Thiết kế và nghiên cứu hệ thống bioreactor cho cây dứa cayenne

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** NGUYỄN BẰNG PHI THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CƢ́U HÊ ̣THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DƢ́A CAYENNE Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Thành phố Hồ Chí Minh -2006- 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ***000*** THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CƢ́U HÊ ̣THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DƢ́A CAYENNE Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Giáo viên hƣớng dẫn Sinh viên thực hiện TRẦN THỊ DUNG NGUYỄN BẰNG PHI NGUYỄN VĂN HÙNG Thành phố Hồ Chí Minh -2006- 3 MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY ************ DESIGN AND RESEARCH BIOREACTOR SYSTEM FOR CAYENNE PINEAPPLE Graduation thesis Major: Biotechnology Professor Student TRAN THI DUNG NGUYỄN BẰNG PHI NGUYỄN VĂN HÙNG Ho Chi Minh City -2006- 4 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC NIÊN KHÓA: 2002 – 2006 SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN BẰNG PHI Thành phố Hồ Chí Minh 2006 5 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE GVHD: TS. TRẦN THỊ DUNG SVTH: NGUYỄN BẰNG PHI TS. NGUYỄN VĂN HÙNG MSSV: 02126078 Thành phố Hồ Chí Minh 2006 6 LỜI CẢM TẠ Để hoàn tất cuốn luận văn này tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giảng dạy, góp ý, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến: -Ba mẹ đã dày công nuôi dưỡng, dạy dỗ con -Các Thầy cô Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. - TS.TRẦN THỊ DUNG, Trưởng Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. - TS.NGUYỄN VĂN HÙNG, Trưởng Bộ môn điều khiển tự động khoa Cơ khí Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh -KS.NGÔ THANH HOÀNG, Giảng viên khoa Cơ khí- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh -Các kỹ sư ở Trung Tâm Công Nghệ Sinh Học- Trường Đại Học Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh. -Tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 Tháng 08 năm 2006 Nguyễn Bằng Phi 7 TÓM TẮT NGUYỄN BẰNG PHI, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2006. “THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE” Hội đồng hướng dẫn:  TS. Trần Thị Dung  TS.Nguyễn Văn Hùng Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Công nghệ sinh học-Trường Đại học Nông Lâm Tp. HCM trên đối tượng cây dứa Cayenne in vitro. Tiến hành nhân chồi dứa Cayenne bằng bioreactor. Mẫu cấy là chồi dứa 3 tháng tuổi của phòng Nuôi cấy mô thực vật, Bộ môn Công Nghệ Sinh Học- Đại Học Nông Lâm tp.HCM. Chồi dứa nuôi cấy 6 tuần bằng bioreactor. Quá trình thực hiện bao gồm 2 giai đoạn : +Giai đoạn 1: Thiết kế hệ thống bioreactor sục khí tự tạo và bioreactor ngâm chìm định kỳ tự tạo. +Giai đoạn 2: Nghiên cứu hệ thống bioreactor trên qua 2 thí nghiệm : Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố thể tích dinh dưỡng trong hệ thống bioreactor sục khí đối với hệ số nhân chồi Thí nghiệm 2: Thay đổi yếu tố thời gian đối vơi hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ(Temporary immersion bioreactor) Những kết quả thu được : +Bioreactor sau khi thiết kế đã hoạt động tốt. +Hình thức nuôi cấy cây dứa bằng bioreactor sục khí là không phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Thể tích môi trường 1,5L cho kết quả khả quan hơn so với thể tích 1L khi nuôi cấy bằng bioreactor sục khí liên tục. +Bioreactor sục khí liên tục giúp cho cây dứa phát triển tốt hơn so với bioreactor sục khí gián đoạn. 8 +Bioreactor ngâm chìm định kỳ là loại bioreactor phù hợp cho sự phát triển của cây dứa. +Bioreactor ngâm chìm định kỳ với thời gian ngâm chìm định kỳ 10’/2h cho hiệu quả nhân chồi dứa tốt nhất. 9 MỤC LỤC Trang Tóm tắt luận văn ......................................................................................................... 7 Danh sách các bảng .................................................................................................... 11 Danh sách các hình ..................................................................................................... 12 Danh mục viết tắt ........................................................................................................ 13 Phần 1 : Giới thiệu 1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................ 14 1.2. Mục đích-yêu cầu ................................................................................................. 15 1.3. Giới hạn đề tài ...................................................................................................... 15 Phần 2 : Tổng quan tài liệu 2.1. Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa ........................................................ 16 2.2.Phân loại .............................................................................................................. 17 2.3. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam ............................. 18 2.4. Tình hình sản xuất và sản lượng dứa ................................................................... 20 2.5. Giới thiệu về nuôi cấy mô ................................................................................... 22 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng trong nuôi cấy invitro ...................................................... 25 2.7. Tổng quan về bioreactor ...................................................................................... 28 2.8. Giới thiệu các phương pháp nhân chồi cây dứa .................................................. 34 2.9. Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nuôi cấy ngâm chìm điṇh kỳ .................. 38 2.10. Ảnh hưởng hệ thống ngâm chìm định kỳ đến chất lượng cây trồng ................. 40 2.11. Ảnh hưởng của hệ thống ngập chìm đến chi phí sản xuất ................................. 44 2.12. Các nghiên cứu và ứng dụng bioreactor trên đối tượng cây dứa ...................... 44 Phần 3 : Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu 3.1. Thời gian và địa điểm .......................................................................................... 45 3.2 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 45 3.3 Vật liệu ................................................................................................................. 45 3.4. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 45 3.4.1Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) ..................................................................................................... 45 10 3.4.2 Tiến hành thí nghiệm ......................................................................................... 48 3.5. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 50 Phần 4 : Kết quả và thảo luận 4.1 Thiết kế hệ thống tự động cho bioreactor sục khí tự tạo và ngâm chìm định kỳ (TIB) ........................................................................................................................... 51 4.1.1Thiết kế hệ thống tự động bioreactor sục khí tự tạo ........................................... 51 4.1.2 Thiết kế hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ tự động ................................ 51 4.2 Kết quả thí nghiệm ............................................................................................... 53 4.2.1 Thí nghiệm 1 Khảo sát hiệu quả nhân chồi dứa bằng bioreactor sục khí liên tục. .......................................................................................... 53 4.2.2 Thí nghiệm 2 : Ảnh hưởng của thời gian ngâm chìm định kỳ đến khả năng nhân chồi dứa bằngTIB ............................................................................... 55 Phần 5 : Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận................................................................................................................ 60 5.2. Đề nghị ............................................................................................................... 60 Tài liệu tham khảo ...................................................................................................... 61 Phần phụ lục ............................................................................................................... 63 11 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng Trang Bảng 3.1 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1a ........................................................... 45 Bảng 3.2 Các nghiệm thức của thí nghiệm 1b ........................................................... 45 Bảng 3.3 Các nghiệm thức của thí nghiệm 2 ............................................................. 45 Bảng 4.1- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1a .................................................... 49 Bảng 4.2- Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí liên tục ........................................................................ 49 Bảng 4.3- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 1b .................................................... 51 Bảng4.4- Ảnh hưởng của yếu tố thể tích đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor sục khí gián đoạn .................................................................... 51 Bảng 4.5- Các chỉ tiêu theo dõi của thí nghiệm 2 ...................................................... 53 Bảng 4.6- Ảnh hưởng của yếu tố thời gian ngâm chìm đến hệ số nhân chồi của cây dứa Cayenne trong bình bioreactor TIB .............................................................. 54 12 DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình Trang Hình 2.1- Cấu trúc bioreactor ............................................................................ 26 Hình 3.1- Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor sục khí hình cầu kiểu Hàn Quốc .... 42 Hình 3.2-Sơ đồ lắp ráp hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ.......................... 43 Hình 4.1-Bioreactor sục khí .................................................................................. 47 Hình 4.2- Sơ đồ mạch điện thiết kế cho TIB tự động ........................................... 47 Hình 4.3-Hộp điều khiển tự động TIB tự chế ....................................................... 48 Hình 4.4-Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình bioreactor sục khí liên tục và sục khí gián đoạn .............................................................................................. 50 Hình 4.5- Chồi dứa sau 4 tuần nuôi cấy trong bình TIB 10’/2h ........................... 53 Hình 4.6-Biểu đồ hệ số nhân chồi ......................................................................... 55 13 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BAP : 6-benzylaminopurine GA3 : Gibberellic acid IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole-3-butyric acid NAA : -Naphthaleneacetic acid TDZ : Thidiazuron MS : Môi trường Murashige và Skoog, 1962 TIB : Temporary immersion bioreactor 14 Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Nước ta thuộc vùng nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm khá phù hợp cho nhiều loại cây trồng khác nhau phát triển. Dứa là cây ăn quả nhiệt đới, là một trong ba loại cây ăn quả hàng đầu của nước ta (chuối-dứa-cam quýt) dùng để ăn tươi, đặc biệt có thể chế biến xuất khẩu. Chính vì vậy, cây dứa được trồng ở nhiều vùng trong nước và với điều kiện thích hợp nhiệt độ và ẩm độ cao thì cây dứa có thể sinh trưởng quanh năm. Do là loại cây không kén đất, dứa có thể trồng ở vùng gò đồi, đất dốc (200 trở xuống), đất xấu nghèo dinh dưỡng. Vì vậy chúng ta có thể nói cây dứa giúp con người tận dụng quỹ đất để có thêm sản phẩm và mang lại hiệu quả kinh tế khi thu hoạch. Dứa còn dùng để chiết xuất enzyme bromelin dùng trong công nghiệp thuộc da, vật liệu làm film. Quả dứa dùng để chế biến đồ hộp, làm rượu, giấm, nước ép, nước cô đặc, làm bột dứa dùng cho giải khát….. Lá dứa dùng để lấy sợi (2-2.5% cellulose). Chính vì khả năng ứng dụng khá lớn của cây dứa mà cây dứa ngày càng chiếm vị thế quan trọng được thể hiện qua năm 1993 thì kim ngạch xuất khẩu chỉ đạt 658 triệu đô la Mỹ và cho đến năm 1998 thì đã đạt 3450 triệu đô la Mỹ. Để phục vụ nhu cầu ngày càng cao của con người thì việc tận dụng lại chồi con của cây dứa từ cây mẹ không mang lại hiệu quả kinh tế. Do những cây này thường cho quả nhỏ dần trong các mùa vụ sau. Việc cung ứng đủ giống dứa đạt chất lượng và sạch bệnh là vấn đề cấp thiết. Nhân giống vô tính in vitro có thể đáp ứng được những yêu cầu về chất lượng đồng đều với số lượng lớn. Tuy nhiên việc nhân chồi dứa bằng phương pháp nuôi cấy mô vi nhân giống tốn nhiều chi phí về lao động, phải cấy từng chai một trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt, và phải cấy chuyền sau khoảng 4-6 tuần do cạn kiệt môi trường dinh dưỡng. Việc sản xuất giống ở quy mô công nghiệp khó có thể thực hiện một cách tự động hóa được. Từ những thực trạng đó, năm 1981 Takayama lần đầu tiên ứng dụng bioreactor để nhân giống với số lượng lớn trên đối tượng cây Begonia. Qua quá trình phát triển, nhiều kiểu bioreactor khác nhau ra đời như : bioreactor sục khí, bioreactor khuấy, bioreactor ngâm chìm định kỳ....Trong đó, bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng đem lại hiệu quả cao hơn phương pháp nhân giống thông thường trên 15 môi trường thạch và phương pháp nuôi cấy trong dịch lỏng có khuấy và sục khí liên tục, đồng thời cây con khi ra vườn cũng tốt hơn so với cây con nuôi ở môi trường thạch. Hiện nay ở Việt Nam những nghiên cứu về bioreactor còn rất ít, đặc biệt là trên đối tượng cây dứa. Do vậy, đề tài : “ THIẾT KẾ VÀ NGHIÊN CỨU HỆ THỐNG BIOREACTOR CHO CÂY DỨA CAYENNE” được tiến hành tại Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học Đại Học Nông Lâm Tp.HCM. 1.2 Mục đích - Yêu cầu Mục đích Xác định được cấu trúc, cách vận hành và mô hình của hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng (temporary immersion bioreactor (TIB)) cho cây dứa. So sánh hiệu quả nhân chồi giữa 2 kiểu bioreactor : ngâm chìm định kỳ và sục khí. Xác định thời gian ngâm chìm định kỳ trong TIB thích hợp để cho hiệu quả nhân chồi cây dứa tốt nhất. Yêu cầu Nắm được cấu trúc và cách vận hành hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ trong môi trường lỏng(TIB) Đánh giá hiệu quả nhân chồi của hệ thống bioreactor ngâm chìm định kỳ(TIB) 1.3 Giới hạn đề tài : - Do giới hạn về thời gian và điều kiện trang thiết bị thí nghiệm nên đề tài chỉ tiến hành quá trình nhân chồi trong phòng thí nghiệm, chưa thực hiện thí nghiệm ngoài đồng - Do giới hạn về kinh phí nên hệ thống điều khiển chưa kiểm soát các yếu tố pH, dinh dưỡng, ánh sáng ... trong quá trình nuôi cấy một cách tự động. 16 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm thực vật học và sinh thái cây dứa  Đặc điểm thực vật học Dứa là cây thân thảo lâu năm, thuộc lớp đơn tử diệp. Sau khi thu hoạch quả các mầm nách ở thân tiếp tục phát triển và hình thành một cây mới giống như cây trước; quả thứ hai thường bé hơn quả trước. Cây dứa trưởng thành cao đến 1 m và rộng 0,5 m trong khi cây dứa Smooth Cayenne trưởng thành cao 1,5 m và có đường kính từ 1,3 – 1,5 m. Đây là giống dứa được trồng nhiều nhất trên thế giới. Hoa Hoa gồm có 3 lá đài, 3 cánh hoa, 6 nhị đực xếp thành 2 vòng tròn, 1 nhị cái có 3 tâm bì và bầu hạ. Cánh hoa màu xanh, đỏ tía, gốc có màu trắng nhạt và trên mặt cánh hoa có những vảy. Tràng hoa dạng ống dài hơi loe ở phía đầu, ở giữa lồi lên 3 núm nhụy tím mờ của vòi nhụy. Hoa tự bất thụ (self-sterile) và phát triển quả không hạt; thụ phấn nhờ gió không xảy ra và sinh sản hữu tính hiếm thấy trong tự nhiên. Nhân giống vô tính là hình thức sinh sản tiêu biểu sử dụng chồi bao gồm chồi đỉnh, chồi bên và chồi rễ. Quả Quả dứa thuộc loại quả tụ do 100 – 200 quả nhỏ hợp lại. Các giống khác nhau thì hình dạng quả và mắt quả cũng khác nhau. Bộ phận ăn được của dứa là do trục của chùm hoa và lá bắc phát triển nên. Sau khi hoa tàn thì quả bắt đầu phát triển. Hạt Hạt dứa nhỏ, màu tím đen, có vỏ và nội nhủ rất cứng, tỉ lệ nảy mầm thấp và bất thường nếu không qua tiền xử lí. Mỗi quả con chỉ có vài hạt. Dứa thường không hạt nếu để thụ phấn tự do. Hạt dứa thường do thụ phấn nhân tạo và được sử dụng trong các chương trình lai tạo giống mới. Thân Thân cây dứa chia làm 2 phần: một phần trên mặt đất và một phần dưới mặt đất. Phần ở trên thường bị các lá che kín nên khó nhìn thấy. Khi cây đã phát triển đến mức độ nhất định, có thể dùng các mầm ngủ trên các đốt để nhân giống. Lá 17 Lá dứa mọc trên thân cây theo hình xoắn ốc. Lá thường dày, không có cuống, hẹp ngang và dài. Bề mặt và lưng lá thường có một lớp phấn trắng hoặc một lớp sáp có tác dụng làm giảm độ bốc hơi nước ở lá. Các giống dứa thường có gai nhọn và cứng ở mép lá, nhưng cũng có giống lá không gai như Cayenne. Tùy theo giống, một cây dứa trưởng thành có khoảng 60 – 70 lá. Rễ Rễ dứa gồm rễ cái và rễ nhánh (mọc ra từ phôi hạt); rễ bất định (mọc ra từ mầm rễ trên các đốt của các loại chồi dứa trước khi đem trồng). Rễ dứa thuộc loại ăn nông, phần lớn do nhân giống bằng chồi nên mọc từ thân ra, rễ nhỏ và phân nhiều nhánh. Bộ rễ dứa thường tập trung ở tầng đất 10 – 26 cm và phát triển rộng đến 1 m. Sinh thái cây dứa Dứa là cây ăn quả nhiệt đới thích nhiệt độ cao, nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng 28 – 320C, nhiệt độ giới hạn 15 – 400C. Nhiệt độ có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến quá trình hình thành quả chín của quả do đó là yếu tố đầu tiên ảnh hưởng đến phẩm chất của quả. Yếu tố quan trọng không kém là chế độ nước bao gồm lượng mưa hàng năm và phân bố mưa. Dựa vào 2 chỉ tiêu trên, các vùng sinh thái thích hợp được thiết lập đảm bảo việc trồng dứa trên diện rộng đạt năng suất cao. Theo kinh nghiệm, lượng mưa thích hợp nhất cho dứa là 1000 – 1.500 mm. Tuy nhiên dứa vẫn phát triển tốt ở những vùng có lượng mưa thấp nhưng thuộc khí hậu đại dương, quanh năm ấm mát. Cây dứa ưa ánh sáng tán xạ hơn ánh sáng trực xạ. Lượng chiếu sáng thích hợp làm tăng năng suất và cải thiện phẩm chất hương vị quả. Độ chiếu sáng còn ảnh hưởng đến màu sắc quả. Dứa có bộ rễ tập trung ở lớp đất mặt do đó yêu cầu đất phải tơi xốp, thoáng, có kết cấu hạt, không có nước đọng vào mùa mưa. Về pH, các giống khác nhau có yêu cầu khác nhau. pH 5,6 – 6,0 có thể lên đến 7,5 đối với giống Cayenne; nhóm dứa Queen có thể sinh trưởng tốt trên đất phèn pH 4,0 trong khi giống Spanish (các giống dứa ta) thích nghi với pH từ 4,5 – 5,0. 2.2.Phân loại Dứa có tên khoa học là Ananas comosus (L.) Merr thuộc:  Phân lớp: Magnoliophyta 18  Lớp: Liliopsida  Bộ: Poales  Họ: Bromeliaceae  Giống: Ananas  Loài: A. comosus 2.3. Các nhóm dứa chính và các giống dứa phổ biến ở Việt Nam Các nhóm dứa chính Dứa gồm khoảng 50 giống và 2000 loài phân bố ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới châu Mỹ . Các giống dứa đang được trồng trọt hiện nay được chia thành 3 nhóm: nhóm dứa Cayenne, nhóm dứa Queen (còn gọi là hoàng hậu) và nhóm Spanish (nhóm Tây Ban Nha). Nhóm Cayenne Lá dài, không có gai hoặc có một ít ở đầu chóp lá, dày, lòng máng lá sâu, có thể dài hơn 100 cm, hoa có màu xanh nhạt, hơi đỏ, quả có dạng hình trụ, mắt rất nông, quả nặng bình quân 1,5 – 2,0 kg rất phù hợp cho việc chế biến làm đồ hộp. Khi chưa chín quả màu xanh đen, sau đó chuyển dần và đến lúc chín quả có màu đỏ hơi pha da đồng. Cây đẻ yếu, trung bình chỉ cho 1 – 2 chồi một gốc trong một năm. Trong điều kiện chăm sóc kém có thể không có chồi cuống. Quả dứa Cayenne chứa nhiều nước và vỏ mỏng nên rất dễ thối khi vận chuyển. Vì thế việc chọn vùng, địa điểm trồng và qui hoạch đồng ruộng phải quan tâm đến đặc điểm này. Nhóm Queen Lá hẹp, cứng, có nhiều gai ở mép. Mặt trong của lá có 3 đường vân trắng hình răng cưa chạy song song theo chiều dài, hoa có màu xanh hồng. Quả có nhiều mắt, mắt nhỏ và lồi, cứng do đó tương đối dễ vận chuyển. Thịt quả vàng, ít nước và có vị thơm hấp dẫn. Ưu điểm của nhóm dứa này là không kén đất, có thể trồng trên các loại đất nghèo dinh dưỡng, cây có hệ số nhân giống cao, trung bình 4 – 6 chồi/gốc, có thể chịu được bóng râm. Thịt quả dòn, có màu sắc và hương vị phù hợp để ăn tươi. 19 Nhược điểm: quả bé, trọng lượng bình quân chỉ đạt từ 500 – 700 g. Dạng quả hơi bầu dục khó thao tác trong khi chế biến. Thịt quả có nhiều khe hở, không chặt nên khó đạt tiêu chuẩn để làm đồ hộp xuất khẩu. Nhóm Spanish Lá mềm, mép lá cong, hơi ngả về phía lưng, hoa tự có màu đỏ nhạt. Quả ngắn, kích thước to hơn so với nhóm Queen nhưng bé hơn so với nhóm Cayenne. Trọng lượng quả trung bình xấp xỉ 1kg. Khi chín vỏ quả có màu nâu đỏ, sẫm hơn nhiều so với quả Cayenne và cũng có dạng hình trụ cân đối. Thịt quả màu vàng trắng không đều, mắt quả sâu, vị hơi chua. Chồi ngọn và đặc biệt là chồi cuống nhiều, ảnh hưởng đến phẩm chất quả. Nhìn chung, các giống dứa trong nhóm Spanish tuy dễ trồng, chịu được bóng nhưng phẩm chất kém nên được trồng chủ yếu ở qui mô hộ gia đình, không nên tập trung thành vùng lớn. Ngoài ba nhóm dứa trên, còn có nhóm Abacaxi tách ra từ nhóm Spanish nhưng mức độ phổ biến còn thấp.  Các giống dứa phổ biến ở Việt Nam Dứa hoa Phú Thọ Còn được gọi là Queen cổ điển. Nó có những đặc tính điển hình nhất của giống Queen như quả nhỏ; mắt nhỏ, lồi; gai ở rìa lá nhiều và cứng…Đây là giống nhập nội vào Việt Nam khoảng đầu thế kỉ XX, được trồng rải rác ở các tỉnh phía Bắc và miền Trung. Ưu điểm nổi bật của dứa hoa Phú Thọ là thịt vàng giòn, rất thơm và hấp dẫn nên nó được dùng để pha trộn vào nước dứa ép từ các giống khác hay các loại quả khác để tạo ra mùi thơm đặc trưng. Giống này dễ trồng, chịu được đất xấu, đất chua, dễ ra hoa trái vụ. Nhược điểm là quả nhỏ, năng suất nhìn chung thấp, khó chế biến đồ hộp nên hiệu quả kinh tế không cao. Dứa hoa Na Hoa (Hoa Bali) 20 Giống dứa này có đặc tính của nhóm mắt nhỏ, lồi, khi chín vỏ và thịt quả đều có màu vàng. So với dứa hoa Phú Thọ, giống này có lá ngắn và to, quả cũng to hơn. Bình quân trọng lượng từ 0,9 – 1,2 kg/quả. Khi chín kĩ, nước trong thịt quả cũng nhiều hơn. Đây là giống dứa khá phổ biến ở các vùng trồng tập trung với ưu điểm dễ canh tác, có thể duy trì năng suất đến vụ thứ 2, thứ 3 nếu áp dụng kĩ thuật chăm sóc thích hợp; hệ số nhân giống tương đối cao. Tuy nhiên, do có mắt sâu, quả hơi bầu dục nên khó đạt tỉ lệ cái cao khi chế biến đồ hộp, hiệu quả kinh tế thấp. Dứa Kiên Giang và dứa Bến Lức (từ địa phƣơng là “khóm”) Một số tác giả liệt kê các giống này vào cùng với giống dứa Na Hoa. Trong điều kiện khí hậu miền Nam, cây sinh trưởng mạnh, quả có kích thước lớn hơn so với trồng ở miền Bắc, đồng thời một số đặc điểm cũng khác đi. So với dứa Bến Lức, dứa Kiên Giang có dạng hình trụ hơn, mắt quả to hơn và thịt quả có nhiều nước hơn. Đây là những giống trồng khá phổ biến ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Nhóm dứa Cayenne Đặc điểm của nhóm dứa này là lá không gai ngoài một vài gai ở đầu mút lá, lá dày, lòng máng sâu, có nhiều phấn ở mặt dưới nhất là ở phía gốc. Giống này du nhập vào nước ta cuối những năm ba mươi, đầu những năm bốn mươi ở một số địa phương miền Bắc chủ yếu trong những đồn điền do người Pháp quản lí. Chân Mộng (thuộc Vĩnh Phú) là một trong những nơi tiếp nhận giống đầu tiên, về sau người ta quen gọi là Cayenne Chân Mộng. Các giống Cayenne được trồng phổ biến hiện nay là giống Cayenne Thái Lan, Cayenne Trung Quốc và Cayenne Lâm Đồng. Theo tài liệu của Viện cây ăn quả miền Nam , giống Cayenne Thái Lan và Trung Quốc đều cho trái to và phát triển tốt; tuy nhiên là giống mới nhập nội nên cần có thời gian để kết luận. Với ưu điểm năng suất cao, quả to và dễ thao tác trong chế biến làm đồ hộp, có chất lượng cao cả về hóa sinh lẫn tỉ lệ cái nên giống Cayenne đang được chú ý phổ biến ra diện rộng. Các vùng trồng dứa nguyên liệu được hình thành nhằm cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy chế biến dứa. 2.4. Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa trên thế giới 21 Theo thống kê năm 2001 sản lượng dứa của thế giới đạt 13.739.000 tấn, phân bố theo các châu lục và khu vực như sau: Châu Phi 2.229.000 tấn, Bắc Mỹ 1.512.000 tấn, Nam Mỹ 2.556.000 tấn, Châu Á 7.275.000 tấn, Châu Phi 2.000 tấn và Châu Đại Dương 164.000 tấn. Các nước có sản lượng dứa cao như Thái Lan 2.300 tấn, Philipin 1.572 tấn, Brazil 1.442 tấn, Trung Quốc 1.284 tấn, Nigeria 881 tấn… Tình hình sản xuất và sản lƣợng dứa ở Việt Nam Tình hình sản xuất Theo tài liệu thống kê , diện tích trồng dứa cả nước năm 1995 là 25.734 ha đến năm 2000 lên đến 36.541 ha. Tính đến năm 2000 diện tích trồng dứa của miền Bắc là 9.675 ha chiếm 26,48% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu ở vùng Đông Bắc và đồng bằng sông Hồng; trong khi diện tích gieo trồng của miền Nam là 26.866 ha chiếm 73,52% diện tích trồng dứa cả nước, chủ yếu tập trung ở vùng đồng bằng sông Cửu Long. Các tỉnh có diện tích gieo trồng dứa khá lớn là Kiên Giang (9.200 ha), Tiền Giang (7.803 ha), Bạc Liêu (3.625ha), Cần Thơ (1.338 ha), Long An (661 ha), Quảng Nam (2.320 ha), Bình Định (500 ha), Thanh Hóa (2.900 ha), Ninh Bình (1.572 ha), Nghệ An (600 ha), Bắc Giang (657 ha)… Bên cạnh đó, các tỉnh miền Đông Nam Bộ có diện tích dứa tăng đáng kể trong khoảng thời gian từ năm 1998 đến năm 2000: Tp. HCM tăng từ 76 ha lên đến 150 ha, Đồng Nai tăng từ 61 ha lên 123 ha, Bình Thuận tăng từ 12 ha lên 40 ha. Hiện nay cây dứa Cayenne được các nhà nông học đánh giá cao do phù hợp với đất đai thổ nhưỡng của các tỉnh miền Trung, Tây Nguyên và các vùng đất nhiễm phèn khác. Nhiều dự án mở rộng vùng trồng dứa Cayenne được thực hiện ở khu vực Đông Nam Bộ như Chương trình phát triển cây dứa Cayenne ở Tp. HCM thời kì 2003 – 2005 , ở khu vực Tây Nguyên (Gia Lai, Đaklak) . Một số tỉnh miền Trung như Bình Định, Phú Yên …cũng đề nghị Tp. HCM cung cấp giống dứa Cayenne để nhân rộng .  Sản lƣợng dứa Theo tài liệu thống kê sản lượng dứa của cả nước năm 2000 là 291.428 tấn phân bố trên các khu vực trồng dứa cả nước như sau: miền Bắc đạt 57.246 tấn, khu vực Bắc trung bộ 25.218 tấn, miền Nam 234.164 tấn trong đó các tỉnh thuộc khu vực Duyên Hải Nam Trung Bộ đạt 20.832 tấn, Tây Nguyên 2.357 tấn, khu vực Đông Nam Bộ 22 1.417 tấn và khu vực có sản lượng dứa lớn nhất trong nước – Đồng Bằng Sông Cửu Long 209.558 tấn. Các tỉnh có sản lượng dứa cao là Kiên Giang (89.094 tấn), Tiền Giang (79.880 tấn), Bạc Liêu (24.860 tấn), Ninh Bình (20.315 tấn), Quảng Nam (15.724 tấn), Thanh Hóa (11.107 tấn), Hà Tây (1.725 tấn), Bắc Giang (1.495 tấn), Phú Thọ (1.159 tấn)… 2.5. Giới thiệu về nuôi cấy mô Nuôi cấy mô tế bào thực vật Nuôi cấy mô tế bào thực vật hay còn gọi là nuôi cấy in vitro là công cụ cần thiết trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu cơ bản và ứng dụng của ngành công nghệ sinh học. Nhờ áp dụng kĩ thuật nuôi cấy mô, con người đã thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh hơn gấp nhiều lần so với tự nhiên. Do đó tạo ra hàng loạt cá thể mới giữ nguyên tính trạng di truyền của cơ thể mẹ, làm rút ngắn thời gian đưa giống mới vào sản xuất. Hơn nữa dựa vào kĩ thuật nuôi cấy mô có thể duy trì và bảo quản nhiều giống cây trồng quí hiếm để phục tráng giống cây trồng. Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật bắt đầu từ một mảnh nhỏ thực vật vô trùng được đặt trong môi trường dinh dưỡng thích hợp. Chồi mới hay mô sẹo mà mẫu cấy này sinh ra bằng sự tăng sinh được phân chia và cấy chuyền để nhân giống. Lịch sử phát triển Năm 1838, hai nhà sinh vật học Đức là Schleiden và Schwann đề xướng học thuyết tế bào và nêu rõ: Mọi sinh vật phức tạp đều gồm nhiều sinh vật nhỏ, các tế bào hợp thành, các tế bào phân chia mang thông tin di truyền chứa trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh và là những đơn vị độc lập từ đó có thể xây dựng lại toàn bộ cơ thể. Năm 1902, Haberlandt đề xướng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật để chứng minh tính toàn năng của tế bào, nghĩa là mỗi tế bào đều mang đầy đủ thông tin di truyền của cá thể. Ông tiến hành trên cây họ hòa thỏa (cây một lá mầm) một lọai cây khó thực hiện và ông bị thất bại. Năm 1922, Kote (học trò Haberlandt) và Robbins (nhà khoa học người Mỹ) đã lặp lại thí nghiệm của Haberlandt và nuôi cấy được đỉnh sinh trưởng tách ra từ đầu rễ của một loại cây thuộc họ hòa thảo tạo ra hệ rễ nhỏ và có cả rễ phụ. Tuy nhiên sự sinh 23 trưởng như vậy chỉ tồn tại trong một thời gian sau đó chậm lại và ngừng hẳn mặc dù tác giả đã chuyển sang môi trường mới. Năm 1934, White đã nuôi cấy thành công đầu rễ cây cà chua (Lycopersicum esculentum). Năm 1937, Gautheret và Nobecout đã tạo ra và duy trì được sự sinh trưởng mô sẹo cây cà rốt trong một thời gian dài trong môi trường thạch cứng. Năm 1941, Overbeck đã chứng minh được vai trò của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phôi họ cà. Trong thời gian này chất hích thích sinh trưởng nhân tạo thuộc nhóm auxin đã được nghiên cứu và tổng hợp hóa học thành công. Và năm 1948 Steward đã xác định được tác dụng của nước dừa trong nuôi cấy mô sẹo cây cà rốt Năm 1955, người ta tìm ra tác dụng kích thích phân bào của kinetin.Sau đó các chất cytokinine khác như BAP, 2 IP, Zeatin cũng được phát hiện. Năm 1957, SKoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ty lệ giữa kinetin/auxin đối với sự hình thành các cơ quan từ mô sẹo trên cây thuốc lá. Từ năm 1954, đến năm 1959 kỹ thuật tách và nuôi cấy tế bào đơn đã được phát triển, các tác giả đã gieo tế bào đơn và nuôi cấy tạo được cây hoàn chỉnh. Năm 1966, Guha và Mahheswari nuôi cấy thành công tế bào đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược. Năm1967, Bougin và Nistsh tạo thành công cây đơn bội từ túi phấn cây thuốc lá. Ứng dụng Năm 1986, một số lượng lớn cây trồng sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được tiêu thụ tên thị trường thương mại với hàng chục triệu dollar. Kỹ thuật này thể hiện một số ưu điểm đã được ứng dụng: - Nhân giống vô tính với tốc độ nhanh. - Tạo cây sạch bệnh và kháng bệnh. - Cảm ứng và tuyển lựa dòng đột biến. - Sản xuất cây đơn bội qua nuôi cấy túi phấn. - Lai xa. - Lai tế bào soma và tạo dòng protoplast. - Gây biến tính thực vật qua hấp thụ DNA và ngoại lai. - Cố định nitrogen. 24 - Cải thiện hiệu quả của quang tổng hợp. - Bảo quản nguồn gen quý. Các phƣơng pháp nuôi cấy in vitro Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng Mẫu cấy bao gồm: đỉnh sinh dưỡng, chồi đỉnh, chồi bên, có kích thước khoảng 0.58 - 1 cm. Đây là phương pháp dễ dàng nhất, mẫu sau khi vô trùng và được nuôi cấy trong môi trường thích hợp cho loại cây đó thì sau một thời gian nuôi cấy tạo thành một hay nhiều chồi. Sau đó, nuôi cấy trong môi trường có bổ sung chất kích thích sinh trưởng thì sẽ tạo thành nhiều chồi, rễ, tạo thành cây hoàn chỉnh. Nuôi cấy mô sẹo Mẫu cấy là những tế bào đỉnh sinh trưởng hay nhu mô được tách ra trong môi trường giàu auxin thì mô sẹo được hình thành. Mô sẹo là những tế bào vô tổ chức có màu trắng. Khối mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh trong môi trường không có chất kích thích sinh trưởng tạo mô sẹo. Nuôi cấy mô sẹo được thực hiện đối với những cây không có khả năng nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng. cây tái sinh từ mô sẹo có nhiều chồi hơn so với cây tái sinh từ đỉnh sinh trưởng, tuy nhiên mức độ biến dị tế bào soma của phương pháp này rất cao. Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào đơn Những khối sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng, đặt trong máy lắc thì khối sẹo dứơi tác dụng cơ học và hóa học sẽ tách ra nhiều tế bào đơn lẻ gọi là tế bào đơn. Những tế bào đơn này nuôi cấy trong môi trường đặc biệt thì sẽ tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy trong môi trường lỏng tế bào đơn tách ra và đặt trải trong môi trường thạch thì sẽ phát sinh thành những tế bào mô sẹo. Những tế bào mô sẹo này được nuôi cấy trong môi trường cytokinin/auxin thích hợp thì sẽ tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Trong chọn giống cây trồng người ta dựa vào phương pháp này để tạo ra giống mới bằng cách đột biến tế bào đơn bằng hóa chất hay phóng xạ. Nuôi cấy protoplast- chuyển gen Protoplast (tế bào trần ), thực chất là tế bào đơn được tách vỏ cellulose, có sức sống và duy trì chức năng sẵn có. Protoplast có thể tái sinh trực tiếp từ thân, lá, rễ bằng cơ học, hoặc từ những tế bào đơn sẵn có. Trong môi trường thích hợp các protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào, tiếp tục phân chia và tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 25 Trong chọn giống cây trồng người ta sử dụng phương pháp này để cải tiến giống cây trồng bằng cách cho dung hợp protoplast ở 2 protoplast cùng loài hoặc khác loài. Protoplast có khả năng hấp thu tế bào ngoại lai để cải thiện đặc tính của một số loại cây trồng mà không thông qua các phương pháp chuyển gen khác. Nuôi cấy tế bào đơn bội Hạt phấn của cây trồng được nuôi cấy trong môi trường thích hợp tạo thành mô sẹo, những mô sẹo này có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh có bộ nhiễm sắc thể n gọi là cây đơn bội. Trong nuôi cấy mô thực vật người ta sử dụng những mô sẹo này xử lý colchicin để tạo thành cây đa bội. 2.6. Các yếu tố ảnh hƣởng trong nuôi cấy in vitro Chất điều hoà sinh trƣởng Chất sinh trưởng thực vật hay còn gọi là chất điều hòa sinh trưởng thực vật là các hợp chất hữu cơ (bao gồm các sản phẩm thiên nhiên của thực vật và các hợp chất tổng hợp nhân tạo) có tác dụng điều tiết các quá trình sinh trưởng và phát triển, làm biến đổi một quá trình sinh lý thực vật nào đó, ở những nồng độ rất thấp. Chúng không phải là các chất dinh dưỡng hay các sinh tố dùng trong thực vật.  Một số chất điều hoà sinh trƣởng thƣờng dùng: Auxin Auxin là một nhóm các chất được tổng hợp chủ yếu ở đầu thân, đầu rễ, được vận chuyển đến các bộ phận khác nhau của cơ thể để kích thích sự tăng trưởng của tế bào. Các phản ứng auxin và sự tăng trưởng có liên quan với vô số quá trình sinh lý và trao đổi chất khác và mối quan hệ nhân quả giữa auxin, ARN và chuyển hóa protein không phải hoàn toàn rõ ràng. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với việc xử lý auxin là làm tăng độ kéo dài của tế bào, điều này xảy ra chỉ một vài phút sau khi xử lý. Một đặc trưng quan trọng là vách tế bào, là một vị trí quan trọng chịu sự tác động 26 của các chất điều hòa sinh trưởng thực vật (Torry và csv, 1981). Auxin làm giảm pH do kích thích sự bài xuất proton H+, pH hoạt hóa các enzym tác động nới lỏng vách tế bào và enzym tổng hợp vách tế bào, nhờ đó khởi động quá trình giản nở tế bào (Roger Prat, 1993). Auxin hoạt hóa sự sinh tổng hợp các hợp chất cao phân tử (protein, xenluloza, pectin, …) và ngăn cản sự phân giải chúng (Grodzinxki, 1981). Cytokinin Đây là chất hoạt hóa sự phân chia tế bào (Mitsuhashi và csv, 1969; Mai Trần Ngọc Tiếng, 1989), đồng thời làm tăng quá trình chuyển hóa acid nucleic và protein (Vũ Văn Vụ và csv, 1993). Cytokinin được sử dụng khá nhiều trong kỹ thuật nuôi cấy mô, những chất thường được dùng là Kinetin và BA (Benzyl Adenin). Cytokinin phá vỡ trạng thái ngủ của hạt, kích thích hạt nẩy mầm, làm tăng sự nở hoa. Cytokinin gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô bao gồm mô sẹo sinh trưởng (cals) trong mô nuôi cấy, hay việc tạo thành các mô bứu ở các cây gỗ lâu năm (Nester và csv, 1985; Taiz L. và csv, 1991). Cytokinin kích thích sự tổng hợp mới enzym Rubisco (Ribulozo-1,5-biphotphat cacboxylaza/oxygenaza) hoặc ở mức sao chép (làm tăng hoạt tính ARN-polymeraza) hoặc ở mức dịch mã (thành lập các polyriboxom) (Parthier, 1985). Ảnh hưởng của Cytokinin thấy rõ khi phối hợp sử dụng với auxin (Meredith và csv, 1970). Skoog và csv (1948) ghi nhận lượng benzyl amino purine cao có tác dụng kích thích sự tạo chồi, đồng thời ức chế sự phân hóa tạo rễ. Gibbérelline Gibbérelline đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất Gibbérelline đầu tiên được nhận dạng là acid gibbérellique hoặc là GA3, kế đến là GA4 + GA7 và GA7. Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng có sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất gắn trên nhân.  Tính chất sinh lý của Gibbérelline -Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc những phát hoa phát triển hơn. 27 Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. -Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa. -Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt. -Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi cho sự nảy mầm. -Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấy các hoạt động đối kháng: chúng dường như đối ngược với hiện tượng phân hóa tế bào. Trong nuôi cấy in vitro Gibbérelline không được sử dụng vào mục đích này, nhưng chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi thân…). Ảnh hƣởng của nguồn carbon Trong môi trường nuôi cấy, các mô không có khả năng tự dưỡng do không quang hợp đầy đủ trong điều kiện thiếu sự trao đổi khí với bên ngoài, do vậy cần cung cấp đường để giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối. Các loại đường thường được sử dụng là sucrose, d-glucose, d-fructose (Doods và Roberts, 1987). Sucrose là nguồn carbon được sử rụng rộng rãi nhất cho các loại cây, nồng độ sucrose thay đổi từ 2%-12% hoặc cao hơn tùy thuộc vào giống và tuổi phôi cấy. Ảnh hƣởng của nƣớc dừa Nước dừa (CW-coconut water) thêm vào môi trường với lượng thích hợp sẽ kích thích sự phát triển của chồi bên cũng như sự hình thành cây con (Urata và Iwanaga, 1965; Scully, 1966; Tanaka và Sakanishi, 1978). Từ việc sử dụng CW, nhiều mô thực vật được nghiền tách dịch chiết và bổ sung vào môi trường nuôi cấy có tác dụng kích thích sự phát triển phôi như nội nhũ bắp, chà là, chuối, mầm đậu, mầm lúa mì, nước chiết cà chua … nhưng thông thường các dịch chiết chỉ có tác dụng trên các loài cây trồng không cùng nguồn gốc (Trần Văn Minh, 2002). Theo Vũ Văn Vụ và csv (1993), trong CW khá giàu các hợp chất nitơ dạng khử như các acid amin, ngoài ra trong CW còn chứa các hormon sinh trưởng như cytokinine. 28 Theo sự phân tích thành phần dinh dưỡng của Tổ chức Y tế Thế giới, thì trong CW có chứa protein, cacbohydrat, canxi, sắt và một số vitamin như thiamin, riboflavin, niacin, acid ascorbic và đường. Ảnh hƣởng của than hoạt tính Phải có những thực nghiệm xác định nồng độ than hoạt tính thích hợp cho quá trình nuôi cấy. Than hoạt tính thêm vào môi trường kích thích sự phát triển phôi của cây bắp, jujube và đu đủ. Than hoạt tính thường được bổ sung vào môi trường để hấp thụ các chất độc ( dạng phenol) do cây tiết ra. Ảnh hƣởng của độ pH và Agar pH của môi trường nuôi cấy thường ở khoảng 6, thấp hơn 4,5 hoặc cao hơn 7 đều ức chế sự phát triển của mô (Nguyễn Văn Uyển, 1993 và Bùi Bá Bổng, 1995). Ảnh hƣởng của các điều kiện vật lý Ánh sáng cần thiết cho sự phát sinh hình thái của mô cấy. Trong tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần trong khoảng 1.000 lux. Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần chiếu sáng ở cường độ cao từ 3.000-10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tự dưỡng có khả năng quang hợp. Dưới cường độ ánh sáng cao, cây lùn và có màu xanh hơi giảm nhưng có tỷ lệ sống sót cao khi chuyển sang môi trường đất. Chưa có nhiều nghiên cứu về chế độ sáng trong môi trường cấy mô, nhưng thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày của bóng đèn néon huỳnh quang là thích hợp cho sự phát triển mô cấy của nhiều loài. Cấy phôi thường không sử dụng ánh sáng đèn. Theo Scozzoli và Pasini, 1992; Pinto và csv, 1994, cấy phôi đào nên để trong tối 14 ngày. Tương tự, ở cây bơ nên để 21 ngày trong tối ở nhiệt độ 210C (Lano và csv, 1995). Ngoài ra, để mô cấy phát triển tốt thì môi trường nuôi cấy phải thông thoáng và có nhiệt độ thích hợp, nhiệt độ trong phòng nuôi cấy thường được giữ ở 25-28oC (Nguyễn Văn Uyển, 1993). 2.7.Tổng quan về bioreactor Hệ thống bioreactor được thiết kế vớí mục đích cải thiện và nâng cao hiệu quả cũng như năng suất của quá trình vi nhân giống. Mô hình bioreactor được thiết kế theo dạng fermentor trong nuôi cấy vi sinh vật, tùy vào đối tượng cây mà có nhiều kiểu 29 bioreactor khác nhau nhằm mục đích nhân số lượng lớn tế bào, mô hay cơ quan trong môi trường lỏng có hệ thống làm thoáng khí. Tế bào thực vật khác với tế bào nấm men. Nếu được bảo quản trong điều kiện giống nhau thì tế bào thực vật không sinh trưởng đơn độc mà cũng không xảy ra sự sinh trưởng đồng thời giống như nấm men. Tuy nhiên bằng kỹ thuật nuôi cấy mô thì việc nhân sinh khối, nghiên cứu dinh dưỡng và sinh hóa trong môi trường lỏng thì tỏ ra hiệu quả(Gamborg, 1966; Gamborg, et al, 1968; Gamborg and Shyluk, 1970). Việc sử dụng bioreactor cho nhân giống thực vật được thực hiện đầu tiên vào năm 1981 do Takayama thực hiện trên đối tượng cây Begonia (Takayama và Miasawa,1981). Hệ thống này còn được ứng dụng có hiệu quả trên nhiều loại thực vật khác(Takayama,1991). Sử dụng một bioreactor cỡ nhỏ ( từ 4-10l) trong khoảng 1-2 tháng có thể tạo ra đến 4000-20.000 cây con. Điều này cho thấy một triển vọng lớn trong việc áp dụng bioreactor thương mại đồng thời mở ra một hướng mới trong sản xuất các sản phẩm có hoạt tính sinh học có nguồn gốc thực vật(Takayama,1991). Mục đích của nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor là tăng nhanh số lượng lớn các chồi đồng nhất và đồng thời giúp giảm chi phí trong nhân giống thực vật(Nhut et al,2004) 1. Cửa nạp nguyên liệu 2. Ống dẫn khí vào 3. Hệ thống sục khí 4. Ống dẫn nướ c 5. Ống thoát nướ c 6. Motor 7. Đai bả o v ệ 8. Thanh truyền độ n g 9. Cánh quạt 10. Bộ phận cảm biến 11. Vách ngăn 12. Lớp giữ nhiệt 13. Cửa rút nguyên liệu Hình 2.1- Cấu trúc bioreactor 30 Thuận lợi của nuôi cấy bằng bioreactor Theo Takayama và Akita (1994) thì một số thuận lợi chính của bioreactor trong vi nhân giống thực vật đó là: - Sự tiếp xúc tốt hơn giữa sinh khối thực vật với môi trường. - Không có sự hạn chế về trao đổi khí. - Có thể điều khiển sinh khối thực vật tùy theo thể tích môi trường. - Tiết kiệm được thời gian và nhân công trong việc nuôi cấy chuyền. - Dễ dàng cho nhân giống số lượng lớn tạo nhiều sinh khối. - Dễ dàng điều khiển được thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy. - Tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng hơn nếu được tăng cường không khí. - Mẫu cấy được tiếp xúc đầy đủ hơn với môi trường dinh dưỡng nên làm cho tốc độ sinh trưởng và phát triển được tăng nhanh. - Nhờ việc liên tục di chuyển trong môi trường nuôi cấy nên ít xảy ra hiện tượng ưu thế ngọn, sự ngủ của chồi biến mất và kết quả là tạo được nhiều chồi hơn. Khó khăn của nuôi cấy bằng bioreactor Mặc dù phương pháp nuôi cấy lỏng lắc và bioreactor đã tỏ ra vượt trội hơn so với các phương pháp nuôi cấy trên môi trường bán rắn nhưng bên cạnh đó nó vẫn còn có những hạn chế nhất định. Chẳng hạn như (Ziv, 2000): - Tuỳ vào từng đối tượng mà thiết kế một kiểu bioreactor thích hợp, khó áp dụng đồng loạt cho nhiều giống khác nhau. - Thường gặp hiện tượng bất thường về phát sinh hình thái như: hiện tượng thuỷ tinh thể (vitrification), hiện tượng bất thường của phôi, hiện tượng stress tế bào. Những hiện tượng trên làm giảm hiệu suất nhân giống và sản xuất sản phẩm trao đổi chất thứ cấp. Một vấn đề lớn nữa thường gặp trong nuôi cấy môi trường lỏng đó là việc nhiễm vi sinh vật. Nấm, vi khuẩn, nấm mốc và côn trùng là những nguồn gây nhiễm nghiêm trọng. Chúng là nguyên nhân chủ yếu gây mất nguồn mẫu thực vật trong các phòng thí nghiệm thương mại. Vì là môi trường lỏng nên sự lây nhiễm vi sinh vật sẽ xảy ra rất nhanh và gây hậu quả nghiêm trọng hơn so với các loại môi trường khác (rắn, bán 31 rắn). Sự lây nhiễm có thể xuất phát từ các giai đoạn thao tác chuẩn bị và điều khiển thiết bị. Trong một số phòng thí nghiệm để hạn chế nguy cơ bị nhiễm thì người ta thường tạo một không gian vô trùng trong phòng cấy bằng dòng không khí tạo áp lực dương (Ziv, 2000). Phân loại bioreactor Bioreactor khuấy thoáng khí (Aeration-agitation bioreactor) Kiểu bioreactor này thường được đề cập dưới dạng những bình phản ứng khuấy trộn (stirred tank bioreactors – STRs) có cánh khuấy chẳng hạn như: tua-bin, chân vịt, mái chèo hay ruy-băng xoắn ốc. Mặc dù STRs có ý nghĩa trong nuôi cấy tạo huyền phù nhưng nó cũng gây ra những lực khuấy mạnh. Tuy nhiên, gần đây STRs đã được cải tiến nhằm khắc phục các bất lợi trên. Kiểu cánh khuấy ruy-băng xoắn ốc được xem là có hiệu quả đối với nuôi cấy huyền phù tế bào thực vật có mật độ cao và nuôi cấy tạo phôi soma (Archambault et al., 1994). Nói chung thì bioreactor dạng này thường được sử dụng trong nuôi cấy tạo phôi. Nhưng hiện nay vẫn còn quá ít các nghiên cứu tiến hành so sánh hiệu quả giữa các kiểu bioreactor khác nhau.  Bioreactor hình trống quay (Rotating drum bioreactor) Kiểu bioreactor này gồm có một bình chứa có dạng hình trống được gắn trên một trục quay, trục này có nhiệm vụ nâng đỡ và quay bình chứa. Bình được quay với tốc độ khoảng 2 – 6 vòng/phút nhằm hạn chế tối đa lực xé làm tổn thương tế bào. Một bình phản ứng không có tấm ngăn cách có thể được sử dụng trong nuôi cấy tạo cây con thông qua quá trình tạo chồi và tạo phôi (Takayama và Akita, 1994).  Bioreactor màng lọc xoay (Spin filter bioreactor) Kiểu bioreactor này có một màng lọc xoay có nhiệm vụ hòa trộn huyền phù nuôi cấy và đồng thời lấy đi môi trường đã sử dụng và bổ sung môi trường mới vào. Các màng lọc quay khuấy trộn môi trường không làm xé rách màng tế bào chính là nhờ vào việc tạo ra được những đường khuấy mỏng. Để có thể duy trì được lâu sự tăng trưởng liên tục của mô sẹo và sự phát triển của phôi đạt được sự nhân nhanh, người ta đã thiết kế một bioreactor có hai màng lọc cùng quay. Một chiến lược nhằm nuôi cấy hiệu quả hơn đó là trong giai đoạn tăng sinh tế bào, người ta tiến hành nuôi cấy liên tục. Nhằm tạo sự đồng nhất, ổn định điều kiện nuôi cấy cho các tế bào và duy trì được 32 nhóm tế bào đang tăng trưởng phù hợp cho sự phát triển tạo phôi bất cứ lúc nào. Giai đoạn thứ hai của bioreactor là tạo phôi theo chu kỳ. Sự phát triển của phôi có thể được điều khiển thông qua nguồn dinh dưỡng thiết yếu hoặc các thành phần khí. Việc tạo ra các cây con thông qua con đường tạo phôi soma được nhận thấy là thích hợp nhất đối với quá trình nhân sinh khối bằng cách sử dụng bioreactor màng lọc xoay (Honda et al., 2001). Bioreactor có khuấy và không khuấy bằng nén khí (Pneumatically agitated and non-agitated bioreactor) Đây là kiểu bioreactor đơn giản, được thiết kế với một bộ phận sủi bọt khí ở phía dưới đáy bình, nó có nhiệm vụ là khuấy trộn môi trường và cung cấp oxygen (đối với bioreactor sục khí đơn giản, bioreactor tạo bọt dạng hình cột). Trong một số trường hợp, bình nuôi cấy có thể gắn thêm các ống thông (đối với bioreactor air-lift). Bioreactor air-lift Kiểu bioreactor này cũng tương tự với bioreactor được khuấy trộn bằng dòng xoáy-STRs (nhưng ở đây thì không có cánh khuấy). Bioreactor air-lift khắc phục được hai nhược điểm của bioreactor khuấy bằng cánh khuấy đó là: ít tốn năng lượng cho việc khuấy trộn môi trường và ít gây ra lực xé rách các tế bào, nhờ những dòng khí nhỏ di chuyển nhẹ nhàng từ phía dưới lên. Sự hòa trộn dòng khí vào trong pha lỏng trở nên có hiệu quả hơn do có sự lưu trú các bong bóng khí trong môi trường. Để có thể tạo được các bọt khí nhỏ mịn thì dòng khí phải được thổi qua một màng lọc với những lỗ có kích thước rất nhỏ 0,01 – 0,1 mm. Thường sử dụng màng ceramic. Chính nhờ sự nhỏ mịn của các bong bóng khí đã làm cho các tế bào giảm đáng kể sự cọ sát nên ít bị tổn thương, nhất là đối với những tế bào có độ nhạy cảm cao (Paek và Debasis, 2003) Bioreactor sục khí dạng đơn giản và bioreactor sủi bọt khí dạng hình cột (Simple aeration bioreactor and bubble column bioreactor) Cũng giống như bioreactor air-lift, bioreactor sủi bọt hình cột cũng tạo ra ít sự cọ sát. Điểm khác biệt chủ yếu giữa bioreactor air-lift và bioreactor sủi bọt hình cột là hệ thống tuần hoàn và chế độ thủy động lực học. Loại bioreactor này thích hợp cho nuôi cấy nhiều loại cây khác nhau thông qua quá trình nuôi cấy chồi, thân củ, rễ củ… (Takayama, 1991). Hơn nữa, việc chia bioreactor sủi bọt hình cột thành nhiều phần và 33 cài đặt nhiều bộ phận sủi bọt khí sẽ đẩy nhanh tốc độ tăng sinh khối (Buitelaar et al., 1991). Những hạn chế chung của cả air-lift bioreactor và bioreactor sủi bọt hình cột là: a) có bọt nổi lên do tăng cường một lượng khí lớn, b) các tế bào có khuynh hướng bị tống ra khỏi dung dịch bởi bọt khí, c) tế bào lớn lên trên thành của bình nuôi cấy (trong bọt). Số lượng tế bào bên trong bình biểu thị tổng sinh khối của tế bào. Hiện tượng nổi bọt và tăng trưởng trên thành bình là do đường kính của bình và nắp bình có cùng kích thước. Vấn đề này đã được giải quyết bằng cách cải tiến bình nuôi cấy như miệng bình có đường kính lớn hơn, hay bình có kiểu dạng cầu (Paek et al., 2001). Bioreactor sủi bọt dạng cầu (Ballon type bubble bioreactor – BTBB) Bioreactor dạng này có hình cầu và có nắp ở trên đỉnh. Ở gần đáy của bình có một khóa hình chữ Y hoặc chữ T có nhiệm vụ châm thêm môi trường và là cổng thu