Sự thay đổi hàm lượng flavonoid trong lá của cây chùm ngây (Moringa oleifera Lam.) theo các giai đoạn phát triển

- 20 - Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ¾ Vật liệu: - Cây Chùm ngây trồng tại Đồng Nai của công ty TNHH Hanh Thông và cây Chùm ngây trồng tại Gò Vấp, TPHCM được dùng làm nguyên liệu để xác định tên khoa học và nghiên cứu. - Lá của cây được dùng để khảo sát hàm lượng flavonoid ở 3 giai đoạn phát triển như sau (Ảnh 2.1): Lá của cây ở giai đoạn đang tăng trưởng 3 tháng tuổi (Cây ở giai đoạn tăng trưởng) thu vào tháng 3 năm 2008. Lá của cây ở giai đoạn đang ra hoa được 1 tháng (Cây ở giai đoạn ra hoa) thu vào tháng 9 năm 2008. Lá của cây ở giai đoạn có trái non đang tăng trưởng (Cây ở giai đoạn có trái non) thu vào tháng 11 năm 2008. - Hạt của cây 1 năm tuổi được dùng làm nguyên liệu nuôi cấy in-vitro tạo sẹo (Ảnh 2.2). Cây 3 tháng tuổi Cây đang ra hoa Cây có trái non Ảnh 2.1. Cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non. - 21 - Ảnh 2.2. Hạt cây Chùm ngây. ¾ Vật liệu dùng trong các sinh trắc nghiệm: Diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) dùng làm sinh trắc nghiệm đo hoạt tính auxin và hoạt tính của acid abcisic. Tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.) dùng làm sinh trắc nghiệm đo hoạt tính cytokinin. Trụ hạ diệp cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) dùng làm sinh trắc nghiệm đo hoạt tính giberelin. ¾ Dụng cụ - Thiết bị, Hoá chất: Bếp cách thủy (Memmert, Đức), Bể siêu âm Sonorex, bản silica gel F254. Các dung môi hóa chất (Trung quốc, Merck). Thuốc thử son phèn + lục iod dùng cho khảo sát thực vật học. Quercetin chuẩn (98%) do Viện Kiểm nghiệm TPHCM cung cấp. ¾ Môi trường nuôi cấy: MS (Murashige và Skoog, 1962) được bổ sung đường saccharose 30 g/l, pH = 5,8 ± 0,1. Khử trùng bằng autoclave ở 1atm, 1210C, trong 18 phút. Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: GA3, BA, NAA… 1cm - 22 - 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp nghiên cứu chung được tóm tắt theo sơ đồ sau (hình 2.1) Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tổng quát chung. Cây Chùm ngây trưởng thành (Ngoài tự nhiên) Hạt Cây 3 tháng tuổi - Khảo sát đặc tính sinh lý của lá - Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần Lá Cây đang tăng trưởng trái non Cây đang ra hoa Mô sẹo Lá - Quan sát đặc điểm hình thái - Sự tăng trưởng của mô sẹo - Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần Cây con in-vitro - Khảo sát thực vật học => Xác định tên khoa học - Khảo sát CĐQH của lá - Sơ bộ thành phần hoá thực vật lá - Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần của từng lá - 23 - 2.2.1. Khảo sát thực vật học 2.2.1.1 Thu mẫu, mô tả đặc điểm hình thái Thu các bộ phận: thân, rễ, lá, hoa, quả, hạt của cây Chùm ngây. Dùng kính lúp cầm tay và kính hiển vi quang học để quan sát các bộ phận. Mô tả đặc điểm và chụp hình minh họa các bộ phận: thân, lá, hoa và quả. Đối chiếu tài liệu mô tả về cây Chùm ngây [1], [4], [5]. 2.2.1.2. Mô tả đặc điểm giải phẫu Cắt ngang thân, rễ, lá Chùm ngây, nhuộm bằng phương pháp nhuộm kép với son phèn và lục iod. Mỗi cơ quan quan sát 5 – 10 vi phẫu trong dung dịch nước hay glycerin 50% bằng kính hiển vi quang học. Mô tả đặc điểm cấu tạo giải phẫu, chụp hình minh hoạ. 2.2.1.3. Xác định tên khoa học Tên khoa học của loài khảo sát được xác định bằng cách dựa vào đặc điểm về hình thái, cấu tạo giải phẫu thực vật quan sát được, Sử dụng khoá định chi Moringa trong họ Moringaceae (họ Chùm ngây), khoá định loài trong chi Moringa của Flore of China (volume 8), Nguyễn Tiến Bân (1997) và so sánh với mô tả, hình vẽ hay hình chụp trong các tài liệu của Phạm Hoàng Hộ (2000), Võ Văn Chi (2004) và hình chụp cây Chùm ngây trong các tài liệu điện tử [5], [47], [49], [54]. 2.2.2. Khảo sát vài đặc tính sinh lý của lá cây Chùm ngây 2.2.2.1. Khảo sát cường độ quang hợp ¾ Xác định lá chức năng: Lá cây Chùm ngây ngoài tự nhiên ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi) trồng ở Đồng Nai được dùng để đo cường độ quang hợp. Thời gian đo bắt đầu vào lúc 9 giờ và kết thúc lúc 11 giờ. Cường độ ánh sáng đo bằng máy “TM 201 Taiwan”, tại thời điểm đo cường độ ánh sáng dao động trong khoảng 60.000-90.000 lux , nhiệt độ 28-340C. - 24 - Sử dụng máy “Leaf porometer Model SC-1” để đo cường độ quang hợp của lá ngoài tự nhiên (Ảnh 2.3). Tiến hành đo cường độ quang hợp của lá từ đầu ngọn cành (lá số 1) trở xuống, mỗi lá đo ở 4 vị trí (Ảnh 2.4), lặp lại 3 lần. CĐQH được xác định bằng hàm lượng µmol CO2 hấp thụ trên m2 lá trong 1 giây (µmol CO2/m2/s). Lá chức năng được xác định là lá có cường độ quang hợp cao nhất. Ảnh 2.3. Máy “Leaf porometer SC-1” đo cường độ quang hợp của lá ngoài tự nhiên Ảnh 2.4. Vị trí lá đo quang hợp ¾ Khảo sát cường độ quang hợp Lá chức năng (lá số 4) của cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non được tiến hành đo cường độ quang hợp. Phương pháp và vị trí lá đo CĐQH 1 3 2 4 - 25 - như mô tả ở mục 2.2.2.1. So sánh cường độ quang hợp của lá chức năng trong 3 giai đoạn phát triển. 2.2.2.2. Khảo sát trọng lượng khô/trọng lượng tươi Lá chét của lá chức năng cây Chùm ngây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non được tiến hành thu hái ở thời tiết tốt (trời nắng), vào khoảng 8 giờ –11 giờ. Xác định trọng lượng khô/trọng lượng tươi bằng cách cân lá trước và sau khi sấy ở nhiệt độ 70-800C cho đến khi trọng lượng không đổi. Thực hiện trên 3 mẫu lấy giá trị trung bình. Trọng lượng khô/trọng lượng tươi được tính theo công thức sau: KL lá sau khi sấy khô TLK/TLT = KL lá tươi ban đầu 2.2.2.3. Khảo sát hoạt tính chất ĐHSTTV nội sinh [13] ¾ Ly trích hợp chất: Vật liệu ly trích hợp chất điều hoà sinh trưởng thực vật là lá chức năng (lá số 4) của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non. Ly trích hợp chất điều hòa sinh trưởng thực vật theo Yokota et al., 1980; Bùi Trang Việt , 1992. Qui trình ly trích được trình bày tóm tắt theo sơ đồ sau (hình 2.2): - 26 - Hình 2.2. Sơ đồ ly trích và phân đoạn các chất điều hoà sinh trưởng thực vật ¾ Sắc ký: Dùng phương pháp sắc ký trên bản mỏng Silica gel F254 (Merck) để phân tách các chất điều hòa tăng trưởng thực vật. Dung môi di chuyển là cloroform: methanol: acid acetic (tỷ lệ 80:15:5 theo thể tích). Vị trí auxin, acid abcisic và cytokinin trên bản pH 2,5 Trích ether (3 lần) Dịch trích methanol 80% Cô cạn Thêm 10ml nước pH 7 Trích n-Butanol bão hoà (3 lần) Cô cạn Cô cạn Dịch tan trong nước Dịch trích ether Sắc ký Dịch nước Dịch n-Butanol Sắc ký Sinh trắc nghiệm cytokinin Sinh trắc nghiệm auxi, acid abcisic và giberelin Lá (1 g) Nghiền trong methanol 80% (24giờ) - 27 - sắc ký được phát hiện trực tiếp dưới tia UV 254 nm so với các chất chuẩn là acid indol acetic (AIA), acid abcisic (AAB) và zeatin. Với giberelin, bản sắc ký được phun acid sulfuric: ethanol (tỷ lệ 5: 95 theo thể tích), sấy ở 1100C trong 10 phút trước khi quan sát dưới tia UV 254 nm so với chuẩn là acid giberelic GA3 (Yokota et al., 1980). Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật được đo ở các vị trí tương ứng với vị trí của chất chuẩn. ¾ Sinh trắc nghiệm: Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dựa trên các sinh trắc nghiệm (Nguyễn Thị Ngọc Lang, 1970 trong Bùi Trang Việt, 1989). Hoạt tính auxin và acid abcisic: được đo bằng sinh trắc nghiệm khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.). Hạt lúa được gieo trên bông ẩm trong tối ở nhiệt độ 300C±20C, sau 5 ngày tách lấy diệp tiêu trong phòng tối. Khúc cắt diệp tiêu trong các sinh trắc nghiệm được để trong tối, nhiệt độ 300C±20C, đo chiều dài sai biệt sau 24 giờ. Hoạt tính auxin trong mẫu tỷ lệ thuận với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn AIA 1 mg/l và nước cất. Hoạt tính acid abcisic tỷ lệ nghịch với sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu so với dung dịch chuẩn AAB 1 mg/l và nước cất. Hoạt tính giberelin: được đo bằng sinh trắc nghiệm cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.). Gieo hạt xà lách trên bông ẩm, ở nhiệt độ 300C±20C, sau 1 ngày chọn các hột có rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ. Cây mầm xà lách trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 lux±500 lux, nhiệt độ 300C±20C, đo chiều dài sai biệt sau 72 giờ. Hoạt tính giberelin tỷ lệ thuận với chiều dài sai biệt trụ hạ diệp cây mầm so với chuẩn là nước cất và GA3 tinh khiết 10 mg/l. Hoạt tính cytokinin: được đo dựa trên sự tăng trọng lượng của tử diệp dưa chuột (Cucumis sativus L.). Hạt dưa chuột được gieo trong tối trên bông ẩm, nhiệt độ 300C ± 20C, khi rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ hạt thu các tử diệp. Tử diệp dưa chuột trong các sinh trắc nghiệm được để dưới ánh sáng liên tục 2500 lux ± 500 lux, nhiệt độ 300C ± 20C, đo trọng lượng sai biệt sau 48 giờ. Hoạt tính cytokinin tỷ lệ thuận với sai biệt trọng lượng của tử diệp dưa chuột so với chuẩn là nước cất và zeatin 1 mg/l. - 28 - 2.2.3. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật trong lá cây Chùm ngây [8], [11] Lá cây Chùm ngây ngoài tự nhiên (3 tháng tuổi) trồng ở Đồng Nai được tiến hành thu hái, phơi khô. Tán thành bột. Lấy 30 g bột, chiết phân đoạn theo độ phân cực tăng dần với các dung môi: ether ethylic, ethanol và nước. Xác định các nhóm hoạt chất lần lượt trong từng dịch chiết bằng các phản ứng hóa học đặc trưng theo bảng 2.1. Bảng 2.1. Phân tích sơ bộ thành phần hoá thực vật bằng các phản ứng hóa học. Nhóm hợp chất Thuốc thử Cách thực hiện Phản ứng dương tính Chất béo Nhỏ dd lên giấy Vết trong mờ Carotenoid Carr-Price Xanh→ đỏ Tinh dầu Bốc hơi tới cắn Có mùi thơm Triterpenoid Liebermann-Burchard Đỏ nâu-tím, lớp trên có màu xanh lục Alkaloid Thuốc thử chung alkaloid Kết tủa Coumarin Phát quang trong kiềm Phát quang mạnh hơn Anthraglycosid KOH 10% Dd kiềm có màu hồng tới đỏ Flavonoid Mg/HCl đđ Dd có màu hồng tới đỏ Anthocyanosid HCl Đỏ Tanin Dd FeCl3 Xanh rêu hay xanh đen Saponin Thuốc thử Liebermann Có vòng tím nâu Acid hữu cơ Na2CO3 Sủi bọt Chất khử Thuốc thử Fehling Tủa đỏ gạch - 29 - 2.2.4. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá cây Chùm ngây 2.2.4.1. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần theo vị trí lá Cây Chùm ngây ngoài tự nhiên ở giai đoạn tăng trưởng (3 tháng tuổi) trồng ở Đồng Nai thu hái riêng lá từ ngọn cành (lá số 1) trở xuống đến lá số 7, phơi khô, tán bột. Bột lá của từng vị trí được đem đi xác định các chỉ tiêu sau: ¾ Xác định độ ẩm ¾ Định tính flavonoid bằng SKLM ¾ Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần 2.2.4.2. Khảo sát hàm lượng flavonoid toàn phần trong lá của cây ở 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa và có trái non Thu hái lá 1 đến lá 5 của cây trong 3 giai đoạn tăng trưởng, ra hoa, có trái non được tiến hành thu hái chung, phơi khô, tán bột. Bột lá được đem đi xác định các chỉ tiêu sau: ¾ Xác định độ ẩm ¾ Định tính flavonoid bằng SKLM ¾ Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần . 2.2.5. Nuôi cấy tạo mô sẹo 2.2.5.1. Thử nghiệm khử trùng mẫu ™ Thao tác ngoài tủ cấy: Tách bỏ lớp vỏ màng cứng bên ngoài, rửa hạt trong dung dịch xà phòng loãng trong 5 phút, tiếp tục rửa hạt dưới vòi nước trong vòng 10 phút. ™ Thao tác trong tủ cấy: Rửa hạt bằng cồn 700 trong 30 giây, rửa lại bằng nước cất vô trùng. Lắc hạt trong dung dịch Javel thương phẩm theo tỷ lệ Javel : nước cất là 1:2 hoặc 1:3 và thời - 30 - gian 10 phút, 15 phút. Rửa lại mẫu 3 lần bằng nước cất vô trùng. Sau đó ngâm hạt trong nước cất vô trùng 2 giờ (thời gian đủ để hạt trương nước). Chỉ tiêu theo dõi: Theo dõi kết quả tỷ lệ (%) hạt nảy mầm không bị nhiễm trùng sau 2-3 tuần nuôi cấy . Số hạt vô trùng nảy mầm Tỷ lệ hạt nảy mầm (%) = Tổng số hạt đã gieo 2.2.5.2. Tạo cây con in-vitro Khảo sát sự tạo cây con in-vitro từ hạt trong 4 loại môi trường sau: MS0, MS + GA3 0,2 mg/l, MS + GA3 0,5 mg/l, MS + GA3 1 mg/l. Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian hạt ra rễ, tạo thành cây con. Quan sát hình thái cây con, đo chiều cao và đếm số lá theo thời gian (tuần). 2.2.5.3. Khảo sát khả năng tạo sẹo Mẫu cấy: lá chét cây con in-vitro 3 tuần tuổi, dùng dao phẫu thuật tạo từ 2-3 vết thương trên phiến lá chét, cấy chạm vào bề mặt môi trường MS có bổ sung saccharose 30 g/l và các chất điều hoà sinh trưởng thực vật khác nhau để khảo sát sự tạo mô sẹo. Khảo sát khả năng tạo sẹo trên 4 môi trường gồm: MS + NAA 0,5 mg/l; MS + NAA 1 mg/l; MS + NAA 0,5 mg/l + BA 0,2 mg/l; MS + NAA 1,0 mg/l + BA 0,2 mg/l. Chỉ tiêu theo dõi: Thời gian tạo sẹo. Hình thái, màu sắc sẹo. 2.2.5.4. Khảo sát đặc điểm hình thái cấu trúc mô sẹo theo thời gian Mô sẹo sau 2 tuần tuổi, được cấy sang môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l, quan sát mô tả hình thái của mô sẹo theo thời gian và quan sát hình thái giải phẫu mô sẹo, chụp hình. - 31 - 2.2.5.5. Khảo sát sự tăng trưởng của mô sẹo theo thời gian Mô sẹo được cấy chuyền sau 2 tuần tuổi nuôi cấy trên môi trường MS + NAA 1 mg/l + BA 0,2 mg/l. Theo dõi sự gia tăng trọng lượng tươi và trọng lượng khô của sẹo. 2.2.5.6. Khảo sát hàm lượng flavonoid trong mô sẹo lá Mẫu lá ban đầu và mẫu mô sẹo sau 1, 2, 3, 4 tuần tuổi phơi khô, sau đó tán thành bột và đem đi xác định các chỉ tiêu sau: ¾ Xác định độ ẩm ¾ Định tính flavonoid bằng SKLM ¾ Xác định hàm lượng flavonoid toàn phần 2.2.6. Phân tích flavonoid 2.2.6.1. Xác định độ ẩm [4] ™ Nguyên tắc: Xác định độ ẩm bằng phương pháp sấy theo tiêu chuẩn DĐVN III, phụ lục 12.13. Bột dược liệu sấy ở 1050C ở tủ sấy trong 2 giờ. Cân dược liệu trước và sau khi sấy, lặp lại 3 lần. Độ ẩm được tính theo công thức sau: A: Độ ẩm dược liệu (%) a: khối lượng trước khi sấy b: Khối lượng sau khi sấy 2.2.6.2. Định tính flavonoid [8], [11], [16], [20] ¾ Qui trình chiết flavonoid cho định tính và định lượng Flavonoid trong lá hay mô sẹo được chiết theo qui trình sau: (hình 2.5) (a - b) × 100 A% = a - 32 - Hình 2.3. Qui trình chiết flavonoid cho định tính và định lượng (Harborne, J.B., 1989) [30]. ¾ Định tính flavonoid bằng SKLM SKLM bằng bản mỏng Silica gel F254 Dung môi khai triển: n-Butylacetat- nước-acid formic (15:5:5). Dung dịch chuẩn: Hoà tan 1 mg quercetin trong 1 ml methanol để được dung dịch chuẩn có chứa 1 mg/ml. Cách tiến hành: Cắn ethylacetate hoà tan trong MeOH, chấm riêng biệt lên bản mỏng khoảng 20 - 50 μl mỗi dung dịch chiết và dung dịch chuẩn. Tiến hành triển khai trên hệ dung môi trên, để khô bản mỏng ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 366 nm, trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng phát quang màu nâu hay hiện màu bằng hơi amoniac đậm đặc, FeCl3 5%…. Trên Mẫu (1 g) Chiết với methanol (3 lần) Thuỷ phân với MeOH/HCl 10% Trung hoà pH = 7 Lọc Cắn ethylacetate Lắc với ethylacetate Dịch Methanol Dịch ethylacetate Cắn Định tính và định lượng flavonoid - 33 - sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu, cùng giá trị Rf với vết quercetin chuẩn [11]. 2.2.6.3. Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp UV-Vis [16], [30] ¾ Nguyên tắc Dựa vào sự tương quan giữa độ hấp thu của quercetin chuẩn + AlCl32% tại bước sóng hấp thu 415 nm với nồng độ quercetin (µg/ml) tương ứng trong các điều kiện xác định. ¾ Qui trình Định lượng flavonoid toàn phần bằng phương pháp UV- Vis Dung dịch chuẩn mẹ: Hoà tan chính xác 20 mg quercetin chuẩn đối chiếu vào 50 ml dung dich MeOH trong bình định mức. Pha mẫu quercetin chuẩn: Từ dung dịch mẹ pha các dãy dung dịch thử có nồng độ từ thấp đến cao (1-60 μg/ml) bằng cách lấy tăng dần thể tích dung dịch mẹ bằng micropipet và pipet chính xác, sau đó pha loãng với dung dịch MeOH/AlCl3 2% trong bình định mức, để yên 10 phút. Đem đo quang ở bước sóng 415 nm, xác định độ hấp thu của chuẩn quercetin (Arvouet, A., B. Vennat, A. Pourrat and Legret, 1994) [16]. Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 1,0 g mẫu, chiết theo qui trình mục 2.2.6.2 cắn ethylacetate hoà tan với methanol trong bình định mức 100 ml, lọc bằng màng lọc 0,45 µm. Lấy 10 ml dịch này pha loãng trong MeOH/AlCl3 2% thành 20 ml. Đem mẫu thử đo ở bước sóng 415 nm, xác định độ hấp thu mẫu thử. Xác định hàm lượng quercetin (Q%) (Arvouet, A., B. Vennat, A. Pourrat and Legret, 1994) [16]. Hàm lượng quercetin (Q%) trong dược liệu được tính bằng công thức. Q (%) = At * Cc * k Ac * a * 100 (100 – h) - 34 - Trong đó Ac: Độ hấp thu của dung dịch chuẩn a : Khối lượng dược liệu (µg) At: Độ hấp thu của dung dịch thử h : hàm ẩm dược liệu Cc: Nồng độ (µg/ml) dung dịch chuẩn. k: độ pha loãng mẫu thử Hàm lượng flavonoid toàn phần (F%) trong dược liệu được tính bằng công thức. F (%) = Q (%) × 2,51 2,51: Hệ số chuyển đổi từ flavonol sang flavonol glycosid (flavonoid) 2.2.7. Xử lý số liệu thống kê Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel, và chương trình Statistical Program Scientific System (SPSS), phiên bản 11.5 dùng cho Windows. Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức p = 0,05 (p: probability) của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự khác nhau.