Thẩm định quy trình định lượng paracetamol 650mg phóng thích kéo dài bằng phương pháp quang phổ uv - Vis

ỗ xốp của khung matrix cần phải phối hợp với các tá dược tan được để tạo được lỗ xốp như lactose (Hoàng Ngọc Hùng, 2012). Các tá dược tạo khung thân nước: với cơ chế dùng các polyme không tan nhưng trương nở tạo một lớp gel thân nước bao quanh viên giúp kiểm soát sự phóng thích hoạt chất. Các polyme thân nước hay sử dụng là hydroxypropyl methylcellulose (HPMC), gôm xanthan, acid polyacrylic (cacbopol) (Hoàng Ngọc Hùng, 2012). 2.4.THỬ NGHIỆM ĐỘ HÒA TAN TRONG NGHIÊN CỨU VÀ ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG THUỐC Thử nghiệm độ hòa tan là phép thử nhằm đánh giá tốc độ, mức độ giải phóng và hòa tan dược chất ngoài cơ thể. Độ hòa tan phản ánh động học phóng thích hoạt chất của viên và khả năng thuốc sẵn sàng hấp thu khi sử dụng (Mohhamad Hosain và JamesWW. Ayres, 1996). Điều kiện trong phép đo độ hòa tan Thiết bị đo hòa tan: hiện nay có 7 loại thiết bị đo hòa tan được giới thiệu trong Dược Điển các nước (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Trong đó, kiểu giỏ quay và kiểu cánh khuấy là hai kiểu thiết bị đo hòa tan thông dụng nhất. 15 Cácthiết bị này phải đảm bảo các thông số kỹ thuật trong USP 36 và phải được chuẩn hóa (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Tốc độ quay: 50, 75 hay 100 vòng/phút là tùy vào chuyên luận quy định trong các Dược Điển hoặc dạng bào chế và tính chất lý hóa của hoạt chất (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Môi trường: được chỉ dẫn trong từng chuyên luận riêng hay các dung môi hòa tan hoạt chất, tùy thuộc tính của dạng thuốc nghiên cứu (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Thể tích môi trường: thông thường là 500, 750, 900, 1000 mL, phụ thuộc vào tính chất lý hóa và dạng bào chế của hoạt chất (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Thời gian thử nghiệm: tùy theo yêu cầu của từng dạng thuốc (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). Vị trí lấy mẫu:ở khoảng giữa bề mặt dung môi và mặt trên cách khuấy, cách thành cốc 1 cm (Robert B. Raffa, 2005). Thời điểm lấy mẫu: đối với thuốc phóng thích kéo dài, mẫu thường được lấy ở ít nhất ba thời điểm để đánh giá độ phóng thích hoạt chất in vitro. Lấy mẫu lần thứ nhất ở thời điểm 1 hay 2 giờ để khẳng định không có sự phóng thích ồ ạt. Mẫu thứ hai thường được lấy ở thời điểm giữa của quá trình để xây dựng đồ thị phóng thích in vitro. Mẫu cuối cùng được chọn lấy vào thời điểm cuối của quá trình để biết phần trăm hoạt chất được phóng thích tối đa. Thời điểm và số lần lấy mẫu được xây dựng dựa trên hồ sơ giải phóng hoạt chất của thuốc (The United States Pharmacopeial Convention, 2013). 2.5.TỒNG QUAN VỀ QUANG PHỔ UV - VIS Phương pháp phân tích quang phổ là phương pháp phân tích quang học dựa trên việc nghiên cứu sự tương tác của bức xạ ánh sáng trên chất khảo sát hoặc sự hấp thụ các bức xạ dưới một tác động hóa lý nào đó(Trần Tứ Hiếu, 2008).  Phổ UV – Vis và nguồn gốc của sự hấp thụ(Lê Nhất Tâm, 2014) - Vùng phổ này thường được chia làm 3 vùng chủ yếu: cận UV (185 – 400 nm), khả kiến (400 – 700 nm) và cận hồng ngoại (700 – 1100 nm). - Nguồn gốc của sự hấp thụ trong vùng này chủ yếu là sự tương tác của các photon của bức xạ với các ion hay phân tử của mẫu. - Sự hấp thụ chỉ xảy ra khi có sự tương ứng giữa năng lượng photon và năng lượng các điện tử ngoài cùng (của ion hay phân tử) hấp thụ. - Kết quả của sự hấp thụ là có sự biến đổi năng lượng điện tử của phân tử. Chính vì vậy phổ UV - Vis được gọi là phổ điện tử. 16 - Sự hấp thụ năng lượng điện tử trong vùng sóng ánh sáng tử ngoại gần (190 - 400 nm) và khả kiến (400 - 780 nm) của các chất gây ra sự chuyển dịch của các điện tử từ trạng thái cơ bản sang trạng thái kích thích. - Biểu đồ biểu diễn sự tương quan giữa cường độ hấp thu theo bước sóng của một chất được gọi là phổ UV- Vis của chất ấy trong điều kiện xác định. - Các quang phổ kế UV - Vis đo độ truyền quang T hay độ hấp thu A của bức xạ khi truyền qua mẫu lỏng. - Độ truyền quang T được tính: T= I I0 Hay: %T = I I0 x 100 - Độ hấp thụ A được xác định: A = -logT - Tùy vào trạng thái của mẫu đo mà phổ thu được có những đường nét khác nhau: Hình 2.12.Đồ thị về đường phổ của hai mẫu khác nhau Chú thích: a: Benzen in solution b: Benzen vapour  Sự chuyển dịch điện tử của các hợp chất hữu cơ - Phần lớn các hợp chất hữu cơ được nghiên cứu trong vùng phổ UV - Vis. - Quá trình chuyển tiếp bao gồm các điện tử π, σ hay điện tử n nằm trên các orbital của các nguyên tử nhẹ như H, C, N, O.  Những yếu tố ảnh hưởng tới sự chuyển mức: Ảnh hưởng của dung môi: - Bước sóng hấp thu và cường độ hấp thu của các hợp chất chịu ảnh hưởng của dung môi. - Sự tác động của những dung môi khác nhau lên các phân tử làm thay đổi mức năng lượng giữa các trạng thái kích thích và cơ bản. 17 - Sự tác động của dung môi lên phân tử làm sinh ra chuyển dịch xanh và chuyển dịch đỏ. Chuyển dịch xanh: + Là hiện tượng hấp thu bức xạ của các hợp chất hữu cơ có bước sóng ngắn hơn trong những dung môi có tính phân cực cao. + Hiện tượng tìm thấy ở quá trình chuyển dịch n π* của nhóm carbonyl. + Nguyên nhân là do sự làm bền trạng thái n của dung môi. Chuyển dịch đỏ + Là hiện tượng các hợp chất hữu cơ có xu hướng hấp thu những bức xạ có bước sóng dài hơn trong những dung môi có độ phân cực cao hơn. + Hiện tượng được tìm thấy ở các phân tử hữu cơ mà trong cấu trúc phân tử của nó có sự liên hợp. + Nguyên nhân do khi mạch C càng dài thì hiệu ứng liên hợp càng tăng, dẫn tới độ lệch năng lượng giữa hai trạng thái giảm và do trong phân tử hữu cơ có hiệu ứng liên hợp càng dài thì bước sóng hấp thu càng lớn. Ảnh hưởng của pH - Ảnh hưởng độ bền của phức. - Ảnh hưởng đến sự tạo phức. - Ảnh hưởng dạng tồn tại. Ảnh hưởng của sự liên hợp Sự liên hợp p-π hay π-π đều làm cho trạng thái kích thích của điện tử π* bền hơn có năng lượng thấp hơn đều này dẫn tới bước sóng hấp thu dài hơn.  Định luật Lambert – Beer: Chiếu một chùm tia đơn sắc song song có cường độ I0 rọi thẳng góc lên bề dày L của một môi trường hấp thụ thì sau khi qua lớp hấp thụ này cường độ của ánh sáng nhỏ đi còn là I (I < I0). Gọi T là độ truyền qua của ánh sáng thì T = I I0 Định luật Lambert - Beer: độ hấp thụ ánh sáng của vật chất tỷ lệ thuận với hai thành phần là nồng độ chất hấp thụ và khoảng đường của ánh sáng truyền qua vật chất. A = -lgT = ε.C.l A: độ hấp thụ l: chiều dày của lớp hấp thụ (cm) C: nồng độ của chất hấp thụ (mol/l) ε: hệ số hấp thụ mol 2.5.1. Cấu tạo máy quang phổ UV-Vis Cấu tạo của máy quang phổ UV - Vis được trình bày ở hình 2.13. 18 Hình 2.13. Cấu tạo máy quang phổ UV-Vis 6800 2.5.1.1.Nguồn sáng Nguồn sáng cho máy quang phổ là chùm bức xạ phát ra từ đèn. Máy quang phổ dùng đèn Hydro hay đèn Deuterium cho phổ phát xạ liên tục trong vùng UV 200- 380nm (nhưng thường sử dụng 200-340nm) và đèn Tungsten Halogen đo vùng 380- 1000nm. Để làm việc cho cả hai vùng thì phải có đủ 2 loại đèn trên. Một yêu cầu đối với nguồn sáng là phải ổn định, tuổi thọ cao và phát bức xạ liên tục trong vùng phổ cần đo. 2.5.1.2.Bộ tạo ánh sáng đơn sắc (monochromator) Bộ đơn sắc có chức năng tách bức xạ đa sắc thành bức xạ đơn sắc, bao gồm kính lọc, lăng kính hay cách tử. Cách tử là một bảng nhôm hay các kim loại Cu, Ag, Au, được vạch thành những rãnh hình tam giác song song. Khi chiếu ánh sáng qua cách tử, phần còn lại có tác dụng tạo nên vân nhiễu xạ có bước sóng khác nhau, khi quay cách tử sẽ tạo ra phổ nhiễu xạ giống như trường hợp ánh sáng qua lăng kính. Ưu điểm là cho độ phân giải tốt, tán sắc tuyến tính, độ rộng của dải ổn định, chọn bướcsóng đơn giản, gọn nhẹ, dễ chế tạo; nên hiện nay sử dụng cách tử tạo ánh sáng đơn sắc được ưa chuộng. Cách tử dùng cho UV-Vis có 1200 vạch/mm (thường dao động từ 300-3600 vạch/mm), số vạch càng nhiều thì năng suất phân giải càng cao. Lăng kính của máy quang phổ dùng lăng kính littrow (lăng kính 30o) bằng thạch anh, có đặc điểm ánh sáng đi qua lăng kính hai lần do phản xạ ở mặt sau. 2.5.1.3.Detector Detector là bộ phận đo tín hiệu ánh sáng trước và sau khi đi qua dung dịch (đựng trong cuvet). Các tín hiệu sau khi đi ra detector sẽ được khuếch đại, lưu giữ và xử lý trên máy tính. 2.5.1.4.Cuvet đựng mẫu Cuvet phải làm bằng chất liệu cho bức xạ ở vùng cần đo đi qua. Cuvet thủy tinh không thích hợp cho vùng UV. Cuvet thạch anh cho bức xạ đi qua từ 190 - 1000 nm. Cuvet nhựa chỉ dùng trong Vis và chỉ sử dụng được 1 vài lần. Quang phổ phát xạ Nguồn sáng + Mẫu Máy đơn sắc Đầu thu Xử lý tín hiệu Huỳnh quang, hấp thu, Raman Nguồn sáng Mẫu  19 2.5.1.5.Bộ khuếch đại tín hiệu (amplificator) 2.5.1.6.Bộ phận ghi Bộ phận ghi hay đồng hồ đo có 2 thang đo bao gồm:  Thang đo độ hấp thụ A hay mật độ quang D (Absorbance, Optical Density).  Thang đo độ thấu quang, độ truyền quang T (Transmittance). 2.5.2. Ưu điểm - Phương pháp có độ nhạy cao, cho phép xác định nồng độ trong khoảng 10-2 đến 10-6 mol/L (1-10%). - Phân tích thuận tiện: không đòi hỏi thiết bị, hóa chất quá đắt tiền, có thể phân tích nhiều đối tượng mẫu khác nhau. - Dễ tự động hóa: các thao tác từ đưa mẫu phân tích vào, đưa các hóa chất cần thiết, vẽ phổ, xử lý phổ, xử lý kết quả, xử lý thống kê đều được thực hiện một cách tự động hóa trên các máy móc, thiết bị hiện đại. - Phương pháp này rất thuận lợi cho việc nghiên cứu các cơ chế tạo phức, xác định các dạng tồn tại của ion trung tâm, các ligand nằm trong phức đơn và đa ligand trong pha nước cũng như pha hữu cơ. 2.5.3. Các sai số trong phép đo Phương pháp phân tích quang phổ cũng như các phương pháp phân tích khác, sai số được chia làm hai loại: sai số do tiến hành phản ứng hóa học (hóa chất, thao tác, dụng cụ), sai số của tín hiệu đo độ hấp thụ của dung dịch (sai số hệ thống). Trong phương pháp quang phổ thì sai số quan trọng nhất là sai số của tín hiệu trong quá trình đo độ hấp thu. 2.5.4. Yêu cầu của chất phân tích Các hợp chất cần xác định phải bền và ít phân ly, ổn định, không thay đổi thành phần trong khoảng thời gian nhất định để thực hiện phép đo (10 - 20 phút). Hệ số ɛcàng lớn càng tốt, nồng độ các chất xác định phải tuân theo định luật Lambert – Beer. Các hợp chất là phức cần đo phải có bước sóng cực đại khác xa bước sóng cực đại của thuốc thử trong cùng điều kiện, tức là khoảng 80 - 100 nm. 2.5.5. Một số ứng dụng Phương pháp phổ UV - Vis có ý nghĩa quan trọng trong lĩnh vực phân tích định tính, phân tích cấu trúc phân tử và phân tích định lượng. Nguyên tắc của phương pháp phân tích định lượng là dựa vào mối quan hệ giữa mật độ quang và nồng độ dung dịch của định luật Lambert - Beer, phương pháp định tính là dựa vào hình dáng của phổ và bước sóng cực đại. 2.5.5.1. Xác định mức độ tinh khiết của hợp chất Nếu hợp chất trong suốt, các vết của tạp chất dễ phát hiện khi chúng có cường độ hấp thu đủ mạnh. 20 Nếu hợp chất có vạch hấp thu ở vùng UV - Vis thì cần tinh chế cho đến khi hệ số phân tử của sự hấp thu đạt giá trị không đổi. 2.5.5.2. Nhận biết và xác định cấu trúc của hợp chất - Nhận biết sản phẩm của sự tổng hợp bằng cách so sánh đường cong hấp thu của sản phẩm tổng hợp với đường cong hấp thu của sản phẩm thiên nhiên hay mẫu chuẩn. - Nhận biết nhóm chức của hợp chất dựa vào quang phổ, các thông tin về các nguyên tố và phản ứng định tính các nhóm chức. Có thể sử dụng cường độ vạch hấp thu với mục đích nhận dạng trong trường hợp chất tinh khiết. - Nhận biết cấu tạo của hợp chất ban đầu dựa vào số liệu hấp thu của các dẫn xuất hay sản phẩm phân hủy của nó. - Xác định đồng phân hình học, dạng trans có λmax, 𝜀max lớn hơn dạng cis. - Xác định sự đồng phân do sự hỗ biến enol - keton, thiol - thion. 2.5.5.3. Phân tích hỗn hợp - Định tính và định lượng hỗn hợp. - Điều kiện để có kết quả xác đáng: chất phân tích tuân theo định luật Lambert- Beer, đã biết hệ số hấp thu của mỗi hợp chất tinh khiết. 2.5.5.4. Xác định trong lượng phân tử Khi hợp chất ban đầu không hấp thu trong vùng sóng này, nếu nó phản ứng với tác nhân có vạch hấp thu đặc trưng, cường độ mạnh và độ dài sóng thì hệ số hấp thu của chất dẫn xuất thu được không khác hệ số của tác nhân. Nếu hệ số hấp thu này là không đổi trong bất cứ dẫn xuất nào thì mật độ quang học D sẽ phụ thuộc vào M của chất ban đầu. 𝑀 = 𝜀.𝜔.𝑙 𝐷 Trong đó 𝜔 nồng độ chất L chiều dày cuvet 2.5.5.5. Xác định hằng số phân ly của acid, base Ví dụ:HB + H2O ↔ H3O+ +B- 𝑝𝐾𝑎 = 𝑝𝐻 + 𝑙𝑔 CHB CB− Quang phổ được sử dụng để xác định lg CHB CB− , đo pH của dung dịch sẽ suy ra p𝐾𝑎. 2.5.5.6. Nghiên cứu phản ứng hóa học - Theo dõi biến đổi nồng độ các chất trong phản ứng. - Xác định vận tốc phản ứng. - Xác định nhiệt sinh của các phân tử không bền. - Thiết lập công thức thực nghiệm và hằng số tạo phức trong dung dịch. 2.6.THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG Thẩm định phương pháp là sự khẳng định bằng việc kiểm tra, cung cấp bằng 21 chứngkhách quan để chứng minh rằng phương pháp đó đáp ứng được các yêu cầu đặt ra (fitness for the urpose). Kết quả của thẩm định phương pháp có thể được sử dụng để đánh giá chất lượng, độ tin cậy của kết quả phân tích. Thẩm định phương pháp phân tích là một phần không thể thiếu nếu muốn có một kết quả phân tích đáng tin cậy (Trần Cao Sơn ctv, 2010). 2.6.1.Khi nào cần thẩm định(Hoàng Ngọc Hùng, 2012) - Sử dụng một phương pháp mới vào công việc phân tích hằng ngày. - Thay đổi mục đích sử dụng của phương pháp. - Giới hạn thu được sau khi phân tích nằm ngoài giới hạn quy định. - Thay đổi quy trình: thành phần tá dược trong thuốc, trang thiết bị, thông số kỹ thuật, thay đổi nhà cung cấp hóa chất. 2.6.2.Tầm quan trọng của việc thẩm định(Bộ Y tế, 2011;Nguyễn Lầu Hai, 2014;Nguyễn Thị Diệp Chi, 2008). Thẩm điṇh quy trình phân tích là môṭ quá trình tiến hành thiết lâp̣ bảng thưc̣ nghiêṃ của các thông số đăc̣ trưng của phương pháp để chứng minh phương pháp đáp ứng yêu cầu phân tích dư ̣kiến. Nói cách khác, việc thẩm điṇh môṭ quy trình phân tích yêu cầu chúng ta chứng minh môṭ cách khoa hoc̣ rằng khi tiến hành thí nghiêṃ sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhâṇ đươc̣. Trong các tiêu chuẩn chúng ta phải xây dưṇg phương pháp phân tích hay cũng goị là quy trình thử nghiêṃ để giúp cho viêc̣ kiểm tra chất lươṇg cũng như các tiêu chí đề ra cho các tiêu chuẩn đó. Muc̣ tiêu của viêc̣ thẩm điṇh các phương pháp phân tích là để chứng tỏ rằng quy trình đáp ứng với nhu cầu dư ̣kiến. Phương pháp phân tích sau khi thẩm điṇh có thể đưa vào Dươc̣ điển hoăc̣ đưa vào các tiêu chuẩn cơ sở để xin đăng ký lưu hành. 2.6.3.Nội dung thẩm định(Bộ Y tế, 2013; Đặng Văn Giáp, 2012; Trần Tử An, 2005) Cơ sở cần thiết cho viêc̣ thẩm điṇh phương pháp phân tích để điṇh lươṇg những thành phần chủ yếu trong nguyên liêụ thuốc, hoaṭ chất trong các chế phẩm cần dưạ vào các tiêu chuẩn sau: - Độ đặc hiệu - Tính tuyến tính - Đô ̣lăp̣ laị - Đô ̣đúng 2.6.3.1. Độ đặc hiệu Độ đặc hiệu: là khả năng cho phép xác định chính xác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác (tạp chất, sản phẩm phân hủy,) có trong mẫu thử. Tùy đối tượng trong quy trình phân tích mà thực hiện 22 thử nghiệm. Trong quy trình định lượng tính đặc hiệu biểu thị bằng độ chênh lệch hay là hiệu giữa các kết quả thu được từ một mẫu giả định với các kết quả thu được từ mẫu thử. Tính đặc hiệu cũng là độ nhiễu của phương pháp. Độ nhiễu càng thấp, tính đặc hiệu càng cao. Cách thực hiện:chuẩn bị một mẫu giả định có công thức và thành phần các chất hoàn toàn giống như mẫu thử và mẫu trắng tức là mẫu bao gồm các thành phần giống hệt như mẫu thử nhưng không chứa hoạt chất cần định lượng. Yêu cầu: Sự sai khác giữa hai hệ số góc không quá 2%, chứng tỏ quy trình có tính chọn lọc với chất phân tích. 2.6.3.2. Tính tuyến tính Tính tuyến tính của môṭ phương pháp phân tích là khả năng luâṇ ra các kết quả thử của phương pháp hoăc̣ bằng phép biến đổi toán hoc̣ hay trưc̣ tiếp dưạ vào tương quan tỷ lê ̣giữa đaị lươṇg đo và nồng đô.̣ Tính tuyến tính trong một miền giá trị được xác định bằng hệ số tương quan R. Cách thưc̣ hiêṇ: tiến hành thưc̣ nghiêṃ để xác điṇh ứng với các nồng đô ̣x biết trước, các giá tri ̣ điṇh lươṇg đươc̣ y. Như ta đa ̃biết nếu y phu ̣thuôc̣ tuyến tính vào x có nghiã là trong khoảng nồng đô ̣cần khảo sát đường biểu diêñ của y theo x là môṭ đường thẳng theo phương trình sau: y=ax+b. Dưạ vào kết quả thu đươc̣ từ thưc̣ nghiêṃ của x và y tương ứng ta tính hê ̣số tương quan R: 𝑅 = ∑(𝑥 − �̅� ) × (𝑦 − �̅�) √∑(𝑥 − �̅�)2 × ∑(𝑦 − �̅�)2 Nếu: R=1: có tính tương quan tuyêṭ đối. R>0: có tương quan đồng biến. R<0: có tương quan nghic̣h biến. R=0: hoàn toàn không có tương quan tuyến tính. Sau khi xác nhâṇ đươc̣ khoảng tuyến tính của phương pháp, ta có thể xây dưṇg phương pháp hồi quy của khoảng này tức là xác điṇh hê ̣số a và b của phương trình trên: 𝑎 = ∑ 𝑥𝑦 − ∑ 𝑥 ∑ 𝑦 𝑛⁄ ∑ 𝑥2 − (∑ 𝑥) 2 𝑛⁄ ; 𝑏 = 𝑦 − 𝑎𝑥 y: giá tri ̣ điṇh lươṇg đươc̣. x: nồng đô ̣điṇh lươṇg. Phương trình hồi quy: 𝑦 = 𝑎𝑥 + 𝑏 Yêu cầu: tùy theo hoac̣h điṇh mà choṇ giá tri ̣ R. 23 2.6.3.3. Đô ̣lăp̣ laị Đô ̣lăp̣ laị (hay đô ̣chính xác) là mức đô ̣sát gần giữa các kết quả thử riêng lẻ với giá tri ̣ trung bình �̅�thu đươc̣ khi áp duṇg phương pháp đề xuất cho cùng môṭ mâũ thử đồng nhất trong cùng điều kiêṇ xác điṇh. Đô ̣lăp̣ laị bi ̣ ảnh hưởng bởi sai số ngâũ nhiên. Đô ̣lăp̣ laị thường đươc̣ biểu hiêṇ bằng đô ̣lêc̣h chuẩn (SD) hay đô ̣ lêc̣h chuẩn tương đối (RSD) của môṭ loaṭ các lần thử nghiêṃ. Cách thưc̣ hiêṇ: độ lặp lại được thực hiện bằng cách tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu 3 nồng độ hoặc thực hiện định lượng tối thiểu 6 lần ở nồng độ 100%. Sau đó áp duṇg công thức tính SD và RSD của phương pháp. Yêu cầu:RSD càng nhỏ, phương pháp phân tích càng chính xác, RSD do mỗi phòng thí nghiêṃ đưa ra, thông thường ta choṇ RSD ≤ 2%. SD = √ ∑(𝑥𝑖 −𝑋) 2 𝑛−1 𝑅𝑆𝐷 = 𝑆𝐷 𝑋 × 100% 𝑋 = ∑ 𝑥𝑖 𝑛 X: giá tri ̣ trung bình 2.6.3.4. Đô ̣đúng Đô ̣đúng của môṭ phương pháp phân tích là mức đô ̣sát gần của giá tri ̣ tìm thấy với giá tri ̣ thưc̣, khi áp duṇg quy trình đề xuất trên cùng môṭ mẫu thử đa ̃ đươc̣ làm đồng nhất trong điều kiêṇ xác điṇh. Đô ̣đúng bi ̣ ảnh hưởng bởi sai số hê ̣ thống. Độ đúng sẽ được tính bằng tỷ lệ phần trăm giữa lượng chất chuẩn tìm thấy so với lượng chất chuẩn thêm vào. Cách thưc̣ hiêṇ: tiến hành định lượng tối thiểu 9 lần mẫu thử ở tối thiểu 3 nồng độ. Từ kết quả thu được xác định tỷ lệ % tìm lại của chất đem thử: Đ = 𝜇 𝑥 × 100% Đ: tỉ lê ̣phuc̣ hồi. μ : hàm lươṇg tìm laị. x : hàm lươṇg chất chuẩn thêm vào. Yêu cầu: Tỉ lê ̣phuc̣ hồi trung bình phải đaṭ: 97% ≤ ĐTB ≤ 103%. 2.7. CÁC NGHIÊN CỨU LIÊN QUAN Andrew D. Trafford, Roger D. Jee và các cộng sự (1999) đã sử dụng phương pháp quang phổ để xác định hàm lượng paracetamol trong nhiều chế phẩm. Kết quả phương pháp cho thấy khả năng lặp lại tốt, độ lệch chuẩn và hệ số biến thể cho 6 lần so sánh trong cùng một lô cùng một ngày là 0,14 và 0,16%, sai lệch trung bình -0,22% và độ chính xác trung bình là 0,45% (Andrew D. Trafford et al., 1999). 24 Ramesh Sawant, Lokesh Bhangale và các cộng sự (2010) đã định lượng paracetamol bằng phương pháp quang phổ. Phương pháp sử dụng NaOH 0,1M làm dung môi, đo độ hấp thu tại bước sóng 256 nm. Phương pháp nghiên cứu có ý nghĩa thống kê vì tất cả các thông số đều nằm trong khoảng chấp nhận được. Ưu điểm phương pháp đơn giản, nhanh chóng và chính xác (Ramesh Sawant et al., 2010). 25 CHƯƠNG 3. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. NGUYÊN LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ 3.1.1. Nguyên liệu Các nguyên liệu, chất chuẩn, tá dược và hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong các bảng 3.1; 3.2 và 3.3. Bảng 3.1. Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu Tên nguyên liệu Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng Paracetamol USP Malinkrodt (Mỹ) Hoạt chất Paracetamol chuẩn (Hàm lượng 99,72%) Chất chuẩn Viện KN TPHCM Chất chuẩn Bảng 3.2. Các tá dược dùng trong nghiên cứu Tên tá dược Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng PVP K30 USP Mỹ Tá dược dính Avicel 101 BP Đài Loan Tá dược độn DST BP Đài Loan Tá dược rã HPMC K15M USP Nhật Tạo khung matrix Magnesi stearat BP Malaysia Tá dược trơn bóng Bảng 3.3. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu Tên hóa chất Tiêu chuẩn Nguồn gốc Ứng dụng Nước cất Nhà sản xuất Việt Nam Pha dung dịch đệm Acid phosphoric Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm Dinatri hydrophosphat Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm Kali dihydrophosphat Nhà sản xuất Trung Quốc Pha dung dịch đệm Natri hydroxyd Nhà sản xuất Trung Quốc Dung môi pha mẫu 3.1.2.Trang thiết bị Danh mục các trang thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trong bảng 3.4. Bảng 3.4. Danh mục trang thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu STT Tên thiết bị Mã hiệu Nguồn gốc 1 Cân phân tích AND HR200 Nhật 2 Máy UV-Vis Shimazdu 1800 Nhật 3 4 Máy thử độ hòa tan Máy siêu âm Pharma Test PTW3C Elma T840DH Đức Đức 5 Máy đo pH Hanna Hi 2210 Mỹ 3.1.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu Phòng thí nghiệm bộ môn Bào chế, Kiểm Nghiệm - Khoa Dược, Trường Đại Học Tây Đô. Thời gian nghiên cứu từ tháng 01/2017 đến 06/2017. 26 3.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Trước khi thẩm định, tiến hành định tính nguyên liệu paracetamol bằng cách đo bước sóng cực đại hấp thu của mẫu nguyên liệu với mẫu chuẩn bằng phương pháp đo quang UV - Vis. 3.2.1.Quytrình định lượng paracetamol trong chế phẩm Khảo sát quy trình định lượng paracetamol thông qua tham khảo chuyên luận “viên nén paracetamol” trong Dược điển Việt Nam IV, điều chỉnh các bước tiến hành cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm hiện có. Sau đó, tiến hành thẩm định quy trình định lượng theo Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam (Bộ Y tế, 2013). Phương pháp xử lý mẫu: Mẫu chuẩn C: cân chính xác 37,5 mg paracetamol chuẩn vào bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N và 50 mL nước, lắc 15 phút, bổ sung nước cất đến vạch. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 50 mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Sau đó, hút chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N, thêm nước đến vạch định mức, lắc đều thu được dung dịch chuẩn có nồng độ 7,5 µg/mL. Mẫu thử T: cân chính xác một lượng bột thuốc khoảng 75 mg paracetamol vào bình định mức 100 mL, thêm 25 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT) và 50 mL nước, lắc 15 phút, thêm nước đến định mức. Lắc đều, lọc qua giấy lọc khô, bỏ 10 mL dịch lọc đầu. Lấy chính xác 10 mL dịch lọc cho vào bình định mức 100 mL. Thêm nước vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lấy chính xác 10 mL dung dịch trên cho vào bình định mức 100 mL, thêm 10 mL dung dịch natri hydroxyd 0,1 N (TT), thêm nước đến định mức, lắc đều. Mẫu giả lập GL: tiến hành tạo mẫu giả định bằng cách cân tất cả các thành phần trong công thức một viên ứng với 75 mg paracetamol. Mẫu giả định được xử lý tương tự như mẫu thử T trước khi đo quang. Mẫu giả dược GD: mẫu giả dược được tạo ra và xử lý tương tự mẫu giả lập GL (ngoại trừ thành phần không có chứa paracetamol). Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,01 N. Tính đặc hiệu Tiến hành: thẩm định tính đặc hiệu tiến hành trên 2 mẫu giả lập GL và giả dược GD. Đo độ hấp thu của hai mẫu trên tại bước sóng 257 nm. Ghi nhận kết quả và tính tỷ lệ giữa độ hấp thu của mẫu GD/GL. Yêu cầu: quy trình định lượng đạt tính đặc hiệu khi tỷ lệ độ hấp thu của mẫu GD/GL không quá 2%. 27 Khoảng tuyến tính và miền giá trị Tiến hành: tiến hành pha dung dịch paracetamol chuẩn gốc có nồng độ khoảng 75 ppm. Từ đó, pha loãng dung dịch này thành các dung dịch chuẩn thứ cấp theo dãy nồng độ 30 ppm; 15 ppm; 7,5 ppm; 3,75 ppm; 1,5ppm và 0,75 ppm. Lần lượt đo độ hấp thu của các dung dịch chuẩn ở bước sóng 257 nm. Dựa vàokết quả độ hấp thu, xác định phương trình hồi quy y = ax + b và hệ số tương quan bình phương (r2). Yêu cầu: r2 ≥ 0,995 quy trình đạt tính tuyến tính và miền giá trị xác định trong khoảng tuyến tính khảo sát. Độ chính xác Tiến hành: chuẩn bị mẫu thử tương tự như ở mục xử lý mẫu (mẫu T). Thực hiện với 6 mẫu độc lập. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu trên ở bước sóng 257 nm. Ghi nhận kết quả độ hấp thu, tính toán hàm lượng paracetamol có trong từng mẫu và RSD giữa 6 mẫu. Yêu cầu: quy trình đạt độ chính xác khi kết quả định lượng paracetamol trên 6 mẫu có RSD ≤ 2%. Độ đúng Tiến hành: tạo các mẫu giả lập bằng cách thêm chuẩn paracetamol tương ứng với 90, 100 và 110% vào mẫu tá dược. Mỗi mức hàm lượng thực hiện với 3 mẫu độc lập. Cách xử lý mẫu tương tự mẫu thử T. Xác định hàm lượng paracetamol bằng cách đo độ hấp thu ở bước sóng 257 nm. Sau đó, tính tỷ lệ hồi phục bằng cách so sánh lượng paracetamol tính toán được với lượng cân thực tế ban đầu. Yêu cầu: quy trình phân tích đạt độ đúng khi tỷ lệ phục hồi ở từng nồng độ và tỷ lệ phục hồi trung bình chung nằm trong giới hạn cho phép: 97 - 103%. 3.2.2.Quy trình định lượng paracetamol trong phép đo hòa tan Điều kiện đo hòa tan: - Thiết bị đo hòa tan: kiểu cánh khuấy (loại II theo USP 36). - Thể tích môi trường: 900 mL. - Môi trường hòa tan: môi trường pH khảo sát: 4,5. - Nhiệt độ môi trường: 37 ± 0,5oC. - Tốc độ cánh khuấy: 50 vòng/phút. - Thời điểm lấy mẫu: 15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ. - Thể tích lấy mẫu: 20 mL. Xử lý mẫu:lọc dịch hòa tan qua giấy lọc thường, bỏ vài mL dịch lọc đầu, lắc đều. Rút 1 mL dịch lọc vào bình định mức 100 mL, bổ sung NaOH 0,1 N vừa đủ, lắc đều. 28 Mẫu trắng: dung dịch NaOH 0,1 N. Tiến hành đo độ hấp thu các mẫu thử và mẫu chuẩn. Thẩm định quy trình đo hòa tan Tính đặc hiệu:quy trình đạt độ đặc hiệu khi độ hấp thu của mẫu giả dược so với mẫu giả định tại các thời điểm khảo sát đều không quá 2% theo Sổ tay đăng kýthuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. Tính tuyến tính: chuẩn bị dãy các dung dịch chuẩn có nồng độ 0,75 – 30 ppm. Phương trình hồi quy đạt độ tuyến tính khi r2 ≥ 0,98 theo USP 36. Độ đúng: cho vào mẫu thử một lượng chất chuẩn của chất cần thử có hàm lượng bằng 50%, 80% và 100% hàm lượng ghi trên nhãn. Quy trình phân tích đạt độ đúng khi tỉ lệ phục hồi ở từng mức nồng độ nằm trong giới hạn cho phép 95 - 105% theo USP 36. Độ chính xác: từ kết quả của độ đúng, tính RSD của các kết quả thu được ở từng mức độ. Quy trình phân tích độ chính xác đạt khi giá trị thống kê độ hấp thu trên 3 mẫu/nồng độ có RSD ≤ 10% ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ, RSD ≤ 5% ở thời điểm 3 giờ theo USP 36. 3.2.3. Khảo sát viên Tylenol trên thị trường Tiến hành quét phổ mẫu chuẫn và Tylenol 650 mg Extended Release. Pha mẫu như ở mục 3.2.1 tiến hành đo độ hấp thu ở bước sóng 257 nm. Xử lý số liệu, xác định hàm lượng Tylenol 650 mg Extended Release. 29 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ 4.1. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG CHẾ PHẨM Trước khi tiến hành thẩm định, ta khảo sát nguyên liệu paracetamol so với mẫu chuẩn. Kết quả định tính nguyên liệu paracetamol được trình bày ở hình 4.1. Hình 4.1. Kết quả định tính nguyên liệu paracetamol 4.1.1.Độ đặc hiệu Phổ UV của mẫu chuẩn, mẫu giả lập và mẫu giả dược được trình bày ở hình 4.2. Hình 4.2. Overlay phổ UV của mẫu giả dược, mẫu giả lập và mẫu chuẩn QUÉT PHỔ CHUẨN QUÉT PHỔ GIẢ DƯỢC QUÉT PHỔ GIẢ LẬP QUÉT PHỔ CHUẨN QUÉT PHỔ NGUYÊN LIỆU 30 Qua đường biểu diễn độ hấp thu của mẫu giả lập và mẫu chuẩn so với mẫu giả dược thể hiện rằng paracetamol cho đỉnh hấp thu đặc trưng ở bước sóng 257 nm. Như vậy phương pháp định lượng paracetamol bằng phương pháp đo quang có tính đặc hiệu. Kết quả độ đặc hiệu được trình bày như ở bảng 4.1. Bảng 4.1 Kết quả độ đặc hiệu Độ hấp thu Ảnh hưởng tá dược (%) Mẫu giả dược Mẫu giả định 0,001 0,540 0,19 Nhận xét: Tại bước sóng 257 nm, tá dược có hấp thu, nhưng độ hấp thu của tá dược với mẫu giả định nhỏ hơn 2%. Vậy phương pháp phân tích cho phép xác định chính xác và đặc hiệu hoạt chất paracetamol mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của chất khác có trong mẫu thử theo Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.1.2. Tính tuyến tính – miền giá trị Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ paracetamol được trình bày trong bảng 4.2 và hình 4.3. Bảng 4.2. Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ Nồng độ (mg/l) 0,75 1,50 3,75 7,50 15,00 30,00 Độ hấp thu 0,051 0,103 0,266 0,539 1,075 2,149 Hình 4.3. Liên quan tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thu Đ ộ h ấ p t h u y = 0.0717497x - 0.00240881 R² = 0.99999 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 5 10 15 20 25 30 35 Nồng độ (µg/mL) 31 Nhận xét: Dựa trên đồ thị ta thấy khoảng nồng độ từ 0,75 - 30,00 mg/l có sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang là rất tốt. Đồng thời so sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta lại thấy R2 = 0,99999> 0,995 đạt theo yêu cầu của Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.1.3.Độ chính xác Kết quả độ chính xác được trình bày như ở bảng 4.3. Bảng 4.3. Kết quả độ chính xác Mẫu Độ hấp thu Nồng độ Hàm lượng (mg) % Hàm lượng Kết quả 1 0,533 7,46 648,30 99,74 SD = 1,7512 x 10-3 RSD = 0,3269% 2 0,535 7,49 650,16 100,02 3 0,536 7,50 650,29 100,04 4 0,537 7,52 651,28 100,20 5 0,535 7,49 650,16 100,02 6 0,538 7,53 650,66 100,10 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD của 6 lần thử nhỏ hơn 2%. Vậy quy trình phân tích đạt về độ chính xác theo Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.1.4.Độ đúng Kết quả độ đúng được trình bày như ở bảng 4.4. Bảng 4.4. Kết quả độ đúng Mẫu STT Lượng chất chuẩn thêm vào (mg) Độ hấp thu Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 90% 1 33,9 0,482 33,8 99,71 2 33,5 0,477 33,4 99,70 3 33,7 0,480 33,6 99,70 �̅� 99,70 RSD (%) 0,52 100% 1 37,3 0,525 36,8 98,66 2 37,8 0,535 37,5 99,21 3 37,6 0,531 37,2 98,94 �̅� 98,94 RSD (%) 0,95 110% 1 41,3 0,588 41,2 99,76 2 40,9 0,582 40,8 99,76 3 40,7 0,580 40,6 99,75 �̅� 99,76 RSD (%) 0,71 TRUNG BÌNH 99,47 RSD (%) 0,73 32 4.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG PHÉP ĐO HÒA TAN 4.2.1. Độ đặc hiệu Kết quả độ đặc hiệu được trình bày như ở bảng 4.5. Bảng 4.5. Kết quả độ đặc hiệu ở môi trường pH 4,5 Thời gian Độ hấp thu Ảnh hưởng tá dược (%) Mẫu giả dược Mẫu giả lập 15 phút 0,003 0,528 0,57 30 phút 0,003 0,535 0,56 1 giờ 0,006 0,538 1,12 2 giờ 0,008 0,542 1,48 3 giờ 0,008 0,551 1,45 Nhận xét: Tại bước sóng 257 nm, tá dược có sự hấp thu, nhưng độ hấp thu của tá dược với mẫu giả lập nhỏ hơn 2%. Vậy phương pháp phân tích cho phép xác định chính xác và đặc hiệu hoạt chất paracetamol ở môi trường pH 4,5 mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của chất khác có trong mẫu thử theo Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. 4.2.2. Tính tuyến tính Môi trường pH 4,5 Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ paracetamol ở môi trường pH 4,5 được trình bày trong bảng 4.6 và hình 4.4. Bảng 4.6. Sự biến thiên độ hấp thu theo nồng độ ở môi trường pH 4,5 Nồng độ (mg/l) 0,75 1,50 3,75 7,50 15,00 30,00 Độ hấp thu 0,052 0,104 0,266 0,538 1,079 2,161 Hình 4.4. Đồ thị khảo sát tính tuyến tính của paracetamol ở môi trường pH 4,5 y = 0.0721525x - 0.00357426 R² = 1 0 0.5 1 1.5 2 2.5 0 5 10 15 20 25 30 35 Đ ộ h ấ p t h u Nồng độ (µg/mL) 33 Nhận xét: Dựa trên đồ thị ta thấy khoảng nồng độ từ 0,75 - 30,00 mg/l có sự tuyến tính giữa nồng độ và độ hấp thụ quang là rất tốt. Đồng thời so sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta lại thấy R2 = 1 > 0,98 đạt theo yêu cầu của USP 36. 4.2.3.Độ chính xác Kết quả độ chính xác được trình bày như ở bảng 4.7. Bảng 4.7 Kết quả độ chính xác Thời gian 15 phút 30 phút 1 giờ 2 giờ 3 giờ Mẫu Độ hấp thu 1 0,527 0,532 0,536 0,542 0,550 2 0,526 0,533 0,537 0,540 0,551 3 0,527 0,533 0,537 0,542 0,548 4 0,528 0,534 0,536 0,541 0,550 5 0,528 0,533 0,538 0,542 0,547 6 0,527 0,531 0,535 0,539 0,549 RSD (%) 0,14 0,19 0,20 0,23 0,27 TRUNG BÌNH 0,206 Nhận xét: Độ lệch chuẩn tương đối RSD ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ nhỏ hơn 10%; ở thời điểm 3 giờ RSD < 5%. Vậy quy trình phân tích đạt độ chính xác ở môi trường pH 4,5 theo USP 36. 4.2.4. Độ đúng Kết quả độ đúng được trình bày như ở bảng 4.8. Bảng 4.8. Kết quả độ đúng Mẫu STT Lượng chất chuẩn thêm vào (mg) Độ hấp thu Lượng hoạt chất tìm lại (mg) Tỷ lệ phục hồi (%) 50% 1 325,4 0,260 328,1 100,83 2 325,1 0,256 324,2 99,72 3 325,0 0,255 322,3 99,17 �̅� 99,91 RSD (%) 1,03 80% 1 520,2 0,416 523,8 100,69 2 520,1 0,415 521,9 100,35 3 519,9 0,413 519,0 99,83 �̅� 100,29 RSD (%) 0,37 100% 1 650,4 0,523 656,7 100,97 2 650,5 0,524 657,7 101,1 3 649,8 0,512 643,5 99,03 �̅� 100,46 RSD (%) 1,28 TRUNG BÌNH 100,22 RSD (%) 0,89 34 Nhận xét: Tỷ lệ phục hồi ở cả 3 mức nồng độ trong môi trường pH 4,5 nằm trong khoảng 95 - 105%. Vậy quy trình phân tích đạt về độ đúng theoUSP 36. 4.3. KHẢO SÁT VIÊN TYLENOL Tiến hành thử nghiệm viên Tylenol 650 mg Extended Release. Phổ mẫu chẩn và phổ mẫu Tylenol Extended Release trình bày ở hình 4.5. Hình 4.5. Overlay phổ UV của mẫu chuẩn và Tylenol 650 mg Extended Release Nhận xét: Sau khi quét phổ thấy được đường phổ của mẫu Tylenol 650 mg Extended Release gần với đường phổ của mẫu chuẩn. Hàm lượng Tylenol Extended Release được trình bày ở bảng 4.9. Bảng 4.9. Hàm lượng của viên Tylenol ở lô thử nghiệm Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng (mg) Hàm lượng viên (%) 1 0,529 648,4 99,75 2 0,529 648,4 99,75 3 0,528 647,4 99,60 4 0,528 647,4 99,60 5 0,528 647,4 99,60 6 0,532 649,7 99,95 KẾT QUẢ 99,71 QUÉT PHỔ CHUẨN QUÉT PHỔ TYLENOL 35 CHƯƠNG 5. THẢO LUẬN Nguyên liệu paracetamol đã được kiểm tra, định tính bằng cách chồng phổ UV - Vis giữa mẫu nguyên liệu với mẫu chuẩn. Nguyên liệu có hàm lượng 99,72% paracetamol. Đề tài đã tiến hành quy đổi lượng nguyên liệu để có được hàm lượng paracetamol như đúng yêu cầu của hàm lượng viên. 5.1.THẨM ĐỊNH QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG CHẾ PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ UV-VIS Sau khi tham khảo chuyên luận “viên nén paracetamol” trong Dược điển Việt Nam IV, chúng tôi tiến hành điều chỉnh các bước sao cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm hiện có. Sau quá trình khảo sát, đánh giá thực nghiệm cho thấy quy trình phù hợp, đáp ứng được yêu cầu định lượng viên nén paracetamol 650 mg PTKD. Chúng tôi đã tiến hành thẩm định quy trình định lượng đã thiết kế theo Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. 5.1.1.Độ đặc hiệu Để chứng minh được quy trình định lượng có tính chọn lọc cao hay nói cách khác là các yếu tố khác (nếu có) như tá dược, dung môi không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả định lượng paracetamol. Chúng tôi tiến hành song song hai mẫu: mẫu giả dược (có thành phần giống như công thức nhưng không có paracetamol) và mẫu giả lập (có thành phần hoàn toàn giống với công thức bao gồm cả paracetamol). Tiến hành xử lý mẫu và đo độ hấp thu trong cùng điều kiện. Kết quả cho thấy rằng tại cực đại hấp thu của paracetamol 257 nm thì mẫu giả dược vẫn có hấp thu. Tuy nhiên, độ hấp thu này so với mẫu giả lập là không quá 2% đáp ứng theo yêu cầu của Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đã đạt độc đặc hiệu. 5.1.2.Tính tuyến tính So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta thấy R2=0,99999> 0,995 đạt theo yêu cầu của Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. Do đó có thể dùng phương trình hồi quy y = 0.0717497x - 0.00240881 để định lượng paracetamol 650 mg PTKD ở khoảng nồng độ 0,75 - 30,00 mg/l. 5.1.3.Độ chính xác Kết quả 6 lần định lượng cho RSD ≤ 2% nằm trong giới hạn cho phép theo quy định của Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam, cho thấy sự lặp lại trong thao tác của người phân tích. 5.1.4.Độ đúng Quy trình định lượng cho kết quả tỷ lệ hồi phục ở mỗi nồng độ riêng biệt 90%, 100%, 110% và tỷ lệ hồi phục trung bình đều nằm trong giới hạn yêu cầu từ 97,0 - 36 103,0% của Sổ tay đăng ký thuốc - Cục quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đảm bảo được tính nguyên vẹn của mẫu, trong quá trình pha mẫu khảo sát, hàm lượng hoạt chất đã mất đi không đáng kể do thao tác hoặc bị giữ lại trên vật liệu lọc. 5.2. QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG PARACETAMOL TRONG PHÉP ĐO HÒA TAN Theo FDA, thử nghiệm độ hòa tan in vitro được áp dụng cho các chế phẩm phân liều dạng rắn nhằm xác định lượng hoạt chất hòa tan trong môi trường lỏng cóthể tích nhất định, trong khoảng thời gian định trước, sử dụng các thiết bị chuyên biệtnhằmkiểm soát một cách thận trọng các thông số của thử nghiệm độ hòa tan. Đề tài đã tham khảo điều kiện đo hòa tan cho viên nén paracetamol trong Dược điển Việt Nam IV và chuyên luận “viên nén phóng thích kéo dài acetaminophen” trong USP 36. Chúng tôi tiến hành điều chỉnh các bước sao cho phù hợp với điều kiện thực nghiệm hiện có. Sau quá trình khảo sát, đánh giá thực nghiệm cho thấy quy trình phù hợp, đáp ứng được yêu cầu định lượng trong phép đo độ hòa tan của viên nén paracetamol 650 mg PTKD. Có nhiều hướng dẫn về thẩm định quy trình định lượng (bao gồm định lượng cho phép đo hòa tan), nhưng chỉ có hướng dẫn của USP là cụ thể và riêng biệt cho đo hòa tan. Tuy cách tiến hành theo hướng dẫn của USP phức tạp hơn so với các hướng dẫn khác như ICH, FDA hay Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam nhưng khoảng yêu cầu cho phép rộng hơn. Trong phép đo hòa tan có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến kết quả như hoạt chất, tá dược, quá trình sản xuất, tình trạng viên khi đo, viên dính vào thành cốc, tốc độ cánh khuấy hay sự phân tán của hoạt chất trong môi trường đo hòa tan. Tất cả yếu tố kể trên ảnh hưởng đến kết quả đo hòa tan rất nhiều và do đó mà độ lặp lại trong kết quả đo hòa tan thấp. Khoảng cho phép rộng hơn theo USP giúp cho quá trình thẩm định dễ dàng hơn. Chính vì thế, đề tài này tiến hành thẩm định quy trình định lượng paracetamol trong phép đo độ hòa tan theo USP. 5.2.1. Độ đặc hiệu Để chứng minh được quy trình định lượng có tính chọn lọc cao hay nói cách khác là các yếu tố khác (nếu có) như tá dược, dung môi pha mẫu hay môi trường hòa tan không ảnh hưởng hoặc ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả định lượng paracetamol. Chúng tôi tiến hành đo độ hòa tan song song hai mẫu ở môi trường pH 4,5: mẫu giả dược và mẫu giả lập. Tiến hành xử lý mẫu và đo độ hấp thu ở từng thời điểm khảo sát (15 phút, 30 phút, 1 giờ, 2 giờ và 3 giờ) trong cùng điều kiện. Kết quả cho thấy rằng cực đại hấp thu của paracetamol tại 257 nm thì mẫu giả dược vẫn có hấp thu. Tuy nhiên, độ hấp thu này so với mẫu giả lập là không quá 2% đáp ứng theo yêu cầu của Sổ tay đăng ký thuốc - Cục Quản lý Dược Việt Nam. Như vậy, quy trình đã đạt độ đặc hiệu. 37 5.2.2 Tính tuyến tính Viên nén paracetamol 650 mg PTKD có mức độ giải phóng hoạt chất tại thời điểm đầu là khoảng 50% và thời điểm cuối là khoảng gần 100%. Đối với tính tuyến tính và miền giá trị trong phép đo độ hòa tan thì yêu cầu phải xây dựng rộng hơn ±20% so với nồng độ thấp nhất và cao nhất tức là trong phép đo độ hòa tan này phải xây ít nhất là từ 30% - 120%. So sánh hệ số tương quan R của đồ thị và giới hạn hệ số tương quan ta thấy R2=1>0,98 đạt theo yêu cầu của USP 36. Do đó có thể dùng phương trình hồi quy y=0.0721525x - 0.00357426 để định lượng paracetamol 650 mg PTKD ở khoảng nồng độ 0,75 - 30,00 mg/l. 5.2.3.Độ chính xác Kết quả 6 lần định lượng sau các khoảng thời gian đều cho RSD ≤ 5% nằm trong giới hạn cho phép theo quy định của USP 36, cho thấy sự lặp lại trong thao táccủa người phân tích. 5.2.4. Độ đúng Quy trình định lượng cho kết quả tỷ lệ hồi phục ở mỗi nồng độ riêng biệt 50%, 80%, 100% và tỷ lệ hồi phục trung bình đều nằm trong giới hạn yêu cầu từ 95,0 - 105,0% của USP 36. Như vậy, quy trình đảm bảo được tính nguyên vẹn của mẫu, trong quá trình pha mẫu khảo sát, hàm lượng hoạt chất đã không bị mất đi đáng kể do thao tác hoặc bị giữ lại trên vật liệu lọc. 5.3.KHẢO SÁT VIÊN TYLENOL TRÊN THỊ TRƯỜNG Viên đạt tất cảchỉ tiêu chất lượng đề ra như hình thức cảm quan, định tính, định lượng. Hàm lượng paracetamol trong viên đạt so với yêu cầu chỉ tiêu chất lượng. Độ lặp lại và hàm lượng paracetamol trong viên Tylenol trong lô thử nghiệm được trình bày ở bảng 5.1. Bảng 5.1. Khảo sát độ lặp lại và hàm lượng paracetamol trong viên Tylenol 650 mg Extended Release Mẫu Độ hấp thu Hàm lượng (mg) Hàm lượng viên (%) 1 0,529 648,4 99,75 2 0,529 648,4 99,75 3 0,528 647,4 99,60 4 0,528 647,4 99,60 5 0,528 647,4 99,60 6 0,532 649,7 99,95 KẾT QUẢ SD = 1,5492 x 10-3 RSD = 0,2929% 99,71 Kết quả cho thấy rằng phương pháp UV - Vis có thể giúp định lượng chính xác và sát gần với giá trị thực hàm lượng paracetamol trong dịch hòa tan mà không bị ảnh 38 hưởng bởi các tá dược. Như vậy, có thể sử dụng quy trình đã thẩm định để tiến hành định lượng paracetamol trong phép đo độ hòa tan. Cả hai phương pháp định lượng trong chế phẩm và trong độ hòa tan viên nén paracetamol phóng thích kéo dài đều sử dụng phương pháp UV - Vis. Với các số liệu chứng minh trong thẩm định quy trình phân tích cho phép phương pháp có thể áp dụng để định lượng. Mặt khác, phương pháp này có nhiều ưu điểm: đơn giản, tiện lợi, cho kết quả nhanh chóng, chính xác và tiết kiệm chi phí. 39 CHƯƠNG 6. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6.1.KẾT LUẬN Sau một thời gian thực nghiệm thẩm định quy trình định lượng paracetamol 650 mg bằng phương pháp quang phổ UV - Vis đã thu được một số kết quả sau: Phương pháp định lượng trong chế phẩm đạt về các yêu cầu theo Sổ tay đăng ký thuốc – Cục Quản lý Dược Việt Nam: - Độ đặc hiệu: quy trình định lượng có tính chọn lọc cao (độ hấp thu của mẫu giả dược so với mẫu giả lập không quá 2%). - Tính tuyến tính: xây dựng được phương trình hồi quy với hệ số tuyến tính cao R2> 0,995. - Độ lặp lại: sai số tương đối (hoặc độ lệch chuẩn tương đối) đạt ≤ 2%. - Độ đúng: khả năng tìm lại nằm trong khoảng 97 – 103%. Phương pháp định lượng trong phép đo hòa tan đạt về các yêu cầu theoUSP 36: - Độ đặc hiệu: độ hấp thu của mẫu giả dược so với mẫu giả lập không quá 2%. - Tính tuyến tính: xây dựng được phương trình hồi quy với hệ số tuyến tính cao R2> 0,98. - Độ lặp lại: đạt ở các thời điểm 15 phút, 30 phút, 1 giờ và 2 giờ RSD < 10%, 3 giờ RSD < 5%. - Độ đúng: khả năng tìm lại nằm trong khoảng 95 – 105%. Phương pháp quang phổ có nhiều ưu điểm: - Đơn giản. - Tiện lợi. - Cho kết quả nhanh chóng. - Chính xác. - Tiết kiệm chi phí. 6.2.KIẾN NGHỊ Dựa trên các kết quả đạt được chúng tôi có một số kiến nghị như sau: - Do quá trình làm, thiết bị có trục trặc nên cần tiếp tục khảo sát các khoảng thời gian giải phóng bao nhiêu phần trăm dược chất ở phép đo hòa tan. - Cần tiến hành định lượng ở những môi trường khác. - Cần tiến hành định lượng trên nhiều mẫu hơn nữa nhằm đạt độ chính xác cao hơn. - Ngày nay, với sự tiến bộ không ngừng của khoa học nên có nhiều phương pháp để thẩm định quy trình định lượng paracetamol như:  Phương pháp HPLC.  Phương pháp sắc ký khí. 40  Phương pháp cực phổ. Từ đó tăng tính chính xác hơn cho quá trình kiểm nghiệm dược phẩm, góp phần làm giảm sự lưu hành thuốc giả, thuốc kém chất lượng nhằm mang lại lợi ích cho người tiêu dùng. 41 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt, Tiếng Anh 1. Bộ môn Bào chế - Trường Đại học Dược Hà Nội (2005). Một số chuyên đề về bào chế hiện đại. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 2. Bộ Y tế (2007). Bào chế và sinh dược học tập 2. Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội. 3. Bộ Y tế (2009). Dược điển Việt Nam IV. 4. Bộ Y tế (2011). Kiểm nghiệm thuốc. Nhà Xuất Bản Giáo Dục Việt Nam, Hà Nội. 5. Bộ Y tế (2012). Dược thư quốc gia Việt Nam. 6. Bộ Y tế (2013). Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc - phụ lục 8: Thẩm định phương pháp phân tích. 7. Dhopeshwarkar, V. and Zatz, J.L. (1993). “Evaluation of xanthan gum in the preparation of sustained release matrix tablets”. Drug Delivery, 19(9). p. 999- 1017. 8. Dipti Phadtare (2015). “Extend release formulation of BCS class i drugs”, World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 4(04). p. 1676-1688. 9. Đặng Văn Giáp (2012). Phân tích dữ liệu trong kiểm nghiệm. Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh.tr. 51-56. 10. Hoàng Ngọc Hùng (2012). Tá dược và chất phụ gia dùng trong dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm. Nhà xuất bản Y Học, Hà Nội. 11. Lê Quan Nghiệm (2007). Sinh dược học và các hệ thống trị liệu mới. NXB Y học.tr. 50-60, 178-209. 12. Mohhamad Hosain, JamesWW. Ayres (1996). “Relative bioavailability of a novel sustained release acetaminophen mold tablets”. International Journal of Pharmaceutical, Volume 133, p. 223-235. 13. Nguyễn Lầu Hai (2014). Xây dựng quy trình định lượng Cephalexin trong dược phẩm bằng phương pháp quang phổ UV – Vis. Luận văn tốt nghiệp ngành Hóa học. Trường Đại Học Cần Thơ. 14. Nguyễn Thị Diệp Chi (2008). Bài giảng kiểm nghiệm thực phẩm và dược phẩm. Đại học Cần Thơ, Tp. Cần Thơ. 15. Robert B. Raffa (2005). Analgensis, Antipyretic and anti-inflamatory Drug, Remington: The science and practice in pharmacy, 21th edition. pp. 1541-1542. 16. The United States Pharmacopeial Convention (2013). The United States Pharmacopeia 36 – National Formulary 31. 17. Trần Thanh Đức (2012). Định lượng paracetamol trong một số dược phẩm trên địa bàn thành phố Cần Thơ bằng phương pháp UV – Vis. Luận văn tốt nghiệp Đại học. Trường Đại Học Cần Thơ. 18. Trần TửAn (2005). Kiểm nghiệm dược phẩm. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 42 19. Trần Tứ Hiếu (2008). Phân tích trắc quang phổ hấp thụ UV-Vis. Tái bản lần 2. Hà Nội. NXB Đại học Quốc gia Hà Nội. 20. Trần Thị Thu Hằng (2014). Dược Lực Học. Nhà xuất bản Phương Đông.tr. 199- 200. 21. Trần Cao Sơn, Phạm Xuân Đà, Lê Thị Hồng Hảo và Nguyễn Thành Trung (2010). Thẩm định phương pháp trong phân tích hóa học và vi sinh vật. Nhà Xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. Viện kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm quốc gia Hà Nội. 22. Võ Thùy Ngân (2008). Nghiên cứu kỹ thuật và quy trình bào chế viên PTKD chứa diltiazem 90 mg. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ dược học. Trường Đại Học Y Dược Tp. Hồ Chí Minh. Website 23.Andrew D. Trafford, Roger D. Jee và các cộng sự (1999). A rapid quantitative assay of intact paracetamol tablets by reflectance near-infrared spectroscopy. t. Access 15 May 2017. 24. Lê Nhất Tâm (2014). UV-Visiple Spectrophotometer. https://www.slideshare.net/nhattamnhattam/ph-uv-vis. Truy cập ngày 20.05.2017 25. Ramesh Sawant, Lokesh Bhangale và các cộng sự (2010). Validated spectrophotometric methods for simultaneous estimation of Paracetamol, Domperidone and Tramadol HCl in pure and tablet dosage form. origsite=gscholar&cbl=2042709. Access 15 May 2017 43 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Thẩm định quy trình phân tích theo USP Loại quy trình phân tích Loại 1 Loại 2 Loại 3 Loại 4 Định lượng tạp Giới hạn tạp Độ đúng + + * * - Độ chính xác + + - - - Tính đặc hiệu + + + * + Giới hạn phát hiện - - + * - Giới hạn định lượng - + - * - Tính tuyến tính + + - * - Miền giá trị + + * * - *: có thể được thẩm định tùy thuộc vào yêu cầu của mỗi quy trình. Loại 1: định lượng nguyên liệu hay thành phẩm chính của thuốc. Loại 2: xác định tạp chất trong nguyên liệu hay sản phẩm phân hủy trong thuốc. Loại 3: định lượng hoạt chất phóng thích trong đo độ hòa tan. Loại 4: định tính. 44 Phụ lục 2: Độ hấp thụ của mẫu giả lập, giả dược ở bước sóng 257 nm khi khảo sát độ đặc hiệu 45 Phụ lục 3: Khảo sát tính tuyến tính ở bước sóng 257 nm 46 Phụ lục 4: Độ hấp thụ của mẫu khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm 47 Phụ lục 5: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 90% khi khảo sát độ đúng 48 Phụ lục 6: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 100% khi khảo sát độ đúng 49 Phụ lục 7: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 110% khi khảo sát độ đúng 50 Phụ lục 8: Độ hấp thụ của mẫu giả lập, giả dược ở bước sóng 257 nm khi khảo sát độ đặc hiệu trong đo độ hòa tan 51 Phụ lục 9: Khảo sát tính tuyến tính ở bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 52 Phụ lục 10: Độ hấp thụ của mẫu sau 15 phút khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 53 Phụ lục 11: Độ hấp thụ của mẫu sau 30 phút khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 54 Phụ lục 12: Độ hấp thụ của mẫu sau 1 giờ khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 55 Phụ lục 13: Độ hấp thụ của mẫu sau 2 giờ khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 56 Phụ lục 14: Độ hấp thụ của mẫu sau 3 giờ phút khi khảo sát độ chính xác tại bước sóng 257 nm trong đo độ hòa tan 57 Phụ lục 15: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 50% khi khảo sát độ đúng trong đo độ hòa tan 58 Phụ lục 16: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 80% khi khảo sát độ đúng trong đo độ hòa tan 59 Phụ lục 17: Độ hấp thụ của mẫu thêm chuẩn hàm lượng 100% khi khảo sát độ đúng trong đo độ hòa tan 60 Phụ lục 18: Độ hấp thụ của mẫu Tylenol 650 mg Extended Release