Sản xuất phôi bò bằng thụ tinh ống nghiệm theo phương pháp Imai

BÀI BÁO CÁO SEMINAR Chủ đề: SẢN XUẤT PHÔI BÒ BẰNG THỤ TINH ỐNG NGHIỆM THEO PHƯƠNG PHÁP IMAI Đặt vấn đề. Ngày nay Nhật Bản là một trong những cường quốc về công nghệ sinh học (CNSH) trên thế giới. Trong chăn nuôi, CNSH được áp dụng rộng rãi trong di truyền giống, sản xuất thức ăn và xử lý môi trường. Đối với chăn nuôi bò sữa, bò thịt, Cấy truyền phôi ở Nhật đã trở thành phổ biến. Trung bình hàng năm số bò được cấy phôi khoảng 55-60 nghìn con và số bê ra đời bằng công nghệ này quãng 16.000-18.000 con. Mỗi lần gây siêu bài noãn trên bò lấy được 5-6 phôi đủ tiêu chuẩn cấy. Ở Nhật, tỷ lệ có chửa do cấy phôi tươi đạt 51%, cấy phôi đông lạnh đạt 45%. Hiện nay, ở Nhật thụ tinh ống nghiệm (TTON) trên bò là kỹ thuật đang được quan tâm nhiều ở tất cảc các cơ sở nghiên cứu do yêu cầu của các địa phương để sản xuất (SX) bò đen cho thịt (Japanese Black - JB) chất lượng cao. Giống JB của Nhật là giống bò truyền thống được xem như “ Quốc bảo” và cấm xuất ra khỏi Nhật. Giữa các địa phương của Nhật, kỹ thuật nuôi và nhân giống JB cũng là bí quyết không phổ biến. Đối với bò thịt JB, cả bê đực bê cái đều có giá trị cao trên thị trường, vì thế nhiều trại đã cấy phôi bò JB lên nền bò sữa để SX bò đen có giá trị kinh tế cao hơn bò sữa. Cấy phôi TTON bò JB đạt tỷ lệ có chửa 34%. Thu noãn bào bằng kỹ thuật siêu âm để TTON là kỹ thuật mới đã và đang được các nhà chọn giống quan tâm. Ưu điểm của kỹ thuật này là kiểm soát được bò cho phôi và chất lượng phôi giống SX ra, mặt khác thu được nhiều phôi hơn so với gây siêu bài noãn, thu noãn bằng phương pháp siêu âm để TTON trung bình đạt 5-10 phôi nang trên một lần thu noãn. CNSH của Nhật Bản trong đó có công nghệ phôi bò luôn được quan tâm và coi trọng, hàng năm công nghệ phôi bò luôn được cải tiến và đổi mới để đáp ứng với nhu cầu của thị trường thịt sữa của nước này.  Nội dung. Lịch sử phát triển của cấy truyền phôi. Cấy truyền phôi được coi như kỹ thuật thụ tinh nhân tạo đối với động vật cái. Thật vậy, cấy truyền phôi cho phép khai thác tối đa khả năng sinh sản của con cái ưu tú và nâng cao tiến bộ di truyền của con mẹ trong đàn giống như thụ tinh nhân tạo đã cho phép khai thác tối đa sức sản xuất và tính trạng tốt của con đực. Tuy kỹ thuật cấy truyền phôi được hình thành sau kỹ thuật thụ tinh nhân tạo, nhưng nó cũng đóng góp đáng kể vào công tác truyền giống nhân tạo. Vào năm 1890, trong một thông báo ở Hội Hoàng gia Anh, lần đầu tiên Heape đã công bố sự thành công việc cấy truyền trứng thỏ đã được thụ tinh ở giai đoạn 2-4 tế bào. Các trứng này sau khi được cấy truyền đã phát triển bình thường và không bị ảnh hưởng bởi các tính trạng di truyền của con cái nhận trứng. Vào năm 1897, chính tác giả của thí nghiệm trên đã lặp lại thí nghiệm này và đã thu được các kết quả tương tự. Vào thời kỳ này, thông tin về cấy truyền phôi không mang lại một ý nghĩa gì đặc biệt và bị lãng quên trong một thời gian dài. Đến năm 1929, ở Cambride, Pincus, Hammond và Walton đã xem xét lại vấn đề này, sau đó Nicolas đã tiến hành nghiên cứu cấy truyền phôi trên chuột cái và đã nhấn mạnh sự cần thiết để đảm bảo kết quả cấy truyền là sự đồng pha về chu kỳ động dục giữa con cái cho và con cái nhận phôi. Vấn đề đồng pha về chu kỳ động dục đã được xem xét một cách chuyên biệt trong nghiên cứu của Chang. Những thử nghiệm đầu tiên về cấy truyền phôi trong chăn nuôi có từ năm 1932. Warwick và Berry đã tiến hành cấy truyền phôi trên dê. Tuy nhiên, cần phải chờ đợi đến cuối đại chiến thế giới lần 2 (1940- 1945 ), vấn đề cấy truyền phôi mới được nhắc lại và được nghiên cứu một cách hệ thống cả ở động vật trong phòng thí nghiệm và cả trong chăn nuôi. Yếu tố quan trọng kích thích nghiên cứu này là sự tranh luận về khả năng gây siêu bài ngàn dưới sự kích thích của các hormon sinh dục: FSH và PMSG. Những kiến thức đầu tiên về cấy truyền phôi bò đã thu được ở Wisconsin vào năm 1951. Trên cơ sở đó, dưới sự hướng dẫn và xúc tiến của Hammond, rồi đến Rowson tổ chức sinh sản động vật Cambride có ý tưởng thực sự nghiên cứu về cấy truyền phôi trong chăn nuôi. Ngày nay, cấy truyền phôi đã đạt được một cách hiệu quả không chỉ ở các động vật trong phòng thí nghiệm mà còn ở nhiều loài động vật khác: bò, cừu, dê, ngựa, lợn, chó... Và trong những thập niên gần đây, kỹ thuật này đã trở thành lĩnh vực thương mại ở nhiều nước. Chỉ riêng ở Mỹ, năm 1978 đã có 10.000 con bê được sinh ra bằng kỹ thuật cấy truyền phôi. Phương pháp cấy truyền phôi cũng được áp dụng trong nhân y. Trứng được được thụ tinh ngoài cơ thể, sau đó được cấy vào cơ quan sinh dục của một phụ nữ vừa kết thúc quá trình động dục, phôi được cấy vào hoàn chỉnh quá trình phát triển của nó trên cơ thể của một phụ nữ khác. Ngày nay, người ta khẳng định một cách chắc chắn là cấy truyền phôi không những chỉ mang lại lợi ích to lớn trên phương diện khoa học mà còn có tầm quan trọng đặc biệt trong thực tiễn. Về mặt lý thuyết, cấy truyền phôi ở con cái cũng giống như thụ tinh nhân tạo ở con đực,cho phép khai thác tối đa các đặc tính di truyền tốt ở cả con bố và con mẹ. Tuy nhiên, người ta nhận thấy rằng việc triển khai kỹ thuật cấy truyền phôi còn có nhiều khó khăn, hạn chế. Về phương diện kỹ thuật, kỹ thuật cấy truyền phôi cho phép phân tích một cách sâu sắc hơn những vấn đề về sinh lý. Sinh hóa, di truyền sinh sản. Các vi xử lý phôi cho phép đánh giá tốt hơn những hiện tượng thành thục và thụ tinh của trứng, phân biệt sớm giới tính cũng như làm thuận lợi cho sự sinh đẻ giới tính theo ý muốn bằng hệ thống sinh sản vô tính và sinh đôi cùng trứng. Trên phương diện chăn nuôi, cấy truyền phôi góp phần sử dụng tối đa những con cái giống ưu tú cũng như là sự thụ tinh nhân tạo đã cho phép khai thác và sử dụng tối đa tinh dịch của của con đực giống tốt. Số tế bào sinh dục cái là rất nhiều nhưng ít được sử dụng. Thật vậy, chỉ tính ở bò, một buồng trứng chứa khoảng 75.000 nguyên bào trứng trong khi đó số lượng trung bình các bê được sinh ra trong thời kỳ sinh sản của bò ít khi vượt quá 4-5 con. Cấy truyền phôi là một biện pháp hiệu quả để phổ biến những tiến bộ di truyền của con mẹ trong quần thể, làm tăng cường mức độ chọn lọc của các con mẹ với con bố do làm tăng số lượng đời con sinh ra của một gia súc mẹ. Những tiến bộ kỹ thuật hiện hữu và đặc biệt sự sử dụng những phôi đông lạnh là cách đơn giản để nhập khẩu những giống ngoại vào một đất nước. Kỹ thuật này cho phép làm giảm khó khăn về sự thích ứng của động vật sống khi vận chuyển trong những vùng 'sinh thái khác nhau. Nó cũng có thể được sử dụng cho sản xuất những con bê thịt trong đàn bò sữa, đồng thời cho phép sử dụng trứng của những con cái chất lượng tốt nhưng bị loại thải vì những lý do khác nhau. Những triển vọng khác nhau này phải được xem xét một cách thực tế, nó sẽ chỉ được khẳng định dần dần khi kỹ thuật (chủ yếu là kỹ thuật làm đông lạnh) được thiết lập một cách chắc chắn và giá trị sản phẩm cao hơn chi phí sản xuất. Phương pháp thực hiện. Mỗi năm khoảng 12-15 nghìn bò được cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và hàng nghìn bê sinh ra bằng kỹ thuật này. SX phôi bằng thụ tinh ống nghiệm ở Nhật chủ yếu trên bò thịt JB và bò sữa cao sản HF (Holstein Friesian). Khác với kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm trước đây, điều thú vị của kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm mới này là không mất thời gian loại bỏ hết tế bào vành phóng xạ (cumulus cells), rút ngắn thời gian phôi ở bên ngoài tủ nuôi cấy, do đó tăng tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn phôi dâu và phôi nang. Imai và các cộng sự (NLBC of Japan) đã nghiên cứu và khẳng định rằng các tế bào cumulus  đã thúc đẩy phôi bò phát triển  ở giai đoạn 4-8 tế bào vượt qua được giai đoạn ức chế phát triển. Hơn nữa, phương pháp hoạt hoá tinh trùng mới này đã chọn lọc được những tinh trùng có hoạt lực tốt nên đã nâng cao tỷ lệ thụ tinh và chất lượng phôi tạo ra. Các bước tiến hành thụ tinh ống nghiệm theo phương pháp Imai. 2.1.   Thu tế bào trứng bò. Tế bào trứng bò được lấy từ buồng trứng ở lò mổ và lấy trên bò sống bằng phương pháp nội soi và siêu âm (để SX phôi giống và các nghiên cứu cơ bản khác). Buồng trứng lấy từ lò mổ, được bảo quản bằng nước muối sinh lý có bổ sung kháng sinh, đưa về phòng thí nghiệm trước 8 tiếng đồng hồ. Thu tế bào trứng tại phòng thí nghiệm bằng xơ-ranh 5 ml và kim 18-20G. Hút dịch nang trứng và tế bào trứng cho vào môi trường D-PBS 3% CS có bổ sung kháng sinh đã được làm ấm ở 37°C. Kỹ thuật thu tế bào trứng bò bằng nội soi và siêu âm cũng rất phổ biến ở Nhật nhằm sản xuất phôi giống chất lượng cao bằng thụ tinh ống nghiệm. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật viên phải có tay nghề cao, kinh nghiệm thực tế và phải được đào tạo. Hình 1 : Thu tế bào trứng Phân loại tế bào trứng và nuôi chín. Những trứng có chất lượng tốt được rửa 4 lần trong môi trường nuôi chín, sau đó chuyển vào giọt môi trường nuôi cấy tế bào: TCM-199 5%CS (20 tế bào trứng trong một giọt 100ml). Sau đó cho vào tủ nuôi cấy 5% CO2, nhiệt độ 38.5°C, độ ẩm 98% sau 20 giờ để nuôi trứng chín. Hính 2 : Phân loại trứng Hình 3 : Nuôi trứng in vitro 2.3.   Chuẩn bị môi trường. Các môi trường cần thiết (môi trường rửa trứng sau khi nuôi chín, môi trường hoạt hoá tinh trùng, môi trường thụ tinh) phải được chuẩn bị trước: Chuẩn bị hai đĩa môi trường rửa tế bào trứng sau khi nuôi chín như sau: cho vào mỗi đĩa petri (Ø 35) 2,5 ml môi trường BO có bổ sung BSA. Chuẩn bị một đĩa thụ tinh: lấy 4 giọt, mỗi giọt 5ml  dung dịch  rửa trứng (BO + BSA) cho vào đĩa petri (Ø 35). Để cả 3 đĩa trên trong tủ nuôi cấy trước 2 giờ thụ tinh.    2.4.  Hoạt hoá tinh trùng. Tinh trùng được hoạt hoá theo phương pháp 90% percoll.     Ly tâm lần 1: lấy 3 ml môi trường 90% percoll cho vào ống ly tâm, giải đông 1-2 cọng rạ tinh đông lạnh trong nước ấm 37°C, cho tinh trùng vào ống ly tâm đã có môi trường 90% percoll, ly tâm với tốc độ 2100v/phút trong 10 phút.     Ly tâm lần 2: Lấy phần tinh trùng lắng phía dưới, cho tiếp 6ml môi trường rửa tinh trùng (BO+ Hypotaurine+ Heparin) ly tâm lần 2 (1800v/phút, trong 5 phút).     Pha loãng: Lấy phần tinh trùng lắng phía dưới cho tiếp 1ml dung dịch rửa tinh trùng vào ống ly tâm trộn đều và đo thể tích dung dịch tinh trùng sau khi hoạt hoá (V1). Lấy 50ml tinh trùng cho vào 4,95ml nước muối 3% trộn đều trên voltex.    Điều chỉnh mật độ thụ tinh: nhỏ giọt dung dịch tinh trùng trên buồng đếm, đếm số lượng tinh trùng, lấy trung bình cộng của 2 lần đếm và tính số lượng tinh trùng cần thiết để thụ tinh. Cách tính như sau: tính số ml môi trường rửa tinh trùng cần thiết để pha loãng tinh trùng. Pha loãng lần 1: Lấy số tinh trùng trung bình cộng của 2 lần đếm/12,5 ´ V1-V1=A ml.  Lấy A ml môi trường rửa tinh trùng cho vào ống tube tinh trùng trộn đều ta được thể tích là Aml + V1 = Bml với nồng độ tinh trùng là 12,5´10.000.000/ml. Pha loãng lần 2: Thêm một lượng môi trường (ml) pha loãng tinh trùng bằng thể tích (ml) sau khi pha loãng lần 1 để điều chỉnh tổng số tinh trùng đạt 6,25´10.000.000/ml. Sau khi tinh trùng được hoạt hoá và điều chỉnh đến nồng độ thích hợp để thụ tinh, lấy 95ml dung dịch tinh trùng cho vào giọt thụ tinh. 2.5. Thụ tinh. Tế bào trứng sau khi nuôi 20 giờ lấy ra khỏi tủ nuôi cấy, rửa 3-4 lần trong môi trường rửa (BO + BSA). Sau đó để tiến hành thụ tinh, chuyển tế bào trứng đã rửa vào giọt thụ tinh, cho vào tủ nuôi cấy 5% CO2 , nhiệt độ 38,5ºC, độ ẩm 98%, quá trình thụ tinh được tiến hành trong quãng 5-6 giờ. Hình 4 : Tế bào trứng thụ tinh in vitro 2.6.  Chuẩn bị môi trường rửa hợp tử và môi trường nuôi phôi. Chuẩn bị hai đĩa rửa, mỗi đĩa 2,5ml môi trường CR1aa 5% CS, phủ 2 ml dầu khoáng vi lượng.  Một đĩa nuôi phôi: lấy 4 giọt mỗi giọt 100 ml CR1aa 5% CS cho vào đĩa petri (Ø 35), phủ 4,5 ml dầu khoáng vi lượng. Cho cả 3 đĩa trên vào tủ ấm CO2 khoảng 2 giờ trước khi chuyển phôi vào nuôi. Trứng sau khi thụ tinh, được chuyển vào đĩa rửa, rửa ở mỗi đĩa 3 lần, sau đó chuyển vào giọt môi trường nuôi phôi, cho vào tủ nuôi cấy CO2 nuôi tiếp và theo dõi sự phát triển của phôi. Hình 5 : Tạo giọt nuôi cấy Ngày 0-2: phôi phát triển 1 tế bào, ngày 1-3: phôi 2 tế bào, ngày 2-3: phôi 4 tế bào, ngày 3-5: phôi 8 tế bào, ngày 5-6: phôi dâu, ngày 6-7: phôi dâu chặt, ngày 6-8: phôi nang sớm, ngày 8-9: phôi nang trương nở hoặc đang thoát màng, ngày 9-11: phôi nang thoát màng. Hình 6 : Các giai đoạn phát triển của phôi bò 2.7. Đánh giá phân loại phôi thụ tinh ống nghiệm. Vào ngày thứ 6-8 kể từ khi thụ tinh, phôi sẽ phát triển đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang và phôi nang mở rộng (dãn nở). Căn cứ vào giai đoạn phát triển, hình thái và cấu trúc tế bào phôi để đánh giá và phân loại chất lượng phôi theo quy định. Những phôi tốt đảm bảo chất lượng đem cấy cho bò nhận hoặc đông lạnh. Tóm tắt quá trình tiến hành thụ tinh ống nghiệm: Ngày -1 Lấy buồng trứng từ lò mổ Bảo quản và vận chuyển trong nước muối sinh lý 25°C trong vòng 8 giờ Lấy TB trứng từ buồng trứng. Kiểm tra, chọn lọc những TB trứng đạt tiêu chuẩn  để nuôi chín  m- PBS + 3% CS Nuôi chín  TB trứng trong ống nghiệm TCM-199 + 5% CS, trong 20 giờ ở 38,5°C, 2% CO2, độ ẩm 98% Ngày 0 Hoạt hoá tinh trùng - Mt rửa tinh trùng (BO +  Hypotaurine+ Heparin ) -  Mt pha loãng tinh trùng (BO + 20mg/ml BSA) -  Mt rửa trứng (BO + 10mg/ml BSA)                Thụ tinh -  Nồng độ tinh trùng (6 ´10.000.000/ml) ở 38,5°C, 2% CO2, độ ẩm 98% trong 5-6 giờ               Nuôi phôi CR1aa +5% CS  (TCM- 199 + 5 % CS) 7-9 ngày ở 38.5°C, 2% CO2, độ ẩm 98% Ngày 2 Quan sát sự phát triển của phôi Quan sát bước đầu phát triển của phôi  và sự loại bỏ dần tế bào cumulus Ngày 3-6 Quan sát hình thái học của phôi Cứ sau 24 giờ gõ đĩa một lần Ngày 7-9 Kiểm tra sự phát triển của phôi nang Kiểm tra sự phát triển của phôi nang trong suốt các ngày từ thứ 7 đến thứ 9.  Chọn phôi đạt tiêu chuẩn, cấy cho bò nhận hoặc đem đông lạnh. Kết luận và đề nghị. Kết luận. Công nghệ cấy truyền phôi (CTP) được xem là biện pháp đặc biệt trong việc sớm tạo ra những con giống tốt làm hạt nhân của đàn bò sữa, bò thịt. Công nghệ CTP giúp nâng cao khả năng chống bệnh cho bò, nhân nhanh các giống tốt, quý hiếm ra thực tế sản xuất, trên cơ sở khai thác triệt để tiềm năng di truyền của những cá thể cái cao sản; nâng cao khả năng sinh sản, tăng năng suất sữa, thịt, làm ngắn thời gian tuyển chọn giống, vì một con bò cho phôi có thể tạo ra nhiều bê chất lượng cao, dành kinh phí đầu tư chuồng trại, thức ăn và nhân công. Đề nghị. Cần nghiên cứu và tìm tòi nhiều phương pháp có tính ứng dụng cao và không ngừng cải tiến kĩ thuật để nâng cao chất lượng, củng như sản lượng phôi nhằm rút ngắn thời gian để phục vụ cho nhu cầu cấy truyền. Tài liệu tham khảo. Enhancing tropical beef cattle genetics, reproduction and animal breeding skills, Queensland, ausralia, 2001.