Nghiên cứu tạo dòng cây dưa hấu (citrulus lanatus thumb.) chuyển gen kháng bệnh virus đốm vòng PRSV

cứu của chúng tôi, việc gây tổn thương các mảnh lá mầm trước khi lây nhiễm với vi khuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng lưỡi 90 dao sắc chọc và khía nhẹ lên các mảnh lá mầm, đặc biệt là ở phần lát cắt gần gốc lá mầm. Cách làm này cũng giống với công bố của nhiều tác giả khác khi tiến hành chuyển gen vào dưa hấu (Choi et al., 1994; Akashi et al., 2005; Cho et al., 2008). Hiệu quả chuyển gen vào dưa hấu phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như kiểu gen, chủng vi khuẩn, vector sử dụng và các bước trong quá trình chuyển gen ,... Gen gus đã được dùng để tối ưu hóa quy trình chuyển gen và chuyển thành công trên nhiều giống dưa hấu khác nhau. Hiệu suất chuyển gen ở dưa hấu được báo cáo giao động từ 0% đến 16% (Choi et al., 1994; Suratman et al., 2010; Cho et al., 2008; Li et al., 2012). Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tạo được 5 dòng dưa hấu mang gen gus trong đó có 3 dòng thuộc dưa hấu D2 (tỷ lệ chuyển gen thu được là 1,85%) và 2 dòng thuộc dưa hấu L2 (tỷ lệ chuyển gen thu được là 1,87%). Tất cả 5 dòng dưa hấu chuyển gen này đều có biểu hiện màu xanh chàm khi nhuộm với X-gluc và cho kết quả PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII (bảng 3.9). Như vậy, trong số bốn dòng dưa hấu nghiên cứu, dưa hấu D2 và L2 cho hiệu quả chuyển gen tương đương nhau, dòng D1 và L1 không tạo được cây chuyển gen. Điều này cho thấy rằng khả năng tiếp nhận đoạn gen chuyển của các dòng dưa hấu là khác nhau rõ rệt, quy trình chuyển gen thông qua A.tumefaciens của chúng tôi có thể áp dụng cho việc tạo cây dưa hấu chuyển gen D2 và L2. 4.3. Tạo tính kháng virus bằng chuyển gen ở dƣa hấu Hiện nay, việc tạo cây trồng chuyển gen kháng virus ứng dụng cơ chế gây bất hoạt gen RNAi đang rất được chú ý nghiên cứu. Năm 1998, Waterhouse và cs đã sử dụng gen mã hóa cho protein xử lý sau dịch mã HC-pro của virus Y khoai tây để kháng lại chính virus đó. Đây là công bố đầu tiên về ứng dụng RNAi trong việc tạo cây trồng chuyển gen kháng virus. Ngay sau đó, kỹ thuật này đã được ứng dụng để tạo ra nhiều loại cây trồng kháng virus khác (Wang et al., 2000; Kalantidis et al., 2002). Trước đây, hầu hết các nghiên cứu chuyển gen RNAi tạo cây kháng virus đều tập trung vào việc bất hoạt gen mã hóa cho protein vỏ của virus (Andika et al., 2005; Park et al., 2005, Xu et al., 2004). Tuy nhiên, tính kháng ở các cây chuyển 91 gen thu được nhanh chóng bị yếu đi và thường không duy trì được tính kháng ở thế hệ sau. Mặt khác, do tính kháng của cây chuyển gen đối với một số dòng virus liên quan mật thiết với độ tương đồng giữa trình tự gen tương ứng của virus đó và đoạn gen được chuyển vào cây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng nếu độ tương đồng thấp hơn 90% thì cây chuyển gen không kháng được dòng virus đó. Để khắc phục những nhược điểm này, ngày nay các nhà khoa học đã chú ý chọn lựa vật liệu di truyền chuyển gen ở nhiều vùng có độ bảo thủ cao trong genome của virus. Trong các protein của PRSV, hai protein được quan tâm nhiều nhất là protein vỏ và protein Nib. Protein vỏ tham gia tạo capsid, có vai trò bao bọc acid nucleic nhằm tránh sự phá hủy của các nuclease, giữ cho hình thái và kích thước virus ổn định, tham gia vào sự hấp thụ của virus lên vị trí đặc hiệu trên tế bào nhạy cảm. Protein Nib là RNA polymerase phụ thuộc RNA của virus (RNA-dependent RNA polymerase, RdRp), chịu trách nhiệm tái bản phân tử RNA dương và âm của virus đồng thời có vai trò trong quá trình xâm nhiễm của virus (Deiman et al., 1997; Fellers et al., 1998). RdRp cùng các thành phần khác của virus và tế bào chủ tạo thành một phức hợp sao chép thực hiện quá trình tái bản genome của virus. Vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu sử dụng 2 gen này trong tạo cây chuyển gen kháng bệnh (Schubert et al., 2004; Ehrenfeld et al., 2004). Ngoài ra, Hcpro cũng là một protein quan trọng, có vai trò trong việc phân cắt các polyprotein thành các protein chức năng. Bên cạnh đó, các gen CP, Nib và HCpro là những gen có nhiều vùng gen có độ bảo thủ cao, do đó chúng tôi lựa chọn cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro của PRSV do Viện Công nghệ sinh học thiết kế làm vật liệu di truyền chuyển gen trong nghiên cứu này. Cấu trúc này đã được chuyển thành công vào 2 giống đu đủ Việt Nam, hiệu quả chuyển gen đạt được từ 0,3-1,25%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tiến hành 3 lô thí nghiệm riêng biệt để chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-Hcpro vào dưa hấu D2 và L2. Sau các giai đoạn nuôi cấy và chọn lọc, thu được 13 dòng cho kết quả PCR dương tính với cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn gen chuyển, trong đó có 8 dòng thuộc dưa hấu D2 và 5 dòng thuộc dưa hấu L2. Hiệu suất chuyển gen đối với dưa hấu D2 là 2,47%, đối với dưa 92 hấu L2 là 1,81%. So với hiệu suất chuyển cấu trúc gus-intron vào 2 dòng dưa hấu này thì hiệu suất chuyển cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro là cao hơn, đặc biệt là dưa hấu D2 (hiệu suất chuyển gen gus là 1,85%). Sự khác biệt trong hiệu suất chuyển gen đối với 2 cấu trúc trên có thể là do loại vector sử dụng là khác nhau. Năm 2010, Yang và cs đã chuyển thành công cấu trúc RNAi mang đoạn gen CP của ZYMV và PRSV vào 3 giống dưa hấu thương mại Feeling, China baby và Quality thông qua A.tumefaciens. Khi phân tích tính kháng virus của 10 dòng chuyển gen Feeling T0, nhóm tác giả đã thu được 2 dòng có khả năng kháng hoàn toàn đối với ZYMV và PRSV. Khi phân tích các thế hệ T0 và T1 của 2 dòng kháng bệnh này, các tác giả đã phát hiện sự tồn tại các sợi siRNA (loại RNA có vai trò quan trọng, quyết định đến hiệu quả của việc làm câm gen sau phiên mã và quyết định đến hiệu quả kháng virus ở cây chuyển gen) trong dịch chiết từ mô của chúng. Trong nghiên cứu của chúng tôi, đã thu được 1/8 dòng D2 T0 và 1/5 dòng L2 T0 có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV, tỷ lệ kháng virus ở dưa hấu D2 là 12,5% và dưa hấu L2 là 20,0%, tỷ lệ này cũng gần tương đương với tỷ lệ kháng virus mà Yang và cs (2011) đã công bố. Trong nghiên cứu tạo cây kháng virus, việc đánh giá khả năng kháng virus của các dòng cây chuyển gen là rất quan trọng. Do PRSV có thể lây truyền qua các vết thương cơ giới hoặc qua trung gian là các loại rệp, do đó chúng tôi đã lựa chọn phương pháp lây nhiễm virus thông qua việc tạo các vết thương hở trên bề mặt lá non của cây chuyển gen để đánh giá tính kháng virus của các dòng dưa hấu chuyển gen. Phương pháp lây nhiễm virus cho dưa hấu thông qua các vết thương hở cũng đã được tiến hành trong nhiều nghiên cứu (Yang et al., 2010; Park et al., 2005; Zhong et al., 2003; Niao et al., 2005). Khi nghiên cứu tính kháng đối với PRSV của các dòng dưa hấu chuyển gen D2 và L2 ở thế hệ T0, chúng tôi đã thu được 2 dòng cây có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV sau 45 ngày theo dõi, trong đó 1 dòng thuộc D2 (D2.7, tỷ lệ 12,5%) và 1 dòng thuộc L2 (L2.3, tỷ lệ 20,0%). Khi kiểm tra sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen ở thế hệ T1, chúng tôi thu được 7 cây thuộc dưa hấu D2.7 và 6 cây thuộc dưa hấu L2.3 cho kết quả PCR 93 dương tính với cặp mồi đặc hiệu với đoạn gen chuyển. 13 dòng cây này được kiểm tra tính kháng đối với PRSV, kết quả chúng tôi đã thu được tỷ lệ kháng hoàn toàn đối với PRSV là 42,87% đối với dưa hấu D2.7 và 33,33% đối với dưa hấu L2.3, tỷ lệ này cao hơn khá nhiều so với ở thế hệ T0 (12,5% đối với dưa dấu D2 và 20% đối với dưa hấu L2). Như vậy, cấu trúc RNAi của chúng tôi đã hoạt động tốt và được di truyền ở dưa hấu chuyển gen thế hệ T0 sang thế hệ T1. Tuy nhiên, trong số các dòng cây chuyển gen, tỷ lệ số dòng cây có khả năng kháng hoàn toàn với virus không cao so với tổng số dòng cây chuyển gen thu được, mức độ kháng bệnh của các dòng dưa hấu chuyển gen cũng hoàn toàn khác nhau. Do đó, để nâng cao hiệu quả kháng PRSV, cần thiết phải tìm hiểu sự bất hoạt nhiều gen chức năng của PRSV cũng như nghiên cứu cơ sở và biện pháp nâng cao sự biểu hiện của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen. Ở thế hệ T1, chúng tôi thu được 1 cây thuộc dưa hấu D2.7 có biểu hiện bệnh ở ngày thứ 26 ở mức độ 1 và duy trì tình trạng biểu hiện này trong suốt quá trình theo dõi. Bên cạnh đó, chúng tôi thu được 1 cây chuyển gen thuộc dưa hấu D2.7 có mức độ biểu hiện bệnh tăng dần trong khoảng 2 tuần xuất hiện triệu chứng nhưng sau đó thì mức độ biểu hiện các triệu chứng bệnh lại giảm đi. Điều này có thể do cấu trúc RNAi chuyển vào cây hoạt động không ổn định. Hiện tượng này cũng đã được quan sát trên cây thuốc lá chuyển gen kháng TMV của Phạm Thị Vân và cs (2008), cây cà chua chuyển gen kháng TYLCV của Nguyễn Thị Hải Yến (2012). Như vậy, có thể kết luận cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro đã hoạt động tốt trong 2 dòng dưa hấu chuyển gen thuộc D2.7 và L2.3 và được di truyền lại cho thế hệ sau. Kết quả này cùng với những công trình nghiên cứu trước đây (Yang et al., 2011; Xu et al., 2004; Wang et al., 2000; Phạm Thị Vân và cs, 2008; Nguyễn Thị Hải Yến, 2012) đã một lần nữa chứng minh hiệu quả ứng dụng của kỹ thuật RNAi trong việc tạo cây trồng kháng virus. 4.4. Triển vọng của các dòng chuyển gen trong bối cảnh GMO chung H F 94 Dân số tăng nhanh cùng với sự phát triển đô thị hóa và mức thu nhập ngày càng cao ở nhiều nước đang phát triển là nguyên nhân dẫn đến sự tăng nhu cầu đối với các sản phẩm từ thịt, sữa và trứng, ngũ cốc, trong thời gian tới. Tính đến năm 2020, nhu cầu trên toàn thế giới đối với các sản phẩm từ thịt cũng sẽ tăng hơn 55% so với mức tiêu thụ hiện tại, mà phần lớn là ở các nước đang phát triển. Do vậy, nhu cầu đối với các loại thức ăn chăn nuôi, ngũ cốc mỗi năm cũng sẽ tăng theo và ở mức 3% đối với các nước đang phát triển và 0,5% đối với các nước phát triển. Tính trung bình, để tạo ra 1kg thịt thì cần khoảng 3 kg thức ăn chăn nuôi làm từ ngũ cốc và 1kg sữa thì cần khoảng 1kg thức ăn tương ứng (James C, 2006). Bên cạnh đó nhu cầu đối với lương thực và thực phẩm hàng ngày cho con người cũng đang tăng lên không ngừng. Theo dự đoán đến năm 2050 thế giới sẽ có khoảng 9,3 tỷ người, yêu cầu đối với tổng sản lượng lương thực và thực phẩm phải đạt tốc độ tăng trưởng ít nhất 40% so với hiện nay, điều đó thật khó thực hiện trong tình trạng sản xuất như hiện nay khi diện tích đất canh tác ngày một giảm mạnh do xu hướng công nghiệp hóa, đô thị hóa ngày một tăng; nguồn nhân lực trực tiếp tham gia vào sản xuất nông nghiệp ngày một giảm dẫn đến việc mở rộng diện tích canh tác là rất khó thực hiện. Bên cạnh đó, những tác động tiêu cực của nạn mất rừng, ô nhiễm môi trường và biến đổi khí hậu đến đời sống và quá trình sản xuất nông nghiệp: hạn hán, lũ lụt, sạt lở đất, sói mòn, dịch bệnh, cũng ngày một tăng. Do đó, việc sản xuất cây trồng biến đổi gene là hết sức cần thiết. Có 3 lý do chính để chúng ta lựa chọn việc phát triển các sản phẩm chuyển gen: (1) Chuyển gen để bảo vệ cây trồng tốt hơn khỏi dịch, bệnh, côn trùng gây hại cũng như bảo vệ cây trước những điều kiện khắc nghiệt của thời tiết (hạn hán, ngập úng,..), từ đó mà năng suất cây trồng sẽ được nâng cao; (2) Chuyển gen vào cây trồng để giảm lượng thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, phân bón hóa học, từ đó góp phần bảo vệ môi trường sống, chống biến đổi khí hậu; (3) Chuyển gen vào cây trồng để tăng sản lượng và chất lượng lương thực, từ đó mà lợi nhuận nông nghiệp cũng được nâng cao. Ngày 21/06/2010, Chính phủ Việt Nam đã ra Nghị định về An toàn Sinh học đối với sinh vật biến đổi gen, mẫu vật di truyền và sản phẩm của sinh vật biến đổi gen, điều này cho thấy sự quan tâm của Chính phủ Việt Nam đối với vấn đề này. Trong Nghị định nêu rõ các quy định về các vấn đề liên quan đến việc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng các sinh vật biến đổi gen và các sản phẩm của chúng như việc đánh giá rủi ro và quản lý các rủi ro của sinh vật biến đổi gen đối với môi trường cũng như sức khỏe của con người; các quy định về vấn đề nghiên cứu khoa học và 95 phát triển công nghệ về sinh vật biến đổi gen và các sản phẩm của chúng; các quy định về việc khảo nghiệm sinh vật biến đổi gen; các quy định về việc cấp giấy chứng nhận an toàn sinh học; các quy định về việc sinh vật biến đổi gen đủ điều kiện sử dụng làm thực phẩm và thức ăn chăn nuôi; các quy định về việc sản xuất, kinh doanh, xuất nhập khẩu, vận chuyển, lưu giữ sinh vật biến đổi gen và sản phẩm của chúng cũng như các quy định về thông tin của sinh vật biến đổi gen và thông tin của các sản phẩm của sinh vật biến đổi gen (Lê Trần Bình và cs, 2003). Trong nhiều năm qua, việc nghiên cứu, ứng dụng cây trồng biến đổi gen trong sản xuất nông nghiệp đã được Việt Nam rất chú trọng. Đã có nhiều công bố chuyển gen thành công ở nhiều loại cây trồng khác nhau như hoa đồng tiền, cây thuốc lá, đu đủ, cam, lúa, mía, xoan, hông, bông, dưa hấu,Năm 2010, Việt Nam chính thức cho phép trồng thử nghiệm trên diển rộng một số loại cây trồng chuyển gen, đánh dấu bước ngoặt quan trọng đối với sự phát triển cây trồng chuyển gen tại Việt Nam. Cùng với sự phát triển của các loại cây trồng chuyển gen nói chung, các dòng dưa hấu chuyển gen kháng PRSV trong nghiên cứu này cũng rất có triển vọng được nghiên cứu và phát triển thành giống thương mại trong thời gian tới. 96 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 1. KẾT LUẬN 1.1. Đã xây dựng được quy trình tái sinh in vitro 4 giống dưa hấu nghiên cứu. Mảnh lá mầm 5 ngày tuổi là thích hợp cho việc tái sinh ở dưa hấu. Các vùng khác nhau trên lá mầm cho hiệu quả tái sinh cũng khác nhau, vùng gần gốc lá mầm cho hiệu quả tái sinh cao hơn các vùng khác. Môi trường thích hợp để tái sinh chồi là MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 0,5 mg/l IBA, 1,5 mg/l BAP. Các chồi tạo thành có thể được kéo dài trên môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 0,1 mg/l IBA, 580mg/l MES và 0,5 mg/l GA3 và được ra rễ trên môi trường MS bổ sung 3% sucrose, 0,8% agar, 0,1 mg/l IBA. Các cây hoàn chỉnh sẽ được chuyển ra bầu trấu hun : cát (1 : 1) để thích nghi với điều kiện môi trường. 1.2. Đã tối ưu được quy trình chuyển gen gus thông qua A.tumefaciens vào lá mầm dưa hấu: ngưỡng kanamycin 100 mg/l, nồng độ vi khuẩn OD600 = 0,7, thời gian biến nạp 30 phút và thời gian đồng nuôi cấy 3 ngày trong tối được lựa chọn để chuyển gen gus vào dưa hấu. 1.3. Đã chuyển thành công gen gus vào 2 giống dưa hấu D2 và L2, hiệu suất chuyển gen gus thu được đối với giống L2 là 1,87% và D2 là 1,85%. Biểu hiện bền vững của gen gus ở trong cây chuyển gen khá mạnh, màu xanh chàm biểu hiện ở cả lá, thân, hoa, rễ và đỉnh chồi của cây chuyển gen. Giống L1 và D1 không có khả năng tiếp nhận đoạn gen chuyển, hiệu suất chuyển gen là 0%. 1.4. Đã chuyển thành công cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro vào 2 giống dưa hấu D2 và L2 thông qua chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Hiệu suất chuyển gen đạt được là 2,47% (D2) và 1,81% (L2). Phân tích tính kháng PRSV sau 45 ngày lây nhiễm virus nhân tạo ở các dòng dưa hấu T0 thu được 2 dòng dưa hấu có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV trong đó 1 dòng thuộc dưa hấu D2 (D2.7) và 1 dòng thuộc dưa hấu L2 (L2.5). 1.5. Kết quả phân tích sự có mặt của đoạn gen chuyển trong cây chuyển gen và phân tích tính kháng PRSV sau 45 ngày lây nhiễm virus nhân tạo ở các cây T1 thu 97 được 5 cây có khả năng kháng hoàn toàn với PRSV, trong đó có 2 cây thuộc dòng L2.3 (tỷ lệ kháng là 33,33%) và 3 cây thuộc dòng D2.7 (tỷ lệ kháng là 42,87%). Như vậy, cấu trúc RNAi/CP-Nib-HCpro đã được di truyền ổn định từ thế hệ T0 sang T1. 2. ĐỀ NGHỊ 2.1. Tiếp tục phân tích khả năng di truyền của đoạn gen chuyển và tính kháng virus PRSV của các dòng dưa hấu ở các thế hệ tiếp theo và phân tích tính kháng bệnh đối với các chủng PRSV-w khác tại Việt Nam để lựa chọn những dòng có triển vọng phục vụ công tác chọn giống. 2.2. Nghiên cứu đánh giá mức độ an toàn sinh học của các dòng dưa hấu chuyển gen kháng PRSV. 2.3. Thiết kế cấu trúc RNAi có khả năng bất hoạt đồng thời nhiều loại virus khác nhau tại Việt Nam gây bệnh trên dưa hấu. 98 SUMMARY 1. Name of thesis: Generation of transgenic virus-resistant watermelon (Citrulus lanatus Thumb) 2. Objectives - Build up process of transgenic and regeneration of Vietnam watermelon. - Create a new transgenic line of watermelon resistant against Vietnam PRSV viruses. 3. Contents: 3.1. Collecting watermelon varieties. 3.2. Building up an in vitro regeneration process of watermelon varieties collected. 3.3. Building up a transgenic process to watermelon varieties based on gus in PCB- gusplus vector by Agrobacterium method. 3.4. Creating a new transgenic watermelon line resistant against PRSV virus by Agrobacterium tumefaciens CV58C1 containing pK7GWIW2 (II) / CP-Nib-HCpro vector. 3.5. Analyzing the new transgenic plants and assessing the resistance against Vietnam PRSV. 4. Results: 4.1. Managed to build up in vitro regeneration process of the four Vietnam watermelon varieties. The cotyledons pieces, 5 days-old, were suitable for regeneration. Different pieces of cotyledons showed different regeneration results; pieces which were near the foot of cotyledons had better regeneration efficiency than those out of cotyledons foot. MS added 3% sucrose, 0.8% agar, 0.5 mg / l IBA, 1.5 mg / l BAP was favorable medium for shoot regeneration. The shoots elongated in MS added 3% sucrose, 0.8% agar, 0.1 mg / l IBA, 580mg / l MES and 0.5 mg / l 99 GA3 and rooted in MS added 3% sucrose, 0.8% agar, 0.1 mg / l IBA. The new plants will be moved to small plastic bag with burnt husk and sand (1: 1) to get them adapted to new medium. 4.2. Succeeded in building up transgenic process of gus by A. Tumefaciens to watermelon cotyledons: 5-day-old watermelon cotyledons were cut into small pieces about 1 - 2mm2, then soaked into solution of OD600 = 0.7 in 30 minutes. After that cotyledons pieces were dried with absorbent piece and put up in next medium (MS added 3%sucrose, 200MAS, 1,5mg/l BAP, 0,5mg/l IBA, 0,8% agar), kept in the darkness. After 3 days, the cotyledon pieces were washed in distilled water added with 500 mg / l cefo, then dried and taken to regeneration medium (MS added 3% sucrose, 1.5 mg / l BAP, 0, 5 mg / l IBA, 0.8% agar, 200 mg / l Km and 500 mg / l cefo). After 6 weeks, the shoots and shoots group would be brought to rooting-favorable medium (MS added 0.1 mg / l IBA, 100 mg / l Km, 250mg / l cefo) or shoot-favorable medium (MS added 0.1 mg / l IBA, 0.5 mg / l GA3, 150 mg / l Km, 500 mg / l cefo) in 2-3 weeks depending on shoots size. The new plants, then, would be taken to plastic bag with burnt husk: black sand (1:1) in light room or cultivation chamber before assessment. 4.3. When analyzing gus transgenic plants by PCR reaction with nptII gene and dyeing tissue of transgenic plants with X-gluc, the performance obtained in transgenic watermelon varieties ranged from 0 to 1 , 87%. Performance of L1 and D1 was 0%, L2 1.87%, and D2 1.85%. In conclusion, the gus gene was successfully transferred into 2 watermelon varieties D2 and L2 byAgrobacterium tumefaciens containing PCB-guslus CV58C1 vector. Sustainability of GUS in transgenic plants was well expressed; dark green was found in the leaves, stems, flowers, roots and shoots head of transgenic plants. 4.4. Managed to transfer RNAi / Nib-CP-2 HCpro to the two watermelon varieties L2 and D2 by Agrobacterium tumefaciens CV58C1. The results of T0 generation transgenic plants by PCR and RT-PCR with Nib-CP HCpro showed positive, 100 respectively, 8/43 for D2 line and 5/36 for L2. Transgenic performance showed 2.47% (D2) and 1.81% (L2). The resistance of PRSV after 45 days of artificially affected in T0 showed positive for PCR and RT-PCR with Nib-CP gene and that 1/8 of D2 line (D2 .7) and 1/5 of L2 (L2.5) were completely resistant against PRSV. 4.5. The results of T1 transgenic plants by PCR and RT-PCR with Nib-CP HCpro showed positive; respectively 7/18 of D 2.7 and 6/23 of L2. Resistance of PRSV after 45 days of artificially affected in T1 plants showed that PCR was positive with CP-Nib-HCpro gene fragments and that 5new plants were completely resistant against PRSV. Of the 5 plants, 2 belonged to L2.3 line had resistance rate of 33.33% and 3 plants of D2.7 line of 42.87%). Of 13 studied watermelon plants, only one, belonged to L2.3 line, showed the highest expression of disease at 3, the remaining showed the highest expression at 2. 101 NHỮNG CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Nguyễn Thị Thanh Nga, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2010), Nghiên cứu quy trình tái sinh in vitro cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3B): 1-7, 2010 2. Nguyễn Thị Thanh Nga, Hồ Mạnh Tường, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2012), Nghiên cứu quy trình chuyển gen vào cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.). Tạp chí Sinh học, 34(3): 389-396 3. Nguyễn Thị Thanh Nga, Đoàn Thị Thùy Linh, Phạm Thị Vân, Nguyễn Tường Vân, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình, Tạo dòng cây dưa hấu (Citrullus lanatus Thumb.) chuyển gen kháng virus PRSV bằng kỹ thuật RNAi. (đang gửi đăng) 102 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Abhary MK, Anfoka GH, Nakhla MK, Maxwell DP (2006) Post-transcriptional gene silencing in controlling viruses of the tomato yellow leaf curl virus complex. Arch Virol 151: 2349-2363. 2. Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V and Sundaresan V (2005) Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana. Genome Research, 15: 78-91. 3. Adrian (2008) The Health Benefits of watermelon. website: 4. Akashi K, Morikawa K and Yokota A (2005) Agrobacterium-mediated transformation system for the drought and excess light stress-tolerant wild watermelon (Citrullus lanatus). Plant Biotechnology 22 (1): 13–18. 5. Amarzguioui M, Holen T, Babaie E, Prydz H (2003) Tolerance for mutations and chemical modifications in a saran. Nucleic Acids Res 31(2):589-95. 6. Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M, Matzke M, Ruvkun G, Tuschl T (2003) A uniform system for microRNA annotation. RNA 9(3):277-9. 7. Ananthakrishnan G, Xia X, Elman C, Singer S, Paris HS, Galon A, Gaba V (2003) Shoot production in squash (Cucurbita pepo) by in vitro organogenesis. Plant Cell Reports, v.21, p.739-746. 8. Andika IB, Kondo H, Tamada T (2005) Evidence that RNA silencing-mediated resistance to beet necrotic yellow vein virus is less effective in roots than in leaves. Mol Plant Microbe Interact 18(3):194–204. 103 9. Anindya R, Chittori S, Savithri HS (2005) Tyrosine 66 of Pepper vein banding virus genome-linked protein is uridylylated by RNA-dependent RNA polymerase. Virology 5;336(2):154-62. 10. Asad S, Haris W A A, Bashir A, Zafar Y, Malik K A, Malik M N and Lichtenstein C P (2003) Transgenic tobacco expressing geminiviral RNAs are resistant to the serious viral pathogen causing cotton leaf curl disease. Archives of Virology 148, 2341-2352. 11. Babadoost M, Islam S Z, Tian D, Pavon C, Hurt M, Swiader J M, Fouly H M, Ogutu M O, Walters S A, Honda Y (2000) Ressearch Program on Pumpkin Diseases in Illinois. Website: 12. Bartel B, and Bartel D P (2003) MicroRNAs: At the root of plant development. Plant Physiol. 132, 709–717. 13. Bartel DP (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function, Cell. 116(2):281-97. 14. Bateson MF, Lines RE, Peter R, Worawan C, Ha CV, Gibbs AJ, Dale JL (2002) On the evolution and molecular epidemiology of the potyvirus Papaya ringspot virus. J Gen Virol, 83, pp. 2575-2585. 15. Baulcombe D C (2004) RNA silencing in plants. Nature 431:356-63. 16. Bernsein E, Caudy AA, Hammond SM, Gannon GJ (2001) Role for abidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature, 409:363-366. 17. Bonfim K, Faria JC, Nogueira EO, Mendes EA, Aragão FJ (2007) RNAi- mediated resistance to Bean golden mosaic virus in genetically engineered common bean (Phaseolus vulgaris). Mol Plant Microbe Interact. 2007 Jun;20(6):717-26. 18. Boulton MI (2002) Functions and interactions of mastrevirus gene products. Physiological and Molecular Plant Pathology 60, 243-255. 104 19. Carmell MA, Xuan Z, Zhang MQ, Hannon GJ (2002) The Argonaute family: tentacles that reach into RNAi, developmental control, stem cell maintenance, and tumorigenesis. Genes Dev 16(21):2733-42. 20. Chen WS, Chiu CC, Liu HY, Lee TL, Cheng JT, Lin CC, Wu YJ, Chang HY (1998) Gene transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon. Biochem Mol Biol Int 46:1201-1209. 21. Chen WS, Chiu CC, Liu HY, Lee TL, Cheng JT, Lin CC, Wu YJ, Chang HY (1998) Gene transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon. Biochem Mol Biol Int 46:1201-1209. 22. Cho MA, Moon CY, Liu LR, Choi PS (2008) Agrobacterium – mediated transformation in citrullus lanatus. Biologia Plantarum 52(2): 365-369 23. Choi PS, Soh WY, Kim YS, Yoo Ook J and Liu JRta (1994) Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens. Plant cell Reports 13: 344-348. 24. Choi PS, Soh WY, Kim YS, Yoo Ook J and Liu JRta (1994) Genetic transformation and plant regeneration of watermelon using Agrobacterium tumefaciens. Plant cell Reports 13: 344-348. 25. Chu Hoàng Hà, Phạm Thị Vân, Lê Trần Bình, 2009. Tạo cây trồng chuyển gen kháng bệnh virus bằng kỹ thuật RNAi. Báo cáo Hội nghị quốc gia về sinh vật biến đổi gen và quản lý an toàn sinh học, Hà Nội 2009, p. 19-28. 26. Cogoni C, Romano N, Macino G (1994) Suppression of gene expression by homologous transgenes. Antonie Van Leeuwenhoek. 65(3):205-9. 27. Compton M E (1999) Dark pretreatment improves adventitious shoot organogenesis from cotyledons of diploid watermelon. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 58 : 185 – 188. 28. Compton M E, Gray D J (1993) Somatic embryogenesis and plant regeneration from immature cotyledons of watermelon. Plant Cell Reports12: 61 - 65. 105 29. COMPTON ME (2000) Interaction between explant size and cultivar affects shoot organogenic competence of watermelon cotyledons. HortScience, v.35, p.749-750. 30. Compton ME, Gray DJ, Gaba VP (2004) Use of tissue culture and biotechnology for the genetic improvement of watermelon. Plant Cell Tissue Organ Cult 77: 231-43. 31. Crall JM, Elmstrom GW & McCuistion Jr FT (1994) SSDL: a highquality icebox watermelon breeding line resistant to fusarium wilt and anthracnose. HortScience 29: 707–708 32. Crall JM, Elmstrom GW & McCuistion Jr FT (1994) SSDL: a highquality icebox watermelon breeding line resistant to fusarium wilt and anthracnose. HortScience 29: 707–708 33. Cuong Viet Ha (2007), Detection and identification of potyviruses and geminiviruses in Vietnam, PhD thesis, Queensland University of Technology. 34. Davis AR, King SR, Jarret RL, Levi A, Tadmor Y (2004) Lycopene and Total Carotenoid Content as Descriptors for Citrullus lanatus: Limitations and Preliminary Trials. Cucurbit Genetics Cooperative Report 27:34-40 35. Denli AM, Tops BB, Plasterk RH, Ketting RF, Hannon GJ (2004) Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex. Nature. 432(7014):231-5. 36. Di Nicola-Negri E, Brunetti A, Tavazza M, Ilardi V (2005) Hairpin RNA- mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus. Transgenic Res. 14(6):989-94. 37. Đinh Thị Phòng, Nguyễn Thị Thư (2007) Chuyển gen gus vào đỉnh phôi hạt chín giống Đậu tương ĐT12 thông qua Agrobacterium Tumefaciens. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(4): 417-478. 106 38. Dong JZ, Jia SR (1991) High efficiency plant regeneration from cotyledons of Watermelon (Citrullus lanatus Schrad.). Plant Cell Reports v9: 559 – 562. 39. Droste A, Pasquali G, Helena M and Zanettini B (2000) Integrated bombardment and Agrobacterium transformation system: An alternative method for soybean transformation. Plant Mol. Biol. Rep., 18: 51-59. 40. Dykxhoorn, D.M., Novina, C.D., and Sharp, P.A. (2003) Killing the messenger: short RNAs that silence gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 4, 457-467 41. Edwardson JR and Christie RG (1986) Viruses infecting forage legumes. Florida Agriculture Experiment Station Monograph series 4. 42. Ellul P, Lelivelt C, Naval MM, Noguera FJ, Sanchez S, Atarés A, Moreno V, Corella P, and Dirks R (2007) Watermelon, Transgenic Crops V 43. Ellul P, Rios G, Atare A, Roig L A, Serrano R, Moreno V (2003) The expression of Saccharomyces cerevisiae HAL1 gene increases salt tolerance in transgenic watermelon [ Citrullus lanatus( Thunb. ) Matsum. & Nakai. ]. Theor Appl Genet 107: 462-469. 44. Ellul P,· Ríos G,· Atarés A, Roig LA, Serrano R, Moreno V (2003) The expression of the Saccharomyces cerevisiae HAL1 gene increases salt tolerance in transgenic watermelon [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsun. & Nakai.]. Theor Appl Genet (2003) 107:462–469 45. Ender C, Meister G (2010) Argonaute proteins at a glance. J Cell Sci 123:1819–1823 46. FAO 47. Febres VJ, Lee RF, Moore GA (2008) Transgenic resistance to Citrus tristeza virus in grapefruit. Plant Cell Reports 27 (1): 93-104. 107 48. Fehér T (1993) Watermelon: Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. & Nakai. In: Kalloo G & Bergh BO (eds) Improvement of Vegetable Crops (pp. 295–311). Pergamon Press, Oxford 49. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent DNA specific genetic interference by bouble – stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature, 139, pp. 806 – 811 50. Fuentes A, Ramos PL, Fiallo E, Callard D, Sanchez Y, Peral R, Rodriguez R, Pujol M (2006) Intron-hairpin RNA derived from replication associated protein C1 gene confers immunity to tomato yellow leaf curl virus infection in transgenic tomato plants. Transgenic Res 15:291–304 51. Fuentes A, Ramos PL, Fiallo E, Callard D, Sánchez Y, Peral R, Rodríguez R, Pujol M (2006) Intron-hairpin RNA derived from replication associated protein C1 gene confers immunity to tomato yellow leaf curl virus infection in transgenic tomato plants. Transgenic Res. 2006 Jun;15(3):291-304. 52. Gaba, V.; Zelcer, A.; Gal-On, A.(2004) Cucurbit biotechnology – the importance of virus resistance. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant 40:346–558; 53. Gafni Y and Epel BL (2002) The role of host and viral proteins in intra- and inter-cellular trafficking of geminiviruses. Physiologica and Molecular Plant Pathology 60, 231-241. 54. Gal-On A and Raccah B (2000) A point mutation in the FRANK motif of the potyvirus helper component-protease gene alters symptom expression in cucurbits and elicits protection against the severe homologous virus. Phytopathology 90, 467-473. 55. Ganasan K, Huyop F (2010) In vitro Regeneration of Citrullus lanatus cv. Round Dragon. Journal of Biological Sciences 10 (2): 131 – 137. 56. Gawel NJ, Jarret RL (1991) A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea. Plant. Mol. Biol. Rep. 9: 262-266. 108 57. Gillaspie AG, Wright JM (1993) Evaluation of Citrullus sp.germplasm for resistace to watermelon mosaic virus 2. Plant Dis 77: 352-354. 58. Gonsalves D, Tripathi S, Carr JB, Suzuki JY (2009) Papaya Ringspot Virus. The Plant Health Instructor. DOI: 10.1094/PHI-I-2010-1004-01. 59. Gottula J. and Fuchs M (2009) Toward a Quarter Century of Pathogen-Derived Resistance and Practical Approaches to Plant Virus Disease Control. Advances in Virus Research 75, p. 161-183. 60. Gregory RI, Chendrimada TP, Shiekhattar R (2006) MicroRNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex. Methods Mol Biol. 342:33-47. 61. Guner N, Strange EB, Wehner TC, Pesic-VanEsbroeck Z (2002) Methods for screening watermelon for resistance to papaya ringspot virus type-W. Sci Hortic 94:297-307 62. Guner N, Todd C. Wehner (2004) The genes of watermelon. HortScience 39(6):1175-1182 63. Haley B, Zamore PD (2004) Kinetic analysis of the RNAi enzyme complex. Nat Struct Mol Biol. 11(7):599-606. 64. Hallan V, Gafni Y (2001) Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) capsid protein (CP) subunit interactions: implications for viral assembly. Arch Virol. 2001;146(9):1765-73. 65. Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ (2000) An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 404(6775):293-6. 66. Hannon, G.J. (2002) RNA interference. Nature 418, 244–251. 67. He, L., Hannon, G.J. (2004) MicroRNAs: Small RNAs with a big role in gene regulation. Nat. Rev. Genet. 5(7): 522--531. 109 68. +and+Fruit+Juices&format=&man=&lfacet=&max=25&new=1 69. Irvine DV, Zaratiegui M, Tolia NH, Goto DB, Chitwood DH, Vaughn MW, Joshua-Tor L, Martienssen RA (2006) Argonaute slicing is required for heterochromatic silencing and spreading. Science 313(5790):1134-7. 70. James C (2006), Contribution of GM Technology to the Livestock Sector, website: 71. James C (2011). Global Status of Commercialized Biotech/ GM crops: ISAAA Brief. No. 43. 72. Jefferson RA, Burgess SM, Hirsh D (1986) β-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. Proc Natl Acad Sci USA 83: 8447–8451 73. Jefferson, R.A. (1987) Assaying chimeric genes in plants: The GUS gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep. 5, 387-405. 74. Ji X (2008) The mechanism of RNase III action: how dicer dices. Curr Top Microbiol Immunol. 320:99-116. 75. Jones L, Ratcliff F, Baulcombe DC (2001) RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance. Curr Biol. 11(10):747-57. 76. Jones-Rhoades MW and Bartel DP (2004) Computational Identification of Plant MicroRNAs and Their Targets, Including a Stress-Induced miRNA. Molecular Cell, Vol. 14, 787–799 77. Kai Z, Yan-Bing N, Xue-Ping Z (2005) Transgenic tobacco plants expressing dsRNA can prevent infection by Tobacco Mosaic virus. Chin J Agr Biotechnol 2: 201 - 205 78. Kalantidis, K., Psaradakis, S., Tabler, M. and Tsagris, M. (2002) The occurrence of CMV-specific short RNAs in transgenic tobacco expressing 110 virus-derived double-stranded RNA is indicative of resistance to the virus. Mol. Plant Microbe Interact. 15, 826–833. 79. Kamachi S, Mochizuki A, Nishiguchi M, Tabei Y (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to cucumber green mottle mosaic virus based on RNA silencing. Plant Cell Rep. 26(8):1283-8. 80. Kasschau KD, Carrington JC (2001) Long-distance movement and replication maintenance functions correlate with silencing suppression activity of potyviral HC-Pro. Virology. 285(1):71-81. 81. Kidner, C.A., and Martienssen, R.A. (2004) Spatially restricted microRNA directs leaf polarity through ARGONAUTE1. Nature 428, 81–84. 82. Krubphachaya P, Juíek M, Kertbundit S (2007) Induction of RNA-mediated Resistance to Papaya Ringspot Virus Type W. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 40(3):404-411. 83. Krug MGZ, Stipp LCL, Rodriguez APM (2005) In vitro organogenesis in watermelon cotyledons, Pesq. Agropec. bras., Brasília, v.40, n.9, p.861-865 84. Kucharek T (2000) Alternaria Leaf Spot of Cucurbits, PP, 32 website: 85. Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T (2001) Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science. 294(5543):853-8. 86. Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP (2001) An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294(5543):858-62. 87. Lê Thị Ánh Hồng (2002) Bệnh học phân tử thực vật. Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. 88. Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn (2003) Áp dụng các kỹ thuật phân tử trong nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 111 89. Lee RC, Ambros V (2001) An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science. 294(5543):862-4. 90. Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH, Kim VN (2004) MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23(20):4051-60. 91. Li J, Tang Y, Qin Y, Li X & Li H (2012) Agrobacterium-mediated transformation of watermelon (Citrullus lanatus). African Journal of Biotechnology Vol. 11(24), pp. 6450-6456 92. Ling KS, Harris KR, Meyer JDF, Levi A, Guner N, Wehner TCW, Bendahmane A, Havey MJ (2009) Non-synonymous single nucleotide polymorphisms in the watermelon eIF4E gene are closely associated with resistance to Zucchini yellow mosaic virus. Theor Appl Genet 120:191-200. 93. Liu, H.K., C. Yang and Z.M. Wei. (2004) Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of soybean using an embryonic tip regeneration system. Planta, 219: 1042- 1049. 94. López C, Cervera M, Fagoaga C, Moreno P, Navarro L, Flores R, Peña L (2010) Accumulation of transgene-derived siRNAs is not sufficient for RNAi- mediated protection against Citrus tristeza virus in transgenic Mexican lime. Mol Plant Pathol 11:33–41 95. Lund E, Dahlberg JE (2006) Substrate selectivity of exportin 5 and Dicer in the biogenesis of microRNAs. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 71:59-66. 96. Ma JB, Yuan YR, Meister G, Pei Y, Tuschl T, Patel DJ (2005) Structural basis for 5'-end-specific recognition of guide RNA by the A. fulgidus Piwi protein. Nature 434(7033):666-70. 97. Ma SQ, Xu Y, Gong GY, Zhang HY, Shen HL (2005) Analysis on the inheritance to PRSV-W and ZYMC-CH and their linkage in watermelon. J Fruit Sci 22:731-733. 112 98. Mette MF, Aufsatz W, van der Winden J, Matzke MA, Matzke AJ (2000) Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double- stranded RNA. EMBO J 19(19):5194-201. 99. Mohr HC (1986) Watermelon breeding. In: Bassett MJ (ed) Breeding Vegetable Crops (pp. 37–66). AVI Publishing Co., Inc, Westport, CT 100. Napoli C, Lemieux C, Jorgensen R (1990) Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 2(4):279-289. 101. Nguyễn Thị Phương Thảo, Ninh Thị Thảo, Vũ Thị Hà (2010) Nghiên cứu nhân nhanh In vitro cây dưa hấu (Citrullus lanatus), Tạp Chí Khoa học và Phát triển, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (8) 3: 418 – 425. 102. Niao NS, Sen HS, Man WS, Lin YJ, Xing ZF, Wei LD, You WS, Ming ZG, Sheng SF (2005) Creation of trivalent transgenic watermelon resistant to virus infection. Journal of Agricultural Biotechnology 2005, 13(1): 10-15 103. Nikam TD, Ghane SG, Nehul JN and Barmukh RB (2009) Induction of morphogenic callus and multiple shoot regeneration in Monordica cymbalaria Fenzl. Indian Journal of Biotechnology, 8: 442 – 447. 104. Nishantha Jayathilake (2004) Defining the molecular basis of host range in Papaya ringspot virus (PRSV) Australia. PhD thesis, Queensland University of Technology. 105. Pare JM, Hobman TC (2007) Dicer: structure, function and role in RNA- dependent gene-silencing pathways In: Polaina J, MacCabe AP (ed) Industrial enzymes, Springer, Berlin, pp 421–438 106. Park SM, Lee JS, Jegal S, Jeon BY, Jung M, Park YS, Han SL, Shin YS, Her NH, Lee JH, Lee MY, Ryu KH, Yang SG, Harn CH (2005) Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (Curcumber green mottle mosaic virus) infection. Plant Cell Rep 24: 350-356. 113 107. Patil BL, Ogwok E, Wagaba H, Mohammed IU, Yadav JS, Bagewadi B, Taylor NJ, Kreuze JF, Maruthi MN, Alicai T, Fauquet CM (2011) RNAi- mediated resistance to diverse isolates belonging to two virus species involved in Cassava brown streak disease. Mol Plant Pathol 12:31–41 108. Phạm Thị Vân, Nguyễn Minh Hùng, Hà Viết Cường, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình và Chu Hoàng Hà (2009) Tạo cây thuốc lá kháng virus TMV bằng kỹ thuật RNAi. Hội thảo uốc gia Bệnh hại Thực vật Việt Nam, 25-26/7 tại Viện Nghiên cứu Bông và phát triển NN Nha Hố - Ninh Thuận. Tr. 32-40. 109. Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê Văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo cây thuốc lá kháng bệnh virus khảm dưa chuột bằng kỹ thuật RNAi. Tạp chí Công nghệ Sinh học 6(4A), p. 679-687. 110. Pirinc V, Onay A, Yildirim H, Adiyaman F, Isikalan C and Basaran D (2003) Adventitious shoot organogenesis and plant regeneration from cotyledons of Diploid Diyarbakir Watermelon (Citrullus lanatus cv. “Surme”). Turk J Biol 27: 101 – 105. 111. Pradeep K, Satya VK, Selvapriya M, Vijayasamundeeswari A, Ladhalakshmi D, Paranidharan V, Rabindran R, Samiyappan R, Balasubramanian P, Velazhahan R (2012) Engineering resistance against Tobacco streak virus (TSV) in sunflower and tobacco using RNA interference. Biol Plant 56:735– 741 112. Purcifull DE, Edwardson J, Hiebert EL, Gonsalves D (1984) Papaya ringspot virus, CMI/AAB description of plant viruses No. 292. 113. Reddy D. V. R., Sudarshana M. R., Fuchs M., Rao N. C. and Thottappilly G (2009) Genetically Engineered Virus-Resistant Plants in Developing Countries: Current Status and Future Prospects. Advances in Virus Research 75, p. 185- 220. 114 114. Redfern AD, Colley SM, Beveridge DJ, Ikeda N, Epis MR, Li X, Foulds CE, Stuart LM, Barker A, Russell VJ, Ramsay K, Kobelke SJ, Li X, Hatchell EC, Payne C, Giles KM, Messineo A, Gatignol A, Lanz RB, O’Malley BW, Leedman PJ (2013) RNA-induced silencing complex (RISC) proteins PACT, TRBP, and Dicer are SRA binding nuclear receptor coregulators. Proc Natl Acad Sci USA 110:6536–6541. doi:10. 1073/pnas.1301620110 115. Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B, Bartel DP (2002) MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16(13):1616-26. 116. Rhee Y, Gurel F, Gafni Y, Dingwall C, Citovsky V (2000) A genetic system for detection of protein nuclear import and export. Nat Biotechnol. 2000 Apr;18(4):433-7. 117. Riley KJ, Yario TA, Steitz JA (2012) Association of Argonaute proteins and microRNAs can occur after cell lysis. RNA 18:1581–1585 118. Rimando AM, Perkins-Veazie PM (2005) Determination of citrulline in watermelon rind. J Chromatog A, 1078:196-200. 119. Rivas FV, Tolia NH, Song JJ, Aragon JP, Liu J, Hannon GJ, Joshua-Tor L (2005) Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC. Nat Struct Mol Biol 12(4):340-9. 120. Romano N, Macino G., (1992) Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol Microbiol. 6(22):3343-53. 121. Ruiz-Ferrer V, Voinnet O (2007) Viral suppression of RNA silencing: 2b wins the golden fleece by defeating argonaute. Bioassays 29:319–323 122. Satyajit Saurabh, Ambarish S. Vidyarthi, and Dinesh Prasad (2013) RNA interference: concept to reality in crop improvement. Planta Mar 2014, Volume 239, Number 3: 543-564 115 123. Schwarz DS, Hutvágner G, Du T, Xu Z, Aronin N, Zamore PD (2003) Asymmetry in the assembly of the RNAi enzyme complex. Cell.115(2):199- 208. 124. Schwarz DS, Hutvágner G, Haley B, Zamore PD (2002) Evidence that siRNAs function as guides, not primers, in the Drosophila and human RNAi pathways. Mol Cell. 10(3):537-48. 125. Schwind N, Zwiebel M, Itaya A, Ding B, Wang M, Krczal G, Wassenegger M (2009) RNAi-mediated resistance to potato spindle tuber viroid in transgenic tomato expressing a viroid hairpin RNA construct. Mol Plant Pathol 10:459– 469 126. Shalaby TA, Omran SA, Baioumi YA (2008) In vitro propagation of two triploid hybrids of watermelon through adventitious shoot organogenesis and shoot tip culture. Acta Biologica Szegediensis Volume 52(1):27-31. 127. Shinichiro K, Atsuko M, Masamichi N, Yukata T (2007) Transgenic Nicotiana benthamiana plants resistant to Cucuber green mottle mosaic virus bases on RNA silencing. Plant cell Report. 1283-1288. 128. Simón-Mateo C, García JA (2011) Antiviral strategies in plants based on RNA silencing. Biochim Biophys Acta 1809:722–731 129. Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG, Waterhouse PM (2000) Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs, Nature. 407(6802):319-20. 130. Song JJ, Smith SK, Hannon GJ, Joshua TL (2004) Crystal structure of argonaute and its implications for RISC slicer activity. Science, 305:1434-1437. 131. Strange EB, Gumer N, Pesic-VanEsbroeck Z, Wehner TC (2002) Screening the watermelon gernplasm collection from to Papaya ringspot virus type-W. Crop Sci 42:1324-1330. 116 132. Sultana RS, Bari MA (2003) Effect of Different Plant Growth Regulators on Direct Regeneration of Watermelon (Citrulus lanatus Thumb.). Plant Tissue Cult 13(2): 173-177. 133. Suratman F, Huyop F, Wagiran A, Rahmat Z, Ghazali H and Parveez GKA (2010), Cotyledon with Hypocotyl Segment as an Explant for the Production of Transgenic Citrullus vulgaris Schrad (Watermelon) Mediated by Agrobacterium tumefacien. Biotechnology 9 (2): 106-118 134. Swain S., Powell D.A. (2004) Papaya Ringspot Virus Resistant Papaya: A Case Study, 135. Tabei, Y.; Nishio, T.; Kurihara, K.; Kanuo, T. (1994) Selection of transformed callus in a liquid medium and regeneration of transgenic plants in cucumber (Cucumis sativus L.). Breed. Sci. 44:47–51; 136. Tolia NH, Joshua-Tor L (2007) Slicer and the argonautes. Nat Chem Biol. 3(1):36-43. 137. Tricoli DM, Carney KJ, Russell PF, Quemada HD, McMaster RJ, Reynolds JF & Deng RZ (2002) Transgenic plants expressing DNA constructs containing a plurality of genes to impart virus resistance. United States Patent No. 6,337,431 138. Tyagi H, Rajasubramaniam S, Rajam MV, Dasgupta I (2008) RNA- interference in rice against rice tungro bacilliform virus results in its decreased accumulation in inoculated rice plants. Transgenic Res 17:897–904 139. Unseld S, Höhnle M, Ringel M, Frischmuth T (2001) Subcellular targeting of the coat protein of African cassava mosaic geminivirus. Virology. 286(2):373-83. 140. Van der Krol AR, Mur LA, Beld M, Mol JN, Stuitje AR (1990) Flavonoid genes in petunia: addition of a limited number of gene copies may lead to a suppression of gene expression. Plant Cell. 2(4):291-9. 117 141. Vanitharani R, Chellappan P, Fauquet CM (2003) Short interfering RNA- mediated interference of gene expression and viral DNA accumulation in cultured plant cells. Proc Natl Acad Sci USA 100:9632–9636 142. Vengadesan G, Prem Anand R, Selvaraj N, Perl-treves R, and Ganapathi A (2004) Transfer and expression of nptII and bar genes in cucumber (cucumis sativus l.). In Vitro Cell. Dev. Biol.—Plant not known:1–6. 143. Verdel A, Jia S, Gerber S, Sugiyama T, Gygi S, Grewal SI, Moazed D (2004) RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex. Science. 303(5658):672-6. 144. Volpe TA, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA (2002) Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science. 297(5588):1833-7. 145. Wang HL, Wang Y, Giesman-Cookmeyer D, Lommel SA, Lucas WJ, (1998) Mutations in viral movement protein alter systemic infection and identify an intercellular barrier to entry into the phloem long-distance transport system. Virology. 245(1):75-89. 146. Wang MB, Abbott DC, Waterhouse PM (2000) A single copy of a virus- derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus. Mol Plant Pathol. 1(6):347-56. 147. Wehner TC (2008) Watermelon. (p. 381-418). In: J. Prohens and F. Nuez, eds. Handbook of Plant Breeding; Vegetables I: Asteraceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, and Cucurbitaceae. Springer Science+Business LLC, New York, NY, 426 p.17. 148. Wei, L., G. Guangqin and Z. Guochang. (2000) Agrobacterium-mediated transformation: state of the art and future prospect. Chinese Science Bulletin, 45(17): 1537-1545. 118 149. Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Liu Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG, Waterhouse PM (2001) Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants. Plant J. 27(6):581-90. 150. Wingard SA (1928) Hosts and symptoms of ring spot, a virus disease of plants. J Agric Res 37: 127 – 153. 151. Xu Y, Kang D, Shi Z, Shen H, Wehner T (2004) Inheritance of Resistance to Zucchini Yellow Mosaic Virus and Watermelon Mosaic Virus in Watermelon. Journal of Heredity 2004:95(6):498–502. 152. Yang CF, Yu TA, Chiang CH, Wu HW, Li CM, Chen JH và Yeh SD (2011) Generation of transgenic watermelon resistant to Zucchini yellow mosaic virus and Papaya ringspot virus type W. Plant cell reports 30(3):359-71. 153. Yap YK, Duangjit J, Panyim S (2009) N-termianl of Papaya ringspot virus type W (PRSV-W) helper component proteinase (HC-Pro) is essential for PRSV systemic infection in zuzzhini. Virus Genes 38:461-467. 154. Zamore PD, Tuschl T, Sharp PA, Bartel DP (2000) RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 101(1):25-33. 155. Zhang H, Kolb FA, Jaskiewicz L, Westhof E, Filipowicz W (2004) Single processing center models for human Dicer and bacterial RNase III. Cell 118(1):57-68. 156. Zhong WH, Jie ZP, Chen XJ, Huai Z, Sheng ZH (2003) Virus Resistance in Transgenic Watermelon Plants Containing a WMV-2 Coat Protein Gene. JGG 2003, 30(1): 70-75 157. Zhou X, Ruan J, Wang G, Zhang W (2007) Characterization and identification of microRNA core promoters in four model species. PLoS Comput Biol. 3(3):e37. 119 158. Zhou Y, Yuan Y, Yuan F, Wang M, Zhong H, Gu M, Liang G (2012) RNAi- directed down-regulation of RSV results in increased resistance in rice (Oryza sativa L.). Biotechnol Lett. doi:10.1007/s10529-012-0848-0 159. Zilberman D, Cao X, Jacobsen SE (2003) ARGONAUTE4 control of locus- specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation. Science 299: 716–719.