Sử dụng kháng thể đầy đủ kháng HER-2 đối với sự biểu hiện vượt mức của HER-2 trong tế bào ung thư trung gian qua liệu pháp gen sử dụng Adenovirus

Nhóm 10:Sử dụng kháng thể đầy đủ kháng HER-2 đối với sự biểu hiện vượt mức của HER-2 trong tế bào ung thư trung gian qua liệu pháp gen sử dụng Adenovirus. Thành viên nhóm: Phan Thị Phương Thanh: 0615114 Phan Thị Hồng Thanh: 0615113 Phan Thanh Hùng: 0515073 Vũ Đình Kỳ: 0615056 Lê Duy Lung: 0615239 Nguyễn Thị Thìn: 0615135 Nguyễn Đình Phú: 0615288 Lâm Hồng Tú: 0615343 Giáo Viên hướng dẩn: Ths.Trần Hoàng Minh Tú Cô Bùi Hoàng Bảo Ngọc Nội Dung Bài Báo Giới thiệu Sơ lược về HER-2 và Adenovirus Thí nghiệm Kết quả thí nghiệm Thảo luận Mục Đích Sử dụng Adenovirus la gián tiếp để đưa gene kháng ung thư buồng trứng So sánh liệu pháp dùng Adenovirus với một số liệu pháp khác HER-2 Là Gi? HER-2 là thụ thể trên màng tế bào. Thuộc nhóm thụ thể của yếu tố tăng trưởng. Thụ thể của yếu tố tăng trưởng thượng bì – gọi là EGFR. Bản chất là một glycoprotein xuyên màng. Gen quy định thụ thể này nằm trên nhánh q của nhiễm sắc thể số 17. Thúc đẩy tăng sinh, sinh mạch tế bào. Tế Bào Thượng Bì Và Thụ Thể HER-2 Thụ Thể HER-2 trên màng tể bào Mô hình tế bào và thụ thể HER-2 Adenovirus tất cả các Adenovirus đều không có vỏ, đường kính 60-90nm. genome của adenovirus là phân tử DNA sợi kép không phân đoạn Bộ gene của adenovirus có thể mang gene mục tiêu >30kb Không gắn vào bộ gene tế bào vật chủ nhưg có thể biểu hiện gene Adenovirus gây ra bệnh cảm cúm Mô hình sâm nhập của Adenovirus vào tế bào chủ Xuyên màng Tạo vỏ bọc bằng vật chất tế bào vật chủ Gắn lên thụ thể màng nhân Bơm vật liệu di truyền Nhóm 10: shptyd Xây dựng Ad5-Tab Adenovirus tái tổ hợp. Nhóm 10: shptyd Fig. 1. Full-length trastuzumab antibody expression cassette using IRES. Schematic illustration of adenoviral vector pDC315 with expression cassette inserteda t E1 region. Antibody light andheavy chains, with separate signal peptide, are linkedb y IRES. VL, variable region of light chain; CL, constant region of light chain;VH, variable region of heavy chain; CH, constant region of heavy chain; SP, signal peptide. Nguyên liệu Trastuzumab thương mại: một loại kháng thể đơn dòng đã được thương mại hóa. Vector pDC315, pBGHE3. Protein tái tổ hợp Erb-2/Fc Chimera. Các loại kháng thể. Các dòng tế bào HEK293: dòng tế bào thận phôi người. SKOV-3: tế bào ung thư buồng trứng người (HER-2+). BT549: tế bào bình thường (HER-2-). L-02: tế bào gan người bình thường. Phương pháp và kết quả Nội dung thí nghiệm Xem xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-Tab. Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab. Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể. Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab. Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể chuột. Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng thể. Xét sự biểu hiện của kháng thể tạo bởi Ad5-TabTế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab Tế bào L-02 cho vào môi trường 10%huyết thanh thai bò. Ủ trong lò ủ ẩm (t=24h, t0=370C, CO2=5%). Chuyển tế bào vào môi trường không huyết thanh. Tế bào được làm nhiễm với Ad5-Tab có nồng độ cao. Tế bào L-02 có chứa vector Ad5-Tab Sau 2h, chuyển tế bào vào môi trường 5% huyết thanh thai bò. Thu hoạch các tế bào nổi (vào ngày thứ 3 và thứ 7). ELISA Kháng thể đơn dòng mAb anti-human IgG1 chuột làm bất động kháng thể tạo ra do Ad5-Tab. mAb tiếp hợp với horseradish-peroxidase. Đọc bằng Microplate reader với bước sóng 450nm. Sơ đồ Kháng thể tạo ra từ Ad5-Tab (trong tế bào L-02). mAb horseradish-peroxidase Nhóm 10: shptyd Fig. 2. In vitro antibody expression in Ad5-TAb -infected L-02 cells.The L-02 cells were infectedw ith Ad5-TAb at a multiplicity of infection of 10. Cell culture supernatants were harvestedat different time points after infection for protein analysis. A, ELISA analysis of supernatants of Ad-TAb - infected L-02 cells. Kết Quả Kiểm tra kích thước kháng thể tạo bởi Ad5-Tab Western Blot Các tế bào: dịch nổi, huyết thanh chuột, trastuzumab thương mại điện di trên SDS-PAGE 12%. Ở điều kiện khử và không. Chuyển protein trên gel polyacrylamid lên màng nitrocellulose. Dò với goat anti-human IgG1 (H+L) polyclonal (gắn với horseradish peroxidase). Sơ đồ Điện di SDS-PAGE 12% Khử Không khử Màng nitrocelluse dò Các bản sao kháng thể dê kháng IgG1 người. Kháng thể thỏ kháng IgG dê Horseradish peroxidase Huyết thanh chuột, Trastuzumab, Ad5-Tab X-RAY chemiluminescent Nhóm 10: shptyd Fig. 3. Columns, mean; bars, SD.Western blot analysis of commercial trastuzumab and supernatants from Ad5-TAb – or Ad5-LacZ - infected L-02 cells under nonreducing (B) and reducing (C) conditions Kiểm tra sự kết hợp đặc hiệu của kháng thể. Rửa SKOV-3 và BT549 bằng PBS ba lần. Cố định bằng paraformaldehid 4% (5 phút). ủ với dịch nổi hoặc trastuzumab (40C, 2h). Kháng thể thỏ kháng IgG người tiếp hợp với FITC. Quan sát tế bào được đánh dấu dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nhóm 10: shptyd Nhóm 10: shptyd Fig. 4. Specific binding of anti-HER-2 antibody expressed byAd5-TAb.Two cell lines SKOV-3 and BT549 are chosen for this binding specificity determination. Cell culture supernatant from Ad5-TAb - infectedL-02 cells was used, and commercial trastuzumab was usedas control. Immunofluorescent microscopy analysis for the specific binding of anti- HER-2 antibody to HER-2. A to B, BT549 incubatedw ith supernatant and trastuzumab, respectively. C to D, SKOV-3 incubatedw ith trastuzumab and culture supernatant, respectively. Kiểm tra ái lực của Ad5-Tab Cho 100 µl HER-2 vào các đĩa ELISA. Ủ 15h ở 40C, cố định bằng sữa khô không béo 5%. Trộn với protein HER-2 trong albumin huyết thanh bò 1%. Ủ trong 1h ở 200C. Chuyển vào đĩa ELISA. Cho Horseradish peroxidase vào. 3,3’-diaminobenzidine nhận màu của peroxidase. Đọc bằng Microplate reader ở bước sóng 450nm. A0/(A0-A)= 1+ (KD/a0). Nhóm 10: shptyd Fig. 5. Affinity constant of anti-HER-2 antibody. Indirect ELISA was applied for estimation of the antibody binding capacity.The proper working concentration of anti-HER-2 antibody were shown to be in the range of 1 ×10-5 to 5.0 ×10-5 mg/ mL, andt hen 2.5 × 10-5 mg/mL was appliedf or the determination of affinity constant. Straight slope is the affinity constant of the antibody. Xét sự biểu hiện của kháng thể trong cơ thể chuột. Tiêm tế bào SKOV-3 vào chuột. Chuột đã được tiêm Ad5-Tab thông qua đường tĩnh mạch. 10 con chuột được lấy máu ở các thời điểm khác nhau. Nhóm 10: shptyd Fig. 6. Anti-HER-2 antibody expression level in the serum of SKOV-3-inoculated nudemice. Ad5-TAbwas given through the tail vein at the dose of 2 × 109 plaque-forming units per mouse at early stage.Mice were bleda t days 3, 7, 10, 14, 21, 28, and3 5, and then serum antibody concentrations were determined by indirect ELISA on HER2-coated 96-well plates and detected with horseradish peroxidase - conjugated mouse anti-human IgGmonoclonal antibody. Points, mean (ng/mL); bars, SD.Ten mice were analyzeda t each time point. Khả năng ức chế sự phát triển khối u của kháng thể. Thí nghiệm 1: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 ba ngày. Thí nghiệm 2: điều trị sau khi tiêm SKOV-3 16 ngày Có 2 nhóm: Nhóm 1 được tiêm Ad5-Tab Nhóm 2 (đối chứng)được tiêm Ad5-LacZ. So sánh thể tích khối u chữa trị bời 2 phương pháp và giữa 2 thí nghiệm. Nhóm 10: shptyd Fig. 7 Antitumor activity of Ad5-TAb -generated anti-HER-2 antibody via gene transfer in tumor-burdened nude mice. A, early stage with smaller size (˜20mm3). B, late stage with large size (˜200 mm3). Nhóm 10: shptyd Tổng kết Trastuzumab Là một kháng thể đơn dòng có tác dụng chữa bệnh ung thư đã được kiểm chúng và công nhận bởi FDA. Phương pháp này sử dụng còn hạn chế do chi phí cao và khó thực hiện. Nhóm 10: shptyd Ad5-Tab Đơn giản và có hiệu quả hơn phương pháp protein kháng thể truyền thống. Mở ra hướng mới để điều trị ung thư và các bệnh khác. Tuy nhiên đây chỉ mới là thử nghiệm ban đầu, cần phải nghiên cứu thêm. Hiệu quả chữa trị tốt nhất ở giai đoạn còn sớm. Nhóm 10: shptyd Nhóm 10: shptyd