Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 nhằm tạo cây thuốc lá chuyển gen kháng bệnh khảm lá

đã phát triển những thí nghiệm của mình thành phƣơng pháp CP tạo cây trồng kháng virus. Phƣơng pháp này đã đƣợc áp dụng tạo những dòng cây chuyển gen kháng nhiều loại virus gây bệnh trên thực vật hai lá mầm và sau đó là thực vật một lá mầm [21]. Tuy vậy, các cây chuyển gen này chỉ kháng đƣợc duy nhất một chủng virus mang gen mã hóa protein vỏ mà nó chuyển vào. Điều này gây trở ngại trong việc phát triển các giống cây trồng kháng virus dựa trên phƣơng pháp CP do độ đa dạng của virus thƣờng khá cao [32] Cho tới những năm cuối thế kỷ 20, cấu trúc dạng kẹp tóc (ihpRNA) hay kỹ thuật RNAi đƣợc xem là một kỹ thuật hiện đại và hữu hiệu nhất trong việc chống lại các bệnh do virus gây ra ở thực vật. Năm 2004, Baulcombe đã công bố cơ chế hoạt động của siRNA và coi đó là một cơ chế quan trọng trong việc kháng lại virus ở thực vật. Các bƣớc chính trong kỹ thuật này bao gồm: (1) thiết kế các vector chuyển gen mang cấu trúc RNAi, (2) biến nạp vector chuyển mang cấu trúc RNAi vào cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens làm bất hoạt các mRNA của virus gây bệnh, (3) sàng lọc các cây chuyển gen mang cấu trúc RNAi và kiểm tra tính kháng virus của các cây chuyển gen [38]. Tính hiệu quả của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen mã hoá protein của virus (gen mã hóa protein vỏ CP, enzyme phiên mã RdRp,…) có khả năng kháng lại chính virus đó đã đƣợc chứng minh bằng thực tế trong những nghiên cứu tạo cây trồng kháng các loại virus khác nhau nhƣ: Potato virus Y PVY [43][33]cucumber mosaic virus CMV, Plum pox potyvirus PPV [18], Tobacco mosaic virus TMV và Potato virus Y PVY[35], Tomato yellow leaf curl virus TYLCV [46]Rice tungro bacilliform virus RTBV, African cassava mosaic virus ACMV [41] … Trong những nghiên cứu này, cấu trúc RNAi có chứa trình tự gen của virus lặp lại đảo chiều thƣờng đƣợc sử dụng để chuyển vào cây và sẽ đƣợc biểu hiện thành RNA sợi đôi dạng kẹp tóc (hairpin RNA, hpRNA) trong cây chuyển gen từ đó kích thích cơ chế RNAi hoạt động khi có sự xâm nhập của virus vào cây. 17 Ngƣời ta đã nhận thấy rằng khi vùng đệm của hpRNA đƣợc lặp lại với một trình tự intron (ihpRNA) thì kết quả ihpRNA tạo ra sự bất hoạt gen là cao nhất[33][44]. Năm 2007, Bonfim và cộng sự đã tạo ra đƣợc một dòng cây đậu chuyển gen kháng virus BGMV (Bean golden mosaic virus) với tính kháng lên đến 93%. Cũng năm này, Shinichiro Kamachi và cộng sự [ 26] đã công bố kết quả tạo ra đƣợc một số dòng thuốc lá chuyển gen CP trong cấu trúc ihpRNA có khả năng kháng cao với virus cucumber green mottle mosaic virus CGMMV đến thế hệ T2 (12/14 số cây kiểm tra) và những siRNA đã đƣợc phát hiện trong những dòng cây chuyển gen này. Nói chung, hầu hết các cây chuyển gen làm chậm sự tích lũy virus và làm chậm hoặc giảm nhẹ các triệu chứng bệnh[19] Cho đến nay đã có các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus đƣợc công nhận và trồng thƣơng mại nhƣ: Đu đủ chuyển gen kháng bệnh đốm vòng (papaya ringspot virus, PRSV) đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ, Trung Quốc, Philippine; Bí đao chuyển gen kháng ba loại vi rút Cucumber mosaic virus, Watermelon mosaic virus, Zucchini yellow mosaic virus, đã đƣợc công nhận và trồng ở Mỹ; Ớt và cà chua chuyển gen kháng Cucumber mosaic virus, đƣợc công nhận và trồng ở Trung Quốc … Ngoài ra rất nhiều các loại cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus khác đang trong giai đoạn khảo nghiệm để đƣợc công nhận là giống cây trồng thƣơng mại nhƣ: Sắn chuyển gen kháng African cassava mosaic virus (Begomovirus); Ngô chuyển gen kháng Maize steak virus (Mastrevirus); Khoai tây chuyển gen kháng đồng thời 3 loại virus Potato virus X (Potexvirus), Potato virus Y (Potyvirus), Potato leafroll virus (Polerovirus); Lúa chuyển gen kháng Rice Tungro viruses (Tungrovirus); Khoai lang chuyển gen kháng Sweet potato feathery mottle virus (Potyvirus... Các cấu trúc gen có nguồn gốc từ virus gây bệnh đƣợc sử dụng chuyển vào cây trồng để tạo tính kháng có thể là các loại khác nhau nhƣ: các cấu trúc của virus theo chiều xuôi (sense) hay chiều ngƣợc (antisense), các cấu trúc dạng kẹp tóc (inverted repeats/hairpin) và các miRNA nhân tạo có đích là các trình tự gen của virus gây bệnh, hay kỹ thuật RNAi “RNA interference”, đang đƣợc quan tâm nhiều và ứng dụng rộng rãi. 18 1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus 1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi RNAi là cơ chế ức chế sự biểu hiện vật chất di truyền ở giai đoạn RNA. Ở thực vật có ba con đƣờng ức chế RNA trong đó con đƣờng đầu tiên là sự ức chế gen sau phiên mã PTGS (post-transcriptional gen silencing) qua trung gian là các RNA nhỏ có vai trò ức chế siRNA (short interfering RNA) đƣợc sử dụng phổ biến nhất trong những nghiên cứu tạo cây chuyển gen kháng virus. Quá trình này xảy ra ở tế bào chất và là con đƣờng quan trọng trong tế bào thực vật nhiễm virus nơi mà sợi RNA kép hoặc cấu trúc thứ cấp của RNA virus sợi đơn có thể sao chép gián tiếp. Trong trƣờng hợp virus DNA, dsRNA có thể đƣợc tạo ra nhờ quá trình phiên mã bổ sung liên tiếp [13]. Cơ chế cũng xảy ra tƣơng tự nhƣ ở động vật. Khi có sự xâm nhập của dsRNA, Dicer bản chất là RNaseIII đặc hiệu cho dsRNA cắt những chuỗi kép RNA này ra những đoạn ngắn hơn, khoảng 21-25 nucleotide, gọi là siRNA . Sau đó, các siRNA kép hình thành đƣợc tách ra làm hai chuỗi đơn, và chỉ một chuỗi đơn RNA với đầu 5' có lực bắt cặp base (base-pairing) nhỏ nhất tiếp tục liên kết với Argonaute trong phức hệ RISC. Tiếp đó, phức hệ RISC đã gắn đoạn siRNA nhận biết các mRNA của tế bào có trình tự tƣơng đồng với trình tự của đoạn chuỗi đơn siRNA này. Sau khi nhận dạng mRNA qua việc bắt cặp các base tƣơng đồng với trình tự của chuỗi đơn siRNA, mRNA bị cắt đứt ở khoảng giữa của chuỗi kép siRNA-mRNA thành những đoạn nhỏ khoảng 12 nucleotid từ đầu 3’. Sau khi bị cắt đứt, mRNA nhanh chóng bị tiêu huỷ bởi các RNA nuclease [16] (Hình 1.6). 19 Hình 1.6: Cơ chế hoạt động RNAi. 1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM. Ở Việt Nam gần đây đã có một số nghiên cứu theo hƣớng ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen chống lại các bệnh do virus gây ra. Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học do GS. Lê Trần Bình và PTS. Chu Hoàng Hà đứng đầu là nhóm nghiên cứu đầu tiên ở Việt Nam đã thành công trong việc ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo cây chuyển gen kháng virus. Một trong những kết quả của đề tài cấp Viện KH&CN Việt Nam đƣợc tiến hành trong 2 năm 2007-2008: “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật RNAi trong tạo giống cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus” là đã tạo đƣợc các cây thuốc lá chuyển gen kháng virus khảm dƣa chuột (CMV), kháng virus khảm thuốc lá (TMV) và kháng đồng thời cả 2 loại virus trên. Năm 2009, ứng dụng RNAi, Phạm Thị Vân và cộng sự [7] (Phòng Công 20 Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học) đã tạo đƣợc dòng thuốc lá chuyển gen ở thế hệ T0 kháng virus CMV với tỷ lệ 64,6%, kháng TMV với tỷ lệ 74,5% và kháng đồng thời hai loại virus TMV và CMV với tỷ lệ 70,8%[7]. Kết quả này cho thấy tiềm năng ứng dụng to lớn kỹ thuật RNAi trong việc tạo giống cây trồng kháng virus. Kỹ thuật RNAi cũng đã đƣợc tiếp tục nghiên cứu ứng dụng trong đề tài trọng điểm cấp nhà nƣớc thuộc chƣơng trình phát triển công nghệ sinh học (KC04- 03/06-10) với mục đích tạo cây đu đủ và cây ăn quả có múi chuyển gen kháng bệnh virus. Đề tài đã đƣợc nghiệm thu cấp nhà nƣớc trong tháng 9/2010. Một trong những kết quả đạt đƣợc của đề tài là đã tạo ra đƣợc các dòng đu đủ chuyển gen có khả năng kháng hoàn toàn với virus đốm vòng. Bên cạnh cây trồng chuyển gen kháng virus cũng đã có rất nhiều thành công trong việc tạo cây có khả năng kháng bệnh cây trồng, kháng vi khuẩn, kháng côn trùng có hại hay cây chuyển gen chống chịu với điều kiện sinh thái bất lợi mang lại hiểu quả kinh tế cao[6]. Tất cả đang mở ra một thời kì mới cho nền nông nghiệp Việt Nam. 21 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1.Vật liệu thực vật Hạt giống thuốc lá C9-1 do công ty TNHH Một thành viên KTKT thuốc lá lai tạo. 2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: - Chủng Agrobacterium tumafaciens CV58C1 mang vector pCB_GUS Hình 2.1. Vector pCB_GUS - Chủng Agrobacterium tumafaciens CV58C1 mang vector TMV_RNAi 22 2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng - Hóa chất: Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Glucose, Trypton, KCl, EDTA, MgCl2, NaOH. Các loại kháng sinh : kanamycin, rifamycine, cefotaxime, streptomycine, spectinmycine. Các chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ: BAP, NAA, và các hóa chất thông dụng của các hãng Fermentas, Invitrogen, Mecrck, Sigma... - Môi trƣờng đƣợc sử dụng trong nghiên cứu nuôi cấy mô tế bào và nuôi cấy vi khuẩn dùng cho thí nghiệm chuyển gen gồm: MS, môi trƣờng lây nhiễm lỏng IM, môi trƣờng tạo mô sẹo, môi trƣờng tạo chồi, môi trƣờng ra rễ và môi trƣởng nuôi khuẩn LB. Thành phần nhƣ trong phụ lục 1. - Máy móc và thiết bị: Buồng cấy vô trùng , máy đo pH, máy đo OD, tủ nuôi lắc, nồi khử trùng, máy ly tâm lạnh,máy điện di, cùng với các thiết bị khác của Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật, Viện Công Nghệ Sinh Học. 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: 2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo Khử trùng toàn bộ dụng cụ trƣớc thí nghiệm Đặt cốc thủy tinh chứa 100ml Javen vào bình khử trùng. Hạt thuốc lá đƣợc cho bình pyrex (dung tích 100ml). Bình Pyrex mở hé 1/3 nắp lọ đặt bên cạnh cốc thủy tinh chứa dung dịch Clo. Bổ sung vào cốc đựng Javen 3ml HCl, hỗn hợp này sẽ tạo ra khí Clo có tác dụng khử trùng hạt thuốc lá. Đậy kín bình khử trùng và dán parafin. Sau 4h lấy hạt đã khử trùng ra để trong box cấy 30 phút để bay hết khí rồi tiến hành gieo hạt. 2.2.1.2. Gieo hạt Gieo hạt vào môi trƣờng MS (100 hạt/ bình) Sau 4 ngày hạt bắt đầu nảy mầm. Khi cây phát triển đƣợc 1 tuần, đánh giá tỉ lệ nảy mầm và cấy chuyển sang môi trƣờng MS mới. 23 2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens 2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium - Lấy chủng khuẩn từ ống giữ chủng và cấy vạch lên môi trƣờng LB đặc có bổ sung các kháng sinh chọn lọc ( Cefotaxime 25mg/l, kanamycin 50mg/l đối với chủng A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa câu trúc pCB_GUS; Rifamycine 50mg/l, streptomycine 100mg/l, spectinomycine 100mg/l đối với chủng vi khuẩn A.tumerfaciens mang vecter chuyển gen chứa cấu trúc TMV_RNAi) nuôi trong tủ ổn nhiệt 28˚C trong thời gian 48 giờ. - Lấy một khuẩn lạc riêng biệt phát triển tốt trên đĩa khuẩn và cấy vào 2 ml LB lỏng có bổ sung các loại kháng sinh chọn lọc nhƣ khi nuôi ở môi trƣờng LB đặc. Bình nuôi lỏng đƣợc đặt trong máy lắc với tốc độ 200 vòng/ phút ở nhiệt độ 28˚C nuôi qua đêm. Lấy 0.5ml dịch huyền phù chuyển sang 50ml LB lỏng (không kháng sinh) nuôi phục hồi khuẩn trong vòng 4h . Ly tâm 4000v/p trong 10p ở 4˚C và hòa tan trong dung dịch IM (MS, pH 5.8) lỏng. Sử dụng vi khuẩn A.tumerfaciens có mật độ đạt OD600=0.7 -1.0 để biến nạp. 2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen Chọn lá có kích thƣớc vừa phải ở các cây con khỏe mạnh 2 tuần tuổi. Dùng dao cắt bốn cạnh mép lá để gây tổn thƣơng, tạo thành các mảnh lá có hình vuông kích thƣớc khoảng 0,25 cm2. Lá bị tổn thƣơng sau đó đƣợc đặt úp trong môi trƣờng lây nhiễm IM để tránh bị khô. 2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy Ngâm khoảng 30 mảnh lá trong đĩa petri chứa 20 ml dung dịch IM có bổ sung 100µl dịch khuẩn Agrobacterium. Các mảnh lá đƣợc ngâm trong dung dịch trên trong 30 có lắc nhẹ trong vòng 30 phút. Sau đó đặt vào bình chứa môi trƣờng MS,1mg/l BAP, 30g/l glucose,8g/l agar, pH5,8. 24 Hình 2.3 : Các mảnh lá được ngâm trong dung dịch IM có bổ sung dịch khuẩn 2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen Sau 3 ngày chuyển các mảnh lá sang môi trƣờng tạo chồi chứa MS, 1mg/l BAP,30g/l glucose,8g/l aga,pH 5,8 và có chứa các kháng sinh 50mg/l kanamycine, 250mg/l Cefotaxime. Sau 3- 4 tuần xuất hiện các chồi nhỏ từ các mảnh lá. Tiến hành tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trƣờng MS, 30g/l glucose,8g/l aga,pH 5,8 và có chứa các kháng sinh 50mg/l kanamycine, 250mg/l Cefotaxime. 2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh Khi các xuất hiện các chồi và các chồi đạt chiều cao khoảng 2- 3 cm tiến hành tách các chồi nhỏ này và chuyển sang môi trƣờng ra rễ ( MS + 0,1mg/l NAA, 30g/l glucose,8g/l aga, pH 5,8) Sau 3 .tuần các cây in vitro đƣợc đƣa ra ngoài môi trƣờng. Cây non đƣợc chuyển sang môi trƣờng cát + trấu ( 50% trấu, 50% cát) và chuyển ra trồng trong nhà lƣới. 2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp nhuộm mô hóa tế bào Thu mẫu từ các cây con sau 2 tuần phát triển trong nhà lƣới. Đối với những cây đƣợc chuyển cấu trúc pCB_GUS, biểu hiện của gen gus đƣợc kiểm tra bằng nhuộm trong dung dịch X-gluc (50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7; 10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM Na2EDTA; 0,1% Triton- 25 100; 1,5mM X-glucuronide). Mẫu lá thuốc lá đƣợc ngâm trong dung dịch X- gluc và ủ trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 37ᵒ C, thời gian ủ từ 24- 48 giờ. Sau thời gian ủ , mẫu đƣợc rửa sạch bằng nƣớc cất khử trùng và ngâm vào dung dịch cồn 70% nhằm loại bỏ diệp lục. Sau khi loại bỏ diệp lục, mẫu đƣợc đƣa lên kính hiển vi soi nổi, quan sát và chụp ảnh. 2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phƣơng pháp PCR ADN tổng số từ lá thuốc lá đƣợc tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển trong các dòng thuốc lá. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8%. 2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số Tách ADN tổng số đƣợc tiến hành theo các bƣớc sau: (1) Lấy 100mg lá non (trong ống effendorf 1.5ml) nghiền trong nitơ lỏng cho tới khi thành dạng bột mịn (2) Bổ sung 500µl dung dịch đệm (0,2M Tris-HCl pH9.0; 0,4M LiCl; 25mM EDTA pH8.0; 1%SDS) vào từng ống. Ly tâm 13000 vòng/ phút, trong 5 phút (3) Hút 350µl dịch trong ở phía trên ra từng ống effendol mới (4) Bổ sung 350µl isopropanol vào từng ống, mix đều (5) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 15 phút. Loại bỏ dịch nổi, thu tủa (6) Làm khô bằng máy Speeed Vac (7) Hòa tan ADN trong 40µl H2O deion 2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với cặp mồi TMV-Fi/ TMV-Ri [8] với trình tự nhƣ sau: TMV-Fi: 5’- CACCATGAAACCTTCACCACA-3’ TMV-Ri: 5’- CTAGGTCCAAACCAAACCAG-3’ 26 Bảng 2.1. Thành phần phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/ TMV-Ri STT Thành phần Thể tích (x1) (µl) 1 H2O deion 10,1 2 Dung dịch đệm 2 3 MgCl2 25mM 2 4 dNTPs 1,6 5 Primer TMV-Fi 0,8 6 Primer TMV- RI 0,8 7 Taq polymerase 1u/µl 0,2 8 Template 2,5 Tổng 20 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR Bƣớc Phản ứng Nhiệt độ (0C) Thời gian Chu kỳ 1 Biến tính 94 3 phút 1 2 Biến tính 94 1 phút 3 Gắn mồi 52 50 giây 25 4 Kéo dài chuỗi 72 1 phút 5 Hoàn tất kéo dài 72 10 phút 1 6 Kết thúc phản ứng 4 ∞ 2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo Các cây chuyển gen sau khi trồng ngoài nhà lƣới cao khoảng 10-30 cm đƣợc kiểm tra tính kháng virus bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo theo phƣơng pháp của Herbers và cộng sự (1996) [20]. Các bƣớc tiến hành nhƣ sau: - Mẫu lá bị bệnh đƣợc nghiền trong đệm phosphat 100 mM (~1g mẫu lá trong 20 ml buffer) với pH = 7. 27 - Lá lây nhiễm đƣợc gây tổn thƣơng nhẹ bằng SiC. - Cho dịch virus lên phần lá đã gây xƣớc, sau vài phút rửa lá bằng nƣớc. 10-20 ngày sau khi lây nhiễm, quan sát và đánh giá triệu chứng sẽ xuất hiện trên cây 28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS Hiện nay, chuyển gen vào thực vật thông qua vi khuẩn Agrobacterium là biện pháp hữu hiệu để tạo cây trồng với những tính trạng mong muốn. Để có thể chuyển các gen mong muốn vào cây trồng, trƣớc tiên phải xây dựng đƣợc tái sinh cây hoàn chỉnh và một quy trình chuyển gen hoạt động hiệu quả. Tại Việt Nam, hệ thống tái sinh và chuyển gen chỉ thị gus mới chỉ đƣợc nghiên cứu trên giống thuốc lá K326 [8][7] mà chƣa đề cập tới giống C9-1. Giống thuốc lá C9-1 đƣợc Viện Kinh tế Kỹ thuật thuốc lá lai tạo, có khả năng thích ứng với những vùng khí hậu đặc trƣng của Việt Nam lại có phẩm chất, năng suất tốt. Do vậy, để tạo tiền đề cho những nghiên cứu tạo giống thuốc lá kháng bệnh và có khả năng thích nghi với điều kiện canh tác tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu qui trình tái sinh và chuyển gen vào giống thuốc lá C9-1 này. Gen chỉ thị gus thƣờng đƣợc sử dụng để đánh giá hiệu quả của một quy trình chuyển gen trƣớc khi tiến hành chuyển các gen đích mong muốn. Đây là gen mã hóa enzyme β-glucuronidase [23], một hydrolase xúc tác cho quá trình phân giải cơ chất glucuronidase tạo sản phẩm có màu xanh đặc trƣng dễ nhận biết và rất bền vững. Trong tự nhiên β-glucuronidase không tồn tại trong thực vật hơn nữa sản phẩm của phản ứng là độc nhất và không độc với tế bào vật chủ, các phƣơng pháp phân tích sản phẩm đơn giản, thuận tiện, rẻ tiền, nhạy và đặc thù, vì vậy gen gus đƣợc coi là gen chỉ thị hữu hiệu trong kỹ thuật chuyển gen ở thực vật[5]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng vector pCB-GUS (Phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật) để chuyển gen chỉ thị gus vào thuốc lá nhằm đánh giá hiệu quả của quy trình tái sinh và chuyển gen vào thuốc lá theo phƣơng pháp của Banerjee và cộng sự [12] có cải tiến. Đây là tiền đề để tiến hành chuyển cấu trúc TMV-RNAi. 29 3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen Theo Banerjee và cộng sự [12], mảnh lá bánh tẻ là nguyên liệu thích hợp để chuyển gen vào cây thuốc lá. Để tạo đƣợc nguồn nguyên liệu, hạt thuốc lá giống C9-1 đƣợc khử trùng bằng khí Clo trƣớc khi gieo lên môi trƣờng MS để nảy mầm trong điều kiện vô trùng. Theo Vân và cộng sự [8][7] có thể sử dụng dung dịch Javel thƣơng phẩm nồng độ 30% để loại nấm mốc và vi khuẩn trên hạt thuốc lá. Phƣơng pháp này đạt hiệu quả khử trùng 100% cho tỉ lệ nảy mầm cao trên 90%. Tuy nhiên, đối với hạt có kích thƣớc nhỏ nhƣ hạt thuốc lá , việc lắc rửa nhiều lần tiêu tốn nhiều thời gian cũng nhƣ làm mất một số lƣợng đáng kể hạt. Trong thí nghiệm này, hạt thuốc lá C9-1 đƣợc khử trùng bằng khí clo theo phƣơng pháp của Toopping (1988) [39] nguồn khí Clo tạo ra từ phản ứng giữa dung dịch HCl và Javel sẽ khử trùng bề mặt các hạt thuốc lá. Các cây con sau khoảng 4 tuần trên môi trƣờng MS có kích thƣớc lá từ 4- 6cm là nguồn nguyên liệu tốt nhất để tái sinh và chuyển gen ở cây thuốc lá. 3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây 3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi Quy trình chuyển gen vào giống thuốc lá K326 đã đƣợc Vân và cộng sự [12][13] thiết lập. Theo quy trình này, các lá bánh tẻ đƣợc cắt thành những mảnh có kích thƣớc 1cm2 và đặt lên môi trƣờng tái sinh GM (MS cơ bản,1mg/l BAP, 30g/l glucose,8g/l agar, pH5,8) 2 ngày trƣớc khi biến nạp sau đó đƣợc nuôi cộng sinh với dung dịch huyền phù của Agrobacterium trong 2 ngày và chuyển sang môi trƣờng GM có bổ sung kháng sinh chọn lọc cũng nhƣ kháng sinh diệt khuẩn. Giống thuốc lá C9-1 có lá nhỏ và mảnh hơn giống K326, lặp lại việc đặt các mảnh lá trên môi trƣờng GM trƣớc biến nạp cho hiệu quả tái sinh cây thấp. Do vậy, đối với giống C9-1, các mảnh lá hình vuông kích thƣớc khoảng 0,5 cm2 đƣợc cắt ra từ cây in vitro và ngâm vào dung dịch huyền phù Agrobacterium (OD600=0.7-1) có lắc nhẹ trong 30 phút. Việc giảm kích thƣớc các mảnh lá xuống một nửa đồng thời lắc nhẹ trong 30 dịch huyền phù vi khuẩn làm tăng thể tích tiếp xúc giữa vết thƣơng thực vật và dịch khuẩn, là một trong những biện pháp có thể làm tăng khả năng xâm nhập của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật dẫn tới tăng hiệu quả chuyển gen. Sau 30 phút, thấm khô và đặt các mảnh lá vào bình chứa môi trƣờng GM và chuyển sang môi trƣờng GM mới. Do vector pCB-GUS có mang đoạn gen kháng kanamycine, nên các môi trƣờng sau biến nạp đều đƣợc bổ sung 50mg/l kanamycine để chọn lọc các cụm chồi chuyển gen. Trong nghiên cứu này, những kết quả về cụm chồi/cây đề cập đến là những cụm chồi/cây sống sót trên môi trƣờng chọn lọc có chứa kanamycine. Cefotacime (400mg/l) cũng đƣợc bổ sung vào môi trƣờng nhằm loại bỏ vi khuẩn còn sót lại trên các mảnh lá. Thí nghiệm chuyển gen gus vào cây thuốc lá C9-1 đƣợc lặp lại 2 lần, mỗi lần với 30 mảnh lá nguyên liệu. Sau 10 ngày tại những vết cắt ở các mảnh lá xuất hiện những cụm tế bào cứng, có màu xanh lá ( hình 3.1) Theo nghiên cứu trƣớc về quá trình tái sinh cây thuốc lá, đây là tiền đề cho việc tái sinh chồi [8][7]. Kinetin là chất điều khiển sinh trƣởng thuộc nhóm cytokine, có tác dụng kích thích tạo và phát triển chồi. Vai trò của kinetin trong tạo chồi đã đƣợc chứng minh trên nhiều đối tƣợng thực vật, ở cả cây một lá mầm và hai lá mầm. Với 30mảnh lá /lần biến nạp (lặp lại thí nghiệm 2 lần) thu đƣợc trung bình 24,5± 2,12 mảnh lá có cảm ứng, đạt tỷ lệ khoảng 81,6± 7,07 (bảng 3.1). Song song với thí nghiệm chuyển gen, thí nghiệm đối chứng đƣợc thiết lập bằng cách đặt các mảnh lá thuốc lá C9-1trực tiếp lên môi trƣờng GM và GM có bổ sung kháng sinh diệt khuẩn và kháng sinh chọn lọc. Toàn bộ mảnh lá không chuyển gen đƣợc đặt lên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh đều vàng dần và chết. Trong số 2x4 mảnh lá đặt lên môi trƣờng cảm ứng không bổ sung kháng sinh có trung bình 3,5 ± 0,7 mảnh lá tạo mô sẹo, đạt tỷ lệ khoảng 87,5± 17,6 31 Bảng 3.1. Kết quả cảm ứng chồi từ mảnh lá Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu cảm ứng Tỷ lệ (%) pCB-GUS 2x30 24,5± 2,12 81,6± 7,07 WT1 2x4 0 0 WT2 2x4 3,5 ± 0,7 87,5± 17,6 Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh Sau khoảng 2 tuần, bắt đầu quan sát đƣợc những chồi nhỏ. Tách các chồi nhỏ và cấy trên môi trƣờng MS cơ bản, không bổ sung chất điều khiển sinh trƣởng. Sau 3 tuần, 100% mảnh lá lô không chuyển gen đều thu đƣợc chồi, với tỉ lệ trung bình là 3,4± 0,25 chồi/mảnh lá. Số lƣợng mẫu tạo chồi trung bình ở lô chuyển gen là 3,2± 0,25 với số chồi trung bình 3,2± 0,25 chồi/mảnh lá (bảng 3.2). Nhƣ vậy, không có sự khác biệt đánh kể trên các lô cây chuyển gen và không chuyển gen, chứng tỏ quá trình tái sinh cây thuốc lá thiết lập trong thí nghiệm này có hiệu quả. Trong qui trình tái sinh cây thuốc K326, các mảnh lá sau khi cảm ứng chồi vẫn đƣợc tiếp tục phát triển trên môi trƣờng có bổ sung kinetin 1mg/l. Qui trình tái sinh giống C9-1 ban đầu cũng đƣợc lặp lại tƣơng tự nhƣ giống K326. Trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy ở lô đối chứng không bổ sung kinetin, hiệu quả tạo chồi cao hơn đáng kế. Do vậy, chúng tôi lựa chọn môi trƣờng không có chất điều khiển sinh trƣởng làm môi trƣờng tối ƣu cho phát triển cụm chồi đối với giống C9-1. Điều này có thể giải thích do sự khác biệt về kiểu gen giữa 2 giống thuốc lá, chỉ cần bổ sung một lƣợng nhỏ kinetin (1mg/l) trong thời gian ngắn (2-3 tuần) là thích hợp để kích thích cảm ứng chồi của mô lá thuốc lá C9-1. 32 Bảng 3.2: Kết quả tạo chồi Lô thí nghiệm Số mẫu thí nghiệm Số mẫu tạo chồi Tỷ lệ (%) Tổng số chồi Số chồi trung bình pCB-GUS 24,5± 2,12 19,5± 0,7 79,75± 4,03 63± 7,07 3,2± 0,25 WT1 0 0 0 0 0 WT2 3,5 ± 0,7 3,5± 0,7 100 12± 1,4 3,4± 0,25 Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh 3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh Tạo rễ là khâu cuối cùng trong nuôi cấy in vitro và có ý nghĩa quan trọng đối với kỹ thuật chuyển gen ở thực vật. Những nghiên cứu về tái sinh và chuyển gen trên cây thuốc lá ghi nhận IBA, NAA và IAA là những hormone sinh trƣởng đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu tạo rễ. Nồng độ các chất điều khiển sinh trƣởng dao động trong khoảng 0,1 mg/l. Vẫn tiếp tục lặp lại qui trình tái sinh thuốc lá đã công bố của Vân và cs, môi trƣờng MS bổ sung 0,1mg/l NAA đƣợc thử nghiệm tạo rễ thuốc lá C9-1 in vitro. Cụm chồi 4 tuần tuổi có chiều cao 1cm đƣợc tách nhỏ và chuyển sang môi trƣờng tạo rễ. Sau 4-5 tuần, quan sát thấy rễ xuất hiện ở hầu hết các chồi, tỷ lệ gần 90% (bảng 3.3). Các chồi đều phát triển xanh tốt và tạo nhiều lá mới. Quan sát thấy các chồi không chuyển gen trên môi trƣờng đối chứng cũng có quá trình tạo rễ tƣơng tự. 33 Bảng 3.3. Tỷ lệ chồi ra rễ trên môi trường RM Lô thí nghiệm Số chồi cấy trên môi trƣờng ra rễ Số chồi ra rễ Tỷ lệ (%) pCB-GUS 63± 7,07 55± 8,4 87.1± 1,9 WT1 0 0 0 WT2 12± 1,4 10,5± 0,7 87,7± 4,4 Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh Khi các cây in vitro đạt chiều cao từ 5- 7 cm tiến hành đƣa ra ngoài bầu đất. Giá thể thích hợp là 50% trấu, 50% cát. Hai loại giá thể này có độ xốp tốt tuy nhiên khả năng giữ nƣớc kém vì vậy phải chú ý việc chăm sóc tƣới nƣớc cho cây. Chăm sóc khoảng 2 tuần trong điều kiện phòng thí nghiệm. Khi cây non có bộ rễ hoàn chỉnh đƣợc chuyển từ giá thể cát, trấu sang trồng trên giá thể với thành phần chủ yếu là đất đất phù sa trong điều kiện nhà lƣới. Từ những kết quả trên, chúng tôi đề ra quy trình chuyển gen và tái sinh cây thuốc lá (giống C9-1) nhƣ sau: - Mảnh lá bánh tẻ kích thƣớc 0,5cm2 đƣợc ngâm trong dịch huyền phù Agrobacterium (OD600=0.7-1) trong 30 phút và đồng nuôi cấy trên môi trƣờng cảm ứng chồi (MS+1mg/lBAP) trong 3 ngày - Sau 2-3 tuần trên môi trƣờng cảm ứng, chuyển sang môi trƣờng tạo cụm chồi (MS) - Sau 3-4 tuần, tách các chồi đơn và chuyển sang môi trƣờng ra rễ (MS+0,1mg/l NAA) - Cây rễ hoàn chỉnh 4-5 tuần tuổi đủ điều kiện để chuyển sang trồng trong bầu trấu-cát (tỷ lệ 1: 1) 34 A B C D E F G H I Hình 3.1. Kết quả chuyển gen gus vào cây thuốc lá A: Mảnh lá ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn B: Mảnh lá được đặt trên môi trường cảm ứng C: Mảnh lá bắt đầu cảm ứng sau 10 ngày quan sát D: Các mảnh lá không biến nạp đặt trên môi truong bổ sung kháng sinh vàng dần và chết E: Cụm chồi xuất hiện trên môi trường chọn lọc F: Tách chồi chuyển sang môi trường ra rễ 35 G: Cây trồng trong môi trường ra rễ sẵn sàng cho ra bầu H: Cây thuốc lá chuyển gen trồng trong bầu cát: trấu I: Cây trồng trong điều kiện nhà lưới sau 2 tuần 3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào Lấy phần ngọn thân mần của 8 cây thuốc lá sinh trƣởng trên môi trƣờng có chứa kanamycine chọn lọc ngâm trong dung dịch đệm cơ chất X-Gluc. Sau 24- 48h mẫu nhuộm đƣợc tẩy hết diệp lục bằng dung dịch ethanol 70% và quan sát trên kính hiển vi soi nổi. a b Hình 3.2. Biểu hiện gen gus trên ngọn thân mầm(a) và trên lá (b) Hình 3.2 cho thấy, mức độ biểu hiện gen gus khá rõ. Màu xanh đặc trƣng ở phần trên và dƣới của ngọn thân mà lá mầm. Kết quả đã chứng minh, gen gus đƣợc chuyển thành công vào cây thuốc lá. Điều này cũng có ý nghĩa là quy trình tái sinh và chuyển gen trên có thể áp dụng để chuyển các gen đích mong muốn, rong trƣờng hợp này là cấu trúc TMV-RNAi. 3.2. CÁC KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi 3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi 36 Kết quả biểu hiện gen gus cho thấy khả năng ứng dụng quy trình tái sinh và chuyển gen để chuyển cấu trúc TMV-RNAi. Chúng tôi tiến hành chuyển cấu trúc RNAi vào cây thuốc lá theo quy trình tái sinh và chuyển gen đã trình bày ở trên. Song song với các cây chuyển gen, các cây đối chứng không chuyển gen cũng đƣợc nuôi cấy theo quy trình tƣơng tự trên môi trƣờng có bổ sung kháng sinh (kanamycin 50mg/l + cefotaxime 250mg/l) và không bổ sung kháng sinh. Bảng 3.5. Kết quả biến nạp cấu trúc TMV-RNAi vào cây thuốc lá Lô thí nghiệm Số mẫu Tạo mô sẹo Tỷ lệ tạo mô sẹo (%) Mẫu tạo chồi Tỷ lệ tạo chồi (%) Tổng số chồi Chồi trung bình Chồi ra rễ Tỷ lệ chồi ra rễ (%) TMV 2x40 33± 1,4 82,5± 3,5 25,5± 2,12 77,2± 3,1 73± 8,4 2,85± 0,07 62± 4,2 85,2± 4,1 WT1 2x4 0 0 0 0 0 0 0 0 WT2 2x4 4± 0 100 3,5± 0,7 87,5± 17,6 11,5± 2,1 3,3± 0,03 10± 1,4 87,3± 3,8 Ghi chú: WT1: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường có bổ sung kháng sinh , WT2: mảnh lá thuốc lá không chuyển gen đặt lên môi trường không bổ sung kháng sinh Tiến hành 2 lần biến nạp với 40 mảnh lá/ lần thu đƣợc trung bình 85% cây sống sót trên môi trƣờng chọn lọc (bảng 3.5). Lô thí nghiệm thứ nhất trải qua quá trình tái sinh, chuyển gen và chọn lọc thu đƣợc 70 cây con in vitro. Khi cây đủ lớn tiến hành cho cây ra ngoài bầu với giá thể 50% cát , 50% trấu. Sau 10 ngày nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm cây đƣợc đƣa ra trồng ngoài nhà lƣới với giá thể chủ yếu là đất. Sau 1 tuần, chúng tôi đã thu đƣợc 58 cây con cho các thí nghiệm phân tích tiếp theo. 37 Bảng 3.6. Tỷ lệ sống sót của cây thuốc lá trên bầu cát, trấu và ngoài nhà lưới Lô thí nghiệm Số cây ra bầu Số cây sống sót trên bầu Tỷ lệ sống sót (%) Số cây ra ngoài nhà lƣới Số cây sống sót ngoài nhà lƣới Tỷ lệ cây sống sót (%) TMV 70 64 91,4 64 58 90,6 WT 4 3 75 3 3 100 Ghi chú: WT là cây đối chứng không chuyển gen 3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus 3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo Các dòng thuốc lá chuyển gen sau 2-3 tuần phát triển khoẻ mạnh trong nhà lƣới đạt có 5-6 lá thật với kích thƣớc lá khoảng 10cm đƣợc thử nghiệm khả năng kháng virus TMV theo phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo (Herber et al., 1996)[20]. Kết quả sau lần lây nhiễm đầu tiên đã thu đƣợc 20 cây không nhiễm bệnh. Với các mẫu thuốc lá không nhiễm bệnh này chúng tôi tiến hành thu maauc và chuẩn bị tách ADN tổng số sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR. 38 Hình 2.4. Cây thu được sau lây nhiễm a. Cây không bị nhiễm bệnh b. Cây biểu hiện bệnh sau lây nhiễm 3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây ADN tổng số từ những mẫu thuốc lá này đƣợc tách chiết và sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhằm xác định sự có mặt của gen chuyển trong các mẫu thuốc lá. Sản phẩm PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,8 %. 3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số Để thực hiện phản ứng PCR trƣớc tiên phải tiến hành tách ADN tổng số có chất lƣợng tốt. Bƣớc đầu tiên trong quá trình tách chiết ADN là nghiền mẫu trong nitơ lỏng. Sau khi nghiền thành dạng bột mịn bổ sung dung dịch đệm, dung dịch này có tác dụng tách pha tốt trong quá trình ly tâm. a. b. 39 Hình 3.3. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 0,8% Kết quả điện di cho thấy các băng đều và rõ nét, chúng tôi kết luận đã tách chiết thành công ADN tổng số phục vụ cho phản ứng PCR. 3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR Các cây không nhiễm bệnh đƣợc thu mẫu để khẳng định sự có mặt của cấu trúc chuyển gen bằng phƣơng pháp PCR. Kết quả phân tích cho thấy, có 18 cây/ 20 cây cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV/Fi- TMV-Ri (hình 3.4). Đối chứng dƣơng là plasmid TMV-RNAi làm khuôn mẫu. Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn mẫu là ADN tổng số tách chiết từ lá thuốc lá không chuyển gen (2 mẫu) đều cho kết quả âm tính. Điều này đảm bảo đoạn gen chuyển không có sẵn trong cây không chuyển gen. Nhƣ vậy, kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV-Fi/TMV-Ri của 20 cây thuốc lá đã chuyển gen chứng tỏ đây là những cây thuốc lá có mang cấu trúc gen cần chuyển. 40 Hình 3.4. Kết quả PCR kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong 20 mẫu thuốc lá C9-1. M: Thang ADN chuẩn 1 kb, (-) Đối chứng âm là sản phẩm PCR sử dụng khuôn là ADN tách từ cây thuốc lá không chuyển gen; 1- 20: 20 cây thuốc lá chuyển gen; (+) Đối chứng dƣơng là plasmid TMV-RNAi 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1. Đã tái sinh thành công cây thuốc lá C9-1 từ và áp dụng đƣợc quy trình quy trình chuyển gen cho cây thuốc lá C9-1sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien, cây thuốc lá chuyển gen biểu hiện hoạt tính GUS. Quy trình này có thể ứng dụng trong việc chuyển các gen đích mong muốn. 2. Biến nạp thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen mã hóa vỏ virus TMV vào cây thuốc lá và thu đƣợc 58 cây thuốc lá chuyển gen 3. Lây nhiễm thành công vào cây thuốc lá C9-1 đã chuyển gen nhằm thử tính kháng virus TMV, kết quả thu đƣợc có 20/ 58 cây kháng tốt. 4. Kết quả kiểm tra 20 cây thuốc lá chuyển gen cho thấy, có 18 mẫu cho kết quả dƣơng tính với phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu TMV- Fi/TMV-Ri, chứng tỏ đây là những cây thuốc lá có mang cấu trúc chuyển gen. Kiến nghị 1. Cần tiếp tục tiến hành đánh giá tính kháng của các dòng thuốc lá chuyển gen bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo vơi virus TMV. Sau khi lây nhiễm nhân tạo, kiểm tra sự có mặt của virus TMV bằng các phản ứng PCR. 2. Tiếp tục theo dõi và đánh giá tính kháng của các mẫu thuốc lá chuyển gen ở thế hệ tiếp theo nhằm tạo đƣợc dòng thuốc lá có khả năng kháng TMV ổn định qua nhiều thế hệ 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1]: TS. Lê Trần Bình. Công nghệ sinh học thực vật rong cải tiến cây trồng, Viện khoa học kỹ thuật Nông Nghiệp Việt Nam, 1997, NXB Nông Nghiệp. [2]: Chu Hoàng Hà (2010): Nghiên cứu tạo cây trồng kháng bệnh do virus gây ra bằng công nghệ ức chế RNA (RNAi) [3]: Trần Văn Hai, Giáo trình Hóa bảo vệ thực vật- Khoa Nông Nghiệp, Đại học Cần Thơ. [4]: Vũ Triệu Mân (2007), Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội, giáo trinh Bệnh cây chuyên khoa, chuyên ngành Bảo vệ thực vật. [5]:Đỗ Tiến Phát (2009), Xây dựng quy trình tái sinh và thử nghiện khả năng chuyển gen gus vào cây thông nhựa ( Pinus merkussi Jungh & De Vries), Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông Nghiệp Hà Nội [6]: Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen ở thực vật. NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. [7]: Phạm Thị Vân , Nguyễn M inh Hùng , Hà Viết Cƣờng , Lê Văn Sơn , Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà (2009) Tạo cây thuốc lá kháng virus TMV bằng kỹ thuật RNAi . Hội thảo Quốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam , 25-26/7 tại Viện Nghiên cƣ́u Bông và phát triển NN Nha Hố - Ninh Thuận. Tr. 32-40. [8]: Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình(2008). Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dƣa chuột bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ sinh học 6(4A): 679-687 [9]: Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm virus bằng kỹ thuật RNAi, Luận văn thạc sĩ khoa học, Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật. [10]: Nguyễn Văn Chín, Nguyễn Ngọc Bích (2008) Theo dõi tình hình sâu bệnh hại thuốc lá làm cơ sở dự báo và nghiên cứu biện pháp phòng trừ phục vụ sản xuất thuốc lá nguyên liệu” Báo cáo khoa học. Công ty TNHH 43 Một thành viên Viện kinh tế kỹ thuật thuốc lá, Tổng công ty thuốc lá Việt Nam: Tài liệu tiếng Anh [11]: Akehurt B.C 1981: Tobacco.longman group Ltd, New York. 764pp. [12]: Banerjee A.K, Part S, Hannapel D.J (2006), “ Eficient production of transgenic potato ( S.tuberosum L.ssp.andigena) plants via Agrobacterium tumerfaciens- mediated transformation.” Plant Science, 170, pp.732-738. [13]: 32Baulcombe D (2004) RNA silencing in plants. Nature 431(7006) : 356-63 [14]: RN (1999) Coat-protein-mediated resistance to tobacco mosaic virus: discovery mechanisms and exploitation. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354: 659-664 [15]: Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAi-mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris). Mol Plant Microbe Interact. 20(6) : 717-26 [16]: Chicas and Macino, 2001. Charateristics of post- transcriptionnal gene silencing EMBO 2 (11): 992-6 [17]: Colliins W.K; Hawks S.N.Jr: Principles of the flue cured Tobacco production. N.C. Stale Univercity 2 nd E.d.1993.300 [18]di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus.Transgenic Res. 14(6): 989- 94 [19]Gottula J, Fuchs M (2009) Toward a quarter century of pathogen- derived resistance and practical approaches to plant virus disease control. Adv Virus Res. 75:161-83 44 [20]: Hersbers, K, Meuwly P, Frommer WB, Metraux JP, Sonnewald U (1996a), Systemic Acquired. Resistance. Mediated by the Ectopic Expression of Invertase. Posible Hexose sensing in the secretory Pathway. Plant Cell 8: 793- 803 [21]: Hull R, Davies JW (1992) Approaches to nonconventional control of plant virus diseases. Crit Rev Plant Sci 11: 17-33 [22]: Ilardi V., Mazzei M., Loreti S., Tomassoli L., barba M., 1995. Biomoleccular and serological methods to identify strains of cucumber mosaic cucumovirus on tomato. EPPO Bulletin 25: 321- 327 [23]: Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447– 8451 [24: Jefferson R.A (1987), “ Asaying chimeric gens in plants: The gus gen fussiuon system”, Plant Molecculer Biology Reporter, (5), pp. 387- 405. [25: Juliana D, Annika P, Jurith M and Iris S ( 2006), “ The use of the phosphomanose isomerase/ mannose seclection system to recover transgenic apple plants” Plant Cell Rep (25), pp. 1149- 1156. [26] Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing. Plant Cell Rep. 26(8): 1283-8 [27: Owen A.M., Downes, J.D., Sahakian, B.J., Polkey, C.E. and Robbins T.W. (1990). Planning and spatial working memory following frontal lobe lesions in Man. Neuropsychologia, 28 (10), 10211034 [28: Owen & Palukaitis, Virology 166: 495, 1988 [29: Palukaitis, P., Roossinck, M. J., Dietzgen, R. G., and Francki, R. i. B. 1992. Cucumber mosaic virus. Adv. Virus Res. 41: 281-348 [30: Palukaitis, P., and Zaitlin, M. 1997. Replicase – mediated resistance to plant virus disease. Adv. Virus Res. 48: 349-377 45 [31: Roossinck MJ (2002): Evolutionnary history of cucumber mosaic virus as deduced by phylogentic analyses. J. Virol. 76: 3382- 3387 [32]Scholthof K-BG, Scholthof HB, Jackson AO (1993) Control of Plant virus diseases by Pathogen-derived resistance in transgenic plants. Plant Physiol 102: 7-12 [33]Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407: 319-20 [34] Stryer Lubert (1988) Third Edition. W. H. Freeman and Company Biochemstry. ISBN 0-7167- 1843 [35]Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection. Appl Biochem Biotechnol. Epub ahead of print [36]: Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijl PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs. Nature 407: 319-20 [37]: Sun ZN, Yin GH, Song YZ, An HL, Zhu CX, Wen FJ (2010) Bacterially Expressed Double-Stranded RNAs against Hot-Spot Sequences of Tobacco Mosaic Virus or Potato Virus Y Genome Have Different Ability to Protect Tobacco from Viral Infection. Appl Biochem Biotechnol. Epub ahead of print [38]: Tenllado F, Llave C, Díaz-Ruíz J (2004) RNA interference as a new biotechnological tool for the control of virus diseases in plants.Virus Res. 102(1): 85-96 [39] Topping JF(1988), Tobacco tranformation Methods ò Molecular Biology, 81: 365 46 [40]Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I (2008) RNA- interference in rice against Rice tungro bacilliform virus results in its decreased accumulation in inoculated rice plants. Transgenic Res. 17(5): 897-904 [41]Vanderschuren H, Alder A, Zhang P, Gruissem W (2009) Dose- dependent RNAi-mediated geminivirus resistance in the tropical root crop cassava. Plant Mol Biol. 70(3):265-72 [42]: Wahyuni, W.S., Dietzegen, R. G., Hanada, K., and Francki, R.I.B. 1992. Seorological and biological variatinon bwtwwen and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus. Plant Pathol. 41: 282- 297 [43]:Waterhouse PM, Graham MW, Wang MB (1998) Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA. Proc Natl Acad Sci USA 95(23):13959-64. [44] 42Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6): 581-90 [45]: Wesley SV et al (2001) Constructs for efficient, effective and high throughput gene silencing in plants. Plant J 27: 581–590 [46]: Zrachya A, Kumar PP, Ramakrishnan U, Levy Y, Loyter A, Arazi T, Lapidot M, Gafni Y (2007) Production of siRNA targeted against TYLCV coat protein transcripts leads to silencing of its expression and resistance to the virus. Transgenic Res. 16(3): 385-98 Trang web: [47]: [48]: [49]: la/2008/4/226146.vip 47 [50]: Quyết định 88/2007/QĐ-TTg, [51]: gi/DV2962-giong-ca-chua-chiu-nhiet-va-khang-benh-xoan-la-virus-4637/ [52]: 48 Phụ lục Phụ lục 1. Thành phần các môi trƣờng MS THÀNH PHẦN MUỐI KHOÁNG CƠ BẢN CỦA MÔI TRƢỜNG MS (Murashige và Skoog, 1962) SKOOG I SKOOG II SKOOG III NH4NO3: 1650mg/l FeSO4.7H2O: 27,8mg/l KI: O,83 mg/l KON3: 1900 mg/l MnSO4.4H2O: 22,3mg/l Na2MoO4.2H2O: 0,25mg/l KH2PO4: 170mg/l H3BO4: 6,2mg/l CuSO4.5H2O: 0,0025mg/l MgSO4.7H2O: 370mg/l ZNSO4.7H2O: 8,6mg/l CoCl2.6H2O : 0,025 mg/L CaCl2.2H2 : 440 mg/L Na2EDTA : 37,3 mg/L Và các nguyên tố đa lƣợng N P K Ca Mg S, vi l ƣ ợng Fe Zn B Co N Mn Cu Al Mo I 49 Phụ lục 2: Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy Môi trƣờng Thành phần Nuôi cấy cơ bản MS(I-V) +30g/l glucose, 8g/l agar, pH5,8. Lây nhiễm ½ MS(I-V) , pH 5,8 Tạo mô sẹo MS (I-V) +1mg/l BAP+ 30g/l glucose+ 8g/l agar, pH5,8. Tạo chồi MS (I-V) +250mg/l cefotaxime + 50mg/l kanamycine + 30g/l glucose +8g/l agar, pH5,8. Ra rễ MS (I-V) + 0,1mg/l NAA + 30g/l glucose+ 8g/l agar, pH5,8. LB lỏng Bacto pepton 10g/l + NaCl 10g/l + Yeast extract 5g/l. pH 7 LB aga LB lỏng + 16 g/l aga Dung dịch X-Gluc 50 mM Na2HPO4 và NaH2PO4; pH7; 10mM[K3(Fe(CN)6]; 10mM K4[(Fe(CN)6]; 10 mM Na2EDTA; 0,1% Triton-100; 1,5mM X-glucuronide Phụ lục 2. 50 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................................. 1 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... 2 MỞ ĐẦU ....................................................................................................................................... 3 CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................... 4 1.1.GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY THUỐC LÁ ................................................................. 4 1.1.1.Phân loại...................................................................................................................... 4 1.1.2. Giá trị của cây thuốc lá ............................................................................................ 5 1.1.3 . Thực trạng phát triển vùng thuốc lá nguyên liệu tại Việt Nam ....................... 6 1.2. MỘT SỐ BỆNH THƢỜNG GẶP Ở CÂY THUỐC LÁ ............................................... 8 1.2.1. Bệnh virus trên cây thuốc lá ................................................................................... 8 1.2.2. Bệnh khảm lá do virus ........................................................................................... 10 1.3. BIỆN PHÁP KHẮC PHỤC ............................................................................................ 14 1.3.1. Sử dụng giống kháng bệnh: .................................................................................. 14 1.3.2.Sử dụng giống sạch bệnh ........................................................................................ 15 1.3.3. Các biện pháp canh tác.......................................................................................... 15 1.3.4. Sử dụng biện pháp công nghệ sinh học ............................................................... 15 1.3.4.1. Giới thiệu chung về công nghệ RNAi trong tạo cây trồng kháng virus ......... 18 1.3.4.2. Cơ chế hoạt động của RNAi ............................................................................. 18 1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU TẠO CÂY CHUYỂN GEN KHÁNG VIRUS Ở VIỆT NAM. ....................................................................................................................................... 19 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ................................................................... 21 2.1. VẬT LIỆU........................................................................................................................ 21 2.1.1.Vật liệu thực vật ........................................................................................................ 21 2.1.2.Chủng vi khuẩn và vector chuyển gen: .................................................................. 21 2.1.3.Hóa chất và thiết bị sử dụng.................................................................................... 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................................................................. 22 2.2.1.Tạo nguyên liệu thí nghiệm: ................................................................................... 22 2.2.1.1.Khử trùng hạt bằng khí Clo ............................................................................... 22 2.2.1.2. Gieo hạt.............................................................................................................. 22 2.2.2.Chuyển gen vào cây thuốc lá thông qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium tumafaciens ........................................................................................................................ 23 2.2.2.1.Tạo dịch huyền phù vi khuẩn Agrobacterium................................................... 23 51 2.2.2.2. Tạo nguyên liệu chuyển gen ............................................................................. 23 2.2.2.3.Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy ......................................................................... 23 2.2.2.4.Tái sinh và chọn lọc cây chuyển gen................................................................. 24 2.2.2.5.Tạo rễ và cây hoàn chỉnh................................................................................... 24 2.2.3.Phân tích cây chuyển gen bằng phƣơng pháp nhuộm mô hóa tế bào ............. 24 2.2.4. Phân tích sự có mặt của cấu trúc chuyển gen TMV_RNAi bằng phƣơng pháp PCR ........................................................................................................................... 25 2.2.4.1. Tách chiết ADN tổng số .................................................................................... 25 2.2.4.2. Thực hiện phản ứng PCR.................................................................................. 25 2.2.5. Phân tích khả năng kháng virus của các cây chuyển gen bằng phƣơng pháp lây nhiễm nhân tạo ................................................................................................. 26 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 28 3.1. XÂY DỰNG HỆ THỐNG TÁI SINH VÀ CHUYỂN GENVÀO GIỐNG THUỐC LÁ C9-1 THÔNG QUA AGROBACTERIUM TUMAFACIENS ......................................... 28 3.1.1. Tạo nguyên liệu thực vật cho thí nghiệm chuyển gen ....................................... 29 3.1.2. Chuyển gen và tái sinh cây ..................................................................................... 29 3.1.2.1. Đồng nuôi cấy với dung dịch Agrobacterium và cảm ứng tạo cụm chồi ...... 29 3.1.2.2. Tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh .............................................................. 32 3.1.3. Phân tích sơ bộ cây chuyển gen gus bằng nhuộm hóa mô tế bào...................... 35 3.2. CÁC KẾT QUẢ BƢỚC ĐẦU TRONG TẠO CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN MANG CẤU TRÚC TMV-RNAi.......................................................................................... 35 3.2.1. Tái sinh và chuyển gen mang cấu trúc TMV-RNAi ......................................... 35 3.2.2. Phân tích cây chuyển gen TMV_RNAi kháng virus ......................................... 37 3.2.2.1. Phân tích khả năng kháng virus TMV bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo .................................................................................................................................... 37 3.2.2.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây ................................................ 38 3.2.2.2.1. Kết quả tách ADN tổng số ......................................................................... 38 3.2.2.2.2. Kết quả phản ứng PCR .............................................................................. 39 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................................. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................................ 42