Nghiên cứu sự phát triển cơ quan lympho của cá tra pangasianodon hypophthalmus từ 1 đến 30 ngày tuổi

vật lưỡng thê và bò sát, tế bào B phát triển đầu tiên ở gan và tỳ tạng, sau đó thì gián đoạn ở gan nhưng ở tỳ tạng vẫn được duy trì và cuối cùng nó xuất hiện ở tuỷ xương. Ở chim, tế bào B phát triển trong túi của Fabricius (là nơi tạo ra các tế bào biểu mô của ruột sau). Và ở động vật hữu nhũ, tế bào B phát triển chủ yếu ở tuỷ xương. Tuy nhiên, ở 1 vài loài động vật hữu nhũ, như thỏ và bò, tổ chức lymphoid ở ruột là nơi quan trọng để tạo ra các tế bào B nguyên thuỷ. Vì vậy, có thể cho rằng tế bào B có thể được sinh ra ở nhiều vị PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 5 trí khác nhau của động vật xương sống có hàm. Trái ngược lại, tế bào T chỉ phát triển ở một số vị trí nhất định (Trích dẫn từ Thomas et al., 2007). 2.4 Các cơ quan lymphoid 2.4.1 Tỳ tạng (Spleen) Tỳ tạng của cá da trơn là một cơ quan lymphoid thuộc vùng ruột được bao quanh bằng màng treo ruột. Nó có màu đỏ thẩm, hình thoi dài hoặc hình trứng có bề mặt phẳng. Nó được bao bọc bởi 1 lớp biểu bì và lớp mô liên kết. Nhiều tế bào nằm ở dưới mô liên kết. Thành phần chính của tỳ tạng gồm dạng thể bầu dục, phần tủy trắng, phần tủy đỏ và trung tâm đại thực bào. Thận của cá chưa trưởng thành không có phần cơ mở rộng đến nhu mô như ở trường hợp của cá trưởng thành. Mặc dù ở tỳ tạng của cá trưởng thành có phần cơ mở rộng đến nhu mô nhưng không rõ ràng như ở động vật hữu nhủ. Tủy trắng và tủy đỏ của cá bột không tách ra riêng biệt như ở cá trưởng thành. Phần tủy đỏ bao gồm nhiều tế bào máu hình sine với những hồng cầu trưởng thành, một số nguyên hồng cầu, đại thực bào, những tế bào lưới và trung tâm đại thực bào sắc tố (melanin). Những sợi mạng lưới được tìm thấy ở vách dạng đường sine, được sắp xếp ở dạng vòng bao quanh vi thể tỳ tạng. Phần tủy trắng có nhiều tế bào bạch cầu kiềm tính hơn phần tủy đỏ, ngoài ra ở tủy trắng còn có tế bào lympho, ít tế bào hồng cầu, đại thực bào và một số trung tâm đại thực bào. Những tế bào hồng cầu chưa trưởng thành hoặc trưởng thành, đại thực bào, với một số ít tế bào hồng cầu trong tế bào chất đã được tìm thấy ở tỳ tạng, bắt màu đậm với dung dịch Wright và Giemsa. Nhìn chung ở tỳ tạng có nhiều đại thực bào hơn ở tiền thận, đều này cho thấy tỳ tạng là cơ quan chính loại bỏ những tế bào hồng cầu già và tạo ra nhiều tế bào mới (Trích dẫn từ Supranee et al., 1991). Theo Nguyễn Quốc Thịnh, 2002 ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) tỳ tạng có màu đỏ thẩm, dạng dẹp, vị trí của tỳ tạng nằm ở màng treo ruột. Chức năng của tỳ tạng là tiêu hủy những tế bào hồng cầu già, tái hấp thu sắt, Hemoglobin và các thành phần cấu tạo hồng cầu khác để sản xuất hồng cầu mới. Ngoài ra tỳ tạng còn có nhiệm vụ sản xuất ra các loại tế bào limpho giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 6 2.4.2 Cơ quan thymus (tuyến ức) Thymus là 1 đôi cơ quan được tìm thấy giữa lớp biểu bì và vỏ ở rìa trên của nắp mang thuộc hốc mang cá . Nó là 1 cơ quan nhỏ. Thymus được bao quanh bởi những sợi mô liên kết. Nó không được tách biệt trong 1 vùng để nhận biết giữa vỏ và lỗi, vì vậy có sự khác nhau với thymus của động vật hữu nhũ. Thymus có thể thay đổi hình dạng và phát triển tốt ở cá hương và cá giống. Nó nằm gần thận trước ở cá hương và cá giống nhưng vị trí đó lại khác so với cá trưởng thành bởi vì là cơ quan rất nhỏ và kích thước tương tự như thymus ở cá giống. Các tế bào thymus bắt màu xanh đen với thuốc nhuộm haematoxylin & eosin đó là loại tế bào chiếm ưu thế được tìm thấy trong Thymus. Thymus là cơ quan quan trọng của cá con và có một nhận định nó là cơ quan nội tiết nhưng chức năng quan trọng phổ biến được nhận biết là nó giữ vai trò trong tạo miễn dịch (Trích dẫn từ Supranee et al., 1991). Ở cá nheo mỹ (channel catfish), thymus nằm ở phía trong mặt lưng của hốc mang. Nó thường được bao bọc bằng lớp biểu bì mỏng.. Ở một số loài, lớp võ của thymus chủ yếu là các tế bào thymus và phần lõi là các tế bào biểu mô chiếm đa số. Các tế bào biểu mô giống với các huyết cầu của 1 số cá có vú. Ở một vài loài cá, thymus có thể được phát hiện ở 1 vài ngày đầu sau khi nở, ngược lại ở 1 vài loài cá bơn sao, dường như chỉ tìm thấy ở cá sau giai đoạn biến thái của ấu trùng. Sự thành thục của thymus ở tất cả các loài cá không phát sinh giống như ở động vật hữu nhủ. Thymus có khả năng thay đổi về kích thước với sự thay đổi của mùa hoặc theo chu kỳ của hormone được nhận dạng nhờ phương pháp mô học. Chức năng thymus của cá cũng giống như ở động vật hữu nhũ, tạo ra các tế bào lympho trong miễn dịch qua trung gian tế bào, trước khi di dời ra cơ quan lymphoid ngoại biên. Ở cá nhỏ, khi vi khuẩn tiếp xúc với hốc mang, phủ lên thymus gây hoại tử biểu bì là phổ biến, sau đó xâm nhập và phá huỷ nhu mô của thymus. Sự thay đổi về hình dạng ngoài của thymus đặc biệt là sự xuất huyết của thymus ở một số loài cá được cho là có liên quan đến điều kiện gây sốc của môi trường (Trích dẫn từ Grizzle et al., 1976). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 7 2.4.3 Thận (Kidney) Thận của cá (nheo Mỹ) thì trải dài và đối xứng hai bên nhưng được chia ra thành từng phần riêng biệt, đó là phần thận trước và phần thận sau. Tiền thận và thân thận của cá trưởng thành và tiền trưởng thành trên 4 cm chiều dài tổng không được liên kết bởi một số biểu mô thận hoặc ống thận. Tĩnh mạch chính của phần thận trước kéo dài từ phần thân thận đến tiền thận. Tiền thận nằm ở phía trước bong bóng hơi của cá gồm tuyến nội tiết, biểu mô và cơ quan tạo máu. Quản cầu thận Malpighi và ống cuộn có ở tiền thận của những cá nhỏ hơn 4 cm chiều dài tổng. Nhưng cấu tạo và những ống này thì kéo dài từ phần tiền thận đã tiêu biến ra phía sau của thận (Trích dẫn từ Grizzle et al., 1976). Ở cá tra thận có màu nâu đỏ nằm dọc theo cột sống. Chức năng chính của thận là bài tiết các sản phẩm của quá trình biến dưỡng như NH3, Ure, các muối hóa trị 2; ổn định môi trường pH; điều hòa áp suất thẩm thấu,… Đồng thời thận còn có chức năng tạo máu và tham gia vào hệ thống miễn dịch bằng mô kẽ. Ngoài ra, thận còn tham gia vào hệ thống nội tiết (tiết kích thích tố và điều hòa quá trình sinh lý của cơ thể bằng hormone Adrenalin và Noradrenalin) (Bùi Châu Trúc Đan, 2003). 2.5 Sự hình thành cơ quan lympho Ở người hệ miễn dịch bao gồm nhiều cơ quan như tuyến ức (thymus), các hoạch bạch huyết, tuỷ xương, tuỵ tạng và ruột thừa. Tất cả các tế bào miễn dịch xuất phát từ các nguyên bào trong phôi, sau đó di chuyển đến các mô và cơ quan chuyên biệt, tại đây chúng sản sinh ra các hồng cầu và bạch cầu. Những tế bào bạch cầu nhất là các đại thực bào, tế bào B, T, NK và tế bào mast giữ vai trò quan trọng trong đáp ứng niễm dịch. Có 2 hệ thống đáp ứng miễn dịch là miễn dịch qua thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào. Cả 2 hệ thống này hoạt động chung để phá huỷ các kháng nguyên. Hệ thống miễn dịch thể dịch bảo vệ cơ thể chống lại các kháng nguyên thông qua sự tiết các prôtêin chuyên biệt là kháng thể, làm bất hoạt hoặc phá huỷ kháng nguyên trên bề mặt của vi khuẩn, nấm, virus nằm bên ngoài tế bào cũng như các chất độc tự do trong máu và huyết tương. Còn hệ miễn dịch qua trung gian tế bào trực tiếp phá huỷ các vi khuẩn qua việc sản xuất những tế bào chuyên biệt tấn công vào các chất xâm nhập (Bùi Tấn Anh và ctv, 2004). Theo Breuil.G, et al., 1997 nghiên cứu sự phát sinh kháng thể IgM trong tế bào và sự thay đổi trong miễn dịch golobulin (IgM) xuyên suốt ở giai đoạn ấu trùng của cá chẽm bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (FITC) và phép phân PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 8 tích FACS để phát hiện những tế bào dương tính với IgM bằng mẫu dò kháng kháng thể. Còn sự phát triển của cơ quan lympho được nghiên cứu bằng phương pháp mô học. Kết quả nghiên cứu cho thấy, một lượng nhỏ IgM được phát hiện bằng phương pháp ELISA ở trứng cá, nhưng giảm dần cho đến ngày thứ 5 sau khi nở, từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 15 không tìm thấy IgM trong tế bào. Sau đó IgM được phát hiện lại từ ngày 15 đến ngày thứ 30. Xuyên suốt giai đoạn này cơ quan thymus và thận trước được hình thành. Từ ngày 30 đến ngày 95, mật độ IgM tăng lên tương quan với trọng lượng cơ thể của ấu trùng. Kết quả này cho thấy rằng IgM được phát hiện từ ngày thứ 0 đến ngày thứ 5 xuất phát từ cá mẹ, trong khi đó IgM được phát hiện từ ngày 15 là các IgM mới được tổng hợp. Hơn thế nửa, tế bào B thành thục và sự tổng hơp IgM tương đối hoàn chỉnh ở ấu trùng cá chẽm 50 ngày tuổi khi cơ quan lympho phát triển đầy đủ. Trong khi đó, Merete et al., 1998 nghiên cứu về sự hình thành cơ lympho và sự sản xuất miễn dịch globulin ở cá tuyết đại dương (Gadus morhua L.), thuộc loài cá nước mặn. Kết quả cho thấy, ở cá tuyết (Gadus morhua L) thận trước và lá lách là cơ quan lympho xuất hiện trước tiên trong khoảng thời gian lúc nở, còn thymus được quan sát ở ấu trùng có kích thước 9 mm. Tế bào IgH mRNA được phát hiện trong lát cắt paraffin của ấu trùng cá, còn cá ở giai đoạn tiền trưởng thành dùng phương pháp lai phân tử. Những tế bào dương tính không phát hiện được ở cá nhỏ hơn 33 mm (58 ngày sau khi nở). IgH mRNA có sự giống nhau với các động vật khác và sự xuất hiện đầu tiên của các tế bào miễn dịch globulin dương tính được tìm thấy bằng phương pháp hoá mô miễn dịch. Tiếp theo đó, vào năm 2001, Lora et al., nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho của cá nheo mỹ, để đánh giá sự thay đổi có liên quan đến sự phát triển về chức năng đáp ứng miễn dịch dịch thể, nghiên cứu đánh giá về thời gian và không gian phân bố của tế bào miễn dịch phát triển ở cá da trơn. Kết quả cho thấy những tế bào có chức năng trong miễn dịch không đặc hiệu nó hiện diện ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus lúc nở và ở tỳ tạng là 3 ngày tuổi. Tế bào lympho dương tính với IgM được phát hiện đầu tiên ở ngày thứ 7, 10 và thứ 14 tương ứng với các cơ quan tạo máu thuộc thận, thymus và tỳ tạng. Sự thành thục của cơ quan thymus được phát hiện đầu tiên ở cá 10 ngày tuổi. Cơ quan thymus xuất hiện rõ ràng và tổ chức lympho thuộc tỳ tạng không quan sát được cho đến ngày thứ 21 sau khi nở. Nghiên cứu còn cho thấy, tổ chức lympho thứ cấp nghèo nàn là do kháng thể được sản xuất ra ít cho đến khi ấu trùng cá được 21 ngày tuổi. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 9 Một năm sau, Nadia et al., 2002 đã nghiên cứu sự phát triển của tế bào B trong tỳ tạng của cá ngựa. Ở cá ngựa trước đây được cho rằng tế bào T có thể phân biệt được ở thymus của cá 4 ngày tuổi nhưng tế bào B chỉ phân biệt được ở cá 3 tuần tuổi. Nhưng ở cá 4 ngày tuổi, phát hiện gen thụ thể của tế bào B trong ADN ly trích từ toàn bộ con cá. Cũng thời gian 4 ngày, bản sao Rag-1 được thấy ở tỳ tạng (là cơ quan trước đây cho rằng không liên quan đến tổ chức lymphoid của cá ngựa); ở cá 10 ngày tuổi, bản sao Ig cũng được phát hiện ở tỳ tạng. Vì vậy, ở cá ngựa tỳ tạng cũng được thừa nhận là cơ quan có chức năng quan trọng trong hệ thống miễn dịch. Và cũng năm này, Lora et al., 2002, nghiên cứu hệ thống đáp ứng miễn dịch thể dịch của cá nheo mỹ (Ictalurus punctatus) ở giai đoạn cá bột và cá giống khi tiếp xúc với vi khuẩn Edwardsiella ictaluri. Nghiên cứu thực hiện với cá không có mầm bệnh được thuần hoá phù hơp với điều kiện môi trường. Cá ở tuổi 1, 2, 3 và 4 tuần và 2, 3, 4, 5, và 6 tháng sau khi nở, Cá được tiêm liều sơ cấp với vi khuẩn E. ictaluri (ở liều 6,4×104 cfu/ ml cho 1 bể) và sau đó 4 tuần tiêm tiếp liều thứ 2. còn nhóm đối chứng thì được tiếp xúc với môi trường nuôi cấy đã tiệt trùng. Kết quả cho thấy kháng thể đặc hiệu được phát hiện đầu tiên ở cá 4 tuần tuổi sau khi nở có trọng lượng trung bình 85 mg. Đáp ứng thứ cấp được chứng minh ở cá hương 4 tuần tuổi khi nhúng liều sơ cấp và 8 tuần tuổi khi nhúng liều thứ cấp. Tuy nhiên, hiệu quả tăng khả năng đáp ứng là đúng được chứng minh ở cá 2 tháng tuổi nhận liều sơ cấp. Cá nhận liều sơ cấp ở trước 4 tuần tuổi và 1 liều thứ cấp nhẹ kết quả đáp ứng kháng thể có ý nghĩa, thậm chí chúng đồng tuổi nhau ở liều tiếp xúc thứ 2 việc tạo ra đáp ứng kháng thể tốt được kéo dài nhờ vào liều tiếp xúc ban đầu. Từ kết quả trên người ta cho rằng cá nheo không có khả năng tạo ra đáp ứng miễn dịch thể dịch trước 4 tuần tuổi. Tiếp tục, nghiên cứu mô học về cơ quan lympho của cá đĩa Xiphophorus maculatus L. ở giai đoạn ấu trùng cho thấy thymus là cơ quan lớn và chứa đầy các tế bào lympho. Trong khi tổ chức lympho có ở lá lách và ống thận phát triển chậm hơn (Leknes, 2003). Cho đến hai năm sau, Zapata et al, 2005, nghiên cứu sự phát sinh hệ miễn dịch ở một số loài cá có giá trị từ cách nguồn báo cáo đã có trước đây. Kết quả cho thấy rằng ở một vài loài cá xương (chẳng hạn như cá angelfish) tế bào máu đầu tiên được hình thành từ khối noãn hoàng. Ở vài loài cá khác như cá ngựa, vị trí cơ quan tạo máu đầu tiên là ở trong phôi, đa số là các tế bào trung gian (ICM), trong khi đó ở cả cá mùi và cá hồi các tế bào máu đầu tiên chỉ xuất hiện 1 thời gian ngắn ở noãn hoàng nhưng sau đó ICM phát triển chủ yếu ở cơ quan tạo máu. Hồng cầu và các đại thực bào là những tế bào máu đầu tiên PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 10 được nhận định ở phôi của cá ngựa. Những tế bào này sinh ra từ tế bào ICM, ống Cuvier và những tế bào ngoại biên. Trong khoảng 24 - 30 giờ sau khi thụ tinh ở nhiệt độ 28°C một ít nguyên bào tuỷ và tế bào tuỷ xuất hiện giữa khối noãn hoàng và vách cơ thể, ở vùng bụng gần phần đuôi ở cá ngựa 1 - 2 ngày tuổi cũng có các tế bào máu phát triển. Cơ quan thymus, thận và lá lách là những cơ quan lympho thiết yếu của lớp cá xương. Thymus là cơ quan lympho được hình thành đầu tiên, mặc dù thận trước có thể xuất hiện trước nhưng chưa xuất hiện các tế bào lympho. Ở cá nước ngọt, lá lách của cá xương là cơ quan lympho phát triển sau cùng. Bên cạnh đó, sự xuất hiện sớm của Rag-1 ở Thymus của cá ngựa có mối tương quan với hình thái của tế bào lympho. Chức năng và hình dạng của tế bào lympho rõ ràng hơn khi cá có được hệ miễn dịch hoàn chỉnh. Gần đây, Sonal et al., 2008 nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho và phát triển của tế bào sinh kháng thể IgM ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus hippoglossus L.). Kết quả mô học cho thấy thận xuất hiện ở cá 1 ngày tuổi sau khi nở, cơ quan thymus xuất hiện ở cá 33 ngày sau khi nở, trong khi đó lá lách là cơ quan sau cùng xuất hiện ở 49 ngày tuổi sau khi nở. Tất cả các cơ quan lympho này có hình thái tương đối hoàn chỉnh sau giai đoạn biến thái. Với phương pháp RT - PCR cho thấy IgM mRCT xuất hiện ở cá 66 ngày tuổi sau khi nở và có thể chậm hơn, tương ứng với thời gian này ở kỹ thuật lai phân tử cũng cho thấy có 1 ít tế bào dương tính với IgM có thể được phát hiện ở giai đoạn đầu của thận và lá lách. Còn phương pháp hoá mô miễn dịch dùng kháng thể đơn dòng phát hiện được IgM ở thận trước và lá lách của cá 94 ngày tuổi, nhưng IgM mRCT được phát hiện chậm hơn. Nhiều tế bào xuất hiện rõ ràng cả IgM mRCT và prôtein có thể được phát hiện ở tỳ tạng, thận trước, và thymus cũng có xuất hiện nhưng ở giai đoạn cá bơn lớn. 2.6 Một số thành tựu về phương pháp mô học Nghiên cứu mô học bắt đầu từ cuối thế kỉ 17 nhưng mãi đến cuối thế kỉ 19 mô học mới được coi là ngành khoa học (trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). Mô học bắt đầu từ khi kính hiển vi đầu tiên được chế tạo bởi Antoni Van Leuwenhoek (1632-1723) người Hà Lan, đến cuối thế kỉ 18 Robert Hooke (1635-1703) nhà khoa học người Anh đã xác định tế bào là đơn vị cấu tạo cơ thể sinh vật. Quan sát miếng nút chai dưới kính hiển vi đã đưa ra kết luận “miếng nút chai được tạo thành từ những túi nhỏ hay tế bào độc lập với nhau và chứa đầy không khí” (R.Hooke, 1665, trích dẫn bởi Nguyễn Quốc Thịnh, 2002). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 11 Sau khi thuyết tế bào ra đời (1893), đặc biệt là lĩnh vực mô học mô tả ra đời thì những thành phần cấu tạo khác nhau của cơ quan và các mô được nghiên cứu cẩn thận, tỉ mỉ hơn. Thành tựu lớn nhất của giai đoạn này là chế tạo ra máy cắt lát mỏng (microtom) cho phép nghiên cứu sâu hơn về cấu trúc hiển vi thể của tế bào và mô (Phạm Phan Địch, 1998), từ đó đến nay mô học ngày càng được chú ý phát triển mạnh mẽ và chuyên sâu hơn. Robert (1989) đã hệ thống lại tất cả các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của cá, các giống loài kí sinh trùng, vi khuẩn, virut gây bệnh trên cá, dấu hiệu bệnh lý đặc trưng của cá đối với từng tác nhân gây bệnh khác nhau. Ông cũng đã mô tả về phản ứng sinh lý của cá, quá trình biến đổi chung của cơ quan trong cơ thể cá khi bị tác nhân xâm nhập và gây bệnh. Bên cạnh đó, ông cũng trình bày cơ bản về những đáp ứng miễn dịch chung của cá trước tác động của các yếu tố vô sinh và hữu sinh. Suprance et al., (1991) nghiên cứu về mô học trên cá trê trắng. Tác giả không nghiên cứu trên cá bệnh mà chỉ nghiên cứu trên cá khỏe và khảo sát 1 số cơ quan như hệ bài tiết, hệ tuần hoàn,… nhằm so sánh khi nghiên cứu mô và cung cấp sự hiểu biết về mô học. Grizzle et al., (1976) giải phẩu và nghiên cứu mô học trên cá nheo. Tác giả đã mô tả đặc điểm về mô trên một số cơ quan của cá nheo như hệ thần kinh, hệ cơ, hệ tiêu hoá...nhằm nhận dạng đặc điểm của các cơ quan để nghiên cứu sau này. Groman (1982) nghiên cứu mô học trên cá chẽm. Tác giả đã quan sát cấu trúc mô khỏe ở nhiều giai đoạn của cá từ giống đến trưởng thành ở một số cơ quan: hệ hô hấp, hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ tiêu hoá, hệ sinh dục, hệ bài tiết…Tiếp đó, Herrera (1996) nghiên cứu trên cá rô phi (Oreochromis niloticus). Tác giả dùng phương pháp mô học để nghiên cứu trên một số cơ quan như da, cơ, xương, hệ tiêu hóa, hệ hô hấp, hệ tuần hoàn, hệ bài tiết, hệ sinh dục, hệ thần kinh… Ở nước ta ngày nay, mô học đã được nghiên cứu nhiều trong lĩnh vực thủy sản như: Nguyễn Quốc Thịnh (2002) bước đầu nghiên cứu về mô bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra. Tác giả đã đưa ra sự so sánh về những biến đổi cấu trúc của mô cá bệnh như hiện tượng xuất huyết, hoại tử, xung huyết so với cá khỏe. Đến năm 2003, Bùi Châu Trúc Đan nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học bệnh phù mắt trên cá tra, quan sát trên các cơ quan như gan, nội tạng… nhằm so sánh những cấu trúc vi thể của cá và tiếp theo là Phan Thị Hừng, 2004 nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng hồng cầu trên cá tra bị bệnh vàng da. Tác giả cũng quan sát cơ quan gan, thận và tỳ tạng trong cấu trúc của mô PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 12 cá bệnh để so sánh với cá khỏe. Gần đây, Võ Quốc Hào (2008), nghiên cứu cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra. Tác giả đã xác định được đặc điểm, cấu trúc mô của cá khỏe từ đó làm cơ sở cho việc chẩn đoán. Ở nước ta, nghiên cứu về mô học trên cá được thực hiện khá phổ biến nhưng chủ yếu thiêng về chẩn đoán và xác định mầm bệnh. Hiện nay, vaccine là biện pháp phòng bệnh hữu hiệu cho cá tra nuôi nhưng việc sử dụng vaccine chưa đem lại hiệu quả do chưa nghiên cứu. Việc sử dụng vaccine có hiệu quả hay không là phụ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch của cá. Do đó, nghiên cứu về sự hình thành cơ quan lymphoid trên cá tra là điều cần thiết. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 13 CHƯƠNG III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu Thời gian thực hiện: Từ 29/12/2008 – 19/05/2009 Địa điểm thu mẫu: Mẫu thu ở trại ương cá tra Thị Trấn Hồng Ngự - tỉnh Đồng Tháp Địa điểm phân tích mẫu: Phòng mô của Bộ môn Sinh học và Bệnh thuỷ sản - Khoa Thuỷ Sản - Đại Học Cần Thơ. 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.2.1 Dụng cụ: Bộ tiểu phẩu, ống universal, khay nhựa, lọ thuỷ tinh, cốc đốt 500ml, máy cắt lát mỏng (microtom), máy xử lý mô, khuôn đúc mẫu, máy ảnh, kính hiển vi, lame, lamelle… 3.2.2 Hoá chất: Formol thương mại (37%), ethanol, xylene, paraffin, sáp ong, thuốc nhuộm Hematoxylin và Eosin, keo dán enterllan. 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Đối tượng nghiên cứu Thu mẫu cá ở ao ương, thu cá từ 1 đến 30 ngày tuổi sau khi nở, mỗi ngày tuổi thu 6 - 30 con. 3.3.2 Phương pháp cắt mẫu Mẫu xác định ở 3 cơ quan chính là thận, tỳ tạng và tuyến ức được tiến hành cắt mẫu thăm dò ở các ngày tuổi như 1, 8, 15, 22,… và sau đó xác định các cơ quan này bằng cách cắt mẫu ở các độ tuổi ngắn lại và xem sự hình thành các chức năng của nó. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 14 3.3.3 Phương pháp cố định mẫu Mẫu thu được cố định trong dung dịch formalin 10% chứa trong ống universal. 3.3.4 Phương pháp làm tiêu bản mô Rửa mẫu sau khi cố định Mẫu mô sau khi cố định trong dung dịch formol 10%, khoảng 24-48h tiến hành rửa dưới vòi nước 2h. Sau đó chuyển sang cồn 70% để bảo quản và xử lý mẫu. Cắt tỉa và định hướng Mẫu trước khi đưa vào qui trình xử lý mẫu phải cắt tỉa và định hướng cho mẫu đạt kích cỡ phù hợp, cắt mẫu với độ dày từ 3-5µm. Đưa mẫu vào catsset và tiến hành xử lý. Quy trình xử lý mẫu Loại nước Việc loại nước phải đảm bảo nguyên tắc là phải loại hết nước trong mẫu mô mà không làm tế bào bị biến dạng hoặc không làm vị trí thành phần cấu tạo tế bào trong mẫu mô không bị thay đổi. Quá trình loại nước được thực hiện bằng cách nhúng mẫu qua nhiều dung dịch cồn với nồng độ gia tăng từ 80-100%. Thời gian thử nước phụ thuộc vào độ dày của mẫu mô Phương pháp làm trong mẫu (tẩm dung môi trung gian) Vì cồn không thể hòa lẫn với paraffin nên sau khi hoàn thành quá trình khử nước, cồn cần phải loại khỏi mẫu mô để tránh tình trạng mô có thể bi co rút khi tẩm paraffin. Dung môi trung gian vừa hòa tan được cồn và paraffin thường dùng là xylen, xylen ít độc và có tính thấm nhanh. Phương pháp này được thực hiện bằng cách ngâm mẫu mô trong xylen qua hai lọ.Thời gian ngâm mẫu mô trong mỗi lọ dao động từ 2h-2h30’. Ngoài ra để tăng khả năng nhấm paraffin và để loại hoàn toàn cồn ra khỏi mẫu mô, trước khi chuyển sang bước ngấm paraffin, mẫu mô được ngâm trong lọ paraffin hòa tan trong xylen. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 15 Tẩm paraffin Paraffin là chất nền để đảm bảo chất tế bào giữ nguyên hình dạng khi cắt vì thế sau khi làm trong mẫu, mẫu mô sẽ được chuyển sang bước ngấm paraffin. Ngâm mẫu qua 2 lọ paraffin, thời gian mỗi lọ khoảng 1h ở nhiệt độ 560C ±1. - Lọ 1: Paraffin: Sáp ong với tỉ lệ 1:1 - Lọ 2: Paraffin: Sáp ong với tỉ lệ 7:3 Xử lý mẫu theo máy tự động Sproceeding tissue (MICROM, STP 120-2) Đúc khuôn: (máy đúc khối: MICROM EC 350-1) Chuyển cassette chứa mẫu đã được xử lý vào khoang chứa paraffin nóng chảy trên máy đúc khối, để cassette trong paraffin khoảng 30 phút, tiến hành đúc khối. Mẫu mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng paraffin nóng chảy ở 650C. Đỗ một ít paraffin vào khuôn inox, gắp mẫu bỏ vào khuôn sau đó đặt mẫu ngay ngắn và ấn sát mẫu vào đáy khuôn và đặt khuôn inox lên chỗ làm lạnh trên máy đúc khối để cố định sơ bộ mẫu trên khuôn Đặt cassette có ký hiệu mẫu lên trên, tiếp tục đỗ paraffin vào đầy khuôn inox. Tiếp theo đặt khuôn inox qua ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách khối paraffin ra khỏi khuôn và chuẩn bị cắt mẫu. Cắt mẫu (máy cắt: Yamato-PR-50) STT Hóa chất sử dụng Thời gian 1 Cồn 80% 1h 2 Cồn 90% 1h 3 Cồn 95% 1h 4 Cồn 100% 1h 5 Cồn 100% 1h 6 Cồn 100% 1h 7 Xylen 2h 8 Xylen 2h 9 Xylen 2h 10 Paraffin + sáp ong + xylen (3:2:5) 2h 11 Paraffin + sáp ong (7:3) 2h 12 Paraffin + sáp ong (1:1) 2h PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 16 Trước khi mẫu đưa vào máy cắt, dung lưỡi dao cắt tỉa khối paraffin sao cho khối paraffin có hình tháp (hình 3.1). Mục đích của cách làm này là để dễ cắt mẫu và khi cắt ra, mẫu sẽ đẹp. + Chuẩn bị máy cắt Đặt lưỡi dao vào máy cắt, vặn ốc thật chặt. Độ lệch của lưỡi dao so với mặt cắt của khối mẫu tạo thành một góc khoảng 15-30o. Khối mẫu sẽ được cắt thành các lát cắt khi tay quay của máy xoay tròn, sau mỗi vòng xoay sẽ có một lát cắt được hình thành. + Tiến hành cắt Đặt khối mẫu vào máy cắt lát mỏng, chỉnh cho khối mẫu ngang và thẳng đứng, điều chỉnh độ dày lát cắt, có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12µm. Sau khi cắt bằng mặt khối mẫu và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày về vạch 4-6 µm và cắt mẫu Dán mẫu lên lame Mẫu cắt tạo thành dãy băng dài, cho dãy băng vào nước ấm ở nhiệt độ 45- 50oC cho dãy paraffin giản ra, dùng kim mũi giáo tách riêng từng đoạn đạt yêu cầu, dùng lame để vớt mẫu lên. Cầm một đầu của lame, đầu kia cho vào cốc nước thủy tinh phía dưới mẫu, sau đó từ từ nâng lên và điều chỉnh cho mẫu ngay ngắn trên lame. Để lame khô tự nhiên khoảng 15 phút sau đó chuyển lame lên máy Slide warmer ủ ở nhiệt độ 45o sau 4 giờ để cố định mẫu lên lame. Sau khi dán mẫu và cố định mẫu trên lame xong tiến hành nhuộm mẫu. Nhuộm mẫu Phương pháp nhuộm màu bằng Hematoxylin và Eosin (H&E) theo qui trình được cài đặt trong máy nhuộm mẫu mô tự động. a b Hình 3.1: Khối paraffin trước khi cắt: (a) khối paraffin có chứa mẫu mô; (b) cassette dung để giữ khối paraffin PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 17 Sau khi cài đặt, cho phiến kính có chứa mẫu vào trong giá và cho vào máy nhuộm với chương trình cài đặt sẵn. Quy trình nhuộm mẫu (máy nhuộm mẫu tự động) Dán Lamelle vào lame Để đảm bảo mẫu được giữ lâu và tăng tính triết quang của mẫu, dùng keo dán Enterlan phủ lên mẫu và dán lamelle lên mẫu. Nhỏ một giọt keo lên mẫu, đặt lamelle nghiêng 450 và tiếp xúc với giọt keo, hạ lame xuống từ từ để tránh bọt khí. Để lame khô 24 giờ sau đó đọc kết quả. Thao tác này cần làm nhanh để tránh sự xâm nhập của hơi nước trong không khí vào miếng mô. 3.4 Đọc kết quả Kết quả được đọc theo tài liệu của Ferguson (2006). Tiêu bản được quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 10x để quan sát tổng quát tiêu bản nếu tiêu bản đẹp đạt yêu cầu có nhân bắt màu tím xanh của Hematoxylin, phần còn lại bắt màu hồng Eosin. Các tiêu bản đẹp sẽ được quan sát lần lượt ở độ phóng đại 40X, 100X (nhỏ giọt dầu) và chụp hình tiêu bản đặc trưng. Xylen 5 phút Dán keo Enterllan Xylen 5 phút Nước máy 5 phút 1% acid acohol 10 giây Nước máy 1 phút Cồn 100% 5 phút Cồn100% 5 phút Cồn 95% 5 phút Eosin 2 phút Xylen I 5 phút Xylen III 5 phút Xylen II 5 phút Cồn 100% 5 phút Haematocylin 1 phút Cồn70% 2 phút Rửa nước 5 phút Cồn 100% 5 phút PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 18 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thông tin chung về hộ ương nuôi Trước khi ương hộ nuôi thường vệ sinh các bờ ao, diệt tạp, cải tạo ao,… hóa chất thường dùng nhất trong cải tạo ao là vôi. Diện tích ao là 3000m2 , mật độ thả ương là 1000con/ m2. Con giống trực tiếp ở cơ sở sản xuất giống, giống khỏe và có chất lượng. Thành phần thức ăn chủ yếu trong ương nuôi như bột cá, hột vịt, bột sữa,…Ngoài ra cũng có lượng thức ăn trực tiếp ở trong ao. Ngày cho ăn 4 lần, mỗi lần được chia đều mà hộ nuôi tính theo mật độ ương. Nhìn chung hộ này nuôi theo kinh nghiệm bản thân là chính. Hình 4.1: Công tác cải tạo ao và các giai đoạn của cá hương (A: cải tạo ao; B: bơm nước vào ao chuẩn bị ương; C: cá 18 ngày tuổi; D: cá 16 ngày tuổi) D A B C PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 19 4.2 Các chỉ tiêu môi trường trong ương nuôi 4.2.1 Nhiệt độ Trong suốt thời gian thu mẫu nhiệt độ trong ao ương tương đối ổn định dao động từ 29,5 – 32oC. Với nhiệt độ này là thích hợp cho sự phát triển của thủy sinh vật. Theo Boyd (1998) thì nhiệt độ thích hợp cho đa số các loài cá phát triển là từ 25 – 32oC. Trong quá trình ương hộ nuôi thường xuyên bơm nước vào do đó sự chênh lệch nhiệt độ không khác biệt lớn. 4.2.2 pH pH là một trong những nhân tố môi trường có ảnh hưởng rất lớn đối với đời sống của thủy sinh vật. pH quá cao hay quá thấp làm thay đổi độ thẩm thấu của màng tế bào, làm rối loạn quá trình trao đổi muối và nước giữa cơ thể và môi trường ngoài. pH qua các đợt theo dõi ít thay đổi dao động từ 7,5 – 8. Theo Swingle (1969) trích dẫn bởi Lê Bảo Ngọc (2004) thì pH thích hợp cho ao nuôi cá là 6,5 – 9. Còn theo Boyd (1998) pH thích hợp cho các ao dao động từ 7 – 9. Do đó, với hàm lượng này là phù hợp cho sự phát triển của cá tra ở giai đoạn ương giống. 4.2.3 Hàm lượng Oxy O2 là chất khí rất quan trọng trong môi trường nước, đặc biệt là đối với thủy sinh vật. Theo Trương Quốc Phú (2004), thì nồng độ Oxy lý tưởng cho cá là lớn hơn 5 mg/l. Hàm lượng oxy đo được dao động từ 4,5 – 6 mg/l. Vì thế, rất thích hợp cho cá phát triển. 4.2.4 Hàm lượng đạm trong nước (TAN) Ammonia là yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến tỷ lệ sống, sinh trưởng đối với thủy sinh vật. NH3 là khí độc, NH3 gây độc cho cá trong khoảng 0,6 – 2,0 mg/l, ion NH4+ không độc (Trương Quốc Phú, 2004). Theo Downing et al., (1975) trích dẫn bởi Lê Bảo Ngọc, 2004. Độ độc này sẽ tăng khi hàm lượng oxy hòa tan thấp hoặc pH cao. Hàm lượng TAN ở ao ương dao động trong khoảng 0 - 0,05. Hàm lượng này không ảnh hưởng gì đối với cá. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 20 4.2.5 Hàm lượng Nitrite (N-N02-) Theo Trương Quốc Phú, 2004, N-N02- là dạng đạm ảnh hưởng độc đối với thủy sinh vật. Tác dụng độc của nó đối với cá là chúng kết hợp với Hemoglobine của máu hình thành Methemoglobine, làm cá chết ngạt. Hàm lượng N-N02- trung bình ở ao ương dao động trong khoảng 0 – 0,05 mg/l. Theo Simon et al., (1994) trích dẫn bởi Huỳnh Trường Giang (2003), thì hàm lượng N02- < 1 mg/l được xem là thích hợp cho tôm cá. Từ nhận định này cho thấy hàm lượng trong ao ương không ảnh hưởng đến cá. 4.3 Sự phát triển của các cơ quan Lympho 4.3.1 Thận Ở cá 6 ngày tuổi có sự hình thành cơ quan của thận (Hình 4.2.A). Thận cá tra được chia ra thành 2 phần riêng biệt, đó là phần thận trước (tiền thận) và phần thận sau (thân thận). Như vậy, về mặt cấu tạo cá tra là loài cá có sự tách rời thận trước và sau. Ở giai đoạn này, thận chỉ tập trung những đám tế bào nhỏ, rời rạc, lỏng lẻo với nhiều không bào, hình dạng chưa đặc thù của thận. Trong khi đó, ở cá 9 ngày tuổi (Hình 4.2.B) thì thận có hình dạng rõ ràng, đặc trưng của nó. Thận trước nằm ở phần đầu xoang cơ thể, có hình oval, nằm trước bóng hơi, màu nâu đỏ. Thận sau nằm dọc theo cột sống, phía trước hẹp và phía sau mở rộng dần. Lúc này, thận trước có vai trò quan trọng trong hệ thống thải của cá, nó là cơ quan bài tiết chủ yếu của cá. Theo Nguyễn Bạch Loan (2004), tiền thận phát triển và là cơ quan bài tiết chủ yếu của cá ở giai đoạn phôi thai và cá con. Và ở hầu hết các loài cá tiền thận chỉ hoạt động đến cá hương, tuy nhiên ở một số ít loài tiền thận còn hoạt động đến giai đoạn cá trưởng thành. Còn theo Grizzle et al., (1976) cho rằng, ở giai đoạn cá hương, thận trước đóng vai trò là cơ quan bài tiết chủ yếu của cá, khi ở cá trưởng thành thì nó giữ vai trò như cơ quan tạo máu cấu tạo gồm các tế bào lympho, mô tạo máu và nội mô. So với các giai đoạn cá 6 và 9 ngày tuổi thì thận ở cá 15 ngày tuổi có kích thước khá lớn về hình dạng và đã có sự hiện diện của các tế bào lympho (Hình 4.3.A). Còn ở cá 21 ngày tuổi và 25 ngày tuổi, ở các lát cắt cho thấy thận có sự khác biệt rõ so với các giai đoạn trước đó, sự tăng đáng kể về kích thước, và đặc biệt là các tế bào lympho tăng lên gấp bội và có sự phân biệt rõ ràng (Hình PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 21 4.3.B). Bên cạnh đó, tiền thận cũng có sự hình thành rãi rác các tế bào bào sắc tố như ở cá trưởng thành. Có thể nói ở 2 giai đoạn này, thận có cấu tạo gần như hoàn chỉnh về mặt cấu trúc của mô học (Hình 4.3.C&D). Tuy nhiên, vẫn chưa khẳng định chính xác về cấu tạo của thận do còn hạn chế về phương pháp nghiên cứu ở mô học. Cũng ở 2 giai đoạn này thì thân thận phát triển về kích thước và dần dần hình thành cấu trúc. Theo Sonal et al (2008), nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus). Kết quả mô học cho thấy thận xuất hiện lúc nở, còn phương pháp hoá mô miễn dịch dung kháng thể đơn dòng phát hiện được IgM ở thận trước của cá 94 ngày tuổi. Vì vậy, so với loài cá bơn Đại Dương thì cá tra phát triển muộn hơn. Có thể nói rằng, kết quả này có sự chênh lệch về ngày tuổi do đây là 2 loài hoàn toàn khác nhau về hình dạng, cấu tạo, chức năng, vùng phân bố và kể cả tập tính sinh sản,… và cũng có thể là do phương pháp còn hạn chế. Nên cần có các nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đại để có kết quả chính xác hơn để khẳng định về mặt chức năng của nó. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 22 Hình 4.2: Thận của cá tra qua các giai đoạn (H&E) A: Cá 6 ngày tuổi (a: thận trước; b: thận sau) X40 B: Cá 9 ngày tuổi (a: thận trước; b: thận sau) X40 C: Cá 10 ngày tuổi (a: thận trước; b: thận sau) X40 D: Cá 12 ngày tuổi (a: thận trước) X40 A a b a b B C a b D a PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 23 Hình 4.3: Cấu trúc của thận qua các giai đoạn của cá (H&E) A: Thận trước cá 15 ngày tuổi X40 B: Thận trước cá 21 ngày tuổi X40 C: Thận trước cá 21 ngày tuổi các tế bào lympho tăng gấp bội và kích thước cũng tăng lên X 400 D: Cấu trúc thận sau cá 21 ngày tuổi các tế bào sắc tố nằm rãi rác và gần như hoàn thành chức năng X 400 A B C D PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 24 4.3.2 Tuyến ức (thymus) Theo nhận định của Lagler et al năm 1962, thì tuyến ức là cơ quan quan trọng của cá con. Tiếp đó Patt & Patt, 1969 có một nhận định thêm, tuyến ức là cơ quan nội tiết nhưng chức năng quan trọng phổ biến được nhận biết là nó giữ vai trò trong hệ thống đáp ứng miễn dịch (Trích dẫn từ Chinabut et al, 1991). Từ nhận định đó, nghiên cứu tuyến ức trên đối tượng cá tra được thực hiện và trên các lát cắt đã phát hiện tuyến ức đầu tiên ở cá 9 ngày tuổi nằm ở mặt lưng của khoang bụng gần thận trước được bao bọc bởi mô liên kết. Lúc này tuyến ức không có hình dạng đặc trưng do chưa hình thành rìa bao ngoài cơ quan, chỉ như một đám tế bào tập trung (Hình 4.4.A). Ở giai đoạn cá 10 ngày tuổi, tuyến ức vẫn nằm ở vị trí nguyên thuỷ của nó ở khoang mang, nằm sát với xoang thính giác và các lá mang. Tuyến ức đã bắt đầu có dạng hình túi. Về kích thước, tuyến ức đã lớn hơn so với giai đoạn cá 9 ngày tuổi. Điểm khác biệt chủ yếu của giai đoạn này so với giai đoạn cá 9 ngày tuổi là nó đã có sự xuất hiện của các tế bào lớn bắt mầu đậm hay còn gọi là tế bào lympho (Hình 4.4.B). Khác với giai đoạn cá 9 ngày tuổi và 10 ngày tuổi, tuyến ức ở cá 11 ngày tuổi này có sự tăng lên đáng kể về kích thước. Nó phình ra hình thành dạng túi đặc trưng. Các lát cắt qua tuyến ức cho thấy sự tăng lên đáng kể số lượng các tế bào tuyến ức đặc biệt là các tế bào lympho (Hình 4.4.C). Điểm khác biệt của giai đoạn này so với các giai đoạn cá 9 và 10 ngày tuổi là tuyến ức đã có sự phân vùng về mặt mô học. Có thể thấy khá rõ vùng tuỷ và vùng vỏ của tuyến ức. Trong vỏ có sự tập trung dày đặc của các tế bào lympho bắt mầu đậm. Trong tất cả các lát cắt không thấy sự tồn tại của một màng ngăn cách giữa tuỷ và vỏ như ở động vật có xương sống bậc cao. Tuy vậy sự thiếu hụt này là một đặc điểm cố định ở hầu hết các loài cá xương, nó không phản ánh sự chưa hoàn thiện về chức năng. Theo Bowden và ctv (2005) thì đến đấy tuyến ức đã hoàn thành sự phát triển của nó. Trong tuyến ức ở giai đoạn này còn nhận thấy khá nhiều tế bào lạ. Các nghiên cứu sâu hơn với sự trợ giúp của kính hiển vi điện tử là cần thiết để xác định rõ các loại tế bào này. Như vậy trên mẫu thu được, không tìm thấy tuyến ức ở cá từ 1 ngày tuổi đến 5 ngày tuổi. Tuyến ức đầu tiên được ghi nhận ở cá 9 ngày tuổi sau đó tiếp tục xuất hiện trong các mẫu cá có tuổi lớn hơn. Thêm vào đó, cũng nhận thấy rằng ở giai đoạn 12 ngày tuổi (Hình 4.4.D) đều đã có tuyến ức chứa đầy các lympho bào PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 25 Khi so sánh với một vài loài khác ta cũng thấy một vài điều thú vị. Cá mandarin, một loài cá phân bố ở phía trên Anh gần Na-uy, hoàn thiện tuyến ức vào 23 ngày sau khi nở. Watts et al., (2003) thì báo cáo rằng ở trên cá ngừ vây vàng (Thunnus orientalis), một loài cá vùng ôn đới, có thể phân biệt được vùng trong và vùng ngoài khoảng 15 ngày sau khi nở. Như vậy là so với các loài cá khác, sự hình thành và phát triển của tuyến ức của cá tra diễn ra sớm hơn. Hình 4.4: Tuyến ức cá của tra qua các giai đoạn (H&E) A: tuyến ức cá 9 ngày tuổi chỉ là đám tế bào đặc trưng X 40 B: tuyến ức cá 10 ngày tuổi xuất hiện các tế bào lynpho X 20 C: Tuyến ức cá 11 ngày tuổi kích thước tăng lên và phình ra trong khoang mang X 40 D: cấu trúc tuyến ức cá 12 ngày tuổi chứa đầy các tế bào lympho X 160 A B C D PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 26 4.3.3 Tỳ tạng Trên lát cắt dọc theo cơ thể của cá, tỳ tạng được tìm thấy ở cá 21 ngày tuổi có màu đỏ thẩm, dạng dẹp elip hai đầu hơi nhọn, nằm trong vùng tiêu hoá bao xung quanh màng treo ruột (Hình 4.5.A). Ở giai đoạn này, tỳ tạng chỉ là một khối, chưa phân biệt rõ ràng phần tuỷ đỏ và tuỷ trắng, các tiểu thể khi quan sát dưới kính hiển vi gần như đồng nhất (Hình 4.5.B). Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2002), tỳ tạng là đơn vị cấu tạo của các tiểu thể, mỗi tiểu thể gồm phần tuỷ đỏ và tuỷ trắng, ở cá còn nhỏ rất khó phân biệt các tiểu thể với nhau. Tỳ tạng được tìm thấy ở giai đoạn cá 21 ngày tuổi, ở tất cả các mẫu thu được, tỳ tạng không được tìm thấy ở cá từ 1 ngày tuổi đến 20 ngày tuổi và từ 22 ngày tuổi đến 30 ngày tuổi. Tỳ tạng ở giai đoạn này cũng thấy khá rõ về hình dạng, và các tế bào lympho bắt màu đậm nằm rãi rác. Tuy nhiên chưa phân biệt về mặt cấu trúc của nó (Hình 4.5.C,D). Theo Merete et al., 1998 nghiên cứu về sự hình thành cơ lymphoid ở cá tuyết đại dương (Gadus morhua L.), thuộc loài cá nước mặn. Kết quả cho thấy, ở cá tuyết (Gadus morhua L) tỳ tạng là cơ quan lymphoid xuất hiện trước tiên trong khoảng thời gian cá 1 ngày tuổi sau khi nở. Tiếp theo, Lora et al., 2001, nghiên cứu sự hình thành cơ quan lymphoid của cá nheo mỹ. Kết quả cho thấy những tế bào có chức năng trong miễn dịch không đặc hiệu nó hiện diện ở cơ quan tạo máu thuộc thận và thymus lúc nở và ở tỳ tạng là 3 ngày tuổi. Cơ quan thymus xuất hiện rõ ràng và tổ chức lymphoid thuộc tỳ tạng không quan sát được cho đến ngày thứ 21 sau khi nở. So với cá tuyết đại dương (Gadus morhua L.) thì tỳ tạng ở cá tra phát triển chậm hơn rất nhiều. Có thể nhận định rằng, vì đây là 2 loài cá khác nhau hoàn toàn về loài, sự phân bố vùng địa lý, đặc điểm, tập tính sinh sống,… nên sự phát triển cơ quan lympho có sự khác biệt nhau. Gần đây hơn, Sonal et al, 2008. Nghiên cứu sự hình thành cơ quan lympho và phát triển của tế bào ở cá bơn Đại Dương (Hippoglossus L.). Kết quả mô học cho thấy tỳ tạng xuất hiện ở 49 ngày tuổi sau khi nở. Còn phương pháp hóa mô miễn dịch dùng kháng thể đơn dòng phát hiện tỳ tạng của cá 94 ngày tuổi. Như vậy, so với loài cá bơn Đại Dương (Hippoglossus L.) thì tỳ tạng của cá tra hình thành và phát triển sớm hơn. Nhưng kết quả này cũng nhận định là đúng, vì ở hầu hết các loài cá nước ngọt thì cơ quan lympho phát triển sớm hơn so với các loài cá ở nước mặn (Doggett et al., 1987). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 27 Hình 4.5: Cấu trúc tỳ tạng cá 21 ngày tuổi. Tỳ tạng có hình dạng rỏ ràng, màu nâu đỏ và các tế bào bắt màu đậm. Chưa phân biệt phần tủy đỏ và phần tủy trắng (H&E). A: X 20 B: Tế bào lympho X 80 C và D: các tế bào lympho bắt màu hồng X 400; X 600 C D A B PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 28 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 KẾT LUẬN § Xác định được các yếu tố về môi trường như nhiệt độ, pH, O2, TAN và N-N02- trong ao ương rất phù hợp cho các cơ quan lympho của cá phát triển. § Bước đầu nghiên cứu bằng phương pháp mô học (H&E) đã tìm thấy được thận ở cá 6 ngày tuổi, tuyến ức ở cá 9 ngày tuổi và tỳ tạng ở cá 21 ngày tuổi. 5.2 ĐỀ XUẤT § Cần nghiên cứu sử dụng các phương pháp hiện đaị hơn như miễn dịch huỳnh quang để có một kết quả chính xác hơn về mặt hình thái và phát triển chức năng của các tế bào. § Phương pháp mô học tỏ ra là phương pháp thích hợp để xác định sự phát triển cơ quan lympho của cá tra. Cần nghiên cứu hệ thống miễn dịch cho các loài cá có giá trị kinh tế khác nhằm năng cao hiệu quả kinh tế. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Boy, 1998. Water quality in pond for aquaculture. Auburn University. 2. Breuil G.; vassiloglou B.; pepin J.F.; romestand B,.Ontogeny of IgM- bearing cells and change in inmunogolobulin M-like protein level (IgM) during in larvae sea bass (Dicentrarchus labrax ), (1997), Fish & Shellfish Immunology, Volume 7, Number 1, January 1997 , pp. 29- 43(15). 3. Bùi Châu Trúc Đan (2003), bước đầu nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học bệnh phù mắt trên cá tra. 4. Bùi Châu Trúc Đan, 2003. Bước đầu nghiên cứu đặc điểm mô bệnh học bệnh phù mắt trên cá tra. Luận văn Đại Học. Khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ. 5. Bùi Tấn Anh, Võ Văn Bé và Phạm thị Nga, 2004, Giáo trình Sinh học đại cương A2 (Sinh học cơ thể và Đa Dạng sinh học), Khối sinh học. 6. Chantanachookhin, C., Seikai, T. and Tanaka, M. Comparative study of the ontogeny of the lymphoid organs in three species of marine fish. Aquaculture ,(1991),99, 143-155. 7. Chinabut, S., C. Limsuwan and P. Kitsawat. 1991. Histology of walking catfish (Clarias batrachus). 8. Doggett, T.A. and Harris J.E. The ontogeny of gut-associated lymphoid tissue in Oreochromis mossambicus. Journal of Fish Biology, 1987, 31, 23-27. 9. Dung T.T., M.Crumlish, N.T.N. Ngọc, N.Q.Thịnh và Đ.T.M Thy.2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh mủ gan trên cá tra (Pangasiaus hypophthalmus ). Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ: 137-142. 10. Ferguson, H.W., J.F. Turnbull, A. shinn, K. Thompson, T.T. Dung, and M. Crumlish.2001. Bacillary necrosis in farmed Pangasianodon hypophthalmus (Sauveage) from the Mekong Delta, Viêtnam. J. Fish Dis. 24:509-513. 11. George Iwama, 1996, The Fish immune System (Orgnism, pathogen, and environment). 12. Grizzle, J.M. and W.A. Rogers. 1976. Anatomy and Histology of the channel catfish. Argicultural experiment station, Auburn University. 13. Groman, D.B. 1982. Histology of the Striped Bass. Department of Pathobiology University of Connectcut Storrs, Connectcut 06268. Bethesda, Maryland. 115pp 14. Herrera, A.A., 1996. Histology of Tilapia (Oreochromis niloticus) PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 30 15. ập nhật ngày 07/01/2009. 16. =41 , cập nhật ngày 07/01/2009. 17. Hugh W. Ferguson, 2006. Systemic Pathology of Fish. 18. Leknes, I. L., (2003) Histological studies on the lymphoid organs in prenatal larvae of platy, Xiphophorus maculatus L. (Poeciliidae: Teleostei). 19. Lora Patrie-Hanson and A. Jerald Ainsworth, 2002, Humoral immune responses of channel catfish (Ictalurus punctatus) fry and fingerlings exposed toEdwardsiella ictaluri. 20. Lora Petrie-Hanson và A. Jerald Ainsworth, 2001, Ontogeny of channel catfish lymphoid organs. 21. Magnadottir.B, S. Lange, S. Gudmundsdottir, J. Bogwald and R.A.Dalmo, (2005). Ontogeny of humoral immune parmeters in fish. 22. Merete B. Schroder, Alberto J. Villena and Trond O. Jorgensen, (1998), ontogeny of lymphoid organs and immunoglobulin producing cells in atlantic cod (gadus morhua l.). 23. Mitchell, A.J. 1997. Fish disease summaries for the southeastern, United States from 1976-1995. Aquacult. Mag.23:87-93. 24. Nadia Danilova and Lisa A. Steiner, 2002. B cells develop in the zebrafish pancreas. 25. Nguyễn Bạch Loan, 2004. Giáo trình “ Ngư Loại I”. Khoa Thủy Sản. Đại học Cần Thơ. 26. Nguyễn Quốc Thịnh (2002), bước đầu nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra. 27. Padros F, Crespo S,Ontogeny of the lympoid organs in the turbot Scophthalmus maximus: A light and electron microscope study. Aquacuture 1996, 144(1-3):1-16 28. Phạm Phan Địch (1998). Mô học. Bộ môn mô học và phôi thai học. NXB y học. 29. Phạm Văn Khánh, 1996. Sinh sản nhân tảo và nuôi cá tra (Pangasius hypothalmus) ở Đồng bằng Sông Cửu Long. Luận án phó tiến sĩ khoa học Nông Nghiệp. Trường Đại Học Thuỷ Sản Nha Trang. 187 trang. 30. Phạm Văn Khánh, 2006. Kỹ thuật nuôi cá tra và cá ba sa trong bè. Thành phố Hồ Chí Minh. Nhà xuất bản Nông Nghiệp. 31. Phan Thị Hừng (2004), nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 31 32. Phan Thị Hừng, 2004. Nghiên cứu cấu trúc mô và sự biến động số lượng tế bào hồng cầu trên cá tra. Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ. 33. Robert, R. J, 1989. Fish pathology. 34. Sonal Patel, Elin Sorhus, Ingrid Uglenes Fiksdal, Per Gunnar Espedal, Oivind Bergh, Odd Magne Rødseth, H. Craig Morton, Audun Helge Nerland, 2008, Ontogeny of lymphoid organs and development of IgM bearing cells in Atlantic halibut (Hippoglossus hippoglossus L. 35. Supranee Chinabut, Chalor Limsuwan, Praveena Kitsawat, (1991). Histology of the walking catfish, Clarias Batrachus. 36. Thomas Boehm & Conrad C Bleul, 2007, The evolutionary history of lymphoid organs, Nature Immunology 8, 131 - 135 (2007). 37. Trần Thanh Xuân, 1994. Some biological characteristics and artificial reproduction of river catfish ( Pangasius hypophthalmus Sauvage) in the Southern Viet Nam. Worshop on the Biological Bases for Aquaculture of Siluriformes, 24-27 May, 1994. Montpellier, France. 38. Trương Quốc Phú, 2004. Bài giảng quản lý chất lượng nước. Khoa thủy sản Đại Học Cần Thơ. 39. Võ Quốc Hào, 2008. Cấu trúc mô của một số hệ cơ quan trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus). Luận văn tốt nghiệp Đại học Cần Thơ. 40. Watts M, Kato K, Munday BL, Burke CM., 2003. Ontogeny of immune system organs in northern bluefin tuna (Thunnus orientalis, Temminck and Schlegel 1884), 34:13e21. 41. Zapata. A, Diez. B, Cejalvo. T, Gutiérrez-de Frías. C and Cortés A, 2005. Ontogeny of the immune system of fish. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 32 PHỤ LỤC I BẢNG THEO DÕI CHỈ TIÊU MÔI TRƯỜNG Đợt Ao Ngày test Nhiệt độ PH O2 NH4+/NH3 N-NO2- 1 A 17/02/2009 30 7.5 5.5 0 0 B 17/02/2009 29.5 7.5 5 0 0 2 A 19/02/2009 29.5 7.5 5 0 0 B 19/02/2009 30 8 5.5 0 0 3 A 21/02/2009 30 8 5 0 0 B 21/02/2009 29.5 7.5 5.5 0 0 4 A 25/02/2009 29.5 7.5 5 0 0 B 25/02/2009 31.5 8 5 0 0 5 A 05/03/2009 31 7.5 5 0.025 0.05 B 05/03/2009 30 8 5 0.05 0.05 6 A 13/03/2009 31 8 5 0 0 B 13/03/2009 31,5 8 5 0 0 7 A 19/03/2009 32 8 5.5 0 0 B 19/03/2009 31.5 8 5.5 0 0 Đợt 1: Ngày đầu tiên thả cá Đợt 2: Cá 2 ngày tuổi Đợt 3: Cá 4 ngày tuổi Đợt 4: Cá 8 ngày tuổi Đợt 5: Cá 16 ngày tuổi Đợt 6: Cá 24 ngày tuổi Đợt 7: Cá 30 ngày tuổi Bộ test được sử dụng: SERA do Đức sản xuất PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 33 PHỤ LỤC II 1. Fromaline trung tính (Neutral buffered formalin: NBF) Formol thương mại (36-40% formoldehydrate) 100ml Na.H2PO4 4g Na2HPO4 6,5g Nước cất 900ml 2. Dung dịch Harris,S Haematoxylin - Haematoxylin 5g - Cồn tuyệt đối 50ml - Phèn chua 100g - Nước cất 100ml - Mercuric oxydate 2,5g Hòa tan phèn chua trong nước nóng, hòa tan Haematoxylin trong cồn tuyệt đối. Trộn lẫn 2 dung dịch với nhau, đun sôi. Thêm mercuric oxydate từ từ, khuấy đều. Làm lạnh, thêm acid acetic (nếu dùng liền), lọc dung dịch nhuộm. Có thể sử dụng ngay. 3. Eosin-Floxin - Stock eosin (1% Eosin Y) 100ml - Stock floxin (1% Floxin B) 100ml - Ethanol 95% 780ml - Glacid Acetic acid 40ml 4. Acid/Acohol - Acohol 1000ml - Hydrochioric 10ml 5. Potassium acetate - Potassium acetate 2g - Nước cất 100ml 6. Dung dịch keo Mayer”S Albumin - Lòng trắng trứng - Glycerol Pha theo thể tích 1:1. Trộn đều sau đó lọc qua giấy lọc. Thêm một ít thymol để ngăn vi sinh vật phát triển. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 34 PHỤ LỤC III Bảng thu mẫu cá từ 1 đến 30 ngày tuổi Ngày/ Tháng/ Năm Ngày tuổi Số mẫu Dấu hiệu bên ngoài Sự xuất hiện cơ quan lympho ở cá Thận Tuyến ức Tỳ tạng 17/02/09 1 30 Bình thường 0 0 0 18/02/09 2 30 Bình thường 0 0 0 19/02/09 3 32 Bình thường 0 0 0 20/02/09 4 36 Bình thường 0 0 0 21/02/09 5 27 Bình thường 0 0 0 22/02/09 6 20 Bình thường 1 0 0 23/02/09 7 25 Bình thường 1 0 0 24/02/09 8 16 Bình thường 1 0 0 25/02/09 9 17 Bình thường 1 1 0 26/02/09 10 23 Bình thường 1 1 0 27/02/09 11 14 Bình thường 1 1 0 28/02/09 12 11 Bình thường 1 1 0 01/03/09 13 9 Bình thường 1 1 0 02/03/09 14 10 Bình thường 1 1 0 03/03/09 15 8 Bình thường 1 1 0 04/03/09 16 8 Bình thường 1 1 0 05/03/09 17 8 Bình thường 1 1 0 06/03/09 18 8 Bình thường 1 1 0 07/03/09 19 8 Bình thường 1 1 0 08/03/09 20 10 Bình thường 1 1 0 09/03/09 21 10 Bình thường 1 1 1 10/03/09 22 9 Bình thường 1 1 1 11/03/09 23 7 Bình thường 1 1 1 12/03/09 24 9 Bình thường 1 1 1 13/03/09 25 8 Bình thường 1 1 1 14/03/09 26 6 Bình thường 1 1 1 15/03/09 27 6 Bình thường 1 1 1 16/03/09 28 6 Bình thường 1 1 1 17/03/09 29 7 Bình thường 1 1 1 18/03/09 30 6 Bình thường 1 1 1 Chú thích: 0: Mẫu cá chưa xuất hiện cơ quan lympho 1: Mẫu cá được tìm thấy cơ quan như thận, tuyến ức và tỳ tạng PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version 35 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version