Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý sinh sản của cá nâu (scatophagus arguslinnaeus, 1766)

hương pháp phân tích hồng cầu và bạch cầu-------------------- 12 3.2.4.4 Phương pháp đo Hematocrit (tỉ lệ huyết sắc tố, %)-------------- 13 3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu--------------------------------------------- 14 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ----------------------------------------- 15 4.1. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU CÁI ---------------------- 15 4.1.1 Các giai đoạn phát triển của buồng trứng --------------------------- 15 4.1.2.Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá nâu cái ---------------------------------------------------------------- 16 4.1.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với hệ số thành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark --------------------------------- 17 4.1.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với tỷ lệ khối lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan cá nâu cái----------------------------------------- 18 ii 4.1.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu cá nâu cái ---------------------------------------------------------------- 19 4.1.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu cái ----------- 19 4.1.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hàm lượng vitellogenines và protein cá nâu cái ----------------------------------- 20 4.2.ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU ĐỰC---------------------- 19 4.2.1. Các giai đoạn phát triển của buồng tinh------------------------------ 21 4.2.2. Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá nâu đực -------------------------------------------------------------------- 22 4.2.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hệ số thành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark cá nâu đực--------------------- 22 4.2.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với tỷ lệ khối lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan cá nâu đực ----------------------------------------- 23 4.2.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu cá nâu đực----------------------------------------------------------------- 23 4.2.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu đực ---------- 24 4.2.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hàm lượng vitellogenines và protein cá nâu đực ---------------------------------- 24 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT --------------------------------------------- 26 5.1 Kết luận------------------------------------------------------------------------- 26 5.2 Đề xuất ------------------------------------------------------------------------- 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO ------------------------------------------------------------ 27 iii LỜI CẢM TẠ Trong khoảng thời gian thực hiện luận văn vừa qua nhờ sự chỉ dẫn, dạy bảo tận tình của thầy cô đã giúp cho em có được những kiến thức bổ ích cho công việc sau nầy, em xin chân thành gửi lời cảm ơn đến: Thầy Nguyễn Thanh Phương, Thầy Lý Văn Khánh đã giúp cho em nhận thấy được những khoảng trống kiến thức cần bổ sung, đồng thời nhờ sự chỉ dẩn quý báo của thầy cô để luận văn hoàn thành theo đúng mục tiêu. Em xin chân thành cám ơn tất cả thầy cô, cán bộ Khoa Thủy Sản đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em trong suốt thời gian học tập cũng như thực hiện đề tài. Em xin chân thành cám ơn các anh chị cao học, các bạn sinh viên lớp nuôi trồng thủy sản K31, các bạn lớp bệnh học thủy sản K31 đã giúp đỡ em trong những lúc em gặp khó khăn. iv TÓM TẮT Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý sinh sản của cá nâu (Scatophagus argus Linnaeus, 1766) được thực hiện từ tháng 04/2009 đến 06/2009 nhằm mục tiêu xác định mối tương quan giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục với hàm lượng vitellogenines trong huyết tương, số lượng, tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương, hàm lượng protein trong huyết tương, cơ và gan. Kết quả cho thấy cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 5 có độ béo Fulton (13,22) và độ béo Clark (10,93) đạt cao nhất và thấp nhất là giai đoạn 1. Khối lượng gan trung bình của cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 3 là lớn nhất (4,59 g/con) và hàm lượng vitellogenines trong huyết tương của cá nâu cái tăng dần theo sự phát triển của tuyến sinh dục và đạt cao nhất ở cá có tuyến sinh dục giai đoạn 5 (3,73 µg ALP/ml protein). Ở cá nâu đực có hệ số thành thục không khác nhau giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục. Cá nâu đực có tuyến sinh dục giai đoạn 1 có độ béo Fulton (9,01) và độ béo Clark (8,14) đạt cao nhất và thấp nhất là giai đoạn 4 và hàm lượng vitellogenines trong huyết tương của cá nâu đực đạt cao nhất ở cá có tuyến sinh dục giai đoạn 3 (3,48 µg ALP/ml protein). 1 PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ Nguồn lợi thủy sản ngày nay được xem là nguồn tài nguyên quan trọng đối với cuộc sống con người. Hầu hết các quốc gia trên thế giới đều sử dụng sản phẩm thủy sản làm thức ăn và đây là nguồn cung cấp đạm tốt nhất cho con người. Tuy nhiên, trong những năm gần đây nguồn lợi thủy sản nói chung bị giảm mạnh do khai thác và đánh bắt quá mức đồng thời nghề nuôi cũng đang gặp khó khăn do vấn đề dịch bệnh, ô nhiễm môi trường và vấn đề con giống. Ở Việt Nam, nuôi thủy sản đang là thế mạnh trong phát triển kinh tế xã hội hiện nay, nó đóng góp đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu của cả nước. Trong nghề nuôi thủy sản ven biển thì tôm sú, tôm thẻ chân trắng, cá mú, cá chẽm, cua biển đang là đối tượng nuôi chính và phổ biến nhưng giá cả giảm mạnh nhất là đối với tôm sú, cá tra, cua biển... Do đó đa dạng hóa đối tượng và mô hình nuôi là một trong những yêu cầu phát triển của nghề nuôi thủy sản nhằm giảm áp lực lên một vài loài tiêu biểu. Hiện nay trong nghề nuôi cá biển, bên cạnh một số loài bản địa như cá mú, cá chẽm,… thì cá nâu cũng được xem là loài có triển vọng nuôi ở vùng ven biển. Cá nâu (Scatophagus argus) là loài có kích thước tương đối lớn, thịt cá béo có mùi vị thơm ngon, có giá trị thương phẩm cao. Các nghiên cứu về đối tượng này còn rất hạn chế đặc biệt là những đặc điểm sinh học sinh lý và sinh sản. Để cung cấp thêm những thông tin cần thiết để hoàn thiện qui trình sản xuất giống và góp phần đưa đối tượng này trở thành đối tượng nuôi phổ biến nên chúng tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý sinh sản của cá nâu (Scatophagus argus Linnaeus, 1766)”. Mục tiêu Tìm hiểu mối tương quan giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục với: - Hàm lượng vitellogenines trong huyết tương - Số lượng và tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương - Hàm lượng protein trong huyết tương, cơ và gan Nội dung  Phân tích mô học xác định các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục  Phân tích hàm lượng vitellogenines trong huyết tương  Phân tích số lượng và tỷ lệ hồng cầu và bạch cầu trong huyết tương  Phân tích hàm lượng protein trong máu, cơ và gan 2 PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm hình thái 2.1.1 Vị trí phân loại: Bộ: perciformes Họ: Scatophagidae Giống: Scatophagus (Cuvier và Valenciennes, 1831) Loài: Scatophagus argus Linnaeus, 1766 Cá nâu (Scatophagus argus) có kích thước tương đối lớn, thịt cá béo, có muồi vị thơm ngon, có giá trị thương phẩm cao. Theo Barry (1992) thì cá nâu có 2 giống là Scatophagus và Selenotoca. Ở Việt Nam theo các tác giả như Yên (1992), Khoa và Hương (1993) thì chỉ có một giống và một loài cá nâu duy nhất là (Scatophagus argus Linnaeaus, 1766). Các nghiên cứu về đối tượng nài hiện còn rất hạn chế, phần lớn tập trung vào phân loại, mô tả, một số thông tin ngắn về thành phần giống loài và sự phân bố, còn những dẫn liệu về đặc điểm sinh học dinh dưỡng và sinh sản loài cá nâu (Scatophagus argus) để làm cơ sở cho các nhiên cứu về sản xuất giống và nuôi là một yêu cầu cấp thiết. Hình 2.1: Hình dạng bên ngoài cá nâu (Scatophagus argus Linnaeus, 1766) Cá nâu mình rất dẹp bên, cao thân, lưng hình vòm, nhìn ngan gần như tròn. Cá có đầu nhỏ, mắt ngắn, mõm tù, miện nhỏ, trên hàm có răng mịnh, mắt cá lớn vừa, lỗ mũi trước tròn, lỗ mũi sau là vạch, màng mang hẹp và liền với eo mang. Vảy lược, nhỏ, phủ khắp thân, đầu, gốc vi hậu môn, vi lương và đuôi, rìa tia vi lưng va tia hậu môn gần như thẳng đứng ,viền sau vây đuôi thẳng (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương, 1993). Đường bên hoàn toàn, bắt đầu từ mép trên lổ mang, cong lên phía trên, sao đó chạy đến giữa cuốn đuôi. Khởi điểm vi lưng nằm ngang phần cuốn xương nắp mang, gai vi cứng nhọn, gai thứ IV, V, VI đài hơn các vi khác. Trước gốc vi lưng có 1 gai không cử động được, hướng về phía đầu. Khởi điểm vi hậu môn ngang với gai cuốn cùng của vi lưng, vi hậu môn có một gai và nhọn. 3 Cá nâu có thân màu xám , nửa trên của thân có rất nhiều chấm đen, to tròn, các đóm nầy nhạt dần về phía bụng, số lượng và hình dạng thay đổi theo từng cá thể. Vi ngực có màu traengs trong, màng da giữa các tia vi còn lại có nhiều sác tố đen. 2.2 Đặc điểm phân bố Cá nâu được tìm thấy ở Rajpara- Ấn Độ, có chiều dài lớn nhất 334 mm và co khối lượng 1,2kg (Khang, 1984). Phân bố nhiều từ Nhật đến Ấn Độ -Thái Bình Dương bao gồm cả vùng biển phía nam Trung Quốc (Mohsine và ctv, 1996). Cá nâu có thể sống từ vùng nước mặn, vùng cửa sông và cả trong nước ngọt, phần lớn sống ở biển. vùng phân bố từ bờ biển Trung Quốc dọc đến Úc Châu (Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương,1993). Theo Nguyễn Hữu Phụng (1995) thì cá nâu sống ở biển , nườc lợ và nước ngọt , phân bố từ Ấn Độ, Úc, Srilanka, Indonesia, Malaysia, Mew Caledonia, Philipphines, Thái Lan, Trung Quốc, Việt Nam. Ở Việt Nam cá nâu phân bố trong đầm, kểnh rạch nước lợ và cửa sông (Nguyễn Tấn Trịnh và ctv, 1996; Mai Đình Yên, 1992) và có ở cả 3 vùng nước gồm Vịnh Bắc Bộ, Miền Trung và Miền Nam Bộ (Nguyễn Hữu Phựng,1995) 2.3 Tập tính dinh dưỡng Cá nâu ăn được nhiều loại thức ăn khác nhau như giun, giáp xác, côn trùng, các vật chất có nguồn gốc từ thực vật tảo …(Fishbae,2000). Trong báo cáo của Nguyễn Tấn Trịnh cá nâu là loài ăn tạp, thức ăn của cá là tảo Silic tảo Enteromopha, tảo Chaetomorpha… Theo Chang (1997) thức ăn cho ấu trùng mới nở trong những ngày đầu tiên là luân trùng Branchionus (rotifer). Sau 9 ngày có thể ăn ấu trùng artemia và sau 19 ngày có thể ăn được copepode 2.4 Đặc điểm sinh trưởng Các nghiên cứu về cá nâu hiện nai còn rất ít, theo báo cáo của Nguyễn Tấn Trịnh và ctv (1996) thì cá nâu có kích thước tương đối lớn. Cá nâu lớn nhất được tìm thấy có chiều dài 33 cm (Allen, 2000). Trong một số đầm nuôi ven biển chúng có sản lượng khai thác đáng kể, chiều dài cá đánh bắt đạt đến 143-175 mm với khối lượng tương ứng105-140 g. Theo nghiên cứu của Assadi và Delighani (1997) thì cá nâu có chiều dài cực đại là 30 cm. Barry và Fast (1992) nghiên cứu về cá nâu cho biết cá cái dài tối đa 28 cm và con đực 27 cm. cá nâu rất thường được nuôi như một loài cá kiểng, nhất là ở giai đoạn nhỏ (Mohsine, 1996) 2.5 Đặc điểm sinh sản Sự thành thục của cá lần đầu tiên ở cá cái khoảng 150 g, tương ứng với cá khoảng 7-9 tháng tuổi và cá đực thành thục sớm hơn cá cái (Barry và Fast, 1992). Sự khác biệt về giới tính của cá nâu có thể phân biệt được dựa vào hình dạnh đầu (Barry và Fast, 1992). Đặc điểm nầy phân biệt tương tự như xác định trên cá tai tượng (Osphronemus gourami) là “trán cá đực” (Ngô Trọng Lư và Thái Bá Hổ, 2003) Đường kính trứng khoảng 0,4 mm là thích hợp cho việc kích thích cho cá sinh sản bằng phương pháp tiêm kích dục tố. Trứng chín mùi có đường kính 4 trứng khoảng 0,6 mm, giọt dầu khoản 0,2 mm vỏ trứng phẳng, trong suốt, màu vàng sáng, trứng rời và nổi. Trứng cá nâu thụ tinh trôi nổi hoàn toàn, bán trong suốt và đường kính trứng khoảng 0,78-0,8 mm theo Arlo W. Fast (1988) trứng cá nâu thành thục có đường kính trứng 0,5 mm. Sự khác biệt về giới tính của cá nâu có thể được phân biệt dựa vào hình dạng đầu (Barry & Fast, 1992). Đặc điểm nầy cũng đã được tác giả Nguyễn Tường Anh xác định trên cá tai tượng “cá đực trán có khối u lớn hơn cá cái”. Theo đánh giá của các nhà khoa học, thì cá nâu có thể trở thành đối tượng nuôi trong các đầm nước lợ vì nó không cạnh tranh thức ăn với các đối tượng nuôi khác và có nguồn giống trong tự nhiên rất phong phú. Tuy nhiên các nghiên cứu trước đây của Yên(1992), Khoa & Hương (1993)cũng như ngoài nước cũng chỉ tập trung vào đặc điểm hình thái phân loại, mô tả và một số thông tin ngắn về sự phân bố, đặc tính dinh dưỡng và sinh sản. Còn những dẩn liệu sinh học sinh sản của loài cá nầy chưa được quan tâm đúng mức. 5 PHẦN III: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Địa điểm: Trại thực nghiệm Bộ môn Kỹ thuật nuôi Hải sản và phòng thí nghiệm sinh lý Bộ môn Dinh dưỡng và chế biến thủy sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại học Cần Thơ. 3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1 Vật liệu thí nghiệm • Bể nhựa • Ống tiêm 1 ml • Thuốc chống đông • Máy ly tâm • Dụng cụ mỗ cá • Lame, lamelle • Pipet • Lọ nhuộm tiêu bản • Kính hiển vi • Buồng đếm hồng cầu • Tủ trữ đông mẫu (-800C ) • Máy nghiền cơ • Máy cắt mô • Cân điện tử • Thước • Các hóa chất, dụng cụ phòng thí nghiệm sinh lý và phòng thí nghiệm Bộ môn dinh dưỡng và chế biến thủy sản – Khoa Thủy Sản – Trường Đại học Cần Thơ 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu Thu mẫu cá ngoài tự nhiên (đủ 6 giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục, mỗi giai đoạn phát triển phôi thu khoảng 10 cá thể), mẫu cá thu được phân tích các chỉ tiêu: • Đo chiều dài tổng, chiều dài chuẩn và chiều cao • Cân khối lượng cá, khối lượng cá không nội tạng và khối lượng tuyến sinh dục (buồng trứng và buồng tinh), khối lượng gan cá • Mẫu tuyến sinh dục (buồng trứng và buồng tinh) phân tích mô học xác định giai đoạn tuyến sinh dục. • Mẫu cơ và gan cá phân tích protein 6 • Mẫu máu phân tích vitellogenines, protein, tỷ lệ và số lượng hồng cầu và bạch cầu, hemoglobin • Hệ số thành thục = 100 x (Khối lượng buồng trứng/Khối lượng thân) • Độ béo Fulton (F) = Khối lượng thân (g)/Chiều dài chuẩn (cm) • Độ béo Clark (C) = Khối lượng thân bỏ nội quan (g)/Chiều dài chuẩn (cm) 3.2.3 Phương pháp thu mẫu máu Đa số các loài cá xương đều có hệ thống tuần hoàn giống nhau bao gồm tim, hệ thống động mạch và hệ thống tỉnh mạch nối liền với nhau. Máu được lấy từ động mạch đuôi bằng ống tiêm nhựa có thể tích 1 ml với đầu kim tiêm 1/2-26, gồm các bước sau: - Trước khi lấy mẫu máu, ống tiêm và kim tiêm được tráng qua bằng heparin. Heparin là một chất chống đông máu (anticoagulant) được sử dụng ở người, heparin nầy ít ảnh hưởng đến các chỉ tiêu về thể tích của tế bào (Blaxhall, 1973), pH máu hay áp suất của O2 và CO2 (Hattingh, 1975; Smit và ctv, 1977) (được trích dẫn bởi Arthur H. Houston, 1990). Ống tiêm và kim tiêm được sử dụng riêng biệt cho từng mẫu cá. - Ống chứa máu 1,5 ml (ependorf tube) được chuẩn bị riêng cho từng mẫu cá. - Lượng máu lấy ở mỗi cá khoảng 2 ml và được giữ lạnh trong nước đá suốt thời giai lấy mẫu. 3.2.4 Các phương pháp phân tích 3.2.4.1 Phương pháp phân tích mô học Mẫu tuyến sinh dục xác định các giai đoạn phát triển tuyến sinh dục bằng phương pháp mô học theo qui trình xử lý mẫu và nhuộm mẫu bằng Mayer's Hematoxylin và Eosin (Hinton, 1990) Giải phẩu cá tách lấy tuyến sinh dục (TSD) cố định trong dung dịch formon 4%, sau 24h lấy mẫu bảo quản trong dung dich cồn 50%. Sau khi cố định TSD được cắt ra thành từng phần nhỏ với độ dầy 3-5 mm cho vào histocasset và ngâm trong cồn 70% đến khi sử lý. Quy trình xử lý mẫu Hoá chất Thời gian Cồn 80% Cồn 95% Cồn 95% Cồn 100% Cồn 100% Cồn 100% Xylen 1 giờ 1 giờ 1 giờ 1 giờ 30 1 giờ 30 1 giờ 30 2 giờ 7 Xylen Xylen Paraffin + xylen (5:5) Paraffin + sáp ong (5:5) Paraffin + sáp ong (7:3) 2 giờ 2 giờ 2 giờ 30 2 giờ 2 giờ Đúc khối Sau khi xử lí xong đặt mẫu trong khung paraffin khoảng 30 phút để mẫu ngấm paraffin tốt. Sau đó dùng kẹp gắp mẫu ra đặt trong khung inox, định hướng mẫu cho đúng rồi đổ paraffin nóng chảy (57 – 60oC) vào khuôn, đồng thời làm lạnh khuôn để mẫu được cố định vững chắc, ấn cho mẫu sát vào đáy khuôn, tiếp tục đổ paraffin vào đầy khuôn. Đặt vào ngăn lạnh hay tủ lạnh để paraffin đặc lại. Lấy khối mô ra khỏi khuôn và đặt vào trong tủ lạnh để làm rắn lại. Cắt mẫu Tiếp theo mẫu được cắt thành từng băng dài và mỏng bằng máy cắt (microtome) với độ dày 4 – 6 µm, dùng kim mũi giáo tách lấy đoạn mẫu không bị vỡ và đặt lát cắt lên lam đã nhỏ sẵn một ít nước ấm (45-500C) cho lát cắt căng ra. Cho lên bàn sấy (slide warmer) với nhiệt độ từ 45 – 500C trong thời gian 12 -24 giờ để paraffin tan ra và mẫu được khô. Nhuộm và dán mẫu Hóa chất Thời gian Xylen Xylen Xylen Cồn 100% Cồn 100% Cồn 70% Rửa nước Haematoxylin Rửa nước Rửa nước Eosin Cồn 95% Cồn 100% 5 phút 5 phút 5 phút 5 phút 5 phút 5 phút 5 phút 2 phút 1 phút 1 phút 2 phút 5 phút 5 phút 8 Cồn 100% Xylen Xylen 5 phút 5 phút 15 phút Dán lame vào vùng có mẫu trên lam bằng keo Canada balsam. Làm khô mẫu Đọc kết quả Quan sát mẫu trên kính hiển vi để xác định các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục. 3.2.4.2 Phương pháp phân tích vitellogenines (protein tạo noãn hoàng) Mẫu Máu được thu từ động mạch lưng bằng kim tim và sau đó ly tâm lạnh ở 4oC trong vòng 6 phút (6.000 vòng/phút), sử dụng huyết tương để đo hàm lượng vitellogenines. Hàm lượng vitellogenines được xác đị nh bằng phương pháp so màu quang phổ (theo phương pháp Alkali-Labile Phosphate dựa trên đường chuẩn Phophorus Standard và so màu ở bước sóng 660 nm). Để xác định được hàm lượng vitellogenines cần trước hết cần xác định hàm lượng protein và alkali-labile phosphate (ALP) có trong huyết tương. * Phương pháp phân tích Protein Lượng protein được xác định theo phương pháp Lowry và ctv (1951) sử dụng Albumine bovine (BSA, Sigma) làm đường chuẩn. Chuẩn bị hoá chất BSA: 10mg/ml H20 Hỗn hợp A: 150 ml Na2CO3 2% + 1,5 ml CuSO4 1% + 1,5 ml NaK Tartrate 2% Folin: 10 ml Folin + 10 ml H2O 9 Quá trình phân tích protein Hóa chất Đường chuẩn Mẫu 0 mg protein 0,05 mg protein 0,1mg protein 0,2 mg protein 0,5 mg protein BSA 0µL 5 µL 10 µL 20 µL 50 µL / Mẫu / / / / / 10 H2O 500 µL 495 µL 490 µL 480 µL 450 µL 490 µL NaOH 1N 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL Ủ trong 30 phút Hỗn hợp A 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Ủ trong 15 phút Folin 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL 500 µL Ủ trong 30 phút Đọc ở bước sóng 660 nm Đường chuẩn Albumine bovine cho phép xác định được lượng protein (mg protein/ml plasma) có trong mẫu. * Phương pháp phân tích Alkali-labile phosphate (ALP) ALP được xác định dựa vào đường chuẩn phosphorus standard Hóa chất phân tích Acid Molybdate: 0,625 mg Amonium molybdate/50 ml H2SO4 2,5M Reducer: 1,58 g/10 ml H2S TCA 20%: 20 g Trichloro acetic acid/100 ml H20 NaOH 2N: 8 g/100 ml H20 HCl 2N: 83,4 ml/16,6 ml H20 Ethanol absolut Acetone Diethylether Chloroforrm 10 Quá trình phân tích 30 ml plasma + 1ml TCA 20% trong15 phút Ly tâm 10 phút (40C): RPM = 3300 rpm. Dùng pipet lấy phần cô đặc 1 ml Ethanol Để vào nước nóng 60oC trong vòng 10 phút Li tâm 2 phút (4oC) ; RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1ml chloroform : 2 ml diethylether : 2ml ethanol trong 5 phút Li tâm 2 phút (4oC); RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1 ml aceton trong 5 phút Ly tâm 2 phút (4oC); RPM = 8000 rpm. Lấy phần cô đặc 1 ml diethylether trong 5 phút Ly tâm 2 phút(4oC); RPM = 8000 rpm Lấy phần cô đặc sấy khô khoảng 1 giờ (50-60oC) 500 µl NaOH 2N Để vào nước nóng 100oC trong 15 phút. Lấy ra để nguội 500 µl HCl 2N. 11 Dùng pipet hút 400 µl mẫu cho vào ống nghiệm rồi tiến hành như sau: Mẫu Phosphorus Standard Nước Acid Molybdate Reducer Tổng Mẫu 400 / 400 200 50 1.050 Đường chuẩn 0 µg/l / / 800 200 50 1.050 0,2 µg/l / 10 790 200 50 1.050 0,5 µg/l / 25 775 200 50 1.050 1 µg/l / 50 750 200 50 1.050 2 µg/l / 100 700 200 50 1.050 4 µg/l / 200 600 200 50 1.050 6 µg/l / 300 500 200 50 1.050 Chờ 10 phút So màu ở bước sóng 660 nm Thiết lập phương trình tương quan cho mẫu chuẩn từ đó dựa trên đường chuẩn và độ hấp thu để tính toán hàm lượng ALP (µg ALP/ml plasma) trong mẫu. Kết quả µg ALP/ml plasma µg ALP Vitellogenines = -------------------------- = -------------- mg protein/ml plasma mg protein 3.2.4.3 Phương pháp phân tích hồng cầu và bạch cầu Định lượng hồng cầu - Máu được pha loãng 200 lần bằng dung dịch Natt & Herrick trong 3 phút và hồng cầu được đếm bằng buồng đếm hồng cầu - Cách pha loãng: 5µl +995µl dd Natt – Henrick. Sau khoảng 3 phút cho vào buồng đếm và đếm số lượng hồng cầu. Số lượng hồng cầu được tính bằng công thức A (triệu tb/mm3) = a x 200/0,02 x 10-6 Trong đó: a: số hồng cầu trong 5 vùng đếm 200: độ pha loãng 0,02: thể tích vùng đếm (5 x 16 x 0,0025 mm3 x 0,1mm) 12 Hình 3.1: Buồng đếm hồng cầu Cách pha dung dịch Natt- Henrick: • NaCl 3,88g • Na2SO4 2,5g • Na2HPO4.12H2O 2,91g • KH2PO4 0,25g • Formalin(27%) 7,5g • Methyl violet 0,1g Định loại bạch cầu Cho một giọt máu lên lam kính, dùng lamel trải đều theo chiều ngược lại, để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó ngâm trong methanol 1-2 phút. Nhuộm mẫu bằng phương pháp nhuộm Wright &Giemsa (Hamuson, 1979 trích dẩn bởi Rowley 1990). các bước nhuộm mẫu: Nhuộm với dung dịch Wright trong 3-5 phút Ngâm trong dung dịch pH 6,2-6,8 trong 5- 6 phút Nhuộm với dung dịch Giemsa trong 20 – 30 phút Ngâm trong dung dịch pH 6,2 trong 15-30 phút Rửa qua nước cất để khô tự nhiên Quan sát dưới khính hiển vi ở vật kính 100x, xác định các loại bạch cầu theo Supranee (1991) Tổng bạch cầu: đếm tổng số hồng cầu và bạch cầu trên 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. W = (1500 - h) x H/h Trong đó: h: Số hồng cầu đếm được trên tổng số 1.500 tế bào trên mẫu nhuộm. H: Mật độ hồng cầu trong mẩu máu 13 3.2.4.4 Phương pháp đo Hematocrit (tỉ lệ huyết sắc tố, %) Đây là phương pháp xác định tỉ lệ thể tích các tế bào máu so với huyết tương. Máu thu được cho vào ống thủy tinh (hematocrit tube), ly tâm hematocrit tube bằng máy ly tâm chuyên biệt trong 2 phút với tốc độ lắng 12.000 vòng/ phút. Dùng thước đo có chia vạch từ 0-100% để xác định tỉ lệ huyết sắc tố (Larsen & Snieszko,1961 trích dẩn bởi Đỗ Thị Thanh Hương, 1997) Các chỉ số liên quan đến hồng cầu cũng được tính như dựa theo phương pháp của Weiberg và ctv (1972) Thể tích hồng cầu MCV (µ3) = 10 x tỉ lệ huyết cầu (%) [số lượng hồng cầu (106/mm3)] Khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu MCH (pg/tb) = 10 x [huyết sắc tố (g/100 ml)]/ [số lượng hồng cầu (106/mm3)] Nồng độ của huyết sắc tố trong hồng cầu (MCHC) (%) MCHC (%) = 100 x tỉ lệ huyết cầu (%)/[huyết sắc tố (g/100 ml)] Phương pháp đo hemoglobin Hemoglobin được đo bằng thuốc thử Drabkin (Oser, 1965) Cách pha Drabkin: gồm thuốc thủ I (Reagent I, HR I) và thuốc thử II (Reagent II,HR II) - Thuốc thử I: 20 g K3Fe(CN)6 trong 1.000 ml nước cất - Thuốc thử II: 75 g KHCO3và KCN trong 1.000 ml nước cất - Pha 10 ml (HR I) và 10 ml (HR II) và 980ml nước cất có dung dịch thử. Cách đo: pha loãng 10µl máu tu được với 2,5ml dung dịch Drabkin trong cuvet. Thuốc thử chuyển huyết sắc tố thành Cynomethemoglobin có màu vàng theo 2 phản ứng Potassium ferrcyanide Hemoglobin (Fe2+) Methemoglobin Potassium cyanide Methemoglobin (Fe3+) Cyanomethemoglobin Dùng máy hấp thu quang phổ (UV spectrophotometer) đo mức độ hấp thu ánh sánh của dung dịch ở bước sóng 540 nm, ở nhiệt độ 25-30ºC. Số lượng huyết sắc tố tính theo công thức: Số lượng huyết sắc tố mmol/l (A) = (0,019 + 37,74 a) x 0,621 Trong đó: a là mức độ hấp thu ánh sáng hay số đo được từ máy quang phổ, mỗi mẫu máu được chuẩn bị thành 2 lần lập lại 14 Số lượng huyết sắc tố g/100 ml = A x 1,1625 3.2.5 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu được phân tích giá trị trung bình (average), độ lệch chuẩn (standard deviation), phương trình hồi qui (sử dụng chương trình microsoft office Excel 2003) và so sánh sự khác biệt giữa các nghiệm thức dựa vào phân tích Anova và Duncan (sử dụng phần mềm SPSS 11.5) với mức ý nghĩa p < 0,05. 15 PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU CÁI 4.1.1 Các giai đoạn phát triển của buồng trứng Giai đoạn 1: Noãn sào rất nhỏ, mảnh, trong suốt, rất khó phân biệt được tinh sào hay noãn sào bằng mắt thường. Trong noãn sào xuất hiện nhiều tế bào thuộc thời kỳ đầu sinh trưởng nguyên sinh chất, tế bào có nhiều góc cạnh, kích thước nhỏ. Tế bào chất ưa kiềm mạnh, nhân nhỏ tròn, bắt màu tím nhạt. Số tiểu hạch ít Giai đoạn 2: Noãn sào gia tăng kích thước và có thể phân biệt rõ tuyến sinh dục đực, cái bằng mắt thường. Kích thước noãn sào nhỏ, màu hơi hồng, màng mỏng, rất khó thấy hạt trứng bằng mắt thường. Trong noãn sào chứa các tế bào ở cuối thời kỳ sinh trưởng nguyên sinh chất, tế bào chất ưa kiềm yếu hơn giai đoạn 1, các tiểu hạch di chuyển ra ngoài màng nhân Giai đoạn 3: Kích thước noãn sào gia tăng rõ, noãn sào có màu vàng nhạt, trên noãn sào đã có mạch máu phân bố. Có thể thấy rõ các hạt trứng trong noãn sào bằng mắt thường. Chúng rất nhỏ, khó tách rời khỏi các tấm trứng. Thời kỳ này các noãn bào bắt đầu chuyển sang giai đoạn sinh trưởng chất dinh dưỡng, do đó noãn bào lớn lên rõ nhờ sự tích lũy chất dinh dưỡng. Tế bào chất còn ưa kiềm nhưng còn rất yếu. Noãn hoàng xuất hiện nhiều hơn, tạo thành một lớp dầy và bắt màu hồng của eosin rõ Giai đoạn 4: Noãn sào có kích thước lớn, có màu vàng tươi, hơi đậm hơn so với noãn sào ở giai đoạn 3. Mạch máu phân bố trên noãn sào nhiều hơn, các hạt trứng to và tương đối đồng đều. Trong noãn sào tổ chức liên kết ít, mạch máu phát triển, màng noãn sào mỏng, có số ít tế bào ở thời kỳ đầu và cuối sinh trưởng nguyên sinh chất. Đa số tế bào ở thời kỳ lớn nguyên sinh noãn hoàng Giai đoạn 5: Noãn sào có kích thước rất lớn, có màu sắc đậm hơn so với giai đoạn 4. Trong noãn sào, chủ yếu là các tế bào trứng đã kết thúc thời kỳ lớn noãn hoàng và chuẩn bị cho thời kỳ đẻ sắp tới. Noãn hoàng tích luỹ đầy trong tế bào chất, số tiểu hạch trong nhân giảm và từ từ tan biến vào dịch nhân Giai đoạn 6: Sau khi cá đẻ xong, noãn sào teo lại, mềm nhão, màng noãn sào nhăn nheo, mạch máu phát triển đều, bên trong có dịch bầm đỏ. Trong noãn sào một số tế bào trứng không được đẻ ra và một số trứng nhỏ bám chặt vào tấm trứng, tổ chức liên kết và mạch máu nhiều, số noãn bào đang thoái hoá và được tái hấp thu, bên cạnh đó vẫn còn có tế bào dự trữ, và một số tế bào chuyển về giai đoạn 2 16 Các giai đoạn phát triển của buồng trứng qua quan sát mô học Giai đoạn 1 Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Giai đoạn 4 Giai đoạn 5 Giai đoạn 6 Hình 4.1: Các giai đoạn phát triển của buồng trứng cá nâu 4.1.2. Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá nâu cái W = 0,1947H2,9964 R2 = 0,9511 W = 0,1107Lc2,7766 R2 = 0,9723 W = 0,0732Lt 2,7494 R2 = 0,9694 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 0 5 10 15 20 25 cm/con g/con Chiều dài tổng (Lt) Chiều dài chuẩn (Lc) Chiều cao (H) Hình 4.2: Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá nâu cái 17 Do sự phát triển đồng bộ của cơ thể là quá trình gia tăng về kích thước và tích lũy thêm về khối lượng cơ thể, quá trình này đặc trưng cho từng loài cá và thể hiện mối tương quan giữa chiều dài và khối lượng cá (Nicolski,1963; Loan, 1998) Khối lượng và kích cỡ của cá rất quan trọng nó ảnh hưởng trực tiếp đến sức sinh sản của cá. Khi cá đến độ tuổi sinh sản cần phải đạt được khối lượng cần thiết để đảm bảo nguồn năng lượng cho các hoạt động sinh sản, quá trình tích lũy vật chất dinh dưỡng này được đánh giá dựa trên khối lượng của cá, đồng thời kích cỡ của cá quyết định một phần đáng kể đến sức chứa các sản phẩm sinh dục đặc biệt ở cá cái. Vì vậy mối tương quan giữa khối lượng, chiều dài và chiều cao cá sẽ quyết định từng giai đoạn của buồng trứng. Qua việc khảo sát trên (Hình 4.2) cho thấy hệ số mũ của chiều dài tổng, chiều dài chuẩn và chiều cao đều nhỏ hơn 3. Vậy khối lượng của cá tăng chậm nhất, chiều dài tổng tăng nhanh nhất, chiều cao của cá tăng chậm hơn so với chiều dài chuẩn và chiều dài tổng. 4.1.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với hệ số thành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark Bảng 4.1: Hệ số thành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark của các giai đoạn tuyến sinh dục của cá nâu cái Giai đoạn tuyến sinh dục Hệ số thành thục (%) Độ béo Fulton (%) Độ béo Clark (%) 1 0,42±0,13 a 7,52±1,75 a 6,78±1,58 a 2 0,54±0,15 a 8,41±2,12 a 7,54±1,91 a 3 3,65±1,87 b 12,08±1,95 b 10,73±1,96 b 4 9,87±3,42 c 12,80±2,03 b 10,82±1,91 b 5 12,01±3,30 d 13,22±2,08 b 10,93±1,68 b Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a, b, c và d) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Từng giai đoạn của tuyến sinh dục đều có sự tích lũy các vật chất dinh dưỡng khác nhau được xác đinh dựa vào độ béo của cá, đồng thời cũng nói lên được sự chuyển hóa nguồn năng lượng của cơ thể sang các sản phẩm sinh dục ở một số giai đoạn tiêu biểu sẽ có hệ số thành thục và độ béo tương ứng. Tuyến sinh dục (buồng trứng) ở giai đoạn 1 và giai đoạn 2 thì hệ số thành thục, độ béo Fulton, độ béo Clark có sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Ở giai đoạn 3, 4 và 5 đều có hệ số thành thục khác nhau có ý nghĩa thống kê (p<0,05) và cũng khác biệt có ý nghĩa thống kê so với giai đoạn 1và 2, đặc biệt ở giai đoạn 5 hệ số thành thục đạt 12,01±3,30 khác biệt cao nhất so với các giai đoạn còn lại và cách biệt rất xa đối với giai đoạn 1 là 0,42±0,13 (Bảng 4.1). Bên cạnh đó ở cá có buồng trứng giai đoạn 3, 4 và 5 thì độ béo Fulton và độ béo Clark không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với độ béo Fulton và độ béo Clark của cá có buồng trứng ở giai đoạn 1 và 2. 18 4.1.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục so với tỷ lệ khối lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan cá nâu cái Bảng 4.2: Tỷ lệ khối lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan ở các giai đoạn tuyến sinh dục của cá nâu cái Giai đoạn tuyến sinh dục Khối lượng gan cá/khối lượng cá (%) Khối lượng tuyến sinh dục/khối lượng gan (%) 1 2,11±0,50 a 20,75±7,66 a 2 2,22±0,67 ab 25,47±8,75 a 3 2,75±0,84 b 155,93±107,94 a 4 2,24±0,60 ab 476,97±215,35 b 5 2,02±0,76 a 744,37±483,31 c Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a, b và c) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Trong quá trình phát triển của buồng trứng, các các cơ quan trong cơ thể cá sẽ tập trung nguồn dinh dưỡng cho quá trình phát triển này, gan cá cũng góp một phần cho sự phát triển của trứng, dựa vào các giai đoạn của tuyến sinh dục từ giai đoạn 1 đến giai đoạn 2 thì khối lượng gan cá trên khối luợng cá có thay dổi không đáng kể. Ở cá có buồng trứng giai đoạn 3 thì khối lượng gan cá trên khối lượng cá có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) đối với giai đoạn 1 và 5. Ở giai đoạn 4, 5 và giai đoạn 1, 2 của buồng trứng thì khối lượng gan cá trên khối luợng cá không có sự khác biệt có ý nghĩa trhống kê (p>0,05). Ở giai đoạn 1, 2 và 3 của buồng trứng thì khối lượng gan cá trên khối luợng cá không có sự khác biệt có ý nghĩa trhống kê (p>0,05) (Bảng 4.2). 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 Giai đoạn tuyến sinh dục Khối lượng (g/con) Khối lượng tuyến sinh dục (g) Khối lượng gan (g) Hình 4.3: Mối tương quan giữa khối lượng tuyến sinh dục và khối lượng gan cá với các giai đoạn tuyến sinh dục Khối lượng gan cá tăng dần từ giai đoạn 1 đến giai đoạn 3 theo sự phát triển của buồng trứng và đạt khối lượng lớn nhất ở giai đoạn 3 (4,59 g/con) sau đó giảm dần từ giai đoạn 4 đến giai đoạn 5 (Hình 4.3). 19 Ở cá có buồng trứng giai đoạn 4 thì tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục trên khối lượng gan cá khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với cá có buồng trứng giai đoạn 1, 2 và 3, ở giai đoạn 1, 2 và 3 thì tỷ lệ này không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (Bảng 4.2). Đặc biệt ở cá có buồng trứng giai đoạn 5, vào giai đoạn nầy buồng trứng đã gia tăng rất nhiều về thể tích và khối lượng của trứng thì tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục trên khối lượng gan cá có tỷ lệ lớn nhất khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với cá có buồng trứng giai đoạn 1, 2, 3 và giai đoạn 4 (Bảng 4.2). 4.1.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu cá nâu cái Bảng 4.3: Số lượng huyết sắc tố, tỷ lệ huyết sắc tố, khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu ở các giai đoạn tuyến sinh dục của cá nâu cái Giai đoạn tuyến sinh dục Số lượng huyết sắc tố (g/100 ml) Tỷ lệ huyết sắc tố (%) Khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu (pg/tb) Nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu (%) 1 6,87±1,62 a 34,49±5,27 a 17,61±6,23 a 20,46±3,46 a 2 7,05±2,33 a 32,45±6,65 a 21,26±6,43 a 22,02±9,04 a 3 6,05±1,41 a 30,86±7,65 a 19,84±4,28 a 21,55±2,85 a 4 6,83±1,20 a 30,98±7,54 a 21,29±10,02 a 22,04±3,50 a 5 6,49±1,07 a 33,99±10,18 a 18,39±5,12 a 26,84±34,14 a Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a) giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Số lượng huyết sắc tố, tỷ lệ huyết sắc tố, khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu giữa các giai đoạn tuyến sinh dục không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 4.3). 4.1.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu cái Bảng 4.4: Số lượng hồng cầu, thể tích hồng cầu, số lượng bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu ở các giai đoạn tuyến sinh dục của cá nâu cái Giai đoạn tuyến sinh dục Số lượng hồng cầu (triệu tế bào/mm3) Thể tích hồng cầu (µ3) Số lượng bạch cầu (triệu tế bào/mm3) Bạch cầu/hồng cầu (%) 1 4,19±1,32 a 84,88±37,38 a 0,05±0,02 b 1,12±0,51 b 2 3,45±1,28 a 103,75±49,46 a 0,03±0,01 ab 0,93±0,54 ab 3 3,13±0,91 a 93,80±12,93 a 0,02±0,01 a 0,67±0,10 a 4 3,65±1,22 a 94,08±46,01 a 0,04±0,01 b 1,14±0,35 b 5 3,66±0,76 a 94,08±36,24 a 0,04±0,02 b 1,03±0,41 ab Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a và b) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Kết quả khảo sát cho thấy số lượng hồng cầu, thể tích hồng cầu không chịu ảnh hưởng bởi các giai đoạn của tuyến sinh dục cá nâu cái trong quá trình phát 20 triển của buồng trứng. Số lượng hồng cầu, thể tích hồng cầu giữa các giai đoạn tuyến sinh dục không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 4.4). Số lượng bạch cầu và tỉ lệ bạch cầu trên hồng cầu ở giai đoạn 1, 2 và giai đoạn 4, 5 của tuyến sinh dục không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Ở giai đoạn 3 của tuyến sinh dục thì số lượng bạch cầu đạt 0,02 (triệu tế bào/mm3) có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) đối với giai đoạn 1 và giai đoạn 4, 5 của tuyến sinh duc (Bảng 4.4). Tỉ lệ bạch cầu trên hồng cầu ở cá có buồng trứng giai đoạn 3 đạt 0,67% có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) đối với giai đoạn 1 và 4 (Bảng 4.4). 4.1.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hàm lượng vitellogenines và protein cá nâu cái Bảng 4.5: Hàm lượng vitellogenines và protein ở các giai đoạn tuyến sinh dục cá nâu cái Giai đoạn tuyến sinh dục Vitellogenines (µg ALP/ml protein) Protein máu (mg protein/ ml plasma) Protein cơ (mg) Protein gan (mg) 1 1,26±1,04 a 41,50±13,12 a 6,42±4,01 a 12,30±3,44 b 2 1,87±1,85 ab 42,98±11,67 a 8,41±7,34 a 10,06±1,34 a 3 2,68±1,43 bc 43,46±8,78 a 7,54±2,77 a 9,74±2,49 a 4 3,12±1,49 c 44,10±18,23 a 5,48±1,97 a 9,66±1,26 a 5 3,73±1,13 c 45,54±9,92 a 5,34±2,35 a 9,50±1,87 a Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a, b và c) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Hàm lượng protein trong máu và trong cơ của cá nâu giữa các giai đoạn tuyến sinh dục không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) (Bảng 4.5). Hàm lượng protein trong gan của cá có buồng trứng giai đoạn 1 lớn nhất (12,30 mg) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với giai đoạn tuyến sinh dục 2, 3, 4 và thấp nhất là giai đoạn 5(9,50 mg), hàm lượng protein trong gan cá có buồng trứng giai đoạn 2, 3, 4 và 5 không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Hàm lượng vitellogenines trong huyết tương tăng dần theo từng giai đoạn phát triển của buồng trứng đạt thấp nhất ở giai đoạn 1 đạt 1,26 (µg ALP/ml protein) và tăng dần lên đến giai đoạn 3, 4 và 5. Hàm lương vitellogenines tăng lên rỏ rệt khi trứng ở giai đoạn 3, 4 và 5 so với giai đoạn 1, đây là giai đoạn lớn lên về kích thước và tích tụ chất dinh dưỡng còn được gọi là quá trình tạo noãn hoàng của tế bào trứng. Buồng trứng ở giai đoạn 5 có hàm lượng vitellogenines đạt cao nhất 3,73 (µg ALP/ml protein) nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với giai đoạn 3 và 4. Hàm lượng vitellogenines ở buồng trứng giai đoạn 1 thấp nhất 1,26 (µg ALP/ml protein) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) với hàm lượng vitellogenines ở buồng trứng giai đoạn 3, 4 và 5 nhưng không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) với hàm lượng vitellogenines ở buồng trứng giai đoạn 2 (Bảng 4.5) Hàm lượng vitellogenines tăng theo từng giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục từ giai đoạn 1 đến giai đoạn 4 và 5 phù hợp với két quả của Lee và ctv 21 (1996) theo dõi sự biến động của hàm lượng vitellogines qua các giai đoạn phát triển của trứng cua (Callinectes sapidus) hàm lượng vitellogines tăng dần khi trứng phát triển từ giai đoạn 3 đến giai đoạn 6. 4.2. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH SẢN CÁ NÂU ĐỰC 4.2.1 Các giai đoạn phát triển của buồng tinh Giai đoạn 1: Tuyến sinh dục chưa phát triển, còn rất nhỏ nằm sát vào cột sống. Tinh sào chỉ là 2 sợi dây dài, mảnh. Giai đoạn 2: Tinh sào là hai dãy nhỏ, có màu trắng trong. Trong tinh sào, tế bào tinh chủ yếu tinh nguyên bào và tinh bào sơ cấp Giai đoạn 3: Chiều ngang tinh sào phát triển to hơn giai đoạn 2. Tinh sào có màu trắng hơi đục. Tổ chức học của tinh sào giai đoạn 3 vẫn chưa xuất hiện buồng sinh tinh rõ ràng. Trong tinh sào chủ yếu vẫn là các tinh nguyên bào, tinh bào sơ cấp, tinh bào thứ cấp và 1 ít tinh tử Giai đoạn 4: Tinh sào có màu trắng đục, cắt ngang tinh sào có sẹ đọng trên lưởi dao nhưng vuốt bụng sẹ không chảy ra. Quan sát tổ chức học cho thấy bên hình thành buồng sinh tinh trên tinh sào,ở giữa buồng sinh tinh là các tinh trùng sắp xếp dầy đặc, số lượng tinh bào giảm đi so vơi giai đoạn 3 Giai đoạn 5: Đây là giai đoạn chín của buồng tinh, kết thúc quá trình sinh tinh. Tinh sào phát triển đạt chiều dài tối đa. Lúc này vuốt nhẹ bụng cá có sẹ chảy ra. Tinh trùng phân bố dày đặc trong các buồng sinh tinh và ống dẫn tinh Giai đoạn 6: Cá đã tham gia sinh sản, tinh sào xẹp xuống, có màu trắng đục hơi trong. Số lượng tinh bào gia tăng rõ so với giai đoạn 5 Các giai đoạn phát triển của buồng tinh qua quan sát mô học Giai đoạn 2 Giai đoạn 3 Giai đoạn 4 Giai đoạn 5 22 Giai đoạn 6 Hình 4.4: Các giai đoạn phát triển của buồng tinh cá nâu 4.2.2. Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá nâu đực W = 0,2905H2,8563 R2 = 0,849 W = 0,1063Lc2,7822 R2 = 0,8978 W = 0,0687Lt2,7485 R2 = 0,9057 0 50 100 150 200 250 0 5 10 15 20 cm/con g/con Chiều dài tổng (Lt) Chiều dài chuẩn (Lc) Chiều cao (H) Hình 4.5: Mối tương quan giữa khối lượng cá với chiều dài và chiều cao cá Nhìn chung mối tương quan giữa khối lượng với chiều dài và chiều cao cá nâu đực cũng tương tự với cá nâu cái, tuy nhiên sự thành thục của cá nâu đực sớm hơn cá nâu cái ( Barry & Fast, 1992) đồng thời ở cùng độ tuổi thường con đực có kích thước nhỏ hơn con cái 4.2.3. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hệ số thành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark cá nâu đực Bảng 4.6: Hệ số thành thục, độ béo Fulton và độ béo Clark ở các giai đoạn tuyến sinh dục của cá nâu đực Giai đoạn tuyến sinh dục Hệ số thành thục (%) Độ béo Fulton (%) Độ béo Clark (%) 1 0,26±0,16 a 9,01±0,79 b 8,14±0,71 b 2 0,34±0,16 a 7,75±1,03 ab 6,98±0,86 ab 3 0,41±0,36 a 7,81±1,19 ab 6,97±0,95 ab 4 0,48±0,20 a 7,21±1,25 a 6,54±1,09 a Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a và b) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) 23 Theo từng giai đoạn của tuyến sinh dục thì hệ số thành thục của cá nâu đực không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05). Bên cạnh đó độ béo Fulton và độ béo Clark ở từng giai đoạn của tuyến sinh dục có sự khác biệt, cụ thể độ béo Fulton và độ béo Clark ở cá có buồng trứng giai đoạn 1 lớn nhất khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với giai đoạn 4 nhưng không khác biệt với giai đoạn 2 và 3 (p>0,05) (Bảng 4.6). 4.2.4. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với tỷ lệ khối lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan cá nâu đực Bảng 4.7: Tỷ lệ khối lượng gan với khối lượng cá và tỷ lệ khối lượng tuyến sinh dục với khối lượng gan ở các giai đoạn tuyến sinh dục cá nâu đực Giai đoạn tuyến sinh dục Khối lượng gan cá/khối lượng cá (%) Khối lượng tuyến sinh dục/khối lượng gan (%) 1 2,22±0,74 a 14,93±14,83 a 2 2,93±0,65 a 12,57±8,15 a 3 2,53±0,61 a 18,27±19,60 a 4 2,29±0,66 a 22,25±10,81 a Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a) giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Do quá trình phát triển của tuyến sinh dục cá nâu đực không tiêu hao nhiều năng lượng như cá nâu cái, quá trình chuyển hóa năng lượng từ gan sang các sản phẩm sinh dục không nhiều nên khối lượng gan cá trên khối lượng cá đạt cao nhất cũng chỉ 2,93% và thấp nhất là 2,22%, khối lượng tuyến sinh dục trên khối lượng gan đạt cao nhất là 22,25% thấp nhất là 12,57% (Bảng 4.7). Khối lượng gan cá trên khối lượng cá và Khối lượng tuyến sinh dục trên khối lượng gan qua từng giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05). 4.2.5. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng, tỷ lệ huyết sắc tố; khối lượng và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu cá nâu đực Bảng 4.8: Số lượng huyết sắc tố, tỷ lệ huyết sắc tố, khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu và nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu ở các giai đoạn tuyến sinh dục cá nâu đực Giai đoạn tuyến sinh dục Số lượng huyết sắc tố (g/100 ml) Tỷ lệ huyết sắc tố (%) Khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu (pg/tb) Nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu (%) 1 9,96±2,55 a 28,81±2,59 a 20,74±4,08 a 32,41±8,86 ab 2 9,12±3,26 a 36,70±6,84 a 21,41±7,47 a 24,35±5,67 ab 3 8,56±2,32 a 38,96±7,04 a 22,94±9,95 a 21,24±4,35 a 4 8,18±2,04 a 35,53±7,18 a 19,64±7,58 a 24,91±7,80 b Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a và b) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) 24 Nhìn chung ảnh hưởng giữa các giai đoạn thành thục với số lượng huyết sắc tố, tỷ lệ huyết sắc tố, khối lượng trung bình của huyết cầu trong hồng cầu không có sự khác biệt có ý nghĩa thông kê (p>0,05) (Bảng 4.8) Nồng độ huyết sắc tố trong hồng cầu ở giai đoạn 4 của tuyến sinh dục là 24,91% không khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với giai đoạn 1 (32,41%) và giai đoạn 2 (24,35%) nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với giai đoạn 3 (21,24%) (Bảng 4.8) 4.2.6. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với số lượng hồng cầu, bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu cá nâu đực Bảng 4.9: Số lượng hồng cầu, thể tích hồng cầu, số lượng bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu với hồng cầu ở các giai đoạn tuyến sinh dục cá nâu đực Giai đoạn tuyến sinh dục Số lượng hồng cầu (triệu tế bào/mm3) Thể tích hồng cầu (µ3) Số lượng bạch cầu (triệu tế bào/mm3) Bạch cầu/hồng cầu (%) 1 5,04±2,12 a 63,27±30,52 a 0,07±0,05 a 1,25±0,51 a 2 4,76±2,34 a 94,65±51,01 a 0,05±0,03 a 1,00±0,34 a 3 4,34±2,09 a 118,65±52,44 a 0,05±0,02 a 1,09±0,57 a 4 4,51±1,61 a 86,62±28,67 a 0,06±0,04 a 1,23±0,36 a Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a) giống nhau thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Trong bảng 4.9 cho thấy, ảnh hưởng giữa các giai đoạn thành thục với số lượng hồng cầu, thể tích hồng cầu, số lượng bạch cầu và tỷ lệ bạch cầu trên hồng cầu trong máu cá không có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p>0,05) (Bảng 4.9). 4.2.7. Ảnh hưởng giữa các giai đoạn tuyến sinh dục với hàm lượng vitellogenines và protein cá nâu đực Bảng 4.10: Hàm lượng vitellogenines và protein ở các giai đoạn tuyến sinh dục cá nâu đực Giai đoạn tuyến sinh dục Vitellogenines (µg ALP/ml protein) Protein máu (mg protein/ml Plasma) Protein cơ (mg) Protein gan (mg) 1 1,09±0,75 a 48,39±4,72 a 6,74±1,87 a 10,53±3,21 a 2 1,62±0,88 a 41,82±5,03 a 7,30±4,52 a 9,21±1,22 a 3 3,48±1,80 b 41,03±8,72 a 7,93±4,18 a 8,97±2,32 a 4 2,64±0,93 ab 43,95±11,97 a 9,10±5,96 a 7,65±2,81 a Các giá trị trên cùng một cột mang mẫu tự (a và b) khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Cũng giống như cá nâu cái, hàm lượng protein trong máu, cơ và gan của cá nâu đực không chịu ảnh hưởng bởi sự phát triển của tuyến sinh dục, trãi qua các giai đoạn của buồng tinh lượng protein trong cơ thể cá vẫn ổn định không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) giữa các giai đoạn tuyến sinh dục (Bảng 4.10). 25 Hàm lượng vitellogenines trong huyết tương của cá nâu đực ở giai đoạn 4 (2,64 µg ALP/ml protein) của tuyến sinh dục không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) so với giai đoạn 3 nhưng khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) so với giai đoạn 1 và 2. Giai đoạn 3 của tuyến sinh dục có hàm lượng vitellogenines trong huyết tương là 3,48 (µg ALP/ml protein) khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05) đối với giai đoạn 1 là 1,09 (µg ALP/ml protein) và giai đoạn 2 (1,62 µg ALP/ml protein) 26 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Ở cá nâu cái có hệ số thành thục tăng dần qua từng giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục và hệ số thành thục đạt cao nhất ở cá có buồng trứng giai đoạn 5 (12,01%). Cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 5 có độ béo Fulton (13,22 %) và độ béo Clark (10,93 %) đạt cao nhất và thấp nhất là giai đoạn 1. Khối lượng gan trung bình của cá nâu cái có tuyến sinh dục giai đoạn 3 là lớn nhất (4,59 g/con). Hàm lượng vitellogenines trong huyết tương của cá nâu cái tăng dần theo sự phát triển của tuyến sinh dục và đạt cao nhất ở cá có tuyến sinh dục giai đoạn 5 (3,73 µg ALP/ml protein). Ở cá nâu đực có hệ số thành thục không khác nhau giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục. Cá nâu đực có tuyến sinh dục giai đoạn 1 có độ béo Fulton (9,01 %) và độ béo Clark (8,14 %) đạt cao nhất và thấp nhất là giai đoạn 4. 5.2 Đề xuất Tiếp tục nghiên cứu mối tương quan giữa các giai đoạn phát triển của tuyến sinh dục với hàm lượng hormone sinh sản (estrogen và testosterone) của cá nâu. 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO Arthur H. Houston (1990). Blood and Circulation. In: Carl B. Schreck and Peter B. Moyle (Eds). Method for Fish Biology. PP: 273-322. Barry, T. P. and Fast, A. W. (1992). Abstract: Biology of the spotted scat (Scatophagus argus) in the Philippines. Asian fisheries science. Chang, Su-Lean (1997). Abstract: Studies on the early development and larvel rearing of spotted scat (Scatophagus argus). J. Taiwan Fish. Đõ Thị Thanh Hương và Trần Thị Thanh Hiền (2000). Bài giảng sinh lý động vật thủy sinh. Khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ. Khan, M. Z. (1984). Abstract:A note on the occurrence of a large sized spotted butterfish Scatophagus argus (Linnaeus) at Rajpara (Gujarat). Journal of the Marine Biological Association of India. Mai Đình Yên (1992). Định loại cá nước ngọt Nam Bộ. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ Thuật. Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương và ctv (1994). Cẩm nang kỹ thuật nuôi thủy sản nước lợ. Khoa Thủy sản-Trường Đại học Cần Thơ. Nguyễn Bạch Loan (1998). Giáo trình ngư loại 1. Khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ. Nguyễn Hữu Phụng (1995). Danh mục cá biển Việt Nam. Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật. Nguyễn Văn Kiểm (2004). Giáo trình kỹ thuật sản xuất cá giống. Khoa thủy sản- Đại học Cần Thơ Phạm Thanh Liêm và Trần Đắc Định (2004). Phương pháp nghiên cứu sinh hoc cá. Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ Trương Thủ Khoa và Trần Thị Thu Hương (1993). Định loại cá nước ngọt vùng Đồng Bằng Sông Cửu Long. Võ Thị Kim Phúc (2003). Khảo sát sự tăng trưởng và thành thục của cá nâu (Scatophagus argus). Luận văn tốt nhiệp đại học, Khoa Thủy sản-Đại học Cần Thơ Mohsin, A.K.M. and Ambak, M.A.(1996). Marine fishes and fisheries of Malaysia andneighbouing cuontries, University Pertanian Malaysia Press 744pp Nicolski, G.V. (1963). Sinh thái học (Nguyễn Văn Thái, Trần Đình Trọng và Mai Đình Yên dịch). Nhà xuất bản Đại học- THCN,216,218-220,223,232,234- 237,384,391. .J. and D.F.S. Raitt(1974). Manual ofFisheries Science, part II : Method ofresources in Holden, M vestigantion ang their applicatio. Rome.FAO Fish. Tech pap (115) Hinton,D.E. Methodsfor Fish Biology. Amerycan Fisheries Fisheries Society. Pp191-213. 0