Nghiên cứu quy trình phân tích 6 - Benzylamionpurine trong giá (đỗ) bằng hplc đầu dò uv

Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 20 CHƯƠNG 2:NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu xác định BA bằng nhiều phương pháp phân tích, nhưng ở Việt Nam cho tới nay vẫn chưa có nghiên cứu nào xác định BA. Với mong muốn xây dựng quy trình phân tích nhanh BA trong giá trên thiết bị HPLC-UV sẵn có, chúng tôi tiến các bước sau:  Khảo sát bước sóng hấp thu  Khảo sát thành phần pha động.  Khảo sát tốc độ dòng pha động.  Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng.  Khảo sát thời gian ngâm mẫu, thành phần dung môi chiết mẫu.  Khảo sát thể tích rửa giải.  Khảo sát tối ưu hóa quy trình chiết tách và làm giàu trên mẫu giả.  Ứng dụng quy trình phân tích trên mẫu thật. Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 21 2.1.THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 2.1.1.Thiết bị và dụng cụ:  Hệ thống HPLC Shimadzu:  Đầu dò UV - 10 Axl  Cột phân tích HRC - ODS AS0678 Kích thước 20 cm x 4.6 mm x 5 µm  Cột bảo vệ GHRC - ODS FU3445  Injector tiêm tự động SIL - 20 A  Bộ điều nhiệt CRB - 6A  Máy xay  Cân kỹ thuật  Cân phân tích (chính xác đến 0.0001 g)  Bể siêu âm  Dụng cụ hút chân không dùng cho 10 cột SPE  Tủ sấy  Một số thiết bị thủy tinh khác  Cột SPE C18 của Altech 2.1.2.Hóa chất:  6- benzyl aminopurine(BA) tinh khiết phân tích của Merck  Methanol tinh khiết phân tích của Merck  Nước khử ion  Acid Acetic 99,7% tinh khiết phân tích của Merck  Acid formic 99,9% tinh khiết phân tích của Merck  Dung dịch NH3 25% tinh khiết phân tích của Merck  CHCl3 tinh khiết phân tích của Merck 2.1.3.Chuẩn bị các dung dịch làm việc:  Dung dịch pha động: Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 22 -Dung dịch A (dung dịch H2O (CH3COOH 0.05% )): thêm 0,5 ml CH3COOH vào 1lit nước khử ion. -Dung dịch B (dung dịch MeOH(CH3COOH 0.05%)): thêm thêm 0,5 ml CH3COOH vào 1lit MeOH  Dung dịch đệm (Amoni formiate, pH=3.7) : -Dung dịch X: lấy 13.6 ml dung dịch NH3 25% pha loãng bằng nước khử ion đến 100 ml. -Dung dịch Y: lấy 7.6 ml dung dịch HCOOH pha loãng bằng nước khử ion đến 100 ml. Trộn 100ml dung dịch Y với 90 ml dung dịch X, đo pH và tiếp tục hiệu chỉnh bằng dung dịch X cho đến khi pH=3.7.  Dung dịch chuẩn BA: -Dung dịch chuẩn gốc BA 1000mg/L: cân 0.1g chuẩn BA trên cân phân tích, hòa tan trong MeOH. Sau đó chuyển vào bình định mức 100ml và định mức đến vạch bằng Methanol. Bảo quản trong tủ lạnh. Sử dụng trong vòng 1 tháng. -Dung dịch BA làm việc 50mg/L: pha từ dung dịch chuẩn gốc BA 1000mg/L.  Dung môi chiết:  Dung môi 1: trộn 20ml MeOH với 5ml H2O cất, ta được 25ml dung môi MeOH: H2O (80:20,v:v).  Dung môi 2: trộn 18.75ml MeOH, 1.25ml HCOOH 99.9% với 5ml H2O cất, ta được 25ml dung môi MeOH:HCOOH 99.9%:H2O (15:1:4,v:v:v).  Dung môi 3: trộn 15ml MeOH, 6.25ml CHCl3 ,1.25ml HCOOH 99.9% với 2.5ml H2O cất, ta được 25ml dung môi MeOH:CHCl3: HCOOH 99.9%:H2O (12:5:1:2,v:v:v:v). Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 23 2.2. KHẢO SÁT TRÊN DUNG DỊCH CHUẨN BA 2.2.1. Khảo sát bước sóng hấp thu: Với mong muốn lựa chọn bước sóng mà tại đó BA hấp thu cực đại, sự tách peak của chất phân tích rõ ràng nhất, chúng tôi tiến hành khảo sát bước sóng hấp thu của BA. Tiến hành: Chuẩn bị dung dịch chuẩn BA trong dung môi MeOH. Phân tích trên máy tử ngoại GBC Cintra 20, quét bước sóng khảo sát từ 200-600nm. 2.2.2.Khảo sát thành phần pha động Pha động là dung môi hữu cơ phân cực, phổ biến nhất là MeOH và ACN. Ngoài ra, nước được thêm vào pha động với mục đích nhằm tăng khả năng phân giải của cột đối với chất cần nghiên cứu. Pha động trong sắc kí lỏng vừa đóng vai trò đưa chất phân tích vào cột vừa là dung môi rửa giải. Sau khi được giữ lại trên pha tĩnh, các chất sẽ được rửa giải ra khỏi cột tại các thời điểm khác nhau tùy vào khả năng tương tác của chúng đối với pha tĩnh, tùy vào tính chất và tốc độ dòng của pha động sử dụng. Do cột sắc kí không thể hoạt động tốt trong môi trường quá acid (pH<2) vì lúc này sẽ có sự phân li của các nhóm eter(-O-Si-C18) ra khỏi cột làm mất hoạt tính của cột, độ phân cực của nhóm silicagel sẽ giảm làm cho chất phân tích không thể tương tác với cột. Nếu trong môi trường quá kiềm, SiO2 tan cũng làm mất hoạt tính của cột. Do đó, trong phần thực nghiệm này chúng tôi chọn nồng độ acid CH3COOH (HAc) 0.05%. Acid acetic là một acid yếu, được thêm vào thành phần pha động đóng vai trò là chất cung cấp proton H+ cho quá trình proton hóa 6- benzyl aminopurine (BA). Để khảo sát thành phần pha động, sử dụng hệ pha động gồm: MeOH (HAc 0.05%)/ H2O(HAc 0.05% )(v/v). Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 24 Vì vậy, tiến hành phân tích trên chuẩn BA (5mg/L) trên hệ thống HPLC/UV để tìm được thành phần pha động tối ưu cho qui trình. Trong nghiên cứu này, khảo sát thành phần pha động ở 5 tỉ lệ thể tích khác nhau: 70/30; 60/40; 50/50; 40/60; 30/70 với các thông số của hệ HPLC như sau: -Chế độ đẳng dòng -Bước sóng 270 nm -Nhiệt độ lò cột 400C -Thể tích mẫu tiêm 10 μl 2.2.3. Khảo sát tốc độ dòng pha động: Thời gian lưu và hình dạng của peak sắc kí phụ thuộc nhiều vào tốc độ dòng pha động. Nếu tốc độ dòng pha động lớn, cũng có nghĩa là nồng độ pha động lớn, khả năng phân bố các chất trong pha động lớn. Nếu là hỗn hợp của nhiều chất sẽ ra nhanh có thể gây chồng lấp các peak. Nhưng nếu tốc độ quá chậm thì chất phân tích bị giữ lại trong cột lâu, thời gian phân tích kéo dài, ảnh hưởng lên hình dạng của peak như peak bị tù, bị kéo đuôi, phân tích kém chính xác. Vì vậy, tiến hành phân tích trên chuẩn BA (10mg/L) trên hệ thống HPLC/UV ở các tốc độ dòng pha động khác nhau để tìm được tốc độ dòng pha động tối ưu cho qui trình. Trong nghiên cứu này, khảo sát tốc độ dòng pha động ở 4 tốc độ dòng khác nhau: 0.5ml/phút; 0.8ml/phút; 1.0ml/phút; 1.2ml/phút với các thông số của hệ HPLC như sau: -Chế độ đẳng dòng -Bước sóng 270 nm -Nhiệt độ lò cột 400C -Thể tích mẫu tiêm 10 μl 2.2.4. Các thông số cài đặt cho hệ thống HPLC- UV: Từ các khảo sát trên, chúng tôi đề nghị các thông số vận hành thiết bị sau: -Nhiệt độ lò cột :40o C -Thể tích tiêm mẫu :10µl -Bước sóng: 270nm Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 25 -Tốc độ dòng: 1ml/phút, thành phần pha động MeOH/H2O (40/60;v/v) -Kỹ thuật tiêm: tiêm mẫu tự động 2.2.5. Khảo sát khoảng tuyến tính và dựng đường chuẩn: Chuẩn bị dãy dung dịch chuẩn có nồng độ: 0.5; 1.0; 2.0; 4.0; 7.0; 10.0; 25.0 (mg/L) và tất cả được pha trong MeOH(100%). Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLC/UV với các thông số cài đặt máy như trên theo thứ tự từ thấp đến cao. 2.2.6. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng: Mục đích: đánh giá độ nhạy của quy trình phân tích dựa vào đường chuẩn Tiến hành: Tiến hành phân tích theo nồng độ chuẩn BA giảm dần từ cao xuống thấp để xác định nồng độ nhỏ nhất Cmin. (Cmin là nồng độ chất phân tích nhỏ nhất mà vẫn có thể xác định được chất phân tích). Nồng độ chất phân tích càng gần Cmin thì khảo sát LOD và LOQ càng chính xác. Theo nguyên tắc một mẫu có thể định tính khi tín hiệu đo được lớn hơn hoặc bằng ba lần tín hiệu nền ( LOD ≥ 3 S/N ) và có thể định lượng khi tín hiệu đo được lớn hơn hoặc bằng mười lần tín hiệu nền ( LOQ ≥ 10 S/N ). * Tính LOD và LOQ theo công thức. LOD = 3 * Cmin / T LOQ = 10 * Cmin / T ( T = S/N ) Trong đó: S chiều cao peak. N: chiều cao của nền tại peak cần xác định. Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 26 2.3. XÂY DỰNG QUY TRÌNH XÁC ĐỊNH BA 2.3.1.Tạo mẫu trắng : Cân và ngâm trong nước ấm khoảng 100g đậu xanh, từ 8 - 12 tiếng, khi nhìn thấy tất cả hột đậu có mầm nhú lên, xả qua nước lạnh. Sau đó ủ đậu, cứ 2 đến 3 giờ thì thay nước sạch 1 lần, sau 5 ngày thì thu được giá thành phẩm. Quy trình xử lý mẫu sơ bộ [9,10,11,12,13,14]: Cân 5g giá (mẫu trắng), cắt nhỏ, cho vào erlen. Thêm chính xác 25ml hệ dung môi chiết (như mục 2.1.3). Đậy kỹ, lắc đều để trong tủ lạnh một thời gian. Sau đó, đánh siêu âm trong 5 phút, tiếp theo lọc dung dịch qua giấy lọc, đem đun cách thủy đến khô. Hòa tan bằng 8 ml dung dịch đệm amoni formiate (pH = 3.7), sau đó cho qua cột SPE C18 (cột được hoạt hóa bằng 10ml MeOH). Rửa giải: BA được rửa bằng MeOH (CH3COOH 0.05% ), định mức lại 1ml MeOH, lọc qua màng lọc 45µm cho vào vial, rồi xác định bằng HPLC/UV. 2.3.2 Khảo sát thời gian ngâm mẫu và hệ dung môi chiết: Mục đích: để đánh giá hiệu quả chiết chất phân tích ra khỏi nền mẫu của các dung môi và lựa chọn thời gian ngâm mẫu thích hợp. Tiến hành: tiến hành xử lý mẫu sơ bộ như trên, với các thời gian ngâm là 6h, 12h, 18h, 24h, 30h ở mỗi thời gian khảo sát với 3 hệ dung môi chiết khác nhau. Dựa trên các tài liệu nghiên cứu chọn 3 hệ dung môi chiết:  Dung môi 1: MeOH: H2O (80:20,v:v)  Dung môi 2: MeOH:HCOOH 99.9%:H2O (15:1:4,v:v:v)  Dung môi 3: MeOH:CHCl3: HCOOH 99.9%:H2O (12:5:1:2,v:v:v:v) Mỗi hệ dung môi chúng tôi thực hiện 3 lần. 2.3.3 Khảo sát thể tích rửa giải: Mục đích: Nếu rửa giải với thể tích dung môi nhiều quá thì tạp chất trong nền mẫu bị rửa giải theo ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Ngược lại, thể tích dung môi ít thì không rửa giải hết chất phân tích gây sai lệch kết quả. Tiến hành: Lấy chính xác 1mL MeOH cho qua cột để rửa giải BA, sau đó lấy dung dịch rửa giải đo tín hiệu trên hệ thống HPLC. Rồi cứ rửa tiếp mỗi lần 1ml MeOH Luận văn cao học Trương Thị Văn Trinh 27 thu dung dịch rửa giải vào vial, đuổi dung môi, định mức lại bằng 1ml MeOH rồi đo tín hiệu trên HPLC. Sau đó tính tổng thể tích dung môi MeOH đã dùng để rửa giải hết BA trên cột. 2.3.4. Khảo sát hiệu suất thu hồi của quy trình: Cách tiến hành: Chuẩn bị mẫu trắng như nhau,mỗi mẫu cân 5g cho vào erlen. Rồi thêm 1ml dung dịch chuẩn ở các nồng độ 0; 10 mg/L; 15 mg/L; 20 mg/L. Sau đó tiếp tục xử lý mẫu như trên và phân tích trên HPLC/UV. Từ kết quả thu được, tính hiệu suất thu hồi theo công thức sau: H% = (C1- C2)/ C3 * 100 Với C1: hàm lượng chất xác định có trong mẫu sau khi thêm. C2: hàm lượng chất xác định có trong mẫu trắng C3: hàm lượng chất chuẩn cho vào mẫu trắng