang. Trọng lượng phân tử của cơ chất. Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường vi mô xung quanh enzyme và dung dịch tự do. Những giới hạn khuếch tán cùng hiệu ứng phân phối ảnh hưởng đến những đặc tính động học của quá trình khuếch tán nếu so sánh chúng với những số liệu nhận được đối với enzyme tự do. Điều này làm cho các thông số công nghệ thay đổi, đó là điều cần phải để ý tới khi thiết lập quy mô của quá trình. NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ AMYLASE CỐ ĐỊNH [8, 14, 30, 31] α-amylase cố định Năm 1968, Barker và các cộng sự đã cố định enzyme α-amylase bằng liên kết hóa trị với vi tinh thể cellulose, liên kết hóa trị này bị ảnh hưởng bởi 3-(p-aminophenoxy)-2-hydroxypropyl ethers và 2-hydroxy-3-(p-isothiocyanatophenoxy) propyl ethers của cellulose tùy mức độ thay thế. Hoạt tính enzyme còn lại sau khi cố định chỉ được khoảng 2% – 6%. Enzyme cố định có sự ổn định nhiệt cao hơn enzyme tự do và sau 7 ngày ở nhiệt độ 45oC enzyme cố định còn lại 20% hoạt tính ban đầu. Về khía cạnh tái sử dụng, α-amylase cố định trên cellulose bị mất một lượng lớn enzyme liên kết vật lý trong những lần đầu tái sử dụng, tuy nhiên hoạt tính sau đó mất đi tương đối ít. Năm 1975, Linko và các cộng sự đã nghiên cứu khá kỹ tính chất và kiểu hoạt động của α-amylase từ B. subtilis cố định bằng cách liên kết với carboxymethyl cellulose, hoạt hóa bởi cyanogen bromide. Chất mang này được chọn vì họ thấy rằng khi α-amylase liên kết với carboxymethyl cellulose thì enzyme có tính ổn định cao nhất. Linko và các cộng sự của mình đã dùng chế phẩm α-amylase cố định này thủy phân tinh bột lúa mì ở 72oC trong thiết bị khuấy. Ban đầu, tốc độ phản ứng của enzyme cố định thấp hơn enzyme hòa tan, nhưng sau 1 giờ thì enzyme cố định tạo ra được lượng đường khử cao hơn enzyme hòa tan. So với α-amylase hòa tan, α-amylase cố định tạo ra tương đối nhiều glucose và maltose hơn vào lúc ban đầu. Điều này phù hợp với kết quả thu được từ Ledingham và Hornby, hai nhà nghiên cứu này đã phát hiện ra rằng trong quá trình hoạt động α-amylase cố định tấn công nhiều điểm hơn so với enzyme tự do và chính điều này làm gia tăng quá trình tạo ra glucose. Một nghiên cứu gần đây bởi Boundy và các cộng sự đã quan sát rằng quá trình cố định α-amylase trên phenolformaldehyde nhân tạo bằng phương pháp hấp phụ đã làm thay đổi kiểu hoạt động của enzyme đối với cơ chất tinh bột, từ dạng endo thành dạng exo. Ở trạng thái tự do, α-amylase dễ dàng tiếp xúc vùng bên trong của phân tử tinh bột lớn, khi đó hoạt tính xảy ra hoạt tính endo. Tuy nhiên, quá trình cố định enzyme làm hạn chế hoạt tính ban đầu của nó tác dụng lên vùng bên ngoài của polysaccharide. Cuối cùng, lưu ý liên kết của α-amylase tạo phức chất với các polymer đồng trùng hợp ái nước nhân tạo đã được mô tả bởi Manecke và các cộng sự. Enzyme được kết hợp với một chất đồng trùng hợp nitrate hóa của methacrylic acid, methacrylic acid m-fluoroanilide và divinylbenzene cũng như với chất đồng trùng hợp nitrate hóa của methacrylic acid 4- hoặc 3-fluorostyrene và divinylbenzene. Hoạt tính của enzyme cố định không quá 3% của enzyme tự do. β-amylase cố định β-amylase có giá trị thương mại lớn trong công nghiệp rượu bia, chưng cất và bánh. Agarose là một trong những chất mang phổ biết nhất dùng trong cố định β-amylase. Một trong những ưu điểm đáng chú ý là lỗ xốp lớn và ổn định cơ học cao. Agarose có thể được chuẩn bị ở dạng hạt, khá phù hợp với quá trình dùng cột, phản ứng xúc tác enzyme trong cột như vậy có thể tạo ra tốc độ dòng tốt vì enzyme – hạt cứng. Nhiều phương pháp để gắn kết β-amylase vào agarose đã được mô tả. Vretblawd và Axen đã cố định β-amylase nguồn lúa mạch bằng liên kết hóa trị với Sepharose, trung gian bởi cyclohexyl isocyanide và acetaldehyde. Enzyme cố định còn đến 40% hoạt tính so với β-amylase tự do. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu cũng đã thử nghiệm một số phương pháp liên kết khác nhằm tìm ra phương pháp phù hợp nhất để gắn β-amylase vào agarose. Họ đã sử dụng cyanogen bromide, bis-oxiranes hoặc divinylsulfon dưới những điều kiện pH và nhiệt độ, sản phẩm enzyme cố định thu được có hoạt tính không ổn định. Enzyme β-amylase cố định trên sepharose có pH và độ mạnh ion tương tự như những enzyme tự nhiên khác, tuy nhiên trong lúc bảo quản thì β-amylase – sepharose có khả năng chống sự vô hoạt và trong lúc sử dụng thì hoạt tính tăng rõ rệt. Enzyme β-amylase cố định rất ổn định khi thủy phân tinh bột liên tục trong khoảng thời gian lâu. Ở 45oC, sau 7 tuần β-amylase duy trì được 50% hoạt tính và phần trăm tương ứng ở 23oC là 85%. Từ kết quả thí nghiệm cho thấy nhiệt độ tối ưu của β-amylase cố định là 45oC. Ngoài ra người ta phát hiện rằng cột β-amylase bị vô hoạt có thể phục hồi lại một cách dễ dàng bằng liên kết của enzyme tự nhiên hoạt hóa trong sự có mặt của acetaldehyde và cyclohexylisocyanide. Caldwell và các cộng sự cũng sử dụng agarose làm chất mang để cố định β-amylase bằng phương pháp hấp phụ. Enzyme β-amylase được gắn thông qua tương tác kỵ nước giữa enzyme và hạt liên kết cộng hóa trị với gel sepharose, để các nhánh hexyl được liên kết với cầu ether. Từ kết quả thí nghiệm cố định β-amylase thấy rằng khả năng hấp phụ tăng khi lượng hexyl tăng. Khả năng hấp phụ trên lượng gel chất mang tối đa đạt ở tỷ lệ hexyl : galactose là 0,51 : 1. Hoạt tính tuyệt đối trên một thể tích tương đương 40 mg protein/ml gel cũng giống hoạt tính β-amylase liên kết hóa trị với chất mang như cellulose, acrylic polymer và agarose. Ngoài ra, một số nhà nghiên cứu đã thử cố định β-amylase qua trung gian diazo hoặc isothiocyanate liên kết với các hạt cellulose và polyacrylamide. Mặc dù β-amylase đã được gắn dễ dàng vào những chất mang phù hợp, dẫn xuất acid azide được nối bị vô hoạt và hoạt tính duy trì sau khi nối diazo và isothiocyanate vào polyacrylamide polymers thấp hơn (≈1%) của dẫn xuất cellulose tương ứng (≈3%). Theo những tác giả trên, steric có ảnh hưởng đến hoạt tính thấp của quá trình cố định. β-Amylase cố định không chỉ hoạt tính thấp mà sự ổn định cũng thấp so với β-amylase tự do. Hầu hết quá trình cố định β-amylase đã mô tả trước kia chỉ ra rằng β-amylase có thể dễ dàng được cố định và một số quá trình cố định có được sản phẩm cố định ổn định tương đối cao. Trong sử dụng công nghiệp, β-amylase có tiềm năng sử dụng cao dùng để sản xuất liên tục maltose từ tinh bột. Glucosamylase cố định Glucosamylase là một trong những enzyme công nghiệp quan trọng nhất. Enzyme này được dùng ở quy mô lớn để đường hóa tinh bột thành glucose hoặc syrup trong công nghiệp thực phẩm. Có hơn 40 bài báo đã được xuất bản trong thập kỷ qua, với ý tưởng cố định glucoamylase bằng liên kết hóa trị hoặc hấp phụ vào những chất mang khác nhau. Từ những yêu cầu cần thiết trong công nghiệp như thực hiện quá trình thủy phân ở nhiệt độ cao (≈60oC) và sử dụng quá trình có tính kinh tế hơn, đã thúc đẩy nghiên cứu quá trình cố định glucoamylase. Để cố định glucoamylase, các nhà nghiên cứu đã thực hiện nhiều phương pháp cố định như: phương pháp liên kết hóa trị, phương pháp nhốt và phương pháp hấp phụ. Đối với phương pháp liên kết hóa trị, cellulose và dẫn xuất của cellulose được xác nhận là chất mang tốt để cố định enzyme trong nhiều trường hợp vì bản chất ưu nước của chúng, cấu trúc tương đối không hạn chế và các nhóm hydroxyl có tiềm năng để phản ứng. Mặc dù liên kết của glucoamylase và cellulose tương đối ổn định, nhưng thực tế khi tái sử dụng hoặc dùng liên tục thì glucoamylase cố định bị mất một phần lớn khả năng xúc tác. Trong phương pháp nhốt, enzyme cố định ổn định nhiệt cao hơn so với enzyme tự do. Nhưng gel lại gây cản trở các phân tử cơ chất phân tử lượng lớn tiếp xúc với chất xúc tác. Đối với phương pháp hấp phụ, quá trình cố định vừa đơn giản lại có tính kinh tế. Smiley và các cộng sự đã cố địn enzyme lên dẫn xuất DEAE-cellulose bằng phương pháp hấp phụ vật lý, hấp phụ một phần ion. DEAE-cellulose là một chất mang rắn chắc và enzyme bị hấp phụ chủ yếu bởi lực tĩnh điện, vì thế liên kết không chặt và khó để ứng dụng thực tế. Chính vì thế một số tác giả người Trung Quốc đã đề nghị DEAE-Saphadex là chất mang phù hợp nhất để hấp phụ glucoamylase. Gần đây, Caldwell và các cộng sự đã cố định glucoamylase bằng cách hấp phụ lên hexyl-Sepharose; hoạt tính còn lại sau khi cố định cao. Sự ổn định nhiệt của enzyme cố định thấp hơn của enzyme hòa tan, nhưng có một sự lưu ý là sự ổn định nhiệt tăng trong sự có mặt của cơ chất. Bảng 1.2: Một số nghiên cứu cố định glucoamylase Phương pháp cố địnhChất mangHoạt tính còn lạiTác giảLiên kết hóa trịCellulose, nylon hoặc thủy tinh16 – 25%Baker và các cộng sựNhốtPolyacrylamide22%Gruesback và RasePolyacrylamide98%Beck và RaseN-polyvinylpyrolidone45%Waton và các cộng sựHấp phụDEAE-cellulose16 – 55%Smiley và các cộng sựDEAE-Saphadex35 – 45%Nhóm người Trung QuốcHexyl-Sepharose68%Caldwell và các cộng sựNgoài ra cũng có nhiều phương pháp khác để cố định glucoamylase được thực hiện, nhưng những phương pháp này vẫn chưa cho kết quả tin cậy. Mặc dù có một số nghiên cứu cố định glucoamylase có ý tưởng tốt, nhưng vẫn còn nhiều điều cần phải nghiên cứu thêm về quá trình thực hiện, các yếu tố mô tả sự ổn định của enzyme và sử dụng enzyme cố định. Dưới những điều kiện của quá trình thực tế rất khó khăn để thu được dextrose như glucoamylase hòa tan. Khi nồng độ enzyme cao, có sự tác động lẫn nhau của phản ứng thủy phân và transferase tạo thành isomlatose trong hệ thống cố định, điều này rất quan trọng và khá khác với kết quả của quá trình gián đoạn sử dụng glucoamylase hòa tan, ở đó nồng độ enzyme tương đối thấp trong suốt chu kỳ phản ứng. Nghiên cứu trong tương lai về những khía cạnh cơ bản của cơ chất phản ứng xúc tác bởi enzyme glucoamylase cố định có lẽ tạo ra những khái niệm mới, những khái niệm này cuối cùng sẽ cung cấp thông tin cơ bản cần cho công nghiệp sản xuất tinh thể dextrose. Pullulanase cố định Pullulanase có nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghiệp. Ví dụ, trong công nghiệp tinh bột bao gồm sản xuất amylose khối lượng phân tử thấp và maltose tinh khiết cao, sử dụng pullulanase như những chất hỗ trợ hiệu quả trong quá trình ổn định dung dịch tinh bột độ nhớt thấp cũng như sản xuất maltotriose hiệu suất cao từ pullulan. Pullulanase cũng xuất hiện như là một carbohydrase sử dụng trong rượu bia từ ngũ cốc không phải malt. Quan tâm về tiềm năng của enzyme này và những ích lợi của enzyme cố định, Martensson and Mosbach liên kết hóa trị pullulanase vào bên trong polymer đồng trùng hợp của acrylamide và acrylic acid bằng cách sử dụng carbodiimide tan trong nước. Hiệu suất cố định đạt được 34%. Quá trình cố định trong sự có mặt của pullulan làm tăng gấp 5 lần hoạt tính khi cơ chất không có mặt. Tuy nhiên, điều này không làm tăng sự ổn định của enzyme. Pullulanase cố định được dùng trong cột để tách nhánh amylopectin tạo ra amylose có khối lượng phân tử thấp. Sử dụng pullulanase không tan ở quy mô lớn sẽ yêu cầu những nghiên cứu trong tương lai nhắm vào sự ổn định của enzyme pullulanase dạng cố định. Một ứng dụng của pullulanase cố định trong công nghiệp tinh bột là tách nhánh amylopectin thành amylose có khối lượng phân tử thấp, rồi sau đó có thể sử dụng β-amylase cố định để thủy phân thành maltose. Hệ thống 2 enzyme cố định: β-amylase và Pullulanase. Từ khi β-amylase và pullulanse được cố định vào chất mang acrylic (Bio-Gel GM 100) bằng liên kết hóa trị, chất mang được hoạt hóa bởi carbodiimide, điều này đã tạo điều kiện để thiết kế ra quá trình cố định hai enzyme vào cùng một bề mặt chất mang. Hệ thống hai enzyme cố định, trong đó các enzyme phối hợp thực hiện, sản phẩm của enzyme đầu tiên là cơ chất cho enzyme thứ hai, vì thế thuận tiện cho hoạt động của enzyme sau. Hơn thế nữa, sự gắn kết các enzyme vào cùng một bề mặt chất mang được ưu tiên, hơn là sử dụng hỗn hợp của hai quá trình cố định riêng lẽ, β-amylase cố định có sự ổn định cao hơn ở vị trí nồng độ protein cao. Quá trình cố định được thực hiện thành công trong hai bước bởi vì điều kiện cố định tối ưu khác nhau của hai enzyme. Hiệu suất cố định của protein β-amylase và protein pullulanase là 40% và 38%. Hoạt tính còn lại lần lượt của β-amylase và pullulanase là 22% và 32%. Điều kiện hoạt động tối ưu của hệ enzyme này là: pH 6, 45oC. Hệ thống vẫn hoạt động ổn định sau 50 giờ, ngược lại đối với enzyme tự do sau 20 giờ bị mất toàn bộ hoạt tính. Trong công nghiệp tinh bột, sử dụng hai enzyme này có khả năng biến đổi hoàn toàn tinh bột, tạo thành sản phẩm giàu maltose. CHITOSAN [5, 18, 25] Giới thiệu về chitosan Chitosan là một polysaccharide gồm các phân tử ᴅ-β(1,4) glucosamine. Chitosan là thành phần quan trọng trong vỏ của động vật giáp xác, bộ xương ngoài của côn trùng và thành tế bào của nấm, nó có tác động tạo khung vững chắc và ổn định. Chitosan là dẫn xuất quan trọng của chitin, được thu bằng cách khử acetyl của chitin khi xử lý với dung dịch KOH hay NaOH đậm đặc, và vì vậy chitosan là một polymer đồng trùng hợp của N-acetyl-ᴅ-glucosamine và ᴅ-glucosamine, chứa một lượng tối đa 30% các nhóm acetyl. Công thức hóa học của chitosan (C6H11NO4)n với n trong khoảng 700 – 4500: Có 2 chỉ số quan trọng nhất của chitosan là mức độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử trung bình. Độ deacetyl hóa là độ chuyển hóa chitin thành chitosan. Thông thường các chitosan có độ deacetyl hóa 85 – 95%, đặc biệt sản phẩm chitosan có độ deacetyl hóa khoảng 45 – 55% tan tốt trong nước nên gọi là chitin tan. Trọng lượng phân tử trung bình của chitosan là một đại lượng có ý nghĩa thống kê, nó được xác định thông qua độ nhớt dung dịch chitosan, có giá trị biến đổi từ 10.000 – 500.000 tùy theo mỗi loại chitosan khác nhau. Hai chỉ số này ảnh hưởng trực tiếp đến các tính chất hóa lý, hoạt tính sinh học và ứng dụng của chitosan. Tính chất của chitosan: Chitosan có tác dụng kháng khuẩn khá tốt, nhất là trên các vi khuẩn gây bệnh như E. coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa và tác dụng diệt nấm nhất là nấm Candida albicans. Chitosan có khả năng hấp phụ lớn. Chitosan không tan trong nước, nhưng nhờ sự có mặt của những nhóm amino làm cho nó có thể tan trong dung dịch acid loãng có pH thấp khoảng 6,5. Chứa các nhóm amino và hydroxyl hoạt động. CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU NGUYÊN LIỆU Enzyme α-amylase Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng enzyme α-amylase của hãng Novo (termamyl 120L), dạng lỏng. Enzyme này là một α-amylase bền nhiệt, sản xuất từ vi khuẩn Bacillus licheniformis. Enzyme α-amylase là một endo–amylase, thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong phân tử amylose, amylopectin tạo các dextrin có phân tử lượng thấp hơn, maltose và glucose. Tính chất: pHopt = 6 – 6,5. Topt = 90oC. Chitosan Nguồn gốc: Đại học thủy sản Nha Trang. Thông số hóa lý: Độ ẩm: 15,92%. Độ tro: 2,0675%. Chỉ số deacetyl hóa (chỉ số DD): 75%. Phân tử lượng trung bình: 5,187x104 đvC. HÓA CHẤT SỬ DỤNG NaOH, Na2CO3, CuSO4.5H2O, KNaC4H4O6, thuốc thử Folin, Albumin, thuốc thử DNS, NaH2PO4, Na2HPO4.12H2O. Glutaraldehyde do Merck sản xuất có nồng độ ban đầu là 25%. DỤNG CỤ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU Máy đo quang phổ hấp thu UV – Vis Thermo Spectronic. Máy khuấy từ Magnetic Stirrer HANNA, BIBBY. Máy đo pH Mettler Toledo. Bể điều nhiệt Gallenkamp No.WF250. Cân 4 số lẻ OHAUS PA214, tủ sấy, tủ lạnh…. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sơ đồ nghiên cứu pHopt Topt Vmax, Km Hiệu quả tái sử dụng Thể tích enzyme Thời gian cố định enzyme Vận tốc lắc Kích thước chitosan Nồng độ glutaraldehyde TẠO CHẾ PHẨM ENZYME CỐ ĐỊNH NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ENZYME CỐ ĐỊNH TỐI ƯU HAI YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG NHIỀU NHẤT KHẢO SÁT NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN QUÁ TRÌNH CỐ ĐỊNH CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH α-AMYLASE Phương pháp cố định enzyme Để tìm ra phương pháp cố định α-amylase thích hợp, chúng tôi đã tiến hành so sánh hai phương pháp cố định α-amylase sau: Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị. Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và kết hợp giữa các enzyme. α-amylase Glutaraldehyde Chitosan Hoạt hóa Ngâm Nước Rửa Cố định Rửa Chitosan đã cố định α-amylase Phương pháp 1: Cố định enzyme bằng liên kết cộng hóa trị Thuyết minh sơ đồ: Trong tất cả các thí nghiệm, khối lượng chitosan được lấy cố định là 1g. Ngâm: Quá trình ngâm nhằm để cho chitosan trương nở hoàn toàn, làm tăng khả năng liên kết với glutaraldehyde và tăng khả năng hấp phụ enzyme. Hoạt hóa: Quá trình hoạt hóa nhằm tạo điều kiện để nhóm CHO của glutaraldehyde liên kết với nhóm NH2 của chitosan. Cho vào erlen chứa 1g chitosan 10ml glutaraldehyde 2%. Erlen được lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: Sau khi glutaraldehyde đã liên kết với chitosan, chúng tôi tiến hành rửa chất mang bằng nước cất, nhằm mục đích loại bỏ những glutaraldehyde không liên kết với chitosan. Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase liên kết với chitosan qua trung gian của cầu nối glutaraldehyde, ngoài ra vẫn xảy ra quá trình chitosan hấp phụ α-amylase. Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml rồi cho vào erlen chứa chitosan đã được rửa sạch. Erlen được lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: sau khi đã gắn kết α-amylase vào chitosan, chúng tôi tiến hành rửa để loại bỏ những enzyme không liên kết, nước rửa sẽ được định mức lên 50ml. Sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein enzyme tan trong nước rửa. Từ đó sẽ xác định được hiệu suất cố định enzyme. Tiếp sau đó xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của α-amylase cố định.  Phương pháp 2: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và tạo liên kết giữa các enzyme Chitosan α-amylase Cố định Ngâm Nước Glutaraldehyde Rửa Liên kết enzyme Rửa Chitosan đã cố định α-amylase Thuyết minh sơ đồ: Ngâm: Quá trình ngâm nhằm để cho chitosan trương nở hoàn toàn, làm tăng khả năng liên kết với glutaraldehyde và tăng khả năng hấp phụ enzyme. Cố định: Quá trình này sẽ tạo điều kiện để α-amylase được hấp phụ vào cấu trúc lỗ xốp của chitosan. Lấy 0,5ml α-amylase định mức thành 25ml bằng nước cất. Cho dung dịch enzyme vào erlen chứa chitosan đã trương nở, lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: Sau khi đã gắn α-amylase vào chitosan, chúng tôi tiến hành rửa để loại bỏ những enzyme không liên kết, nước rửa sẽ được định mức lên 50ml. Sau đó tiến hành xác định hàm lượng protein enzyme tan trong nước rửa. Liên kết enzyme: Quá trình này nhằm tạo điều kiện để nhóm CHO của glutaraldehyde liên kết với nhóm NH2 của α-amylase. Cho vào chitosan đã hấp phụ α-amylase 10ml glutaraldehyde 2%, lắc trong 2 giờ với vận tốc lắc 100 vòng/phút. Rửa: Rửa chất mang bằng nước cất, nhằm mục đích loại bỏ những glutaraldehyde không liên kết. Xác định hiệu suất cố định α-amylase. Xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của α-amylase cố định. Các thông số được chọn để so sánh: Hiệu suất cố định enzyme. Hoạt tính còn lại của enzyme cố định. Sau khi đã chọn được phương pháp cố định, chúng tôi tiến hành xác định: Khảo sát các yếu tố ảnh hướng quá trình cố định. Tối ưu hóa hai yếu tố ảnh hưởng nhiều nhất. Xác định pHopt, Topt. Xác định hệ số phương trình động học của phản ứng enzyme: Vmax và Km. Khảo sát khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định enzyme Quá trình cố định được thực hiện ở nhiệt độ 30oC, trong erlen 250ml. Mỗi thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần để kiểm tra sự khác nhau có nghĩa theo phương pháp ANOVA. Ở thí nghiệm này chúng tôi khảo sát 5 yếu tố ảnh hưởng đến quá trình cố định gồm có: thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc, kích thước chitosan và nồng độ glutaraldehyde. Khối lượng chitosan được cố định là 1g. Để khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố, ban đầu chúng tôi cho 5 yếu tố các giá trị sau: Thể tích enzyme: 0,5ml. Thời gian cố định: 2 giờ. Vận tốc lắc đảo: 100 vòng/phút. Kích thước chitosan: 2,8mm. Nồng độ glutaraldehyde 2% Khi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của một yếu tố, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, còn những yếu tố còn lại sẽ được cố định. Sau đó, khi khảo sát ảnh hưởng của yếu tố tiếp theo, chúng tôi sẽ thay đổi yếu tố đó, đồng thời lấy giá trị tối ưu của yếu tố vừa khảo sát và giữ cố định những yếu tố còn lại. Khảo sát thể tích enzyme sử dụng Thể tích enzyme thay đổi như sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ml. Giá trị các yếu tố khác được giữ cố định. Khảo sát thời gian cố định enzyme Lần lượt thay đổi thời gian cố định: 1, 2, 3, 4, 5 giờ. Thể tích enzyme lấy từ thí nghiệm trước. Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định. Khảo sát vận tốc lắc đảo Lần lượt thay đổi vận tốc lắc đảo: 0, 50, 100, 150, 200 vòng/phút. Thể tích enzyme và thời gian lấy từ thí nghiệm trước. Giá trị của các yếu tố khác vẫn được giữ cố định. Khảo sát kích thước của chitosan Lần lượt thay đổi kích thước chitosan như sau: 0,35; 0,7; 1,4; 2,8 mm. Giá trị các yếu tố khác giữ cố định. Giữ cố định yếu tố về glutaraldehyde. Các yếu tố còn lại là những giá trị tối ưu của các thí nghiệm trước. Khảo sát nồng độ glutaraldehyde Nồng độ glutaraldehyde thay đổi như sau: 1%, 2%, 3%, 4%, 5%. Thể tích enzyme, thời gian cố định, vận tốc lắc đảo và kích thước chitosan là những giá trị tối ưu của những thí nghiệm trước. Tối ưu hóa quá trình cố định Sau khi có kết quả về sự ảnh hưởng của 5 yếu tố công nghệ đến quá trình cố định, chúng tôi chọn ra 2 yếu tố tác động mạnh nhất đến hiệu suất cố định và tiến hành tối ưu hóa theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2, có cấu trúc tâm. Phương trình hồi quy được xây dựng bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm trực giao cấp 2 có tâm. Vì chúng tôi tối ưu 2 yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu nên số thí nghiệm được tính như sau: N = 2k + 2k + no Trong đó: k: là số yếu tố ảnh hưởng đến hàm mục tiêu. 2k = 4: số thí nghiệm ở nhân phương án. 2k = 4: số thí nghiệm tại giao điểm của đường tròn với các trục. no = 1: số thí nghiệm ở tâm phương án cần phải có (tối thiểu bằng 1), Vì vậy tổng số thí nghiệm là: N = 2k + 2k + no = 22 + 2.2 + 1 = 9 Để kiểm tra sự khác không có nghĩa của các hệ số trong phương trình hồi quy, chúng tôi thực hiện thêm 2 thí nghiệm tại tâm. Bảng 2.1: Ma trận quy hoạch cấu trúc có tâm, hai yếu tố Số thí nghiệmXoX1X2X1X2X12 - λX22 - λYSố thí nghiệm ở nhân: 2k1+1-1-1+11- λ1- λ2+1+1-1-11- λ1- λ3+1-1+1-11- λ1- λ4+1+1+1+11- λ1- λSố thí nghiệm ở các điểm giao với trục 2k5+1-α00α 2-λ-λ6+1+α00α 2-λ-λ7+10-α0-λα 2-λ8+10+α0-λα 2-λSố thí nghiệm ở tâm9+1000-λ-λSố thí nghiệm ở tâm làm thêm10+1000-λ-λ11+1000-λ-λVới: α: cánh tay đòn được chọn phụ thuộc vào số yếu tố k và số thí nghiệm ở tâm no Xo: là biến ảo ứng với hệ số bo. X1: là biến mã hóa của Z1 (Z1 là yếu tố ảnh hưởng thứ nhất). X2: là biến mã hóa của Z2 (Z2 là yếu ảnh hưởng thứ hai). Y: hàm mục tiêu, hiệu suất cố định protein enzyme (%). (-1): mức dưới (0): tâm (+1): mức trên Phương trình hồi quy có dạng: Y = bo + b1X1 + b2X2+ b12X1X2+ b11X12+ b22X22 Ngoài ra, còn có thể sử dùng phần mềm Modde 5 để thiết kế thí nghiệm, từ đó xác định phương trình hồi quy và giá trị cực đại. Xác định tính chất enzyme cố định: Xác định pH tối ưu: Tiến hành xác định hoạt tính của enzyme tan và enzyme cố định ở nhiệt độ 50oC, ứng với pH có giá trị thay đổi như sau: 5,5; 6; 6,5; 7; 7,5; 8. Dung dịch tinh bột có pH được điều chỉnh bằng dung dịch đệm phosphate. Từ đó xác định pH tối ưu. Xác định nhiệt độ tối ưu: Nhiệt độ tối ưu được xác định bằng cách đo hoạt tính α-amylase ở những nhiệt độ khác nhau tại giá trị pH tối ưu. Những nhiệt độ khảo sát: 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90. Những giá trị nhiệt độ này được điều khiển bằng bể điều nhiệt. Xác định hệ số phương trình động học của phản ứng enzyme Tinh bột được chuẩn bị với nồng độ từ 5 – 25%. Quá trình thủy phân xảy ra ở điều kiện nhiệt độ và pH tối ưu. Từ đây chúng tôi sẽ xác định nồng độ tinh bột mà phản ứng thủy phân vẫn tuân phương trình Michaelis – Menten. Sau đó chúng tôi sẽ tiến hành thí nghiệm ứng với những nồng độ tinh bột mà phản ứng thủy phân tuân theo phương trình Michaelis – Menten để xác định Km và Vmax của α-amylase cố định và α-amylase tự do. Phương trình động học Michaelis – Menten có dạng: Trong đó: Km được gọi là hằng số Michaelis. V: là vận tốc phản ứng. Vmax: là vận tốc cực đại. [S]: là nồng độ cơ chất. Vì để biểu diễn theo phương trình này cần tiến hành nhiều thí nghiệm để đạt sự chính xác, nên Lineaweaver và Burk đã cải tiến phương trình này như sau: Phương trình có dạng đường thẳng, cắt trục hoành tại điểm  QUOTE và cắt trục tung tại điểm . Xác định hiệu suất cố định enzyme Hiệu suất cố định protein enzyme Hiệu suất của quá trình cố định được tính theo công thức sau: Với: P: là hàm lượng protein enzyme có trong thể tích enzyme ban đầu (mg) P1: là hàm lượng protein enzyme không liên kết (mg). Phương pháp xác định protein tan Để xác định nồng độ protein ta sử dụng phương pháp Lowry. Phương pháp này dựa vào phản ứng Biuret, trong đó các liên kết peptide của protein phản ứng với Cu trong môi trường kiềm để tạo ra Cu+, ion Cu+ tạo ra sẽ phản ứng với thuốc thử Folin tạo ra dung dịch màu xanh tím, cường độ màu phụ thuộc vào thành phần tyrosin và tryptophan trong protein. Trước tiên để xác định nồng độ protein tan trong mẫu thí nghiệm, ta sẽ phải xây dựng đường chuẩn bằng một loại protein tinh khiết thường là albumin. Từ đường chuẩn, khi có giá trị mất độ quang sẽ xác định được nồng độ protein tan. Giá trị mật độ quang được đo bằng máy quang phổ hấp thu UV – Vis tại bước sóng λ = 750nm. Phương pháp này được sử dụng chính xác nhất với những dung dịch có nồng độ protein từ 0,01 đến 1mg/ml. Xây dựng đường chuẩn: Hóa chất: Pha dung dịch albumin chuẩn có nồng độ: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5mg/ml. Dung dịch A: Cân 4g NaOH và 20g Na2CO3 pha trong 1000ml nước cất. Dung dịch B: Cân 0,5g CuSO4.H2O pha trong dung dịch Natri-Kali Tartrat 1%. Dung dịch C: Hỗn hợp của hai dung dịch A và B theo tỉ lệ 50 : 1. Thuốc thử Folin pha loãng bằng nước cất tỉ lệ: 1:3. Cách tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml mẫu và 5ml dung dịch C, để yên trong 10 phút. Cho vào 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút. Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 750nm. Từ đó lập được đường chuẩn C = f(A). C (mg/ml) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 A Hình 2.1: Đường chuẩn albumin Xác định hoạt tính riêng và hoạt tính còn lại của enzyme α-amylase tự do và cố định Hoạt tính riêng của enzyme α-amylase Hoạt tính riêng của enzyme được xác định theo phương pháp dùng phản ứng với DNS, để định lượng đường khử tạo từ quá trình thủy phân tinh bột dưới hoạt động của enzyme. Từ đó xác định hoạt tính enzyme. Trong thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme, chúng tôi dùng tinh bột có nồng độ 1%. Cân 1g tinh bột cho vào 10ml nước cất và xử lý nhiệt ở 100oC cho đến khi tinh bột được hòa tan. Sau đó định mức dung dịch trên thành 100ml bằng dung dịch đệm phosphate pH 6. Cách tiến hành xác định hoạt tính enzyme hòa tan: Pha loãng enzyme. Cho vào erlen: 25ml hồ tinh bột 1% ở pH 6 ủ ở 50oC. Sau khi mẫu đạt 50oC cho vào 1ml enzyme đã pha loãng, ủ 10 phút. Sau khi thủy phân, rút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml DNS. Mẫu trắng: 1ml nước và 2ml DNS. Đun cách thủy các ống nghiệm ở 100oC trong 5 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng nước lạnh, rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất. Lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Cách tiến hành xác định hoạt tính enzyme cố định: Cho vào erlen: 1g chế phẩm α-amylase cố định ủ ở 50oC. Sau đó cho vào 25ml hồ tinh bột 1% ở pH 6 ủ 10 phút. Sau khi thủy phân, lọc để thu dung dịch đường, định mức lên 100ml. Rút 1ml mẫu cho vào ống nghiệm đã chứa sẵn 2ml DNS. Mẫu trắng: 1ml nước và 2ml DNS. Đun cách thủy các ống nghiệm ở 100oC trong 5 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng nước lạnh, rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất. Lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Xây dựng đường chuẩn: Hóa chất: Pha các dung dịch glucose chuẩn có nồng độ: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1mg/ml. Thuốc thử DNS. Cách tiến hành: Cho vào ống nghiệm 1ml mẫu và 2ml thuốc thử DNS. Mẫu trắng: 1ml nước và 2ml DNS. Đun cách thủy các ống nghiệm ở 100oC trong 5 phút. Sau đó làm nguội nhanh bằng nước lạnh, rồi thêm vào mỗi ống nghiệm 10ml nước cất. Lắc đều và đo mật độ quang ở bước sóng 540nm. Từ đó lập được đường chuẩn C = f(A). C (mg/ml) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 A Hình 2.2: Đường chuẩn glucose Công thức tính hoạt tính riêng của α-amylase:  QUOTE  Với: Ur: là hoạt tính riêng của α-amylase (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase) m1: hàm lượng đường khử trong mẫu sau khi thủy phân (mg). m2: hàm lượng protein α-amylase đã dùng để thủy phân (mg). Hoạt tính còn lại của chế phẩm enzyme cố định: Với: Urcđ là hoạt tính riêng của α-amylase cố định (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase cố định ). Urht là hoạt tính riêng của α-amylase hòa tan (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase hòa tan).  CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN CHẾ PHẨM ENZYME α-AMYLASE TỰ DO Bảng 3.1: Hàm lượng protein và hoạt tính riêng của α-amylase tự do Hàm lượng protein (mg/ml)Hoạt tính riêng (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase tự do)50,0920,86 CHỌN PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH ENZYME Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau: % Hoạt tính còn lại (%) Hiệu suất cố định (%) Hình 3.1: So sánh hiệu quả các phương pháp cố định Dựa vào kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy hiệu suất cố định của phương pháp 2 cao hơn phương pháp 1 nhưng không nhiều, tuy nhiên hoạt tính enzyme cố định trong phương pháp 1 lại cao hơn phương pháp 2. Đối với phương pháp 1, ban đầu nhóm NH2 của chitosan sẽ được chuyển đổi thành nhóm CHO bằng cách hoạt hóa chitosan bằng glutaraldehyde, sau đó khi cho enzyme vào, thì nhóm NH2 trong phân tử α-amylase sẽ liên kết với nhóm CHO đồng thời phân tử enzyme cũng bị hấp phụ vào cấu trúc lỗ xốp của chitosan. Hấp phụ Phản ứng cộng hóa trị Hình 3.2: Cố định enzyme bằng phương pháp liên kết hóa trị Ngược lại, trong phương pháp 2, ban đầu chất mang chitosan chỉ tương tác hấp phụ enzyme vào cấu trúc lỗ xốp, sau đó khi cho glutaraldehyde vào, thì nhóm CHO hoạt động của glutaraldehyde sẽ liên kết với nhóm NH2 của enzyme và của chitosan. Dẫn đến kết quả là giữa các enzyme sẽ liên kết với nhau, đồng thời liên kết với chitosan. Liên kết giữa các enzyme Hấp phụ Hình 3.3: Cố định enzyme bằng phương pháp hấp phụ và liên kết các enzyme Từ kết quả của quá trình cố định, chúng tôi nhận thấy rằng ở phương pháp 2, các enzyme liên kết chặt chẽ với chất mang hơn. Điều này rất có lợi trong quá trình rửa cũng như trong khi chế phẩm α-amylase cố định hoạt động sẽ hạn chế enzyme thất thoát ra khỏi hệ thống cố định. Đồng thời enzyme sẽ ổn định hơn trong suốt quá trình hoạt động. Nhưng vấn đề ở đây, do liên kết ở phương pháp 2 nhiều hơn so với phương pháp 1, điều này có thể dẫn đến sự thay đổi cấu hình không gian của enzyme, làm biến đổi trung tâm hoạt động của α-amylase. Điều này làm cho chế phẩm α-amylase cố định ở phương pháp 2 có hoạt định thấp hơn nhiều so với phương pháp 1. Vì lý do này, chúng tôi quyết định chọn phương pháp 1 – Cố định α-amylase bằng phương pháp cộng hóa trị. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ CÔNG NGHỆ ĐẾN HIỆU SUẤT CỐ ĐỊNH Trong phần này, chúng tôi sử dụng phương pháp thực nghiệm cổ điển để khảo sát sự ảnh hưởng của từng yếu tố công nghệ đến hiệu suất cố định. Quá trình được thực hiện theo mục 2.4.3. Từ đó chúng tôi sẽ thu được những giá trị phù hợp của từng yếu tố công nghệ. Khảo sát thể tích enzyme sử dụng Trong thí nghiệm này, giá trị của các yếu tố cố định α-amylase : Thể tích enzyme thay đổi: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5ml. Thời gian cố định: 2 giờ. Vận tốc lắc đảo: 100 vòng/phút Kích thước chitosan: 2,8mm. Nồng độ glutaraldehyde: 2%  Sau khi thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu được kết quả như sau: Hiệu suất cố định (%) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Thể tích enzyme sử dụng (ml) Hình 3.4: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên hiệu suất cố định Lượng enzyme gắn vào chitosan (mg) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 Thể tích enzyme sử dụng (ml) Hình 3.5: Ảnh hưởng của thể tích enzyme sử dụng lên lượng enzyme gắn vào chitosan Bảng 3.2: Hoạt tính riêng của các mẫu α-amylase cố định tương ứng với những thể tích enzyme sử dụng khác nhau Enzyme sử dụng (ml)Hoạt tính riêng (đơn vị hoạt độ/mg protein α-amylase cố định)0,110,05ab ± 0,10,210,19ac ± 0,150,39,97b ± 0,130,410,18ac ± 0,050,510,25c ± 0,09Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P ttrabo52,550,6778,432,57Nhậnb1-6,710,5312,662,57Nhậnb25,330,5310,062,57Nhậnb120,500,660,782,57Loạib11-9,700,8211,832,57Nhậnb22-9,170,8211,182,57NhậnTrong đó: sb: là phương sai của hệ số trong phương trình hồi quy. t: ý nghĩa của các hệ số phương trình hồi quy kiểm định theo chuẩn Student. ttra: giá trị tra bảng phân bố student với α = 0,05. Từ kết quả ở bảng 3.6, chúng tôi thấy rằng các biến đều ảnh hưởng đến hiệu suất cố định trừ X1X2. Nên phương trình hồi quy theo biến mã hóa sẽ có dạng sau: Y = 52,55 – 6,71X1 + 5,33X2 – 9,7X12 – 9,17X22 Phương trình hồi quy theo biến thực: Y = -20,17 + 320,9Z1 + 42,01Z2 – 970Z12 – 9,17Z22 Khi sử dụng phần mềm Modde 5 để chạy kết quả, chúng tôi cũng thu được kết quả tương tự. Để kiểm tra sự tương thích của phương trình hồi quy với mô hình, chúng tôi kiểm tra theo tiêu chuẩn Fisher. Dựa vào kết quả của bảng phân tích ANOVA, chúng tôi có giá trị F từ kết quả thực nghiệm là 123,083 trong khi đó giá trị tra bảng của F(0,05;5;5) = 5,05. Nên Fthực nghiệm > F(0,05;5;5), cho nên kết quả có ý nghĩa thống kê ở mức P < 0,05 và phương trình hồi quy có ý nghĩa cũng như mô hình rất đáng tin cậy. Khi dựng phương trình hồi quy trên hệ trục không gian ba chiều bằng phần mềm Modde 5 ta có: Hình 3.10: Ảnh hưởng của thể tích enzyme và thời gian cố định lên hiệu suất cố định Chiếu đồ thị xuống mặt phẳng (thể tích enzyme, thời gian cố định), chúng tôi có: Hình 3.11: Đồ thị vòng dự đoán kết quả quy hoạch thực nghiệm Tương tác giữa thể tích enzyme sử dụng và thời gian cố định là đường cong có cực đại. Cả hai yếu tố này đều ảnh hưởng trực tiếp lên hiệu suất cố định α-amylase. Dựa vào phương trình hồi quy, tại điều kiện tối ưu thể tích enzyme sử dụng là 0,17ml và thời gian cố định là 2,3 giờ, hiệu suất cố định α-amylase cực đại là 54,11%. Như vậy, hiệu suất cố định protein α-amylase trên chất mang chitosan đạt cao nhất tại những giá trị sau: Thể tích enzyme: 0,17ml. Thời gian cố định: 2,3 giờ. Vận tốc lắc: 150 vòng/phút. Kích thước chitosan: 0,7mm. Nồng độ glutaraldehyde: 4%. KHẢO SÁT TÍNH CHẤT CỦA α-AMYLASE CỐ ĐỊNH Ảnh hưởng của pH Để nghiên cứu sự ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme cố định, chúng tôi tiến hành thay đổi giá trị pH của môi trường phản ứng từ 5,5 – 8 bằng dung dịch đệm phosphat và xác định hoạt tính riêng ở 50oC. Thí nghiệm được tiến hành song song với enzyme tự do. Và chúng tôi thu được kết quả sau: Bảng 3.10: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định pHHoạt tính (đơn vị hoạt tính/mg protein α-amylase)Hoạt tính còn lại (%)α-amylase tự doα-amylase cố định5,518,72a ± 0,199,10a ± 0,0848,58620,86b ± 0,1410,27b ± 0,1249,236,520,18c ± 0,0710,87c ± 0,1353,88717,97d ± 0,1311,17c ± 0,0462,127,516,77e ± 0,2310,18b ± 0,3260,70813,06f ± 0,049,40a ± 0,1971,99Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05) Hoạt tính tương đối (%) 8,5 7,5 5,5 6,5 pH Hình 3.12: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định Từ đồ thị 3.12, chúng tôi xác định được pH tối ưu của enzyme tự do khoảng 6 và của enzyme cố định là khoảng 7 điều này chứng tỏ rằng pHopt của enzyme cố định đã dịch chuyển về phía kiềm so với enzyme tự do. Nguyên nhân của sự thay đổi pH có thể là do ảnh hưởng điện tích của môi trường xung quanh trung tâm hoạt động của α-amylase. Ngoài ra, từ đồ thị chúng tôi cũng nhận thấy enzyme cố định ổn định trong khoảng pH hoạt động rộng hơn so với enzyme tự do. Kết quả về sự chuyền dời pHopt sang vùng kiềm và ổn định trong khoảng pH rộng cũng phù hợp với kết quả của một số tác giả như Saiyavit Varavinit (2001) khi cố định α-amylase trên cellulose, Min-Yun Chang và Ruey-Shin Juang (2004) khi cố định α-amylase trên hợp chất chitosan-đất sét. Ảnh hưởng của nhiệt độ Từ thí nghiệm trên, chúng tôi xác định được pHopt của enzyme cố định, và giá trị pH này được dùng để khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme. Thí nghiệm được chúng tôi tiến hành như mục 2.4.5.2. Và kết quả thu được là: Hoạt tính tương đối (%) Nhiệt độ (oC) Hình 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của α-amylase tự do và cố định Bảng 3.11: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính α-amylase tự do và cố định pHHoạt tính (đơn vị hoạt tính/mg protein α-amylase)Hoạt tính còn lại (%)α-amylase tự doα-amylase cố định6018,38a ± 0,1212,31a ± 0,19676519,55b ± 0,5514,59b ± 0,1974,627020,50c ± 0,1715,13c ± 0,0773,787523,09d ± 0,3116,17d ± 0,0670,058024,86e ± 0,1216,09d ± 0,0864,648526,21f ± 0,1115,63e ± 0,159,649030,58g ± 0,2314,74b ± 0,1548,2Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05)Từ kết quả trên, Topt của enzyme tự do là khoảng 90oC trong khi α-amylase cố định hoạt động tốt trong khoảng 75 – 80oC. Chứng tỏ nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định đã giảm so với enzyme tự do. Đồng thời dựa vào đồ thị chúng tôi cũng xác nhận enzyme cố định có khoảng nhiệt độ ổn định cao hơn so với enzyme tự do. Hiện nay, đã có nhiều nghiên cứu thực hiện cố định α-amylase trên nhiều chất mang với nhiều loại phương pháp khác nhau (bảng 3.12), hầu hết các tác giả đều có chung một kết quả là nhiệt độ tối ưu của α-amylase cố định đều giống hoặc cao hơn so với α-amylase tự do. Trong khi kết quả mà chúng tôi thu được là nhiệt độ tối ưu của enzyme cố định thấp hơn enzyme tự do. Sự khác biệt nêu trên có thể được giải thích như sau: Hầu hết các nhà nghiên cứu khi thực hiện cố định α-amylase trên chitosan, mọi người chỉ dùng phương pháp liên kết hóa trị bằng cách hoạt hóa chitosan ở dạng dung dịch sau đó gắn kết với enzyme. Trong khi đó, chúng tôi hoạt hóa chitosan ở dạng hạt rắn, quá trình cố định vừa xảy ra đồng thời sự hấp phụ enzyme vào lỗ xốp và liên kết hóa trị giữa enzyme với nhóm CHO hoạt động của chitosan. Khi liên kết như vậy, có thể sự tương tác vật lý giữa chitosan và α-amylase đã làm cho cấu hình không gian của enzyme thay đổi, dẫn đến tính chất xúc tác và khả năng chịu nhiệt của α-amylase sẽ bị thay đổi. Bảng 3.12: Các phương pháp cố định và chất mang dùng để cố định α-amylase Phương pháp cố địnhChất mangTác giảHấp phụAS-aluminaMohamed A.Abdel-Naby và các cộng sự (1998)SepharoseLiên kết hóa trịChitosan – đất sétMin-Yun Chang, Ruey-Shin Juang (2004)SepharoseMohamed A.Abdel-Naby và các cộng sự (1998)Sợi cellulose (từ bã mía)S. Varavinit, N. Chaokasem và S. Shobsngob (2002)NhốtCa-alginateA.Riaz, S.A.U. Qader, A. Anwar và S. Iqbal (2009)CMC-alginateHuỳnh Ngọc Oanh – Đại Học Bách Khoa (2007)Đối với một số nghiên cứu về quá trình cố định α-amylase bằng phương pháp hấp phụ bởi những chất mang như AS-alumina, sepharose… có thể do cấu trúc lỗ xốp của chitosan có tính chất khác với các chất mang khác, dẫn đến tương tác giữa enzyme và chitosan cũng khác với giữa enzyme và các chất mang khác nên làm cho nhiệt độ tối ưu của α-amylase thay đổi không giống như kết quả của những tác giả khác. Ngoài ra, khi P.Q.Flor và S.hayashida cố định amylase trên chitin bằng phương pháp hấp phụ thì nhiệt độ tối ưu của α-amylase cũng bị giảm so với enzyme tự do, kết quả này rất phù hợp với kết quả chúng tôi. Và vì chitosan là dẫn xuất deacetyl hóa của chitin, nên từ đây chúng tôi có thể kết luận được rằng, bản chất và tính chất cấu tạo của chất mang đã ảnh hưởng đến sự tương tác của chất mang và enzyme, dẫn đến kết quả mà chúng tôi có được. Đồng thời, với nhiệt độ hoạt động tối ưu khoảng 75 – 80oC, đây là khoảng nhiệt độ hồ hóa của hầu hết tinh bột, điều này cho thấy sản phẩm α-amylase cố định của chúng tôi rất thích hợp để dịch hóa tinh bột. Từ hình 3.13, chúng tôi thấy rằng α-amylase có hoạt tính ổn định trong khoảng nhiều độ rộng so với α-amylase tự do. Kết quả này có được là do chất mang đã bảo vệ, che chở cho α-amylase. NGHIÊN CỨU TÍNH CHẤT ĐỘNG HỌC CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ có thể sử dụng phương trình động học của phẩn ứng enzyme để tìm mối liên hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất, từ đó chúng tôi sẽ tìm được giá trị Vmax và Km để từ đó so sánh khả năng thủy phân của α-amylase cố định và tự do. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất Chúng tôi tiến hành thí nghiệm như mục 2.4.6 và thu được kết quả sau: V (g/l/phút) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 S (g/l) Hình 3.14: Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất lên vận tốc thủy phân Từ đồ thị trên, chúng tôi nhận thấy rằng, với nồng độ tinh bột dưới 150 g/l thì phương trình động học của phản ứng thủy phân tuân theo phương trình Michaelis – Menten. Vì vậy để xác định hằng số Km và Vmax được chính xác hơn, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với những dung dịch có nồng độ dưới 150 g/l. Xác định hệ số phương trình động học Michaelis – Menten 1/V 0,009 0,011 0,013 0,015 0,017 0,019 2,5 2 1,5 1 0,5 0 1/[S] Hình 3.15: Mối liên hệ giữa  QUOTE  và  QUOTE  Từ kết quả hình 3.15, chúng tôi có kết quả sau: Enzyme tự doEnzyme cố địnhVmax1,160,88Km47,8764,95Kết quả cho thấy Km α-amylase cố định lớn hơn α-amylase tự do nhưng ngược lại Vmax của α-amylase cố định thấp hơn. Kết quả này cũng phù hợp với các nghiên cứu cố định α-amylase được thực hiện bởi M. A. Abdel-Naby và các cộng sự (1998), Tarek E. El-Banna (2007), Suman.S và K. Ramesh (2009)… Km càng cao có nghĩa là enzyme càng khó có thể tiếp xúc cơ chất để thủy phân, do đó so với α-amylase tự do thì α-amylase cố định khó có thể tiếp xúc để thủy phân tinh bột hơn. Nguyên nhân của vấn đề này, là do sự cản trở không gian, tinh bột bị cản trở khuếch tán để có thể tiếp xúc với enzyme. KHẢO SÁT HIỆU QUẢ TÁI SỬ DỤNG CỦA ENZYME CỐ ĐỊNH Enzyme cố định được sử dụng lặp đi lặp lại 10 lần để thủy phân tính bộ với thành phần không thay đổi như sau: 25ml dung dịch tinh bột 1%. 1g chế phẩm α-amylase cố định. Nhiệt độ thủy phân 75oC. pH = 7. Thời gian thủy phân 10 phút. Chúng tôi thu được kết quả sau:  Hoạt tính tương đối (%) Số lần tái sử dụng Hình 3.16: Khả năng tái sử dụng của chế phẩm α-amylase cố định Từ kết quả thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy enzyme sau khi tái sử lần 1 thì hoạt tính còn lại chỉ có khoảng 80% so với hoạt tính ban đầu. Hoạt tính giảm nhanh có thể là do trong quá trình cố định, một số phân tử enzyme α-amylase được gắn kết bởi quá trình hấp phụ đã bị thất thoát ra ngoài sau quá trình rửa, làm cho hoạt tính sau đó giảm đi đáng kể. Về khía cạnh hiệu quả sử dụng, tổng lượng đường do enzyme cố định tạo ra sau 4 lần tái sử dụng bằng với lượng đường khử do enzyme tự do tạo ra. Điều đó chúng tỏ, khi sử dụng nhiều lần, hiệu quả thủy phân tinh bột của enzyme cố định cao hơn. Nhất là trong những quá trình sử dụng liên tục hoặc nhiều lần. CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ các kết quả thu được trong quá trình nghiên cứu, chúng tôi đã chọn được phương pháp cố định α-amylase trên chất mang chitosan rắn là phương pháp cố định bằng liên kết cộng hóa trị. Chúng tôi cũng đã xác định được điều kiện cố định α-amylase trên 1g chitosan đạt hiệu suất cao nhất: Lượng enzyme sử dụng 0,17ml. Thời gian cố định 2,3 giờ. Vận tốc lắc đảo 150 vòng/phút. Kích thước chitosan 0,7mm. Nồng độ glutaraldehyde 4%. Chúng tôi nhận thấy quá trình cố định α-amylase trên chitosan rất có triển vọng trong ứng dụng để sản xuất syrup: Hiệu suất cố định α-amylase đạt được 54,11%. Trong điều kiện nhiệt độ và pH tối thích (75oC, pH 7) chế phẩm α-amylase cố định có hoạt tính còn lại trên 70%. Chế phẩm α-amylase cố định ổn định trong khoảng pH và nhiệt độ rộng hơn so với α-amylase tự do. Khi khảo sát hiệu quả tái sử dụng chế phẩm α-amylase cố định, sau 9 lần tái sử dụng hoạt tính còn 70% so với hoạt tính ban đầu. KIẾN NGHỊ Do thời gian hạn hẹp, nên chúng tôi chưa tiến hành khảo sát đầy đủ các vấn đề liên quan đến chế phẩm α-amylase cố định. Vì vậy chúng tôi có một số kiến nghị sau: Nghiên cứu sự ổn định nhiệt của chế phẩm α-amylase cố định. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian bảo quản đến hoạt tính α-amylase cố định. Tối ưu quá trình thủy phân tinh bột. Đánh giá chất lượng sản phẩm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Nguyễn Cảnh và Nguyễn Đình Soa (1994), Tối ưu hóa thực nghiệm trong hóa học và kỹ thuật hóa học, Trường đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh. Nguyễn Hữu Chấn (1996), Enzyme và chất xúc tác sinh học, Nhà xuất bản Y học Hà Nội. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ Enzyme, Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh. Huỳnh Ngọc Oanh, Vũ Thanh Thảo (2007), “Science & Technology Development”, Khảo sát quá trình cố định enzyme α-amylase (termamyl) bởi chất mang CMC-Alginate, Volume 10, pp. 76 – 81. Nguyễn Ngọc Tú và Phạm Thị Mai (1995), “Tạp chí Dược học – số 3”, Nghiên cứu, ứng dụng chitosan dùng trong y tế. Lê Ngọc Tú (1999), Hóa sinh công nghiệp, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội. Tiếng Anh Alan Wiseman (1995), Hanbook of Enzyme Biotechnology, Third edition, Ellis Horwood. Andrés IIIanes (2008), Enzyme Biocatalysis: Principles and Applications, Springer. Arun Kilara, Khem M. Shahani, Triveni P. Shukla (2005), “The use of immobilized enzymes in the food industry: a review”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Volume 45, Issue 5, pp. 161 – 198. Barbara Krajewska (2004), “Appication of chitin- and chitosan-based materials for enzyme imobilizations: a review”, Enzyme and Microbial technology 35, pp. 126 – 139. Elif Sarikaya, Takahiko Higasa, Motoyasu Adachi, Bunzo Mikami (2000), “Comparison of degradation abilities of α- and β-amylase on raw starch granules”, Process Biochemistry, Volume 35, pp. 711 – 715. Jolanta Bryjak (2003), “Glucoamylase, α-amylase and β-amylase immobilization on acrylic carriers”, Biochemical Engineering Journal 16, pp. 347 – 355. Julio Polaina và Andrew P. MacCabe (2007), Industrial Enzymes: Structure, Function and Applications, Springer, pp. 3 – 34. G.D. Haki, S.K. Rakshit (2003), “Developments in industrially important thermostable enzymes: a review”, Bioresource Technology, Volume 89, pp. 17 – 34. Horacio Guzman-Maldonado, Octavio Paredes-Lopez và Costa G. Biliaderis (2005), “Amylolytic enzymes and products derived from starch: a review”, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, Volume 45, Issue 5, pp. 373 – 403. Linqiu Cao (2006), Carrier-bound Immobilized Enzymes, Wiley. Lorena Betancor et. al (2006), “Glutaraldehyde in Protein Immobilization: A Versatile Reagent”, Methods in Biotechnology, Volume 22, pp. 57 – 64. Majeti N.V. Ravi Kumar (2000), “A review of chitin and chitosan applications”, Reactive & Functional Polymers, Volume 46, pp. 1 – 27. Marc J.Ε.C. van de Maarel, Bart van de Veen, Joost C.Μ. Uitdehaag, Hans Leemhuis, L. Dijkhuizen (2002), “Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family”, Journal of Biotechnology, Volume 94, pp. 137 – 155. Mayur G. Sankalia, Rajshree C. Mashru, Jolly M. Sankalia, Vijay B. Sutariya (2006), “Stability improvement of alpha-amylase entrapped in kappa-carrageenan beads: Physicochemical characterization and optimization using composite index”, International Journal of Pharmaceutics, Volume 312, pp. 1 – 14. Michael J. Bailey (1988), “A note on the use of dinitrosalicylic acid for determining the products of enzymatic reactions”, Applied Microbiology and Biotechnology, Volume 29, pp. 494 – 496. Min-Yun Chang và Ruey-Shin Juang (2004), “Activities, sabilities, and reaction kinetics of three free and chitosan-clay composite immobilized enzymes”, Enzyme and Microbial Technology 36, pp. 75 – 82. Padma V. Iyer, Laxmi Ananthanarayan (2008), “Enzyme stability and stabilization-Aqueous and non-aqueous environment”, Process Biochemistry, Volume 43, pp. 1019 – 1032. Perfecto Q. Flor và Shinsaku Hayashida (1983), “Continuous production of High-Glucose syrup by Chitin-immobilized Amylase”, Biotechnology and Bioengineering, Volume XXV, pp. 1973 – 1980. Pradip Kumar Dutta, Joydepp Dutta và V. S. Tripathi (2004), “Chitin and chitosan: Chemistry, properties and applications”, Journal of Scientific & Industrial Research, Volume 63, pp. 20 – 31. R. Reshmi, G. Sanjay, S. Sugunan (2006), “Enhanced activity and stability of α-amylase immobilized on alumina”, Catalysis Communications, Volume 7, pp. 460 – 465. R. K. Owusu-Apenten (2002), Food Protein Analysis: Quatitative Effects on Processing, Marcel Dekker, Inc, pp. 69 – 98. Saiyavit Varavinit, Narisa Chaokasem và Sujin Shobsngob (2002), “Immobilization of a thermostable alpha-amylase”, Science Asia, Volume 28, pp. 247 – 251. Suman. S và K. Ramesh (2009), “Immobilization of a thermostable extracellular amylase from thermophilic Bacillus species”, Int. J. Ph. Sci., Volume 1, Issue 2, pp. 315 – 319. Tarek. El-Banna, Ahmed A. Abd-Aziz, Mohamed I. Abou-Dobara và Reham I. Ibrahim (2007), “Production and Immobilization of α-amylase from Bacillus subtilis”, Pakistan Journal of Biological Sciences, Volume 10, Issue 12, pp. 2039 – 2047. T. K. Ghose, A. Fiechter, N. Blakebrough (1978), Advances in biochemical engineering, Volume 10, pp. 150 – 177. Uwe T. Bornscheuer (2005), Trends and Challenges in Enzyme Technology, Springer-Verlag Berlin Heidelberg.