Nghiên cứu khả năng gây bệnh của vi khuẩn edwardsiella ictaluri và aeromonas hydrophila trên cá tra ( pangasius hypophthalmus)

ết vào ngày đầu tiên nhưng chết nhiều vào ngày thứ 2 với tỉ lệ 41,66% và không thấy cá chết vào ngày thứ 3. Riêng mật độ 2,16×103 CFU/ml xuất hiện cá chết vào ngày thứ 2 và chỉ xuất hiện trong vòng 2 ngày. Qua kết quả thí nghiệm nhận thấy rằng, cá chỉ chết tập trung chỉ trong vòng 2- 3 ngày, những ngày sau đó không thấy xuất hiện cá chết. Ở các nghiệm thức cá đều chết với tỉ lệ cao từ 75% đến 83,33%. Riêng ở nghiệm thức với mật độ vi khuẩn thấp nhất 2,16×103 CFU/ml cũng có tỉ lệ chết khá cao là 54,17%. Kết quả của thí nghiệm không xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn A. hydrophila đem gây cảm nhiễm, vì ở nghiệm thức có mật độ vi khuẩn thấp nhất đã có tỉ lệ cá chết trên 50%. Trong khi đó, thí nghiệm xác định LD50 vi khuẩn này trên cá chép, Đoàn Nhật Phương (2001) đã kết luận chủng A. hydrophila có độc lực mạnh nhất với giá trị LD50 từ 2,64×106 CFU/ml đến 4,52×106 CFU/ml. Chủng A. hydrophila trong thí nghiệm của Ngô Thị Ngọc Thủy (1998) cũng ghi nhận giá trị LD50= 1,35×107 CFU/ml. Ngoài ra, trong thí nghiệm so sánh độc lực của các dòng A. hydrophila có ECP (Extracellular products) khác nhau, Thompson và Adams (1998) đã kết luận những dòng có độc lực mạnh có giá trị LD50 khoảng 105 CFU/ml với protein của ECP có trọng lượng phân tử từ 88kDa đến 52kDa. Ngược lại những dòng vi khuẩn có độc lực yếu có giá trị LD50 khoảng 108 CFU/ml và protein của ECP khoảng 31kDa. Bên cạnh đó, báo cáo của Esteve et al., (1993) cho rằng các dòng vi khuẩn đã được phân lập trong thời gian xảy ra dịch bệnh, sau đó được gây cảm nhiễm trên cá chình (Anguilla anguilla) đã thu được các giá trị LD50 từ 105,4 CFU/ml đến 107,2 CFU/ml, ngược lại ở các dòng vi khuẩn được phân lập tại các thời điểm khảo sát khác thì thu được giá trị LD50 từ 106,2 CFU/ml đến 107,4 CFU/ml. Takahashi et al., (1986) cũng thu được giá trị LD50=1,4×104 CFU/ml khi gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila ở cá thơm (ayu Plecogrossus). Bên cạnh đó, trên cá rô phi (Oreochromis mossambicus) với vi khuẩn A. hydrophila 16 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu chủng SAH 93 và thu được kết quả LD50= 106,22 CFU/ml, cá bị nhiễm bệnh có những biểu hiện bệnh lý rất rõ (Azad et al., 2001). Hơn nữa, ở thí nghiệm xác định độc lực của các chủng A. hydrophila khác nhau, De Figuerredo và Plumb (1977) đã gây cảm nhiễm trên cá nheo Mỹ và đưa kết luận chủng A. hydrophila được phân lập từ cá bệnh có giá trị LD50= 6,4×104 CFU/ml, trong khi đó chủng phân lập từ môi trường có LD50= 1,5×108 CFU/ml. Qua các kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy vi khuẩn gây bệnh cho ký chủ ở mức nào còn tuỳ thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩn ấy đối với ký chủ và các điều kiện tác động. Trong khi đó ở thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra, tuy không xác định được LD50 nhưng ở nghiệm thức có nồng độ vi khuẩn thấp nhất 2,16×103 CFU/ml đã có tỉ lệ chết 54,16% chỉ trong vòng 2 ngày. Kết quả cho thấy chủng A. hydrophila trong thí nghiệm có giá trị LD50< 2,16×103 CFU/ml chứng tỏ chủng vi khuẩn này có độc lực cao hơn những chủng A. hydrophila trong các nghiên cứu trước đây. Bên cạnh đó, cá thí nghiệm đã được thuần hóa 2 tuần trước khi gây cảm nhiễm, nên đủ để cá thích nghi với điều kiện thí nghiệm. Trong thời gian này cá vẫn không có biểu hiện gì bất thường. Hơn nữa trước khi gây cảm nhiễm thì cá đã được kiểm tra vi sinh và ở tất cả các bể hoàn toàn không có sự nhiễm khuẩn, nhất là A. hydrophila. Đặc biệt trong suốt thời gian thí nghiệm thì bể đối chứng không có cá chết hay cá bị nhiễm khuẩn. Qua đó đã thế hiện được tính sạch bệnh và khỏe mạnh của đàn cá thí nghiệm. Ngoài ra, theo Roselynn và Stevenson (1988) độc lực của vi khuẩn A. hydrophila có giá trị LD50 trong khoảng từ 104 CFU/ml đến 105 CFU/ml, nếu vi khuẩn không gây chết ở mật độ 107 CFU/ml thì chủng vi khuẩn không có độc lực. Do đó chủng vi khuẩn A. hydrophila trong thí nghiệm gây cảm nhiễm là có độc lực. 17 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4.2.2 Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri Cũng như ở thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila, ở thí nghiệm này, sau khi gây cảm nhiễm đều xuất hiện cá chết ở tất cả các nồng độ vi khuẩn và xuất hiện bệnh lý ở những mốc thời gian khác nhau. Ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml có thời gian cá biểu hiện bệnh lý sớm nhất 37 giờ và chậm nhất ở mật độ 1×105 CFU/ml là 86 giờ. Trong khi đó thời gian xuất hiện bệnh ở nghiệm thức 1×106 CFU/ml là 72,5 giờ và nghiệm thức 1×107 CFU/ml là 61 giờ (Bảng 4.3) Bảng 4.3: Bảng thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh Nghiệm thức (CFU/ml) Thời gian xuất hiện bệnh (giờ) 1×105 86 1×106 72,5 1×107 61 1×108 37 Kết quả cho thấy, thời điểm cá bắt đầu biểu hiện bệnh của thí nghiệm chậm hơn so với những nghiên cứu trước đây. Trong thí nghiệm gây cảm nhiễm tiêm vi khuẩn này trên cá tra giống của Lương Trần Thục Đoan (2006) đã thu được cá chết vào ngày thứ 2 ở mật độ 1×106 CFU/ml. Lawrence et al., (1997) gây cảm nhiễm E. ictaluri lên cá nheo và ở nghiệm thức 1,3×106 CFU/ml cá chết đã được ghi nhận ở thời điểm 24 giờ sau khi gây cảm nhiễm. Ngoài thời điểm biểu hiện bệnh lý thì tỉ lệ cá chết ở các nghiệm thức cũng phản ánh khả năng gây bệnh của chủng vi khuẩn lên vật chủ. Bảng 4.4: Tỉ lệ cá chết trong thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri Tỉ lệ trung bình cá chết trong thời gian theo dõi (%/tổng số cá/ngày) Nghiệm thức (CFU/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Tổng tỉ lệ cá chết (%) Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1×105 0 0 0 25 0 0 0 0 0 0 25±12,5 1×106 0 0 4,17 25 4,17 0 0 0 0 0 33,33±14,43 1×107 0 0 50 12,5 4,17 0 0 0 0 0 66,67±7,22 1×108 0 50 41,66 0 0 0 0 0 0 0 91,67±7,22 Kết quả bảng 4.4 cho thấy ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml cá chết với tỉ lệ cao nhất 91,67%. Tỉ lệ chết thấp nhất 25% ở mật độ 1×105 CFU/ml. Trong khi đó, ở hai nghiệm thức còn lại 1×107 CFU/ml và 1×106 CFU/ml cá chết với tỉ lệ 66,67% và 33,33%. Riêng ở lô đối chứng, cá đều có trạng thái sinh lý bình 18 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu thường trong suốt thời gian thí nghiệm nên thể hiện được tính thích nghi của cá đối với điều kiện môi trường. Cá bắt đầu chết vào ngày thứ 2 ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml với tỉ lệ 50%. Ở nghiệm thức 1×107 CFU/ml và 1×106 CFU/ml xuất hiện cá chết vào ngày thứ 3 và không thấy cá chết vào ngày thứ 6. Trong đó nghiệm thức 1×107 CFU/ml cá chết tập trung vào ngày thứ 3 với tỉ lệ 50%. Riêng mật độ 1×105 CFU/ml chỉ xuất hiện cá chết vào ngày thứ 4. Từ kết quả thí nghiệm, LD50 của dòng vi khuẩn E. ictaluri thu được trong thí nghiệm gây cảm nhiễm có giá trị LD50 = 106,5 CFU/ml. Trong khi đó, Lương Trần Thục Đoan (2006) sử dụng mật độ vi khuẩn 1×106 CFU/ml và 1×105 CFU/ml tiêm trên cá tra giống đã thu được tỉ lệ chết 100% và 66,7% trong khoảng thời gian theo dõi 10 ngày, trong đó mật độ 1×106 CFU/ml cá bắt đầu chết ở ngày thứ 2 và 1×105 CFU/ml là ngày thứ 3. Ở thí nghiệm xác định khả năng bộc phát bệnh của vi khuẩn này lên cá tra sau khi tiêm, sử dụng mật độ 1,5x105 CFU/0,1ml và 1,5x106 CFU/0,1ml đã thu được tỷ lệ chết ở cả 2 nồng độ là 100% trong 6 ngày thí nghiệm (Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004). Ngoài ra, Williams và Lawrence (2005) sử dụng mật độ 5,2x104 CFU/ml và 5,2x105 CFU/ml tiêm trên cá nheo giống trong khoảng nhiệt độ nước 260C đã gây chết 100% (trích dẫn bởi Lương Trần Thục Đoan 2006). So sánh với kết quả thí nghiệm trên, nhận thấy độc lực của vi khuẩn trong thí nghiệm gây cảm nhiễm yếu hơn so với độc lực của vi khuẩn ở thí nghiệm của Lương Trần Thục Đoan và Phan Thị Mỹ Hạnh, tỉ lệ cá chết thấp hơn so với những thí nghiệm trước có cùng mật độ vi khuẩn. Trong báo cáo của Lawrence et al., (1997) gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm trên cá nheo với hai dòng vi khuẩn E. ictaluri: dòng vi khuẩn phân lập từ tự nhiên và dòng LSU-E2 đã được làm giảm độc lực, kết quả ở dòng LSU-2 thu được giá trị LD50= 5,1×107 CFU/ml, còn ở dòng tự nhiên không xác định được LD50 do ở nồng độ vi khuẩn thấp nhất 1,3×102 CFU/ml đã có tỉ lệ cá chết trên 50%. Hơn nữa, Baxa et al., (1990) sử dụng mật độ từ 4×106 CFU/ml đến 4×108 CFU/ml ngâm trên cá hồi trắng, theo dõi trong 14 ngày, đã ghi nhận được giá trị LD50= 3,4×107 CFU/ml và ở nồng độ 4×108 CFU/ml có tỉ lệ chết cao nhất là 92%. Qua các nghiên cứu trước đây cho thấy vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể của ký chủ tạo nên sự nhiễm bệnh hay không, ở mức nào còn tuỳ thuộc vào khả năng gây bệnh của vi khuẩm đối với ký chủ và điều kiện tác động. Với kết quả thí nghiệm trên, tuy độc lực của dòng vi khuẩn đem gây cảm nhiễm không cao nhưng theo Santos (1988) vi khuẩn được xem như không có độc lực khi có giá 19 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu trị LD50 ≥ 108 CFU/ml (trích dẫn bởi Esteve et al.,1993). Do vậy, kết quả LD50= 106,5 CFU/ml chứng tỏ độc lực của dòng vi khuẩn vẫn nằm trong phạm vi có thể chấp nhận được. Qua kết quả thí nghiệm, cả hai chủng vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri đều được phân lập từ những ao cá bệnh ở An Giang. Hai chủng vi khuẩn này cùng được gây cảm nhiễm trên cá tra nhưng thời điểm biểu hiện bệnh lý, tỉ lệ chết ở cả hai thí nghiệm đều rất khác nhau. Ở thí nghiệm gây cảm nhiễm, chủng A. hydrophila có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 17 giời ở mật độ là 2,16×106. Trong khi đó với mật độ 1×106 của chủng E. ictaluri lại có thời biểu hiện bệnh lý là 72,5 giời. Đồng thời ở mật độ 106 CFU/ml tỉ lệ chết của cá bị nhiễm A. hydrophila (83,33%) cũng cao hơn nhiễm E. ictaluri (33,33%). Bên cạnh đó, giá trị LD50 của chủng E. ictaluri (106,5 CFU/ml) cao hơn chủng A. hydrophila (LD50< 2,16×103 CFU/ml). 4.3 Tổn thương do vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri trên một số cơ quan của cá tra Trong quá trình thí nghiệm cũng tiến hành phân tích và quan sát mẫu mô. Các cơ quan được chọn làm tiêu bản mô gồm: Gan, tỳ tạng, thận. Mẫu mô được nhuộm bằng dung dịch Hematocyline và Eosin. Mục đích của việc quan sát tiêu bản mô học nhằm khẳng định sự hiện diện của vi khuẩn trên các cơ quan. Tuy nhiên, do hạn chế của phương pháp này nên cũng khó xác định được sự hiện diện của vi khuẩn ở các cơ quan mà chỉ quan sát được một số những biến đổi về mô học. 4.3.1 Những biến đổi mô học do vi khuẩn A. hydrophila Kết quả quan sát tiêu bản mô học cho thấy sự biến đổi ở các mô không đáng kể ở cả 4 nghiệm thức, đặc biệt là ở nghiệm thức 2,16×105 CFU/ml và 2,16×106 CFU/ml. Tuy nhiên các biến đổi chủ yếu chỉ là sung huyết và xuất huyết. Trong các nghiệm thức không ghi nhận được hiện tượng hoại tử ở các cơ quan. Sung huyết ở các tĩnh mạch gan làm cho tĩnh mạch có hiện tượng phình to và tập trung nhiều tế bào hồng cầu (Hình 4.3 B), hiện tượng này được ghi nhận ở cả 4 nghiệm thức. Hiện tượng sung huyết xảy ra là do kích thích đặc biệt làm cho mao mạch nở ra một lượng máu lớn hơn bình thường được đưa đến gần ổ viêm, hiện tượng sung huyết được xem là phản ứng đầu tiên của cơ thể đối với tác nhân gây bệnh (Đỗ Thị Hòa và ctv., 2004) Hiện tượng xuất huyết cũng quan sát được ở các nghiệm thức (Hình 4.3 C & Hình 4.3 F). Theo Trần Thị Ngọc Hân (2006) khi những vùng sung huyết dưới 20 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ảnh hưởng của độc tố vi khuẩn, các mao mạch máu bị vỡ hoặc tính thẩm thấu của mao mạch tăng lên, làm cho các tế bào máu trong vùng sung huyết thoát ra xen lẫn với các tế bào máu cơ quan sẽ gây ra hiện tượng xuất huyết. Hiện tượng sung huyết và xuất huyết kéo dài sẽ làm tế bào bị mất cấu trúc, hiện tượng mất cấu trúc đã được ghi nhận ở mô gan của nghiệm thức 2,16×105 CFU/ml (Hình 4.3 D). Tế bào mất cấu trúc và dẫn đến hoại tử, đầu tiên là hoại tử dạng hạt và sau đó là hoại tử gần hóa lỏng đến hoá lỏng (Trần Thị Ngọc Hân, 2006). A C c a b B Hình 4.4 Mô gan cá tra bị nhiễm A. hydrophila (¼) A. Gan cá khỏe (H & E, 10X) a: tế bao gan b: xoang tĩnh mạch gan c: trung tâm đại thực bào sắc tố B. Gan bị sung huyết và xuất huyết (H & E, 40X) C. Gan bị mất cấu trúc (H & E, 10X) 21 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu b a A B a b c C D Hình 4.4 Mô thận và tỳ tạng cá tra bị nhiễm A. hydrophila (¼) A. Thận cá khỏe (H & E, 10X) a: ống dẫn thận b: tiểu cầu thận c: tế bào sắc tố B. Thận cá bị xuất huyết (H & E, 40X) C. Tỳ tạng cá khỏe (H & E, 10X) a: tủy trắng b: tủy đỏ c: trung tâm đại thực bào sắc tố D. Tỳ tạng bị sung huyết và xuất huyết (H & E, 40X) 22 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4.3.2 Những biến đổi mô học do vi khuẩn E. ictaluri khuẩn E. ictaluri cũng Thịnh (2002) hiện tượng sung huyết kéo dài sẽ làm vỡ .5 D) được xem là cơ quan mà vi khuẩn Kết quả quan sát tiêu bản mô học ở thí nghiệm tiêm vi cho thấy sự biến đổi mô học không đáng kể ở các cơ quan gan, thận và ty tạng. Biến đổi nhiều nhất chỉ thấy ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml và 1×107 CFU/ml. Trong đó gan chỉ xuất hiện hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở các tĩnh mạch (Hình 4.5 B). Theo Nguyễn Quốc mạch máu, giải thoát nhiều enzim tiêu hóa (tiêu hóa protein, lipid,…) từ các bạch cầu làm cho tổ chức viêm bị hủy hoại dẫn đến hoại tử, những tổn thương diễn ra tòan bộ tổ chức gan làm cho gan không còn chức năng khử độc, lọc máu, chuyển hóa protein, lipid, glucid, tiết mật, làm cho chất độc không được loại bỏ sẽ tích lũy trong cơ thể kết hợp với các yếu tố khác làm cá chết. Ở thận cũng ghi nhận được hiện tượng sung huyết và xuất huyết (Hình 4 Tất cả các động vật có xương sống đều có phản ứng khi có vật lạ xâm nhập vào cơ thể, nhằm đào thải các tác nhân xâm nhập, phản ứng này gọi là phản ứng sưng viêm hay phản ứng miễn nhiễm, tác giả cũng cho rằng phản ứng miễn dịch được khởi động do sự giải thoát các amin hoạt động từ mạng lưới vi mạch của vùng bị vi khuẩn tấn công, những chất này gây tăng cường máu dẫn đến vùng viêm, đồng thời làm giãn các mao mạch và các khe hở liên bào của tế bào nội mô mao mạch, chính điều này gây ra hiện tượng sung huyết ở vùng bị viêm (Roberts, 1995 được trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Không có hiện tượng hoại tử xảy ra ở gan và thận. Điều này không giống với các thí nghiệm trước đây. Theo một số tác giả thì khi vi khuẩn tấn công vào cơ thể cá thì gây tổn hại đến các mô, các biểu hiện thường gặp là xung huyết, xuất huyết và hoại tử. Baxa et al., (1990) đã ghi nhận có hiện tượng hoại tử ở gan, thận và tỳ tạng khi gây cảm nhiễm E. ictaluri trên cá nheo. Nguyễn Thị Ngọc Hân (2006) cũng ghi nhận có hiện tượng hoại tử dạng hạt và hoá lỏng ở nghiệm thức 1×105 CFU/ml và 1×106 CFU/ml. Cũng như gan và thận, tỳ tạng cũng E. ictaluri tấn công chủ yếu sau khi xâm nhập vào cá tra (Nguyễn Thị Ngọc Hân, 2006). Tuy nhiên biến đổi cấu trúc mô học ở tỳ tạng của cá trong thí nghiệm cũng chỉ là hiện tượng sung huyết và xuất huyết (Hình 4.5 F). Theo Trần Hồng Ửng (2003) khi quan sát tiêu bản mô tỳ tạng dưới kính hiển vi thấy cá bệnh mủ gan có phần tủy trắng nhiều hơn ở cá khỏe. Nguyên nhân là do tủy trắng là vùng chủ yếu sản xuất ra các tế bào bạch cầu, khi cơ thể cá bị vi khuẩn tấn công thì kích thích tủy trắng hoạt động mạnh hơn để sản xuất ra các 23 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu loại tế bào bạch cầu tham gia vào hệ thống đáp ứng miễn dịch tiêu diệt vi khuẩn. Trong khi đó phân tích mô học của Trần Thị Ngọc Hân (2006), Nguyễn Quốc Thịnh (2002) đều cho thấy tổn thương ở gan, tỳ tạng và thận là nhiều nhất, các cơ quan này có hiện tượng sung huyết, xuất huyết dẫn đến hoại tử. Kết quả cho thấy, những biến đổi mô học ở gan, thận và tỳ tạng của cá trong thí nghiệm chủ yếu chỉ là hiện tượng sung huyết và xuất huyết, không như những nghiên cứu trước đây đều ghi nhận còn có hiện tượng hoại tử dạng hạt hoặc hoá lỏng ở cả ba cơ quan. Tóm lại: cá ở hai thí nghiệm gây cảm nhiễm có những biến đổi mô học ở gan, thận và tỳ tạng đều không đáng kể. Chỉ có hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở các cơ quan, không xuất hiện hiện tượng hoại tử. 24 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu E A c a b a b c B F a b c C D Hình 4.5 Mô cá tra bị nhiễm E. ictaluri (¼) A. Gan cá khỏe (H & E, 10X) a: tế bao gan b: xoang tĩnh mạch gan c: trung tâm đại thực bào sắc tố B. Gan bị xuất huyết (H & E, 40X) C. Thận cá khỏe (H & E, 10X) a: ống dẫn thận b: tiểu cầu thận c: tế bào sắc tố D. Thận bị sung huyết (H & E, 10X) E. Tỳ tạng cá khỏe (H & E, 10X) a: tủy trắng b: tủy đỏ c: trung tâm đại thực bào sắc tố F. Tỳ tạng bị sung huyết (H & E, 40X) 25 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 4.4 Kết quả tái định danh vi khuẩn Sau khi gây cảm nhiễm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, sau đó vi khuẩn đã tái phân lập được tiến hành tái định danh vi khuẩn dựa theo phương pháp của Bergey (1974) và dựa theo dòng chuẩn của Inglis et al., (1993). Việc tái phân lập và định danh vi khuẩn hết sức cần thiết đối với lĩnh vực nghiên cứu và ứng dụng. Nó giúp xác định chính xác tác nhân gây bệnh vá có thêm chứng cớ cho các trường hợp nhiễm bệnh. Bởi vì tỉ lệ chết chưa hẳn là dấu hiệu tốt của vấn đề bệnh, mà nó còn có thể là kết quả của vấn đề môi trường xấu hoặc do vi khuẩn gây ra. Hơn nữa vai trò của vi khuẩn chỉ được công nhận khi nó luôn được phân lập từ cá bệnh đó và trong gây cảm nhiễm thực nghiệm (Từ Thanh Dung, 1997). Tái định danh vi khuẩn gồm các bước nhuộm Gram, quan sát hình dạng và tính di động, các phản ứng Oxidase, Catalase, O/F, O/129, Esculin, khả năng phân giải acid amin (Arginine, Lysine, Ornithine), khả năng sử dụng đường (Arabinose, Glucose, Inositol, Rhamnose, Sucrose, Salicin), khả năng sử dụng Urease... 4.4.1 Tái định danh vi khuẩn A. hydrophila Trong 70 mẫu cá bệnh thu được trong thời gian gây cảm nhiễm, đã tái phân lập vi khuẩn 52 mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, cấy trên môi trường dinh dưỡng TSA, ủ ở 28oC sau 24 giờ và đã thu được 156 chủng vi khuẩn. Sau đó dựa vào những đặc điểm hình thái và một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản đã chọn được 12 chủng vi khuẩn tiến hành tái định danh vi khuẩn. 1 2 3 4 B 1 2 A Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310 A. Chỉ tiêu acid amin (1. đối chứng, 2. arginine) B. Các chỉ tiêu: 1. Citrate, 2. SIM, 3. Esculin, 4. TSI. 26 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Qua kết quả kiểm tra nhuộm Gram, quan sát tính di động và các phản ứng test sinh hóa cho thấy chủng phân lập từ cá tra bệnh trong thí nghiệm và chủng gốc ban đầu được phân lập từ cá bệnh ngoài tự nhiên đều có khuẩn lạc dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt, vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que ngắn, kháng với O/129. Phản ứng dương tính với Oxidase, Catalase, Indole, VP, Gelatin, có khả năng phân giải Arginine, không có khả năng sinh H2S, có khả năng lên men các môi trường đường, có khả năng thủy phân Esculin, cho phản ứng âm tính với Urease (Hình 4.6 & Hình 4.7) B A B 2 1 3 4 5 6 7 Hình 4.6 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Xương-CĐ3L310 A. Khả năng phân giải đường (1. arabinose, 2. glucose, 3. inositol, 4. mannitol, 5. rhamnose, 6. sucrose, 7. salicin) B. Test O/129 Chủng Xương-CĐ3L310 sai khác chỉ tiêu H2S (+) và inositol (-) so với dòng chuẩn của Inglis et al., (1993). Nguyễn Thị Như Ngọc (1997) cũng ghi nhận A. hydrophila có khả năng phân giải arginine. Theo kết quả ghi nhận của Ngô Thị Ngọc Thủy (1998), A. hydrophila vẫn có khả năng phân giải ornithin. Ngoài ra, Đoàn Nhật Phương (2002) còn ghi nhận, A. hydrophila có khả năng sử dụng H2S, sử dụng citrate và cho phản ứng dương tính với lysine. 4.4.2 Tái định danh vi khuẩn E. ictaluri Sau khi gây cảm nhiễm, trong quá trình theo dõi thí nghiệm đã thu được 52 mẫu cá bệnh và đã tái phân lập vi khuẩn 39 mẫu bệnh phẩm, vi khuẩn được phân lập từ gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh, cấy trên môi trường dinh dưỡng TSA, ủ ở 28oC sau 48 giờ và đã thu được 117 chủng vi khuẩn. Sau đó dựa vào những đặc điểm hình thái và một số chỉ tiêu sinh hóa cơ bản đã chọn được 12 chủng vi khuẩn tiến hành tái định danh vi khuẩn. 27 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 1 2 3 4 1 2 3 4 A B Hình 4.8 Kết quả test các chỉ tiêu sinh hóa của chủng Tỷ-PT207 A. Các chỉ tiêu acid amin (1. đối chứng, 2. arginine, 3. lysine, 4. ornithine) B. Các chỉ tiêu: 1. TSI, 2. SIM, 3. Citrate, 4. Asculin Qua kết quả kiểm tra nhuộm Gram, quan sát hình dạng và tính di động và các phản ứng test sinh hóa cho thấy chủng phân lập từ cá tra bệnh trong thí nghiệm và chủng gốc ban đầu được phân lập từ cá bệnh ngoài tự nhiên đều có khuẩn lạc nhỏ, tròn, màu tắng đục, rìa có dạng không đồng nhất, vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, không di động, phản ứng Oxidase âm tính và cho phản ứng với Catalase. Trong các phản ứng lên men đường chỉ có đuờng glucose cho phản ứng dương tính còn các đường khác đều âm tính. Có khả năng phân giải Ornithin và Lysine, không có khả năng sinh H2S, cho phản ứng âm tính với Citrate, Urease, Indole và VP, không có khả năng thủy phân Gelatin và Esculin (Hình 4.8). Chủng Tỷ-PT207 sai khác chỉ tiêu khả năng sinh gas từ glucose(+) so với dòng chuẩn của Inglis et al., (1993). 4.5 Một số hạn chế trong quá trình thí nghiệm Nhiệt độ phòng gây cảm nhiễm không ổn định ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian thí nghiệm, điều này ảnh hưởng đến tỉ lệ cá chết. Không theo dõi được các yếu tố thủy hóa của môi trường trong thời gian thí nghiệm. Không có dòng chuẩn vi khuẩn trong quá trình tái định danh vi khuẩn, điều này ảnh hưởng đến tính chính xác khi so sánh kết quả. 28 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận − Ở cả hai thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila và E. ictaluri đều thấy xuất hiện cá chết ở các nghiệm thức, trừ nghiệm thức đối chứng. − Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila, ở nghiệm thức 2,16×106 CFU/ml có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất là 17 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Không xác định được giá trị LD50 của chủng vi khuẩn gây cảm nhiễm. − Thí nghiệm gây cảm nhiễm vi khuẩn E. ictaluri có thời gian biểu hiện bệnh lý sớm nhất ở nghiệm thức 1×108 CFU/ml là 37 giờ sau khi tiêm vi khuẩn cho cá. Chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm có giá trị LD50= 106,5 CFU/ml. − Trong cả hai thí nghiệm, khi quan sát biến đổi mô học chỉ thấy có hiện tượng sung huyết và xuất huyết ở các cơ quan gan, thận và tỳ tạng của cá bệnh. 5.2 Đề xuất − Cần có dòng chuẩn khi tái định danh vi khuẩn. − Cần có dụng cụ đo pH và nhiệt độ nước hằng ngày. − Ổn định nhiệt độ phòng gây cảm nhiễm ở điều kiện 27oC-28oC trong thời gian thí nghiệm gây cảm nhiễm. − Gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá tra và thu mẫu ở những mốc thời gian khác nhau nhằm xác định ảnh hưởng của vi khuẩn đến quá trình biến đổi cấu trúc mô. 29 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Angka, S.L. 1990. The Pathology of the Walking catfish Clarias batrachus (L), infected intraperitoneally with Aeromonas hydrophila Asian Fish Sci. 3: 343- 351. In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992. 2. Aydin, S. and A. Cilta. 2004. Systemic Infections of Aeromonas hydrophila in Rainbow Trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum): Gross Pathology, Bacteriology, Clinical Pathology, Histopathology and Chemotherapy. In Journal of Animal and Veterinary Advances 3 (12): 810-819. 3. Azad, I. S., Rajendran, K. V., Rajan, J. J. S., Vijayan, K. K. and Santiago, T. C. 2001. Virulence and histopathology of Aeromonas hydrophila (SAH 93) in experimentally infected tilapia, Oreochromis mossambicus (L.). In Journal of Aquaculture in the Tropics 16(3): 265-275. 4. Baxa, D. V., J. M. Groff, A. Wishkovsky and R. P. Hedrick. 1990. Susceptibility of nonictalurid fishes to experimental infection with Edwardsiella ictaluri. In Diseases of Aquatic organisms. Vol. 8: 113-117. 5. Bergey, U. 1974. Pathogenicity of lactobacilli. 6. Bộ tài nguyên môi trường Việt Nam. 2006. Ngày truy cập 26/02/2007. 72 7. Bùi Quang Tề. 2006. Bệnh học thủy sản. 8. De Figueirredo, J. and Plum. J. A. 1977. Virulence of different isolates of Aeromonas hydrophila in channel catfish. Aquaculture. 349-354 9. Dương Nhựt Long. 2006. Giảp pháp kĩ thuật góp phần nâng cao chất lượng và khai thác bền vững sản phẩm cá Tra nuôi xuất khẩu vùng ĐBSCL. 10. Đoàn Nhật Phương. 2001. Xác định LD50 và thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) trên cá chép (Cyprinus carpio). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 11. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội. 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản, Đại học thủy sản nha Trang, 345 trang. 12. Esteve, C., E. G. Biosca and C. Amaro. 1993. Virulence of Aeromonas hydrophila and some other bacteria isolated from European eels Anguilla anguilla reared in fresh water. In Diseases of Aquatic organisms. Vol. 16: 15-20. 13. Francis- Floyd R., M.H. Beleau, P.R. Waterstat and P.R. Bowser. 1987. Effect of water temperater on the clinical outcome of infection with 30 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Edwardsiella ictaluri in Channel catfish, Ictalurus punctatus. Journal of the American Veterinary Medical Assosiation 1991, 1413-1416 14. Ferguson H. W, J.F. Turnbull, A. Shinn, K.Thompson, T.T. Dung and M. Crumlish. 2001. Bacillary nercrosis in farmed Pangasius hypophthalamus (Sauvage) from the Mekong Delta, Viet Nam. Journal of Fish Diseases 2001, 24, 509- 513. 15. Hà Yên. 2005. Lập ban điều hành sán xuất và tiêu thụ cá tra, basa. Ngày truy cập: 26/02/2007. 16. Hawke J.P. 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36: 1508-1512. 17. Inglis, V., R. Roberts and N. R. Bromage. 1993. Bacterial Diseases of Fish. 18. Klesius, P.H. and W.M. Sealey. 1995. Chacracterization of serum antibody in enteric septicemia of catfish. In Journal of aquatic animal Heath: 205-210. 19. Lawrence M.L., R.K. Cooper and R.L. Thune. 1997. Attenuation, persistence and vaccine potential of an Edwardsiella ictaluri purA Mutant. Infection and Immunity, Nov. 1997, p.4642-4652. Vol. 65, No. 11. 20. Lê Thị Bé Năm. 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng ở nội tạng cá Tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 21. Lewis, D.H. and J.A.Plumb. 1979. Bacterial diseases p.15-24. In Principal diseases of farm raised catfish. Southern Cooperative Ser. 225 Auburn University. Alabama. 22. Lương Trần Thục Đoan. 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá Tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 23. Ngô Thị Ngọc Thủy. 1998. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh hóa của Aeromonas hydrophila gây bệnh đốm đỏ ở cá trắm cỏ (Ctenopharyngodonidelus) và chọn chủng chế vaccine phòng bệnh. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 24. Nguyễn Bạch Loan. 2004. Ngư loại I. Bài giảng. 25. Nguyễn Quốc Thịnh. 2002. Nghiện cứu mô bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 26. Nguyễn Thị Như Ngọc. 1997. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng (Oxyeleotris marmoratus, Bleeker). LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 31 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 27. Phan Thị Mỹ Hạnh. 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do E. ictaluri trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu long. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 28. Plumb J.A., 1999. Fish diseases and disorders. Aquaculture and aquatic Environments, Auburn University, Alabama 36849 USA. 3: Viral, Bacterial and Fungal infections. 29. Rahman, M.H., S. Suzuki and K. Kawai. 2000. The effect of temperature on Aeromonas hydrophila infection in goldfish, Carassius auratus. 30. Reed, L. J. and H. Muench. 1938. A simple method of estimating fifty percent end points. American Journal of Hygiene 27: 493 – 497. 31. Roselynn, M. and W. Stevenson. 1988. Vaccination against Aeromonas hydrophila. In Fish Vaccination. 9: 112 – 123. 32. Saitanu, K.S., Wongsawang and K. Poonsuk. 1982. Red sore disease in carp (Cyprinus carpio L) J. Aquat. Animal Dis. 3: 79-86. (In Thai). In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992. 33. Takahashi, Y., T. Kajiwaki and T. Itami. 1986. Characteristics of vibriostatic agent-sensitive Aeromonas hydrophila isolated from ayu Plecogrossus altivelis and its pathogenicity. In Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries 52(4): 1727-1733. 34. Tanasomwang, V. and K. Saitanu. 1979. Ulcer disease in striped catfish (Pangasius pangasius) J. Aquat. Animal. Dis. 2: 131-133. In Asian Fish Health Bibliography and Abstracts I: Southeast Asia. Fish Health Section Asian Fisheries Society Manila, Philippines, 1992. 35. Thompson, K. and A. Adams. 1998. Characterisation of Aeromonas hydrophila Extracellular Products with Reference to Toxicity, Virulence, Protein Profiles and Antigenicity. 36. Trần Anh Dũng. 2005. Khảo sát các tác nhân gây bệnh trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh ở tỉnh An Giang. LVCH. Khoa thủy sản, ĐHCT. 37. Trần Hồng Ửng. 2003. Bước đầu xác định sự thay đổi số lượng tế bào bạch cầu và mô tỳ tạng trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) bệnh trắng gan. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 38. Trần Thị Ngọc Hân. 2006. Khảo sát mô học cá Tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm. LVTN. Khoa thủy sản, ĐHCT. 39. Trương Quốc Phú. 2004. Quản lý môi trường ao nuôi. Bài giảng. 40. Từ Thanh Dung. 1997. Tài liệu tập huấn thực hành kí sinh trùng và vi khuẩn. 41. Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh và Đặng Thụy Mai Thy. 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh đốm 32 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 42. Từ Thanh Dung. 2005. Bài giảng bệnh học thủy sản. 43. Williams, M.L and M.L. Lawrence. 2005. Identification and characerization of a two component hemolysin from E. ictaluri. Journal of aquatic animal Heath. 108: 281-189. 33 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu PHỤ LỤC PHỤ LỤC A Phương pháp định danh vi khuẩn 1. Chỉ tiêu về hình thái Hình dạng, màu sắc khuẩn lạc Quan sát khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch TSA và ghi nhận các đặc điểm sau: Hình dạng khuẩn lạc: tròn, dạng sợi, dạng rễ cây, không có dạng cố định. - Rìa khuẩn lạc: nguyên dạng, dạng thùy, dạng sợi.. - Bề mặt khuẩn lạc: dạng đều, hơi lồi, lồi hình vòm - Kích cỡ khuẩn lạc: chấm li ti, nhỏ, trung bình, lớn - Màu sắc khuẩn lạc: kem, trắng (đục hay trong suốt), đen, cam… - Tạo sắc tố ( đổi màu môi trường) có hay không ? sắc tố màu gì ? - Nhuộm Gram Nhuộm gram để quan sát hình dạng, kích thước và xác định vi khuẩn thuộc nhóm gram âm hay gram dương. Thông thường vi khuẩn có các hình dạng: hình cầu, hình chuỗi, hình que ngắn, hình que dài, hình cong. Phương pháp - Sử dụng lame sạch, que cấy tiệt trùng, cho một ít nước muối sinh lý lên lame. - Cho một ít vi khuẩn lên giọt nước muối trên lame và trãi đều. - Để lame khô tự nhiên. - Hơ lướt lame qua ngọn đèn cồn để cố định vi khuẩn. - Để lame nguội và tiến hành nhuộm. - Nhuộm crystal violet khoảng 1 phút. - Rửa lame bằng nước. Nhuộm iodine khoảng 1 phút. - Rửa lame bằng dung dịch alcohol/acetone khoảng 10 giây. - Rửa lại bằng nước và để khô. - Nhuộm safranine khoảng 2 phút. - Rửa lại bằng nước sạch và để khô. - Quan sát trên kính hiển vi quang học ở vật kính 40 X và 100X có giọt dầu. Kết quả ¾ Gram dương: màu xanh/tím ¾ Gram âm: màu đỏ/hồng 2 Các chỉ tiêu về sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn Tính di động 34 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Test này dùng để kiểm tra khả năng di chuyển độc lập của vi khuẩn. Nhiều loại vi khuẩn có khả năng di động nhờ vào tiêm mao. Sự di động này có thể quan sát dưới kính hiển vi bằng phương pháp giọt treo ở vật kính 40X để xác định khả năng di động của vi khuẩn. Phương pháp - Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. - Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle - Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lamelle hòa vào nước muối sinh lý chứa vi khuẩn. - Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn. - Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lên lamelle. - Đặt lame lên kính hiển vi quan sát ở vật kính 40X để kiểm tra tính di động của vi khuẩn. Phản ứng Oxydase Phương pháp - Chạm nhẹ que thử vào một khuẩn lạc trêm đĩa agar. - Quan sát que thử trong 30 giây và ghi nhận sự thay đổi màu sắc. Kết quả ¾ Que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng Oxydase dương tính (+) và không chuyển màu âm tính (-). Phản ứng Catalase Phương pháp - Nhỏ một giọt dung dịch 3% H2O2 lên lame - Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào dung dịch 3% H2O2. Kết quả ¾ Vi khuẩn cho phản ứng Catalase dương tính (+) sẽ gây ra hiện tượng sủi bọt trong dung dịch H2O2; ngược lại khi không sủi bọt thì phản ứng Catalase âm tính(-) Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O-F test) Phương pháp - Chuẩn bị 2 ống nghiệm chứa môi trường O-F đã tiệt trùng. - Tiệt trùng que cấy thẳng và để nguội. - Dung đầu que cấy lấy vi khuẩn trên đĩa agar và cấy thẳng vào 2 ống nghiệm. - Phủ lên 1 trong 2 ống nghiệm 0,5-1 ml dầu parafin và để vào tủ ầm ở nhiệt độ 28-30oC - Kiểm tra hằng ngày đến 7 ngày. So sánh màu của 2 ống nghiệm và ghi nhận kết quả theo bảng dưới đây 35 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Kết quả Ống tiếp xúc không khí Ống phủ dầu parafin Kết quả Xanh lá cây Xanh lá cây Không phản ứng với glucose Xanh lơ ở phần trên Xanh lá cây Phản ứng kiềm tính Vàng Xanh lá cây Phản ứng oxy hóa Vàng Vàng Phản ứng lên men Phản ứng O/129 Test này dùng để phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas và Vibrio. Vi khuẩn Aeromonas kháng (âm tính). Vibrio nhạy cảm (dương tính) với hợp chất này. Phương pháp - Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa nước muối sinh lý tiệt trùng và lắc nhẹ - Dùng pipet tiệt trùng hút vi khuẩn trong ống nghiệm cho 5 giọt lên đĩa agar. - Tiệt trùng que trải thủy tinh bằng cồn 95o và trãi đều vi khuẩn trên đĩa agar. - Đậy nắp để khoảng 1 phút - Dán các đĩa giấy tẩm O/129 ở nồng độ 10µg và 150µg lên đĩa agar. - Ủ trong tủ ấm ở 28oC- 30oC và đọc kết quả sau 24 giờ Kết quả ¾ Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên một vòng tròn vô trùng ≥ 15 mm quanh đĩa tẩm O/129 Môi trường dinh dưỡng dùng để test O/129 phải có nồng độ muối thích hợp cho vi khuẩn Vibrio phát triển, thông thường sử dụng môi trường TSA hoặc NA + 1.5% NaCl Phản ứng Decarboxylase Môi trường: Decarboxylase + 0,5% yeast extract. Thêm 1% amino acid (Arginnine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có amino acid. Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Cấy một ít vi khuẩn vào trong 4 ống nghiệm. Sau đó phủ lên mỗi ống 0,5 ml parafin tiệt trùng. Để trong tủ ấm ở 30oC. - Đọc kết quả từ 1- 4 ngày. Kết quả ¾ Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu ống đối chứng và ngược lại. 36 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Khả năng sinh Indole Môi trường: Nutrient broth Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Để nguội. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử kovac’ s vào ống nghiệm. Kết quả ¾ Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. Phản ứng Voges-proskauer (VP) Môi trường: MR-VP broth Thuốc thử: A: Hòa tan 5 g alpha naphthol trong 100 ml ethyl alcohol. B: Hòa tan 40 g KOH trong 100 ml nuớc cất. Phương pháp - Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ 0,6 ml thuốc thử A và 0,2 ml thuốc thử B vào ống nghiệm. - Lắc đều và để nghiêng ống nghiệm 30 phút. Kết quả ¾ Môi trường chuyểng màu hồng cho phản ứng (+) và ngược lại. Phản ứng tạo Nitrite từ nitrate Môi trường: Nitrate broth Thuốc thử: A: Hòa tan 0,8% sulphanilic acid trong 5-N acid acetic. B: Hòa tan 0,5% alpha-napthylmin 5-N acid acetic. Phương pháp - Cho 3 ml môi trườngvào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Để nguội. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ 1 ml thuốc thử A và 1 ml thuốc thử B vào ống nghiệm. Kết quả ¾ Môi trường chuyển màu đỏ trong vòng 1-2 phút cho phản ứng (+) và ngược lại. Khả năng sử dụng Citrate Môi trường: Simmon’ s Citrate agar. Đun sôi và khuấy cho tan. Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. 37 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu - Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. - Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 30oC. - Đọc kết quả sau 2-7 ngày. Kết quả ¾ Vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường cho kết quả (+) và ngược lại. Khả năng thủy phân Starch Môi trường: Nutrient agar + 0,5% Starch. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội khoảng 45oC, đổ môi trường ra đĩa petri. Thuốc thử Lugol’ s Iodine: Hòa tan KI và Iodone trong 10 ml nước cất rồi thêm tiếp cho đủ 100 ml. Phương pháp - Cấy vi khuẩn lên đĩa petri và ủ ở nhiệt độ 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử Lugol’ s Iodine lên bề mặt agar. - Đọc kết quả trong vòng 30 phút. Kết quả ¾ Nếu xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho phản ứng (+) và ngược lại. Khả năng thủy phân Gelatin Môi trường: Nutrient agar + 1% Gelatin. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội khoảng 45oC, đổ môi trường ra đĩa petri Phương pháp - Cấy vi khuẩn lên đĩa petri và ủ ở nhiệt độ 30oC. - Sau 48 giờ nhỏ thuốc thử HgCl lên bề mặt agar. - Đọc kết quả trong vòng 30 phút. Kết quả ¾ Nếu xuất hiện một vòng tròn lan rộng xung quanh chỗ có vi khuẩn phát triển cho phản ứng (+) và ngược lại. Khả năng sử dụng các nguồn Carbohydrate Môi trường: Nitrate broth 0,4% Bromothymol blue (1,6%) 1% đường (glucose, arabinose, xylose, galactose, sucrose...) Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Để nguội. Dùng môi trường đường tương ứng. - Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC. - Đọc kết quả trong vòng 2-7 ngày. 38 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Kết quả ¾ Nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) và ngược lại. Khả năng sử dụng Urê Môi trường: 0,1% Pepton + 0,0012% Phenol red + 0,1% glucose. Thêm 2% urê cho phản ứng. Môi trường đối chứng không có Urê. Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. Thanh trùng ở 121oC trong 15 phút. - Cấy một ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 30oC. - Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Kết quả ¾ Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có Urê chuyển màu hồng. Khả năng sử dụng đường glucose, sucrose, galactose, sinh gas và H2S Môi trường: TSI (60g/1000ml nước cất). Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. Tiệt trùng ở 121oC trong 15 phút. Để nguội. Phương pháp - Cho 3 ml môi trường vào ống nghiệm. - Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng và chừa lại khoảng 1-2 cm thạch đứng trong ống nghiệm và để nguội. - Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở nhiệt độ 30oC. - Đọc kết quả sau 14-28 giờ. Kết quả ¾ Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm, vi khuẩn sinh gas tạo bọt khí trong ống nghiệm. ¾ Vi khuẩn chỉ lên men đường glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (K/A). ¾ Vi khuẩn lên men đường glucose và lactose hoặc surose cho màu vàng ở cả phần thạch ngiêng và phần thạch đứng (A/A). ¾ Vi khuẩn chỉ lên men đường lactose hoặc sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A/K). ¾ Vi khuẩn không lên men đường glucose, lactose hoặc surose cho màu đỏ ở cả phần thạch nghiêng và phần thạch đứng (K/K). Môi trường Esculin Môi trường: Bile esculin agar Phương pháp: Cấy vi khuẩn thẳng xuống đáy và trên bề mặt môi trường. Ủ ở nhiệt độ 30oC. Đọc kết quả sau 7 ngày. Kết quả ¾ Nếu môi trường có màu cho phản ứng (+) và ngược lại. 39 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu PHỤ LỤC B Phương pháp làm tiêu bản mẫu mô Thu mẫu ở 3 cơ quan: gan, thận, tỳ tạng. Cố định bằng dung dịch formol trung tính 10% trong lọ nhựa, sau đó thực hiện các bước sau: 1. Rửa mẫu sau khi cố định Mẫu mô sau khi cố định trong dung dịch NBF khoảng 24-48 giờ tiến hành rửa dưới vòi nước. Sau đó chuyển sang cồn 70% để bảo quản và xử lý mẫu. 2. Cắt tỉa và định hướng Mẫu trước khi đưa vào quy trình xử lý mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 3-5mm. Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý. 3. Quy trình xử lý mẫu (quy trình xử lý mẫu được thực hiện trên máy) Loại nước Việc loại nước phải đảm bảo nguyên tắc là loại hết nước trong mẫu mô mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế bao trong mẫu mô bị thay đổi. Quá trình loại nước đuợc thực hiện bằng cách nhúng mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 70% đến 100%. Thời gian khử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu mô. Làm trong mẫu (tẩm dung môi trung gian) Vì cồn và paraffin không hòa tan vào nhau nên sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cần phải loại khỏi mẫu mô để tránh tình trạng mô có thể bị co rút khi tẩm paraffin. Dung môi trung gian vừa hòa tan được cồn và paraffin là xylen, xylen ít độc và có tính thấm nhanh. Quá trình này được thực hiện bằng cách ngâm mẫu mô trong xylen qua 2 lọ. Thời gian ngâm mẫu trong mỗi lọ dao động từ 2 giờ đến 2 giờ 30 phút. Ngoài ra để tăng khả năng ngấm paraffin và để loại hoàn toàn cồn ra khỏi mẫu mô, trước khi chuyển sang bước ngấm paraffin, mẫu mô được ngâm trong lọ paraffin hòa tan trong xylen. Tẩm Paraffin Paraffin là chất nền để đảm bảo cho tế bào giữ nguyên hình dạng khi cắt vì thế sau khi làm trong mẫu, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin. Ngâm mẫu qua 2 lọ paraffin, thời gian mỗi lọ khoảng 1 giờ ở nhiệt độ khoảng 56oC Lọ 1: Paraffin + sáp ong với tỉ lệ 1:1 Lọ 2: paraffin + sáp ong với tỉ lệ 7:3 40 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu Các bước loại nước, tẩm dung môi trung gian, tẩm paraffin được thực hiện trên máy Paraffin Embeding Procedures. Cồn 70% .............................................................................................1 giờ Cồn 80% .............................................................................................1 giờ Cồn 95% .............................................................................................1 giờ Cồn 95% .............................................................................................1 giờ Cồn 95% .............................................................................................1 giờ 30 Cồn 100% ...........................................................................................1 giờ 30 Cồn 100% ...........................................................................................1 giờ 30 Xylen 1................................................................................................2 giờ Xylen 2................................................................................................2 giờ Paraffin + Xylen (1:1).........................................................................2 giờ 30 Paraffin + sáp ong (1:1) ......................................................................2 giờ 30 Paraffin + sáp ong (7:3) ......................................................................2 giờ 30 4. Đúc khuôn ¾ Chất nền để đúc khuôn là paraffin: sáp ong nóng chảy (57oC-60oC) tỉ lệ 7:3 ¾ Đổ một ít paraffin vào khuôn ¾ Gắp mẫu mô cho vào khuônÆ đặt mẫu ngay ngắn và ấn cho mẫu sát vào đáy khuônÆ tiếp tục đổ paraffin đầy khuôn. ¾ Đặt vào tủ lạnh hoặc ngăn lạnh để paraffin đặc lại. ¾ Lấy khối mô ra khỏi khuôn và đặt trong tủ lạnh để làm rắn lại. 5. Cắt mẫu Sử dụng máy microtome để cắt mẫu. Mẫu phải được làm lạnh khi cắt. Chuẩn bị máy cắt Đặt lưỡi dao vào máy cắt sao cho lưỡi dao lệch với mặt cắt một góc 15o-40o Tiến hành cắt ¾ Đặt khối mẫu vào máy cắt lát mỏng, chỉnh cho khối mẫu nagng và thẳng đứng. ¾ Điều chỉnh độ dày lát cắt, có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12µm. ¾ Sau khi cắt bằng mặt khối paraffin và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày về vạch 4-6µm và cắt mẫu. ¾ Mẫu cắt tạo thành dãy băng dài, cho dãi băng vào nước ấm ở nhiệt độ 45oC-50oC cho dãy paraffin căng ra, dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn đạt yêu cầu. 6. Dán mẫu ¾ Dán mẫu bằng dung dịch Mayer ’ albumin. ¾ Thoa dung dịch lên lame, đặt một đầu lame vào chậu nứơc ấm nghiệng một góc 45o và nâng từ từ lên, lát cắt sẽ được dán chặc lên phiến lame. 41 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu ¾ Cho lên bàn sấy (slide warmer) với nhiệt độ từ 45oC-50oC ¾ Để qua đêm cho paraffin tan ra và mẫu được khô. 7. Nhuộm mẫu Quy trình nhuộm mẫu được thực hiện trên máy và tiến hành theo các bước sau: Xylene 1..............................................................................................5 phút Xylene 2..............................................................................................5 phút Xylene 3..............................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Cồn 70% .............................................................................................2 phút Rửa nước.............................................................................................5 phút Haematoxyline ....................................................................................1 phút Rửa nước.............................................................................................5 phút 1% acid alcohol...................................................................................10 giây Rửa nước.............................................................................................3 phút Eosin ...................................................................................................3 phút Cồn 95% .............................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Cồn 100% ...........................................................................................5 phút Xylen...................................................................................................5 phút Xylen...................................................................................................5 phút 8. Dán Lamelle vào lame ¾ Để mẫu giữ được lâu và tăng tính chiết quang của mẫu, dùng keo enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu. ¾ Nhỏ một giọt keo lên mẫu, đặt lamelle nghiêng 45o và tiếp xúc với giọt keo, hạ lame xuống từ để tránh bọt khí. 9. Đọc kết quả ¾ Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10X để quan sát tổng quát tiêu bản. Nếu tiêu bản đẹp đạt yêu cầu có nhân bắt màu tím xanh của hematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng Eosin. ¾ Các tiêu bản đẹp sẽ được quan sát lần lượt ở độ phóng đại 40X, 100X (nhỏ giọt dầu). ¾ Chụp hình những tiêu bản đẹp, đặc trưng. 42 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu PHỤ LỤC C Bảng số lượng cá chết hàng ngàytrong thí nghiệm gây cảm nhiễm E. ictaluri Lần lặp lại Nghiệm thức (CFU/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1×105 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 1×105 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 1×105 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 1 1×106 0 0 1 3 0 0 0 0 0 0 2 1×106 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 1×106 0 0 0 1 1 0 0 0 0 0 1 1×107 0 0 3 2 0 0 0 0 0 0 2 1×107 0 0 5 1 0 0 0 0 0 0 3 1×107 0 0 4 0 1 0 0 0 0 0 1 1×108 0 4 3 0 0 0 0 0 0 0 2 1×108 0 5 2 0 0 0 0 0 0 0 3 1×108 0 3 5 0 0 0 0 0 0 0 Bảng số lượng cá chết hàng ngàytrong thí nghiệm gây cảm nhiễm A. hydrophila Lần lặp lại Nghiệm thức (CFU/ml) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Đối chứng 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2,16×103 0 4 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2,16×103 0 3 1 0 0 0 0 0 0 0 3 2,16×103 0 5 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2,16×104 3 3 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2,16×104 2 3 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2,16×104 3 4 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2,16×105 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2,16×105 6 1 1 0 0 0 0 0 0 0 3 2,16×105 7 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 2,16×106 4 2 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2,16×106 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2,16×106 6 0 0 0 0 0 0 0 0 0 43 Trung tâm Học liệu ĐH Cầ Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu