Phân tích sơ bộ thành phần hóa học và chiết phân đoạn rễ cây đinh lăng

n (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Các phương pháp chiết khác Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, trong thực tế người ta còn dùng các kỹ thuật hỗ trợ khác để đẩy nhanh quá trình hòa tan như chiết xuất sử dụng siêu âm, chiết xuất sử dụng vi sóng, chiết dưới áp suất hay sử dụng các dung môi đặc biệt để chiết như chiết chất lỏng siêu tới hạn (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). 38 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 3.1.1. Nguyên liệu - Mẫu cây tươi cả lá, thân, rễ Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms). - Thân và rễ Đinh lăng dùng để nghiên cứu thành phần hóa học và chiết phân đoạn. 3.1.2. Hóa chất và dung môi Ngoài một số dung môi hóa chất cơ bản dùng trong phòng thí nghiệm, trong phần thực nghiệm có sử dụng: - Hóa chất khảo sát vi học: Dung dịch javel 50 %, dung dịch acid acetic 1 %, dung dịch iod 0,1 % (son phèn), dung dịch carmin 1 %, nước cất. - Dung môi chiết xuất: EtOH 96 %, MeOH. - Dung môi dùng trong lắc phân bố, sắc ký lớp mỏng: Diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol. - Dung môi sắc ký lớp mỏng: Chloroform, methanol, n-hexan, n-butanol, diethyl ether, ethyl acetat, petroleum ether, benzen. - SKLM dùng bản silica gel F254 Merck tráng sẵn trên nền nhôm. - Chất chuẩn: Acid oleanoid chuẩn. - Phát hiện vết chất: Đèn tử ngoại bước sóng 254 nm và 365 nm, thuốc thử vanillin sulfuric (VS), thuốc thử acid sulfuric 10 %/EtOH. 3.1.3. Trang thiết bị - Bếp cách thủy. - Bình sắc ký Tây Ban Nha. - Cân phân tích OHAUS PAJ 2102. - Cân phân tích 4 số. - Đèn UV 254 và 365 nm. - Điện thoại di động SAMSUNG J7 Prime. - Kính hiển vi OLYMPUS CX22. - Máy cô quay Shendi RE-52CS-1. - Máy khuấy EMCLAB OS20-Pro. - Tủ lạnh SANYO. 39 - Tủ sấy DRYING OVEN. - Các dụng cụ thông dụng khác trong phòng thí nghiệm. 3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.2.1. Thu hái xử lý và bảo quản Đinh lăng 3.2.1.1. Thu hái Cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) được thu hái ngày 11/11/2016 tại Tri Tôn - An Giang, dược liệu thu hái về được PGS.TS. Trần Công Luận định danh và so sánh với các tài liệu tham khảo xác định được là đúng loài Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms) (Đỗ Tất Lợi, 2004; Võ Văn Chi, 2012). 3.2.1.2. Xử lý và bảo quản Để khảo sát cây khô thì rễ tươi và thân tươi sau khi thu hái được làm sạch và phơi khô ở nhiệt độ phòng hoặc sấy trong tủ sấy ở 60 - 80 oC, tránh tiếp xúc trực tiếp với ánh nắng mặt trời gay gắt vì tia tử ngoại (UV) có trong ánh sáng mặt trời có thể kích thích phản ứng hóa học, tạo nên các hợp chất giả tạo. Tiến hành xay thành bột dược liệu để sử dụng cho nghiên cứu (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014). Để khảo sát cây tươi (khảo sát về đặc điểm vi học), Đinh lăng sau khi được thu hái, làm sạch thì đem đi khảo sát ngay, tránh để trong thời gian lâu vì sẽ làm mất các tế bào hay các tế bào sẽ không còn nguyên vẹn,.. chọn mẫu phải chính xác, có tính đại diện, không quá già không quá non (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007; ĐH Y Dược TPHCM, 2014). Lưu trữ mẫu: Mẫu được lưu trữ tại Bộ môn dược liệu, Trường Đại Học Tây Đô. 3.2.2. Nghiên cứu về đặc điểm vi học 3.2.2.1. Khảo sát hình thái Quan sát các đặc điểm hình thái của toàn cây Đinh lăng tươi và mô tả bộ phận dùng bên ngoài của dược liệu như màu sắc, kích thước, hình dáng,(ĐH Y Dược TPHCM, 2014, Phạm Hoàng Hộ, 2003). 3.2.2.2. Khảo sát vi phẫu Chọn mẫu có tính đại diện, không quá già cũng không quá non. Để quan sát cấu tạo bên trong của những cơ quan thực vật thì nó được thực hiện bằng phương pháp cắt lát mỏng bằng tay và nhuộm hai màu với các cơ quan cắt ra thành từng khoanh (vi phẫu) trước khi quan sát. Nếu mẫu cắt là lá thì thường lấy đoạn 1/3 gân giữa kể từ nơi tiếp giáp với cuống và một phần cuống lá ở hai bên. Nếu là thân thì thường cắt ở lóng. Nếu là rễ thì cắt ở phần rễ non (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014). 40 Có 2 loại phẫu thức được sử dụng: Phẫu thức ngang: Lát cắt nằm trong mặt phẳng vuông góc với trục mẫu cắt. Phẫu thức dọc: Lát cắt nằm trong mặt phẳng song song với trục mẫu cắt, thường sử dụng cho thân và rễ để quan sát các ống tiết hay ống nhựa mủ. Nhuộm mẫu bằng cách nhuộm kép son phèn lục iod: - Ngâm lát cắt vào dung dịch javel cho đến khi thấy lát cắt trắng, sau đó rửa lại bằng nước cất nhiều lần. - Tiếp theo ngâm lát cắt vào dung dịch acid acetic trong vài phút để loại bỏ hết javel. Rửa lại bằng nước cất. - Ngâm lát cắt vào dung dịch son phèn lục iod cho đến khi lát cắt bắt được màu. Rửa lại nhiều lần bằng nước cất cho đến hết màu. - Vi phẫu sau khi nhuộm xong thì được ngâm trong nước cất. Quan sát bằng kính hiển vi ở vật kính 4X, 10X, 40X và được ghi nhận lại bằng các thiết bị điện tử như máy ảnh, điện thoại di động, (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Trương Thị Đẹp, 2014). 3.2.2.3. Khảo sát bột Dược liệu Lấy bộ phận lá, thân, rễ dược liệu Đinh lăng khảo sát (cũng là mẫu dùng cắt vi phẫu) cắt nhỏ, phơi sấy ở nhiệt độ 60 oC (hoặc phơi trong bóng râm) đến khô, xay bột mịn, rây qua rây cỡ 32 (rây mịn). Phần còn lại trên rây được đem đi sấy, xay và rây. Bột dược liệu được quan sát bằng cách: Lấy một lượng nhỏ bột dược liệu khoảng bằng đầu tăm cho lên một phiến kính (lame) rồi nhỏ 1 - 2 giọt nước sau đó khuấy kỹ sau đó đậy lamelle lại và cuối cùng là soi kính hiển vi bắt đầu bằng vật kính 10X, sau đó với vật kính 40X. Trước khi soi kính hiển vi phải quan sát bằng cảm quan để có thêm yếu tố kiểm nghiệm. Các cấu tử tìm thấy được chụp lại bằng điện thoại trực tiếp qua thị kính (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). 3.2.3. Thử tinh khiết 3.2.3.1. Xác định độ ẩm Phương pháp: Dùng cân phân tích OHAUS PAJ 2102 để tiến hành xác định độ ẩm của dược liệu. Độ ẩm dược liệu không quá 13,0 %, tiến hành theo phụ lục 9.6 của DĐVN IV (2009). 41 Cách thực hiện bằng cách trải mỏng khoảng 1,5 g dược liệu đã được nghiền mịn lên dĩa cân và tiến hành xác định độ ẩm theo hướng dẫn sử dụng cân phân tích OHAUS PAJ 2102. 3.2.3.2. Xác định tro toàn phần - Không quá 8,0 %. - Cách tiến hành: Cân khoảng 2 g dược liệu tiến hành theo phụ lục 9.8, phương pháp của DĐVN IV (2009). 3.2.3.3. Xác định chất chiết được trong dược liệu - Không được ít hơn 5,0 %. Theo phụ lục 12.10 DĐVN IV. - Cân chính xác khoảng 2 g bột dược liệu cho vào bình nón. Thêm khoảng 50 ml nước cất, đậy kín, cân lại khối lượng, sau đó để yên trong 1 giờ. Đun sôi nhẹ dưới hồi lưu 1 giờ, để nguội, lấy bình ra  cân lại khối lượng, dùng nước bổ sung lại khối lượng bị giảm, lọc qua phễu lọc thô vào bình  lấy khoảng 25 ml vào cốc thủy tinh đã được bì khối lượng cốc. Cô cách thủy đến cắn khô  cắn thu được đem sấy ở 105 oC trong 3 giờ  lấy ra để nguội trong bình hút ẩm 30 phút. Cân nhanh để xác định khối lượng và tính phần trăm chất chiết được. X % = b x 20,000 a x (100 − h) % Trong đó: b: Khối lượng cắn (g). a: Khối lượng dược liệu cân (g). h: Độ ẩm (%). Tất cả các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên đều được lấy kết quả là giá trị trung bình của 3 lần thử độc lập. 3.2.4. Nghiên cứu về hóa học 3.2.4.1. Định tính Theo Dược Điển Việt Nam IV (2009). ❖ Bột dược liệu Đinh lăng Phản ứng tạo bọt và màu Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt bền trong 10 phút. Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: - Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ. 42 - Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) Fehling, sau đó đun sôi  hiện tủa đỏ gạch. Lấy một ít bột dược liệu đặt trên khay sứ, nhỏ thêm 1 giọt dung dịch Lugol (TT)  bột chuyển sang màu xanh đen (Dược điển Việt Nam IV, 2009). ❖ Cao Đinh lăng Phản ứng tạo bọt và màu Lấy khoảng 1 g bột dược liệu, thêm 5 ml nước cất, lắc mạnh trong 1 phút, sẽ thấy bọt bền trong 10 phút. Lấy 5 g bột dược liệu, thêm 10 ml ethanol 90 % (TT), ngâm trong 3 giờ, lắc, lọc. Lấy dịch lọc làm các phản ứng sau: - Lấy 1 ml dịch lọc vào ống nghiệm nhỏ, thêm 0,5 ml anhydrid acetic (TT), thêm từ từ 0,5 ml acid sulfuric (TT), tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ phía trên có màu xanh. - Lấy 1 ml dịch lọc, thêm 1 ml (TT) fehling, sau đó đun sôi  hiện tủa đỏ gạch (Dược điển Việt Nam IV, 2009). Phương pháp Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4): Bản mỏng: Silica gel 60 F254 Merck. Dung môi khai triển: n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5, lớp trên). Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn. Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Dung môi khai triển: Chloroform - methanol - nước (65 : 35 : 10; lớp dưới). Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu và các cao phân đoạn. Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT) và (TT) acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009). Chấm sắc ký với chất chuẩn Acid oleanolic. Dung môi khai triển: Toluen – ethyl acetat (7 : 3). Mẫu thử: Cao toàn phần của dược liệu, các cao phân đoạn và chất chuẩn acid oleanolic. 43 Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 100 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường (Dược điển Việt Nam IV, 2009). 3.2.4.2. Định tính sơ bộ các nhóm chính trong thân và rễ Đinh lăng Nguyên tắc: Chiết tách nguyên liệu thành các phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với các dung môi: Ether ethylic, ethanol và nước. Thực hiện trên 20 g dược liệu, chiết phân đoạn thu được 50 ml dịch chiết ether ethylic, 50 ml dịch chiết ethanol, 50 ml dịch chiết nước. Xác định các nhóm chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng (ĐH Y Dược TPHCM, 2014). 44 Hình 3.1. Sơ đồ chuẩn bị các dịch chiết Ether ethylic Mẫu thử Dịch chiết ether Dịch chiết cồn thủy phân Dịch chiết cồn Bã Dược liệu Bã Dược liệu Dịch chiết nước thủy phân Dịch chiết nước Bã Dược liệu HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether HCl 10 % / Cách thủy Chiết lại bằng ether Nước / cách thủy Ethanol / hồi lưu 45 Hình 3.2. Sơ đồ phân tích các chất trong dịch chiết ether. Nhỏ lên giấy mỏng. Bay hơi ether Có vết trong mờ Dịch chiết ether Bốc hơi đến cắn. Hòa tan trong cồn. Làm phản ứng cyanidin Triterpenoid Chất béo Tinh dầu Carotenoid Alkaloid Flavonoid Coumarin Anthraquinon Bốc hơi trên chén sứ đến cắn Bốc hơi trên chén sứ đến cắn. Làm phản ứng Liebermann- Burchard Bốc hơi đến cắn, hòa cắn trong nước acid. Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid Bốc hơi trên chén sứ đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi trong UV Phản ứng Bortrager Bốc hơi trên chén sứ. Có mùi thơm, thêm vài giọt cồn, bốc hơi hết cồn Có màu đỏ Dung dịch kiềm có màu đỏ Tăng cường độ phát quang khi soi UV Có tủa Lớp phân cách có màu đỏ nâu – tím và vòng màu lục hay tím khuếch tán lên Cắn có mùi thơm Acid sulfuric đặc Màu lục – xanh dương đậm Thuốc thử Carr-Price Màu xanh chuyễn sang đỏ 46 Hình 3.3. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn. Có bọt khí bay lên Phản ứng với thuốc thử chung alkaloid Thêm một ít tinh thể Na2CO3 Dịch chiết cồn Bốc hơi đến cắn. Cho tác dụng với kiềm, soi trong UV365 Bốc hơi đến cắn. Phản ứng với TT Raymond- Marthoud và Xanthydrol Làm phản ứng cyanidin Đun cách thủy 10 phút với HCl 10 % Thêm vài giọt HCl 10 % và KOH 10 % Phản ứng với dung dịch FeCl3 và dung dịch gelatin muối Bốc hơi tới cắn. Hòa trong nước, lắc mạnh Phản ứng với thuốc thử Fehling Có tủa Tăng cường độ phát quang Tím với thuốc thử Raymond- Marthoud, đỏ với xanthydrol Có màu đỏ Có màu đỏ Đỏ với dung dịch acid. Xanh với dung dịch kiềm Xanh rêu-xanh đen với FeCl3 tủa bông với gelatin muối Có bọt bền trên 15 phút Có tủa đỏ gạch Alkaloid Coumarin Glycosid tim Flavonoid-¥- pyron Flav.Proantho cyanin Flav.anthocya nin Tanin Saponin Hợp chất khử Acid hữu cơ 47 Hình 3.4. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết cồn thủy phân. Dịch chiết cồn Dịch chiết ether Bốc hơi tới cắn. Làm phản ứng Liebermann- Burchard Bốc hơi tới cắn. Nhỏ dung dịch kiềm 10 % soi trong UV365 Phản ứng Borntrager Bốc hơi tới cắn, làm phản ứng với thuốc thử Raymond- Marthound Phản ứng cyanidin Có màu đỏ nâu- tím.Màu xanh lục hay màu tím khuếch tán lên từ lớp phân cách Tăng cường độ phát quang trong UV Có màu đỏ Tím với thuốc thử Raymond- Marthound Có màu đỏ Flav-¥-pyron Glycosid tím Anthraquinon Coumarin Triterpenoid 48 Hình 3.5. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trực tiếp từ dịch chiết nước. Alkaloid Glycosid tim Flavonoid -¥-pyron Flav.Proa nthocyani din Fla.Antho cyanidin Tanin Saponin Acid hữu cơ Hợp chất khử Polyuronid Làm phản ứng với TT chung alkaloid Dịch chiết nước Bốc hơi tới cắn. Làm phản ứng với TT Raymond-Marthound và xanhthydrol Bốc hơi tới cắn, hòa lại trong cồn 25 %.Làm phản ứng cyanidin Đun cách thủy 10 phút với HCl 10% Thêm vài giọt HCl 10 % và KOH 10 % Phản ứng với dung dịch FeCl3 và gelatin-muối Thêm một ít tinh thể Na2CO3 Bốc hơi tới cắn, hòa trong cồn 25 %. Pha loãng với nước, lắc mạnh Làm phản ứng với thuốc thử Fehling Pha loãng trong 5 % thể tích cồn 95 % hay aceton Có tủa Tím với Raymond- Marthound đỏ mận với xanhthydrol Có màu đỏ Có màu đỏ Đỏ trong môi trường acid, xanh trong kiềm Xanh rêu-xanh đen với FeCl3, tủa bông trắng ngà với gelatin-muối Có bọt bền trong 15 phút Có bọt khí bay lên Có tủa đỏ gạch Có tủa bông trắng 49 Hình 3.6. Sơ đồ phân tích các nhóm hợp chất trong dịch chiết nước thủy phân. 3.2.4.3. Chiết xuất và tách phân đoạn Quy trình chiết xuất phân đoạn rễ Đinh lăng Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp ngấm kiệt với dung môi ethanol 96 %. dược liệu sau khi được phơi sấy và xay nhỏ, đem đi làm ẩm bằng ethanol 96 % trong khoảng 2 - 4 giờ. Sau đó dược liệu được cho vào bình ngấm kiệt và cho dung môi chiết ethanol 96 % vào bình ngấm kiệt cách mặt dược liệu từ 2 - 3 cm. Dược liệu được ngăn lại bằng giấy lọc để không để dược liệu nổi trên bề mặt. Bình ngấm kiệt được ngấm kiệt trong vòng 12 - 24 giờ. Dịch chiết được rút với tốc độ 5 ml/phút, chiết kiệt đến khi dịch chiết không còn vết trên bản mỏng (kiểm tra sắc ký lớp mỏng với thuốc thử H2SO4/EtOH 20 %) hoặc được kiểm tra bằng cách nhỏ vài giọt dịch chiết từ bình ngấm kiệt lên lame rồi để cho khô tự nhiên, nếu không còn vết trên lame thì tức là dịch chiết đã được chiết kiệt. Gộp tất cả dịch chiết từ bình ngấm kiệt lại, trộn đều, cô thu hồi dung môi bằng máy cô quay trong điều kiện áp suất giảm ở nhiệt độ khoảng 60 oC để đuổi hết ethanol ta thu được cao toàn phần. Cao được bảo quản trong chai kín, dán nhãn cụ thể. Bốc hơi tới cắn, làm phản ứng Liebermann Triterpenoid Anthraquinon Glycosid tim Flavonoid.¥ - pyron Dịch chiết nước Dịch chiết ether Phản ứng Borntrager Bốc hơi tới cắn, làm phản ứng Raymond- Marthoud Phản ứng cyanidin Có màu đỏ nâu – tím. Màu xanh lục hay tím khuếch tán từ lên từ lớp phân cách Có màu đỏ Có màu tím Có màu đỏ 50 - Dụng cụ chiết xuất: Gồm bình ngấm kiệt hình trụ đứng, dưới đáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra; một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. - Thực hành: Bột rễ Đinh lăng và thân Đinh lăng được xay thô và được rây qua lỗ rây 3 mm. Mẫu dược liệu không nên to hơn 3 mm vì sẽ khó chiết kiệt được dược liệu, mẫu dược liệu cũng không được xay quá mịn hoặc mẫu có tính nhầy nhựa hoặc có thể trương nở sẽ cản trở dòng chảy có thể gây ra hiện tượng nghẹt (tắt) van của bình ngấm kiệt. Đáy của bình ngấm kiệt được lót bằng bông và một tấm lưới. Bột rễ và thân được đặt vào bình, lên trên lớp lưới, lên gần đầy bình. Đậy bề mặt lớp bột bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bi thủy tinh để cho dung môi không làm xáo trộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dung môi cần thiết vào bình cho đến khi dung môi phủ xấp xấp trên lớp mặt cách bề mặt dược liệu khoảng 2 - 3 cm. Có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội. Để yên sau một thời gian, thường là 12 - 24 giờ, mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọt  thu được dịch chiết từ bình ngấm kiệt  cô dịch chiết  thu được cao toàn phần của Dược liệu (ĐH Y Dược TPHCM, 2014; Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007). Phân tách cao toàn phần thành các phân đoạn bằng kỹ thuật lỏng - lỏng Cao toàn phần được hòa tan trong một lượng nước tối thiểu, sau đó lắc phần dịch này lần lượt với các dung môi sau: Diethyl ether, ethyl acetat, n-butanol. Các phân đoạn thu được đem cô dưới áp suất giảm tới cao đặc bằng máy cô quay thu hồi dung môi. 51 Hình 3.7. Sơ đồ tách chiết phân đoạn Bột dược liệu Dịch chiết cồn Cao cồn Dịch nước Dịch diethyl ether Cao diethyl ether Dịch nước Dịch ethyl acetat Cao ethyl acetat Dịch nước Dịch n-butanol Cao n-butanol Dịch nước Cao nước Bã dược liệu Chiết ngấm kiệt với EtOH 96 % Cô quay Hòa với nước Lắc với diethyl ether Lắc với ethyl acetat Cô quay Cô cách thủy Lắc với n-butanol Cô quay Cô quay 52 3.2.4.4. Thăm dò hệ sắc ký các cao phân đoạn Sắc ký lớp mỏng cao Diethyl ether Tiến hành : Sắc ký lớp mỏng trên cao diethyl ether với các hệ dung môi: S1= N-hexan - ethyl acetat (4 : 1). S2= Petroleum ether – diethyl ether (2 : 1). S3= Benzen - chloroform (10 : 1). Sắc ký lớp mỏng cao Ethyl acetat Tiến hành: Sắc ký lớp mỏng trên cao ethyl acetat với các hệ dung môi: S1= Chloroform – methanol (95 : 5). S2= N-hexan – ethyl acetat (1 : 1). S3= Petroleum ether - diethyl ether (3 : 7). Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol Tiến hành: Sắc ký lớp mỏng trên cao n-butanol với các hệ dung môi: S1= Chloroform – methanol (9 : 1). S2= Chloroform (100 %). S3= Chloroform – methanol (8 : 2). 53 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1. THỰC VẬT HỌC 4.1.1. Đặc điểm hình thái Tiến hành theo mục 3.2.2.1. thì thu được một số kết quả như sau: Hình 4.1. Toàn cây và lá Đinh lăng 54 Hình 4.2. Hình thái bên ngoài của lá Đinh lăng Cây nhỏ dạng bụi, cao từ 0,5 - 2 m. Thân nhẵn màu vàng nâu, ít phân nhánh. Lá màu xanh lục sáng, gân lá màu vàng nhạt, cuống lá màu nâu sáng. Lá kép mọc so le (bề rộng của lá 1,2 cm, bề dài của lá khoảng 3,8 cm) có bẹ, phiến lá xẻ 3 lần lông chim, mép có răng cưa không đều, chóp nhọn, lá chét và các đoạn đều có cuống, cuống lá dài phát triển to thành bẹ lá. Lá có mùi thơm nhẹ khi vò nát. Lá Đinh lăng được mô tả phù hợp với mô tả của Võ Văn Chi (2012). 55 ‘ Hình 4.3. Cụm hoa Đinh lăng 56 Cụm hoa mọc ở ngọn thành hình chùy ngắn mang nhiều tán; hoa rất dễ rụng; hoa nhỏ, màu lục nhạt hoặc trắng xám, mép uốn lượn; tràng 5 cánh trái xoan; nhị 5, chỉ nhị ngắn; quả màu nâu đen (dài khoảng 1 cm). Chiều dài của hoa chưa nở khoảng 0,6 cm, chiều ngang khoảng 0,3 cm. Cụm hoa chưa nở có màu xanh nhạt kèm nâu. Các hoa đơn lẻ cụm lại thành cụm hoa tròn đều. Các mô tả phù hợp với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003). Hình 4.4. Hình thái bên ngoài hoa Đinh lăng 57 Hình 4.5. Hình toàn cây và thân Đinh lăng Hình 4.6. Hình đường kính thân Đinh lăng Thân Đinh lăng màu vàng nhạt hay nâu rất nhạt, da sần sùi, kích thước của thân tùy thuộc vào số năm mà cây được trồng. Thân cây trồng khoảng được 3 năm có đường kính thân khoảng 1 cm, chiều dài thân cây khoảng 0,5 - 1 m. Tùy vào vị trí thân cây mà có kích thước khác nhau. Thân cây ở gần gốc cây (rễ) có bán kính lớn hơn so với các thân cây ở gần ngọn  Mô tả thân Đinh lăng phù hợp với mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003). 58 Hình 4.7. Hình hình thái bên ngoài rễ Đinh lăng 59 Hình 4.8. Hình thái bên ngoài rễ chính và rễ con Đinh lăng Rễ cong queo có màu vàng nhạt, vàng hay mà nâu nhạt, thường được thái thành các lát mỏng, mặt cắt ngang màu vàng nhạt. Mặt ngoài màu trắng xám có nhiều vết nhăn dọc, nhiều lỗ vỏ nằm ngang và vết tích của các rễ con. Rễ khoảng 3 năm tuổi có đường kính rễ chính khoảng 8 cm, các rễ con có đường kính khoảng 3 - 4 cm  Mô tả hình thái rễ Đinh lăng tại Tri Tôn - An Giang phù hợp với hình thái mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003) và DĐVN (2009). Nhận xét: - Mẫu Đinh lăng trồng tại An Giang về mặt thực vật học tương tự với miêu tả trong Dược điển Việt Nam IV. - Đường kính và chiều dài của rễ Đinh lăng thì tương đối đồng đều với đường kính và chiều dài của Đinh lăng được mô tả trong Dược điển Việt Nam IV. 4.1.2. Đặc điểm vi phẫu Theo mục 3.2.2.2. khảo sát các đặc điểm về vi phẫu của các bộ phận cây Đinh lăng. Vi phẫu lá Đinh lăng Gân giữa: Lồi ở 2 mặt. Biểu bì tế bào hình chữ nhật không đều, kích thước gần tương đương ở 2 biểu bì trên và dưới, cutin mỏng. Mô dày góc 2 - 3 lớp tế bào đa giác kích thước đều nhau. Mô mềm đạo nhiều lớp tế bào đa giác tròn hoặc gần tròn, kích thước không đều. Bó dẫn xếp hình cung với gỗ ở trên libe ở dưới. Libe xếp thành cụm nhỏ. Mạch gỗ xếp thành dãy 3 - 5 mạch xen kẽ mô mềm gỗ vách cellulose. Túi tiết ly bào kích thước khác nhau nhiều trong vùng mô mềm đạo. Phiến lá: Biểu bì tế bào hình chữ nhật, biểu bì trên kích thước lớn hơn biểu bì dưới, cutin mỏng, lỗ khí ở biểu bì dưới. Mô mềm khuyết 6 - 7 lớp tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, chứa lục lạp. Bó dẫn phụ rải rác gỗ ở trên, libe ở dưới. 60 Hình 4.9. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 10X Tế bào khí khổng dị bào Vách tế bào Cutin lồi Túi tiết Tinh thể calci oxalat Hình 4.10. Vi phẫu lá Đinh lăng vật kính 40X Tinh thể calci oxalat Biểu bì trên Mô dày Mô mềm đạo Gỗ Libe Mô mềm tủy Túi tiết Mô dày góc Biểu bì dưới 61 Vi phẫu cuống lá Vi phẫu tiết diện gần tròn một đầu bằng. Lớp biểu bì hơi dợn sóng, tế bào hình chữ nhật, kích thước lớn hơn tế bào mô dày, đều. Mô dày 2-4 lớp tế bào đa giác gần tròn, kích thước không đều. Mô mềm vỏ đạo nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước lớn hơn tế bào mô dày, không đều, xếp lộn xộn. Nhiều bó libe gỗ xếp thành vòng không liên tục, libe ở ngoài gỗ ở trong. Gỗ và libe có cấu tạo cấp 2. Libe xếp thành từng cụm nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước không đều, xếp thành dãy xuyên tâm; mô mềm gỗ tế bào đa giác xếp thành dãy. Mô mềm tủy đạo tế bào hình đa giác hoặc đa giác gần tròn, kích thước không đều, 2-4 lớp tế bào dưới gỗ vách tẩm chất gỗ mỏng. Hình 4.11. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 10X Mô dày Tinh thể calci oxalat Libe Gỗ 1 Gỗ 2 Mô mềm tủy Biểu bì Mô mềm vỏ 62 Hình 4.12. Vi phẫu cuống lá Đinh lăng vật kính 40X Nhận xét: Mô tả đặc điểm vi phẫu của cuống lá Đinh lăng có những đặc điểm về mô dày gốc, mô gỗ, mô libe, tế bào biểu bì, mô mềm tủy, tinh thể calxi oxalat, giống với những mô tả về cấu tạo các mô, vị trí sắp xếp,cấu tạo cấp 2 của ngành Ngọc lan (Trương Thị Đẹp, 2014). Vi phẫu thân Đinh lăng Vi phẫu tiết diện tròn. Các mô gồm: Biểu bì hóa mô cứng bên ngoài bần, bị bong ra ở lỗ vỏ. Bần nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, kích thước không đều, vách mỏng uốn lượn, xếp xuyên tâm. Mô dày góc nhiều lớp tế bào đa giác tròn, kích thước không đều. Mô mềm vỏ đạo nhiều lớp tế bào hình đa giác hay bầu dục kích thước không đều, một số tế bào vách uốn lượn. Libe tế bào hình đa giác, vách uốn lượn, xếp thành cụm dẹt, kích thước không đều, vách hơi uốn lượn. Gỗ liên tục, dày gấp 3-4 lần libe; mạch gỗ hình đa giác, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ tế bào đa giác, kích thước nhỏ. Tia tủy hẹp 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật có tinh bột rất nhiều. Mô mềm tủy đạo tế bào đa giác kích thước không đều. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai rải rác trong mô mềm vỏ. Đặc điểm vi phẫu cho thấy đối tượng nghiên cứu ở An Giang có những đặc điểm về vi phẫu của thân giống với những miêu tả các tế bào của Dược điển Việt Nam IV (2009) và mô tả của Phạm Hoàng Hộ (2003). Tế bào biểu bì Mô dày góc Gỗ 1 Gỗ 2 Mô mềm tủy 63 Hình 4.13. Vi phẫu thân Đinh lăng vật kính 10X Vi phẫu rễ Đinh lăng Vi phẫu tiết diện gần tròn. Các mô gồm: Bần gồm nhiều lớp tế bào hình chữ nhật, vách mỏng uốn lượn xếp xuyên tâm, bong tróc rất nhiều. Mô mềm vỏ nhiều lớp tế bào đa giác, kích thước khác nhau, vách uốn lượn. Libe gỗ: Libe tế bào đa giác vách uốn lượn dày mỏng xen kẽ nhau thành tầng. Gỗ chiếm tâm không liên tục; mạch gỗ tế bào đa giác tròn, kích thước không đều, phân bố đều trong vùng mô mềm gỗ; mô mềm gỗ tế bào đa giác, vách cellulose. Gỗ thường chiếm phần lớn diện tích của vi phẫu, rễ càng già thì phần gỗ càng nhiều. Tia tủy 1-4 dãy tế bào hình chữ nhật. Tinh thể calci oxalat hình cầu gai nhiều trong mô mềm vỏ. Bần Biểu bì Mô dày Tinh thể calci oxalat Mô mềm vỏ Libe Gỗ 1 Gỗ 2 64 Hình 4.14. Hình vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 10X Toàn thân Đinh lăng Vùng gỗ Bần Mô mềm vỏ Tia tủy Libe 1 Libe 2 Gỗ 65 Túi tiết ly bào Tia gỗ Lông hút Lớp bần Hình 4.15. Vi phẫu rễ Đinh lăng vật kính 40X Nhận xét: Những mô tả về đặc điểm của các mô, các tế bào, lông hút, kích thước túi tiết,..giống với những mô tả của Dược Điển Việt Nam IV (2009). 4.1.3. Đặc điểm bột Dược liệu Soi bột lá Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột lá Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột lá Đinh lăng màu xanh, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt, hơi hăng. Soi dưới kính hiển vi thấy: 66 - Nhiều hạt tinh bột hình chuông, hình đa giác, đường kính từ 10 - 20 µm nằm riêng lẻ, hạt tinh bột kép 2, 3, 4 hay tụ tập thành khối. - Tinh thể calcioxalat hình khối, hình sao. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. Lông đơn bào Tinh thể calci oxalat hình cầu gai Sợi kèm tinh thể Hạt tinh bột hình chuông Tinh thể calci oxalat hình khối Mạch mạng Hình 4.16. Bột lá Đinh lăng soi vi phẫu 67 Mạch điểm Khối nhựa mang màu Mảnh mô mềm Hình 4.17. Soi bột lá Đinh lăng vật kính 40X Soi bột thân Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột thân Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột thân Đinh lăng màu vàng nhạt, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt. . Hình 4.18. Bột thân Đinh lăng soi bột Soi dưới kính hiển vi thấy: - Tinh thể calcioxalat hình khối. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. - Mạch điểm. - Khối tinh bột. 68 Tinh thể calci oxalat Khối nhựa mang màu Mảnh mô mềm Mạch mạng Mạch xoắn Lông đa bào Mạch điểm Lông đơn bào Khối tinh bột Hình 4.19. Soi bột thân Đinh lăng vật kính 40X Soi bột rễ Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.2.3. trên bột rễ Đinh lăng thu được kết quả như sau: Bột rễ Đinh lăng màu vàng nhạt, tơi khô, có mùi thơm nhẹ, có vị ngọt. Hình 4.20. Bột rễ Đinh lăng 69 Mạch mạng Mạch xoắn Mạch điểm Sợi kèm tinh thể Mảnh mô mềm Hạt tinh bột Bó sợi Sợi mô cứng Mạch vạch Hình 4.21. Soi bột rễ Đinh lăng vật kính 40X Soi dưới kính hiển vi thấy: - Tinh thể calci oxalat hình khối. - Lông che chở đơn bào, đa bào. - Mảnh mô mềm. - Mảnh mạch mạng. - Mạch vạch. - Mạch xoắn. - Mạch điểm. 70 - Khối tinh bột. - Sợi kèm tinh thể. - Bó sợi. - Sợi mô cứng. Nhận xét: Các đặc điểm cấu tử soi bột Đinh lăng cho thấy giống với những mô tả của Dược Điển Việt Nam IV (2009). 4.2. THỬ TINH KHIẾT 4.2.1. Độ ẩm ❖ Độ ẩm bột dược liệu Theo mục 3.2.3.1. Kết quả cho thấy bột dược liệu Đinh lăng có độ ẩm đạt theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (≤ 13,0 %). Bảng 4.1. Độ ẩm bột dược liệu Đinh lăng Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 5,0 % 5,8 % 6,2 % 5,7 % Rễ Đinh lăng 5,2 % 6,4 % 7,9 % 6,5 % Nhận xét: Độ ẩm dược liệu đạt với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV (2009) chuyên luận Đinh lăng. Độ ẩm của thân và rễ chênh lệch không cao, nằm trong khoảng từ 5,5 - 6,5 %. ❖ Độ ẩm cao Đinh lăng Theo mục 3.2.3.1. Kết quả cho thấy cao Đinh lăng có độ ẩm đạt theo tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV phụ lục 1.1, độ ẩm cao đặc không được quá 20,0 %. Bảng 4.2. Độ ẩm cao toàn phần Đinh lăng Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 3,2 % 3,5 % 6,9 % 4,5 % Rễ Đinh lăng 0,4 % 0,5 % 0,7 % 0,5 % Nhận xét: Độ ẩm dược liệu đạt với tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam IV chuyên luận Đinh lăng. 71 4.2.2. Xác định độ tro Theo mục số 3.2.3.2. Kết quả cho thấy độ tro đo được đạt tiêu chuẩn so với tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam IV (không quá 8,0 %). Bảng 4.3. Tiêu chuẩn độ tro của Dược liệu Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 0,7 % 1,1 % 0,9 % 0,9 % Rễ Đinh lăng 0,4 % 0,7 % 0,3 % 0,5 % Nhận xét: Tro toàn phần của thân và rễ Đinh lăng nằm trong khoảng 0,5 - 0,9 %. Dược liệu khô đạt tiêu chuẩn tro toàn phần theo DDVN IV chuyên luận Đinh lăng. 4.2.3. Xác định chất chiết được trong dược liệu Bảng 4.4. Chất chiết được trong dược liệu Dược liệu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Thân Đinh lăng 17,9 % 16,8 % 18,9 % 17,9 % Rễ Đinh lăng 21,2 % 21,4 % 18, 8 % 20,5 % Nhận xét: Chất chiết được trong thân và rễ Đinh lăng nằm trong khoảng 17 - 20 %. Dược liệu khô đạt tiêu chuẩn chất chiết được theo tiêu chuẩn DĐVN IV chuyên luận cây Đinh lăng. 4.3. NGHIÊN CỨU HÓA HỌC VÀ TÁCH PHÂN ĐOẠN 4.3.1. Định tính ❖ Định tính trên bột dược liệu Phản ứng tạo bọt Nhận xét: Dịch nước Đinh lăng tạo bọt và cột bọt bền sau 10 phút. Trong khoảng thời gian từ 0 đến 2 phút bọt saponin đạt 0,7 cm, thời gian từ 2 phút đến 5 phút thì bọt saponin đạt 0,5 cm và sau 10 phút bọt đạt 0,3 cm. Sau thời gian 10 phút bọt vẫn bền  Chứng tỏ dược liệu Đinh lăng có saponin. Đạt theo mô tả của DĐVN IV (2009). 72 Phản ứng tạo màu Nhận xét: Khi cho từ từ acid sulfuric (TT) vào thành ống nghiệm chứa hỗn hợp dịch lọc và anhydrid acetic (TT) thì tại lớp phân cách giữa hai dung dịch xuất hiện vòng màu đỏ  Đạt theo tiêu chuẩn của DĐVN IV chuyên luận Đinh lăng. Và khi cho thuốc thử Fehling vào dịch lọc đun sôi thì xuất hiện tủa đỏ gạch  Đạt theo mô tả của DĐVN IV. Khi cho thuốc thử Lugol vào bột dược liệu thì không xuất hiện màu xanh đen  Đạt theo mô tả của DĐVN IV. Nhận xét: Tất cả các phản ứng định tính trên bột dược liệu theo tiêu chuẩn của DĐVN IV chuyên luận Đinh lăng đều đạt  Chứng tỏ Đinh lăng được trồng tại An Giang đạt theo tiêu chuẩn DĐVN IV. ❖ Định tính trên cao Đinh lăng Tiến hành theo mục 3.2.4.4. thu được kết quả như sau: Phản ứng tạo bọt: Nhận xét: Dịch lọc A tạo bọt và cột bọt bền sau 10 phút. Trong khoảng thời gian từ 0 đến 5 phút bọt saponin đạt 1cm, thời gian từ 5 phút đến 10 phút thì bọt saponin đạt 0,8 cm. Sau thời gian 10 phút bọt vẫn bền  Chứng tỏ dược liệu Đinh lăng có saponin. Đạt theo mô tả của DĐVN IV (2009). Phản ứng tạo màu: Nhận xét: Khi cho từ từ acid sulfuric (TT) vào thành ống nghiệm chứa hỗn hợp dịch chiết chloroform và anhydrid acetic (TT) thì có xuất hiện vòng màu hồng đến tím đậm giữa 2 lớp dung dịch. Đạt theo mô tả của bản bổ sung DĐVN IV. Định tính bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4): Bản mỏng: Silica gel 60 F254. Dung môi khai triển: n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5) Mẫu thử: Các cao toàn phần và phân đoạn Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. 73 Soi đèn UV 254 nm Soi đèn UV 365 nm Sau khi nhúng thuốc thử Acid sulfuric 10% Hình 4.22. Định tính cao rễ bằng hệ n-butanol - acid acetic - nước (4 : 1 : 5) Nhận xét: Các vết tách rõ nhưng do trong rễ Đinh lăng có nhiều đường nên còn kéo vệt ở phía dưới bản mỏng. Sau khi nhúng thuốc thử các vết có màu tím nhạt hơi hồng  chứng tỏ các cao phân đoạn có chứa hàm lượng saponin. Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH - H2O (65 : 35 : 10; lớp dưới) Mẫu thử: cao toàn phần và các cao phân đoạn. 74 Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT) và (TT) acid sulfuric 10% trong ethanol, sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. UV 254 nm UV 365 nm Vanilin sulfuric (TT) Acid sulfuric 10%/ cồn Hình 4.24. Định tính saponin bằng sắc kí lớp mỏng Nhận xét: Sau khi nhúng thuốc thử các vết hiện màu tím nhạt. Chứng tỏ trong cao toàn phần, cao các phân đoạn có saponin, terpenoid hiện diện. Nhưng do trong rễ Đinh lăng có nhiều đường nên còn kéo vệt ở phía dưới bản mỏng. Chấm sắc ký với chất chuẩn Acid oleanolic. Dung môi khai triển: Toluen - ethyl acetat (7 : 3). 75 Mẫu thử: cáo toàn phần, cao phân đoạn và acid chuẩn oleanolic Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử acid sulfuric 10 % trong ethanol (TT), sấy bản mỏng ở 100 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. Soi UV 254 nm Soi UV 365 nm Sau khi nhúng (TT) Acid sulfuric 10% Hình 4.23. Định tính cao rễ bằng hệ Toluen - ethyl acetat (7 : 3) Nhận xét: Sau khi chấm SKLM với acid aloeanolic chuẩn thì phát hiện trong cao tổng rễ, phân đoạn Et2O, phân đoạn EtOAc đều có hiện diện của acid chuẩn, có khoảng Rf giống nhau. Nhưng do hàm lượng ít hơn so với chất chuẩn nên các vết không được rõ nét so với chất chuẩn. 76 Định tính saponin thân Đinh lăng bằng sắc kí lớp mỏng Dung môi khai triển: CHCl3 - MeOH - H2O (65 : 35 : 10; lớp dưới) Phát hiện: UV 254 nm; UV 365 nm; phun thuốc thử vanilin sulfuric (TT), sấy bản mỏng ở 105 oC cho tới khi hiện rõ vết. Quan sát dưới ánh sáng thường. UV 245 nm UV 365 nm vanilin sulfuric Hình 4.25. Định tính saponin thân Đinh lăng bằng SKLM Nhận xét: Thân Đinh lăng có chứa saponin như rễ Đinh lăng. Các vết của thân tương tự như rễ Đinh lăng  Chứng tỏ thành phần saponin gần giống nhau. 4.3.2. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng Xác định các nhóm hợp chất sau: 1. Chất béo 6. Coumarin 11. Triterpenoid thủy phân 2. Carotenoid 7. Anthraquion 12. Saponin 3. Tinh dầu 8. Flavonoid 13. Acid hữu cơ 4. Triterpenoid tự do 9. Glycosid tim 14. Chất khử 5. Alkaloid 10. Tanin 15. Hợp chất polyuronid 77 Bảng 4.5. Định tính sơ bộ các nhóm chất chính trong thân và rễ Đinh lăng Nhóm hợp chất Thuốc thử Kết quả định tính chung Đinh lăng Thân Rễ Chất béo Nhỏ dd lên giấy + + Carotenoid Carr-price - - H2SO4 - - Tinh dầu Bốc hơi tới cắn + ++ Triterpenoid tự do Liebermann- Burchard ++ ++ Alkaloid Thuốc thử chung Alkaloid + ++ Coumarin Phát quang trong kiềm ++ ++ Antraglycosid KOH 10 % + + Flavonoid Mg/ HClđđ + + Glycosid tim TT vòng lacton + + TT đường 2- desoxy + + Anthocyanosid HCl/ KOH + + Pro- anthocyanidin HCl/ to + + Polyphenol DD FeCl3 + - Tanin DD gelatin muối + + Saponin TT Liebermann ++ +++ 78 Lắc với dd nước ++++ ++++ Acid hữu cơ Na2CO3 ++ ++ Chất khử TT Fehling ++ ++ Hợp chất Polyuronic Pha loãng với cồn 90 % ++ + Chú thích: (-): Âm tính. (±): Không rõ. (+): Có ít. (++): Có. (+++): Có nhiều. (++++): Có rất nhiều. Nhận xét: Sau khi tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất thì thu được các nhóm hợp chất như: Saponin, flavonoid, alkaloid, tanin, coumarin, chất béo, tinh dầu, các acid hữu cơ, glycosid tim... Trong đó hợp chất saponin chiếm hàm lượng nhiều nhất. So sánh thành phần hóa học giữa thân và rễ Đinh lăng cho thấy thành phần hóa học giữa thân và rễ là như nhau. Song song đó, chúng cũng có sự khác biệt nhưng không đáng kể. Thành phần hóa học trong khóa luận này khảo sát giống với khảo sát của Dược Điển Việt Nam IV (2009) và trong các khảo sát trước đó. Như vậy thành phần hóa học của cây Đinh lăng trồng tại Tri Tôn - An Giang phù hợp với các nghiên cứu trước đó. 4.3.3. Chiết xuất Tiến hành theo mục 3.2.4.3. thu được kết quả như sau: Rễ Đinh lăng (9,3 kg) Dịch chiết cồn (137 670 ml) Cao cồn (1,75 kg) Ngấm kiệt với cồn 96 % Cô quay 79 Hình 4.26. Sơ đồ chiết xuất rễ Đinh lăng Từ 9,3 kg dược liệu rễ Đinh lăng ban đầu bằng phương pháp ngấm kiệt với cồn 96 % thu được 137 670 lít dịch chiết (tổng lượng dung môi cồn 96 % là 178 275 ml), cô dịch chiết dưới áp suất giảm thu được 1750 g cao chiết toàn phần (độ ẩm 0,5 %), quy về cao khô được 1741 g (hiệu suất chiết được là 18,7 %). 4.3.4. Tách phân đoạn bằng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng Tiến hành theo mục 3.2.4.3. 1,75 kg cao toàn phần được hòa với lượng nước tối thiểu và được lắc lần lượt với các dung môi: Et2O, EtOAc, n-BuOH. Các phân đoạn thu được cô dưới áp suất giảm thu được kết quả như sau: Bảng 4.6. Khối lượng và độ ẩm các cao phân đoạn trong cao rễ Phân đoạn Khối lượng (g) Hiệu suất chiết (%) Độ ẩm cao (%) Et2O 300 14,9 13 EtOAc 30 1,7 1,7 n-BuOH 405 22,8 1,65 Nước 800 42,0 8,1 80 Hình 4.27. Sơ đồ tách phân đoạn 4.4. THĂM DÒ HỆ DUNG MÔI 4.4.1. Sắc ký lớp mỏng cao diethyl ether Theo mục số 3.2.4.4. cao diethyl ether được tiến hành SKLM để chọn ra hệ sắc ký hợp lý cho việc tiến hành lên cột phân lập các hợp chất. Cao Et2O sau khi được tham khảo một số tài liệu thì được tiến hành dò trên 3 hệ dung môi: S1: N-hexan - ethyl acetat (4 : 1) S2: Petroleum ether – diethyl ether ( 2 : 1) S3: Benzen - chloroform (10 : 1) Cao rễ TP (1,75 kg) Dịch nước Cao Et2O (300 g) Cao EtOAc (30 g) Dịch nước Cao n-BuOH (405 g) Dịch nước Cao nước (800 g) Cô quay Cô quay Cô quay Cô quay Et2O 79 lít EtOAc 52 lít n-BuOH 82 lít 81 UV 254 nm UV 365 nm Nhúng thuốc thử Hình 4.28. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S1 UV 254 nm UV 365 nm (TT) acid sulfuric 10%/cồn Hình 4.29. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S2 82 UV 254 nm UV 365 nm (TT) acid sulfuric 10%/cồn Hình 4.30. Sắc kí lớp mỏng cao diethyl ether hệ S3 Nhận xét: Qua 3 hệ dung môi khảo sát thì chọn được hệ dung môi S1= n-hexan - ethyl acetat (4 : 1) để tiến hành sắc ký cột để phân lập các chất vì khi soi UV 254 nm và UV 365 nm thì bản mỏng hiện 1 vết nằm trong khoảng Rf (0,25 - 0,35), sau khi nhúng thuốc thử các vết tách đều, không kéo vệt, vết gọn,.. Không chọn hệ S2 và S3 vì bản mỏng kéo vệt, vết bị kéo, các vết nằm gần nhau, không tách rõ  khó tách được các chất. 4.4.2. Sắc ký lớp mỏng cao ethyl acetat Theo mục số 3.2.4.4. tiến hành SKLM trên cao ethyl acetat để lựa chọn ra hệ sắc ký thích hợp cho việc tiến hành phân lập hợp chất từ cao. Cao EtOAc sau khi được tham khảo một số tài liệu thì được tiến hành thăm dò trên 3 hệ dung môi: S1: Chloroform - methanol (95 : 5) S2: N-hexan - ethyl acetat (1 : 1) S3: Petroleum ether - diethyl ether (3 : 7) 83 UV 254 nm UV 365 nm (TT) acid sulfuric 10%/cồn Hình 4.31. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S1 UV 254 nm UV 365 nm (TT) acid sulfuric 10%/cồn Hình 4.32. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S2 84 UV 254 nm UV 365 nm (TT) acid sulfuric 10%/cồn Hình 4.33. Sắc kí lớp mỏng cao ethyl acetat hệ S3 Nhận xét: Qua 3 hệ dung môi khảo sát thì chọn được hệ dung môi S2 để tiến hành sắc ký cột để phân lập các chất vì khi soi UV 254 nm và UV 365 nm thì bản mỏng hiện 1 vết nằm trong khoảng Rf thích hợp (0,25 - 0,35) và khi nhúng thuốc thử các vết tách đều, không kéo vệt, vết gọn,.. Không chọn hệ S1 và S3 vì bản mỏng kéo vệt, vết bị kéo, các vết nằm gần nhau, không tách rõ  khó tách được các chất. 4.4.3. Sắc ký lớp mỏng cao n-butanol Theo mục số thì 3.2.4.4. tiến hành SKLM trên cao n-butanol để chọn ra hệ sắc ký thích hợp cho việc tiến hành phân lập hợp chất từ cao. Cao n-butanol sau khi được tham khảo một số tài liệu thì được tiến hành dò trên 3 hệ dung môi: S1: Chloroform - methanol (9 : 1) S2: Clorofrom 100 % S3: Chloroform - methanol (8 : 2) 85 UV 254 nm UV 365 nm Vanilin sulfuric (TT) Hình 4.34. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S1 UV 254 nm UV 365 nm Vanilin sulfuric (TT) Hình 4.35. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S2 86 UV 254 nm UV 365 nm Vanilin sulfuric (TT) Hình 4.36. Sắc kí lớp mỏng cao n-butanol hệ S3 Nhận xét: Qua 3 hệ dung môi khảo sát thì chon hệ dung môi S1= Chloroform - methanol (9 : 1) để tiếp tục tiến hành phân lập các hợp chất. Chọn hệ dung môi S1vì vết gọn, không kéo vệt, vết gọn. Hệ S2 và S3 vết bị kéo vệt, Rf còn thấp. 87 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. KẾT LUẬN Sau 6 tháng tiến hành thực hiện đề tài, khóa luận thu được kết quả như sau: 5.1.1. Nghiên cứu về đặc điểm vi học Đặc điểm về hình thái lá Đinh lăng cao từ 0,5 - 2 m, bề rộng lá 1,2 cm, lá xẻ 3 lần kép lông chim mọc so le, mép răng cưa và có mùi thơm. Cụm hoa mọc thành từng cụm có chùy ngắn, hoa màu lục nhạt, nhị 5, chỉ nhị ngắn, quả màu nâu đen dài khoảng 1 cm. Thân Đinh lăng có màu vàng nhạt, da sần sùi. Rễ Đinh lăng có màu vàng nhạt, đường kính rễ 3 năm khoảng 8 cm giống với những mô tả của các nghiên cứu trước đó. Đặc điểm về vi phẫu: Quan sát dưới kính hiển vi và được ghi nhận lại hình ảnh trực tiếp qua thị kính thấy được các các mô: Biểu bì, bần, mô dày, cutin lồi, bó gỗ, libe, tinh thể calci oxalat, giống với những mô tả của các nghiên cứu trước đó. Đặc điểm về soi bột: Sau khi tiến hành soi bột dược liệu Đinh lăng, quan sát dưới kính hiển vi thì thấy được các cấu tử như: Tinh thể calcioxalat hình khối, lông che chở đơn bào, đa bào, mảnh mô mềm, mảnh mạch mạng, mạch vạch, mạch xoắn, mạch điểm, khối tinh bột, sợi kèm tinh thể, bó sợi. Những cấu tử tìm thấy được giống với Dược điển Việt Nam IV chuyên luận Đinh lăng. 5.1.2. Thử tinh khiết Độ ẩm rễ Đinh lăng đạt 6,5 %, thân Đinh lăng 5,6 %, cao rễ Đinh lăng 4,5 %, cao thân Đinh lăng 0,5 %. Độ tro rễ Đinh lăng 0,5 %, thân Đinh lăng 0,9 %. Chất chiết được trong thân Đinh lăng la 17,9 %, rễ Đinh lăng 20,5 % Hiệu suất chiết của cao toàn phần là 18,7 %, cao diethyl ether 14,9 %, cao ethyl acetat 1,7 %, cao n-butanol 22,8 % và cao nước cuối cùng là 42,0 %. 5.1.3. Nghiên cứu về hóa học - Sau khi tiến hành định tính sơ bộ các nhóm chất thì thu được các nhóm hợp chất như: Saponin, flavonoid, alkaloid, tanin, coumarin, chất béo, tinh dầu, các acid hữu cơ, glycosid tim... Trong đó hợp chất saponin chiếm hàm lượng nhiều nhất. So sánh thành phần hóa học giữa thân và rễ Đinh lăng cho thấy thành phần hóa học giữa thân và rễ là như nhau. Thành phần hóa học trong khóa luận này khảo sát giống với khảo sát của Dược Điển Việt Nam IV (2009) và trong các khảo sát trước đó. Như 88 vậy thành phần hóa học của cây Đinh lăng trồng tại Tri Tôn - An Giang giống với các nghiên cứu trước đó. - Chiết ngấm kiệt 9,3 kg rễ Đinh lăng, tách phân đoạn thu được các cao phân đoạn sau: Cao diethyl ether 300 g, cao ethyl acetat 30 g, cao n-butanol 405 g và 800 g cao nước cuối cùng. - Từ những cao tách phân đoạn thì đã tìm ra được các hệ dung môi thích hợp để tiến hành Sắc ký cột phân lập các hợp chất tự nhiên: • Cao diethyl ether dùng hệ n-hexan - ethyl acetat (4 : 1). • Cao ethyl acetat dùng hệ n-hexan - ethyl acetat (1 : 1). • Cao n-butanol dùng hệ Chloroform - methanol (9 : 1). 5.2. ĐỀ XUẤT Do điều kiện thời gian còn hạn chế khóa luận này chỉ mới đạt được một phần kết quả khiêm tốn. Sau khi kết thúc khóa luận, em xin đưa ra một số đề xuất như sau: - Khảo sát thành phần hóa học trong các phân đoạn và đồng thời phân lập các hợp chất từ những cao: • Diethyl ether. • Ethyl acetat. • N-butanol. - Thử một số tác dụng dược lý trên các cao phân đoạn: • Bảo vệ gan. • Hoạt tính oxy hóa. • Hoạt huyết dưỡng não. - Qua kết quả nghiên cứu thấy được thành phần hóa học của thân Đinh lăng tương tự với rễ. Song song đó, các nghiên cứu trước đây chủ yếu được thực hiện trên lá và rễ. Vì vậy cần có thêm nhiều nghiên cứu về thân Đinh lăng hơn nữa để thân có thể được sử dụng làm thuốc như lá và rễ. 89 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Takhtajan Armen et al. (2009). Flowering plants. Springer. Pp. 478. [2] Bộ môn dược liệu (2014). Phương pháp nghiên cứu dược liệu. NXB ĐH Y Dược TP Hồ Chí Minh. [3] Bộ Y Tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. NXB Y học Hà Nội. Tr.882 – 884. [4] Bộ Y Tế (2015). Dược điển Việt Nam IV Bổ Sung. NXB Y học Hà Nội. Tr.1154 – 1156. [5] Chaboud A., Rougny A., Proliac A., Raynaud J., Cabalion P. (1995). A new triterpenoid saponin from Polyscias fruticosa, Fr. Pharmazie. 50(5). Pp. 371. [6] Chaboud A., Rougny A., Proliac A., Raynaud J., Cabalion P. (1996), A oleanolic saponin from Polyscias fruticosa Harms var yellow leaves. Pharmazie. 51(8). Pp. 611 - 612. [7] Đỗ Huy Bích và cs (2006). Cây thuốc và Động Vật làm thuốc ở Việt Nam. NXB Khoa Học và Kĩ Thuật. Tập 1. Tr. 793- 786. [8] Đỗ Tất Lợi (2004). Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam. NXB Hồng Đức. Tr 828 - 829. [9] Hồ Lương Nhật Vinh (2014). Nghiên cứu thành phần hóa học. tác dụng ức chế enzym α-amylase và α-glucosidase của phân đoạn dịch chiết lá cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L.) Harms). Luận văn thạc sĩ dược học ngành Dược học cổ truyền. Khoa Dược. Trường Đại học Dược Hà Nội. [10] Seidemann J. (2004). Word spice plants. Springer. Pp. 303. [11] Lutomski J et al. (1992). Polyacetylenes in the Araliaceae family. Herba Polonica. Vol 38(1). Pp. 3 - 11. [12] Ngô Ứng Long và cs (1993). Nghiên cứu dược lý cây Đinh lăng trên chức năng của hệ thần kinh ngoại biên. Tạp chí Dược học. Số 5. Tr. 10 - 12. [13] Nguyễn Thới Nhâm, Nguyễn Thị Thu Hương, Lương Kim Bích (1990). Tác dụng dược lí của cao toàn phần chiết xuất từ rễ và lá Đinh lăng Polyscias fruticosa L. Harms. Araliaceae. Kỷ yếu công trình nghiên cứu khoa học. Viện Dược liệu. [14] Nguyễn Khắc Viện (1989). Góp phần nghiên cứu tác dụng dược lí của cao rễ Đinh lăng trên một số chức năng của cơ thể. Luận án PTS. Ngành Dược lý. Học viện Quân Y. [15] Nguyễn Kim Phi Phụng (2007). Phương pháp cô lập các hợp chất tự nhiên. NXB ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh. 90 [16] Nguyễn Thị Lan (2010). Xác định thành phần hóa học tinh dầu cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L). Harms) ở Nghệ An và Thanh Hóa. Luận văn tốt nghiệp Đại học chuyên ngành Hóa hữu cơ. Khoa Hóa Học. Trường Đại học Vinh. [17] Nguyễn Thị Luyến và cs (2012). Hợp chất flavonoid glycoside có tác dụng ức chế alpha-amylase phân lập từ lá Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Số 6. Tập 17. [18] Nguyễn Thị Nguyệt và cs (1992). Một số kết quản ghiên cứu về saponin trong Đinh lăng. Tạp chí dược học. Số3. Tr.15 - 16. [19] Nguyễn Thị Nguyệt, Võ Xuân Minh, Nguyễn văn Bàn (1992). Một số kết quả nghiên cứu về saponin trong Đinh lăng. Tạp chí Dược học. Số 3. Tr. 15 - 16. [20] Nguyễn Thị Thu Hương (2009). Tác dụng chống trầm cảm của cao chiết cồn từ lá Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Tập 14. Số 3/2009. [21] Nguyễn Thị Thu Hương và cs (2003).Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của cây Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Số 5. Tập 8. Tr. 142 - 146. [22] Nguyễn Thị Thu Hương và cs (2004).Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá của cây Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Số 3. Tr. 85 - 89. [23] Nguyễn Thị Thu Hương và Lương Kim Bích (2001). Nghiên cứu tác dụng chống trầm cảm và stress của Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Tập 6. Tr. 84 - 86. [24] Nguyễn Thượng Dong và cs (2007). Sâm Việt Nam và một số cây thuốc họ nhân sâm. NXB Khoa Học và Kĩ Thuật. [25] Phạm Hoàng Hộ (2003). Cây cỏ Việt Nam. NXB Trẻ. Tập 2. Tr. 516 - 518. [26] Phạm Thị Nguyệt Hằng và Nguyễn Minh Khởi (2017). Tác dụng cải thiện trí nhớ trên mô hình gây thiếu máu não cục bộ tạm thời và bước đầu nghiên cứu cơ chế tác dụng của cao cồn rễ Đinh lăng. Tạp chí Dược liệu. Tập 22. Số 2/2017. Tr. 113 - 119. [27] Quách Tuấn Vinh (2005). 60 cây mẫu trong vườn thuốc. NXB Y học. Tr. 76 - 77. [28] Quách Tuấn Vinh (2006). Dùng cây thuốc. NXB Quân Đội. Tr. 116 - 117. [29] Tran Thi Hong Hanh et al. (2016). α-Amylase and α-glucosidase inhibitory saponins from Polyscias fruticosa leaves. Journal of Chemistry. Vol 2016. [30] Trần Yên (1994). Tác dụng tăng cường trí nhớ của cao rễ Đinh Lăng trên động vật sau scopolamin và sau shock điện. Tạp chí thông tin Y học cổ truyền. Số 8. Tr. 34 - 42. [31] Trương Thị Đẹp (2014). Thực vật dược. NXB giáo dục. Tr. 263 - 264. [32] Vo Duy Huan et al. (1998). Oleanane saponin from Polyscias fruticosa (L.) Harms. Phytochemistry. Vol 47(3). Pp. 451-457. [33] Võ Văn Chi (2012). Từ điển cây thuốc Việt Nam. NXB Y học. Tr. 937 - 938. 91 [34] Võ Xuân Minh (1991). Góp phần tìm hiểu về thành phần hóa học và dạng bào chế của cây Đinh lăng. Tạp chí Dược học. Tập 3. Tr. 19-21. [35] Võ Xuân Minh (1992). Nghiên cứu về saponin Đinh lăng và dạng bào chế từ Đinh lăng. Luận án PTS KH Y dược. Đại học Dược Hà Nội. TRANG WEB [36] Tác dụng chữa bệnh của Đinh lăng. chuthapdo.org.vn/tac-dung-chua-benh- khong-ngo-cua-cay-dinh-lang-8735.html ngày truy cập 04/6/2017, vào lúc 11:38 pm. [37] Trà Đinh lăng TRC. lasen.com.vn/dinh-lang-tra--- trc?gclid=CjwKEAjw387JBRDPtJePvOej8kASJADkV9TL7wnQ46yWUYWU_Bg yhvfYddWlARIVqrFVoYnoELN1qRoCzGjw_wcB, ngày truy cập 05/6/2017, vào lúc 1:02 am. [38] Trà Đinh lăng. quagac.com/san-pham/tra-dinh-lang-614.html, ngày truy cập 05/6/2017, vào lúc1:10 am [39] Hoạt huyết dưỡng não HBN. hadico.vn/san-pham/Than-kinh-tim-mach/Hoat- huyet-duong-nao-HBN.100316110146.html, ngày truy cập 05/6/2017, vào lúc 1:26 am [40] Gối Đinh lăng. goianhviet.com/cach-lam-goi-la-dinh-lang-hay-con-goi-la-goi- dinh-lang-nc2, ngày truy cập 14/6/2017, truy cập vào 2:23 am. [41] Y Dược Việt Nam. ydvn.net/contents/view/307.cay-dinh-lang-polyscias- fruticosa-l-harms.html, ngày truy cập 16/6/2017. Truy cập vào 8:54 am.