Tiểu luận Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản

0,04 ml Nước cất tinh khiết Vừa đủ 200 ml Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 27 Thành phần MW g/L mOsm NaCl 58,4 5,540 189,19 KCl Ca-Lactate 5H20 308,3 0,527 5,13 KH2P04 136,1 0,162 2,38 MgS04.7H20 246,5 0,294 2,38 NaHC03 84,0 2,106 50,14 Na Pyruvate 110,0 0,028 0,50 Na Lactate 112,1 2,416 43,10 Glucose 1,00 5,56 BSA 1,00 Kháng sinh * 10,00 ml Nước cất vừa đủ 1000 ml Chú thích: MW: Khối lượng phân tử mOsm: Milliosmole e. Môi trường BO Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 28 Dung dịch A: Sodium pyruvate : 76 ml Sodium pyruvate : 0,01375 g Penicillin : 10.000 IU Streptomicin : 10 mg Dung dịch B: : 24 ml Ghi chú: Khi dùng mới pha, Sodium pyruvate và kháng sinh hoà vào dung dịch A và sau đó pha loãng với dung dịch B. Vô trùng bằng màng lọc. f. Dung dịch nuôi tế bào trứng Dung dịch BO: 40 ml; BSA (Bovine Serum Albumin): 400 ml g. Dung dịch pha loãng tinh trùng Dung dịch BO: 10 ml ; BSA (tinh thể) : 200 mg h. Men trypsin cho IVF (Dùng để loại bỏ vành phóng xạ xung quanh tế bào trứng): Sodium chloride: 6,0 g Tricine [N-Tris (hydroxymenthyl) methyl glycine]: 1,79 g Trisodium citrate: 2,9 g Phenol red: 0,005 g Nước cất: 1000 ml Phương pháp tiến hành  Quấy đều cho hoà tan hết  Điều chỉnh pH về 7,8 Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 29  Lọc qua giấy lọc Whatman No1  Hấp khử trùng 3.2.3.Kháng thể kháng tinh trùng [8] Quá trình hình thành tinh trùng bắt đầu từ thời điểm dậy thì và tiếp diễn liên tục cho đến suốt đời . Ở người, mỗi tinh hoàn chứa khoảng 400-600 ống sinh tinh. Ống sinh tinh là cấu trúc gồm các thành phần: màng đáy, biểu mô sinh tinh và các tế bào Sertoli. Các tế bào Sertoli và phức hợp liên kết giữa chúng tạo nên hàng rào máu-tinh hoàn. Hàng rào này ngăn cản không cho tinh trùng và các sản phẩm thoái hoá của chúng đi vào cơ thể . Khi hàng rào máu tinh hoàn bị tổn thương thì tinh trùng và các sản phẩm thoái hoá của chúng tiếp xúc với máu, có thể kích hoạt tạo kháng thể kháng tinh trùng Ở nam kháng thể kháng tinh trùng (antisperm antibodies) có thể tìm thấy trong huyết thanh, t inh dịch và trên bề mặt tinh trùng . Ở nữ có thể tìm thấy trong huyết thanh và chất nhầy cổ tử cung-âm đạo . Kháng thể kháng tinh trùng gồm 2 loại Kháng thể bất động tinh trùng (immobilizing – cell toxic) Kháng thể ngưng kết tinh trùng (agglutinating antibody) Dạng kháng thể trong máu và hệ bạch huyết chiếm ưu thế là IgG trong khi ở những nơi tiết dịch thì IgA chiếm ưu thế hơn (Marshburn và Ketteh, 1994; Mazumdar và Livine, 1998), thực tế kháng thể IgA ảnh hưởng đến khả thụ tinh khi nó hiện diện ở màng của đầu tinh trùng, dạng IgM ít được t ìm thấy trong đường sinh dục của nam giới. Cơ chế hình thành kháng thế kháng tinh trùng • Giảm số lượng hoặc giảm hoạt tính các tế bào ức chế - T trong dường sinh dục • Thiếu hoặc không có các yếu tố trong chất tiết đường sinh dục nam, chất cần thiết để ức chế tế bào • Kháng nguyên tinh trùng thay đổi, không đủ để ức chế đáp ứng miễn dịch Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 30 a. Nguyên nhân hình thành kháng thể kháng tinh trùng. Có nhiều nguyên nhân hình thành kháng thể kháng tinh trùng như tinh hoàn ẩn, giãn tĩnh mạch tinh (varicocele), chấn thương đường sinh dục …, nhưng nguyên nhân chiếm hàng đầu là thắt ống dẫn tinh (vasectomy) Thắt ống dẫn tinh: Witkin và cs đã tìm thấy kháng thể kháng tinh tinh trùng sau thắt ống dẫn tinh vài tháng vì thế tỷ lệ người thắt ống dẫn tinh có kháng thể kháng tinh trùng trong máu chiếm từ 50-80% Sinh thiết tinh hoàn: Sinh thiết tinh hoàn cũng là nguyên nhân hình thành kháng thể kháng tinh trùng, khi phẫu thuật làm tổn thương hàng rào máu - tinh hoàn. Theo báo cáo của Hijort và cs, trong 35 trường hợp nam giới sinh thiết tinh hoàn có 6 trường hợp xuất hiện kháng thể khánh tinh trùng ( chiếm 17%) Tinh hoàn ẩn: Tinh hoàn ẩn là nguyên nhân gây tổn thương tinh hoàn, nó có thể làm tăng nguy cơ hình thành kháng thể kháng tinh trùng. Theo Koskimies và Hovatta trong 23 trường hợp nam giới có tinh hoàn ẩn có 3 trường hợp có kháng thể kháng tinh trùng chiếm 13%). Trên lâm sàng, người ta quan tâm đến kiểu tinh hoàn ẩn, thực tế 10% đàn ông có tinh hoàn ẩn một bên và 70% - 80% tinh hoàn ẩn hai bên bị vô sinh Nhiễm khuẩn đường sinh dục: Tỷ lệ hình thành kháng thể kháng tinh trùng ở nhóm đàn ông có tiền sử nhiễm khuẩn đường sinh dục tăng cao so với nhóm không có nhiễm khuẩn ( theo Andrada và cs) b. Ảnh hưởng của kháng thể kháng tinh trùng đối với tinh trùng. Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 31 Khi không có đầy đủ bổ thể và đại thực bào (opsonize macrophage), kháng thể kháng tinh trùng sẽ gắn vào bề mặt tinh trùng làm cho tinh dịch không ly giải hoặc gây bất động tinh trùng tạo nên hiện tượng kết dính tinh trùng Kháng thể kháng tinh trùng có thể ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh bằng cách làm giảm sự di động và tăng số lượng tinh trùng bất động, ngoài ra kháng thể này còn tác động đến sự xâm nhập của tinh trùng qua chất nhầy cổ tử cung, làm thay đổi phản ứng cực đầu, can thiệp vào phản ứng giữa tinh trùng và trứng (Haas và cs, 1980) * Chỉ định: Xét nghiệm tìm kháng thể kháng tinh trùng áp dụng cho các trường hợp: • Tinh trùng kết dính trong tinh dịch • Tỷ lệ tinh trùng sống thấp • Thắt ống dẫn tinh • Phản ứng tinh trùng – chất nhầy cổ tử cung kém c. Chẩn đoán xác định kháng thể kháng tinh trùng. Có nhiều kỹ thuật xác định kháng thể kháng tinh trùng: kỹ thuật ngưng kết tinh trùng, kỹ thuật gắn hạt miễn dịch, kỹ thuật huỳnh quang, kỹ thuật ELISA…, nhưng kỹ thuật gắn hạt miễn dịch có giá trị nhất Kỹ thuật gắn hạt miễn dịch: hạt miễn dịch là những hạt hình cầu làm bằng chất polyacrilamiden đã được gắn globulin miễn dịch của kháng thể người, giúp phát hiện cùng lúc kháng thể IgA và IgG Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 32 Tinh trùng được rửa khỏi tinh tương bằng cách ly tâm nhiều lần, sau đó trộn với dung dịch đệm. Huyền phù tinh trùng này với dung dịch hạt miễn dịch, nhỏ một giọt huyền phù này lên lame, phủ lamlle, quan sát dưới vật kính 40x với kính hiển vi phản pha. Những tinh trùng di động có kháng thể kháng tinh trùng sẽ ngưng kết với các hạt miễn dịch. Kết quả được xem là dương tính khi tỷ lệ tinh trùng di động ngưng kết > 10% * Điều trị Điều trị vô sinh nam có kháng thể kháng tinh trùng bằng các phương pháp như: • Sử dụng thuốc ức chế miễn dịch (sử dụng steroids) • Thụ thai nhân tạo bằng cách bơm tinh trùng vào buồng tử cung (IUI) sử dụng các phương pháp chuẩn bị tinh trùng nhằm làm giảm tác dụng của kháng thể kháng tinh trùng (antisperm antibodies - ASA) • Thụ tinh trong ống nghiệm (IVF), hoặc tiêm tinh trùng vào tương của trứng (ICSI) 4. Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản [1,3] 4.1. Dẩn tinh nhân tạo Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 33 Thụ tinh nhân tạo là một trong những hình thức của công nghệ hỗ trợ sinh sản mà những cố gắng để thụ thai có thể lựa chọn để cải thiện cơ hội mang thai. Bơm tinh trùng vào ống dẫn trứng (ITI) là một trong bốn loại của thụ tinh nhân tạo có sẵn cùng với bơm tinh trùng vào trong tử cung (IUI), bơm tinh trùng vào vòi trứng (IFI) và bơm tinh trùng vào trong âm đạo (IVI) 4.1.1.ITI (Intra Tubal Inseminations): bơm TT vào ống dẫn trứng Bơm tinh trùng vào ống dẫn trứng (ITI) là một trong 4 loại của thụ tinh nhân tạo. Nói chung, phương pháp này mục đích để đặt tinh trùng vào hệ thống sinh sản của phụ nữ không thông qua quan hệ tình dục mà hoặc là không thể hoặc khó khăn để đạt được. Tinh trùng được thu thập và làm sạch trước khi được đặt trong một ống tiêm. Quá trình này được thực hiện bằng cách đặt tinh trùng trực tiếp vào một hoặc cả hai ống dẫn trứng. Một ống thông (ống mỏng) được đưa vào tử cung qua đường âm đạo. Các tinh trùng được rửa sạch sau đó được tiêm vào ống và đẩy vào một trong các ống dẫn trứng. Bơm tinh trùng vào ống dẫn trứng có thể mang lại cơ hội tốt hơn cho việc mang thai, kể từ khi tinh trùng không phải bơi qua cổ tử cung để thụ tinh cho trứng. ITI không thường được thực hiện để điều trị vô sinh vì chi phí cao. Có hai loại bơm tinh trùng vào ống dẫn trứng (ITI):  thụ tinh trong vòi fallop (IFI) Thụ tinh trong vòi fallop (IFI) thường được thực hiện bởi một nội tiết sinh sản tại phòng khám khả năng sinh sản của bạn. Tinh trùng được thu gom và rửa sạch trước khi được đặt vào một ống tiêm vô trùng. Một ống thông được đưa vào thông qua âm đạo vào tử cung trong khi bệnh nhân được gây tê tại chỗ. Tinh dịch được đẩy qua ống thông và gửi vào một trong hai hoặc cả hai ống dẫn trứng.  Chuyển giao tinh trùng trong vòi fallop (SIFT) Chuyển tinh trùng trong vòi fallop (SIFT) là một phương pháp điều trị vô sinh đòi hỏi kỹ thuật cao và được thực hiện trong bệnh viện hoặc tại một bệnh viện khả năng sinh sản. SIFT đòi hỏi phẫu thuật nội soi ổ bụng. Ban đầu mẫu tinh trùng của nam giới được thu thập và chuẩn bị. Người phụ nữ lúc này được gây tê cục bộ, rạch một vết rạch nhỏ trên bụng và một máy ảnh nhỏ được đưa vào xương chậu để xác định vị trí các ống dẫn trứng. Sau đó ống thông được đưa vào các ống dẫn trứng và tinh trùng được đưa qua một ống tiêm vô trùng để vào ống dẫn trứng. ITI và các vấn đề vô sinh Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 34 ITI có thể giúp các cặp vợ chồng đang gặp vấn đề vô sinh khi các hình thức khác của quy trình thụ tinh nhân tạo như IUI không thành công. Bơm tinh trùng vào ống dẫn trứng có thể giúp điều trị vô sinh cho các vấn đề về khả năng sinh sản sau đây:  Rối loạn chức năng xuất tinh  Chất nhầy cổ tử cung bị cản trở  Vấn đề rụng trứng  Không rõ nguyên nhân: vô sinh 4.1.2.Intra- thụ tinh trong âm đạo (IVI) Phương pháp này ít phổ biến hơn so với các phương pháp khác vì nó đơn giản và có khả năng đạt kết quả không cao. Nó nhằm mục đích đưa tinh trùng đặt bên trong âm đạo để tăng cơ hội thụ tinh. 4.1.3.IFI (Intra Follicular Inseminatio): bơm TT vào vòi trứng IFI liên quan đến việc tiêm tinh trùng trực tiếp vào các nang buồng trứng trước khi rụng trứng. IFI yêu cầu can thiệp ít hơn so với thụ tinh ống nghiệm và xung quanh các vấn đề khả năng thụ tinh của IUI. IFI đã được đề xuất 20 năm trước đây, nhưng hàng loạt trường hợp đã báo cáo tỷ lệ thành công bất cứ nơi nào giữa 2% và 28% - gây cản trở phát triển của nó. Các bước thực hiện: người đàn ông có tinh trùng và phân tích tinh dịch và người phụ nữ có một hysterosalpingogram (HSG) để đảm bảo phù hợp cho thủ tục. Phụ nữ trải qua một cuộc kiểm tra để kiểm soát buồng trứng (FSH tái tổ hợp, HMG gonadotropin con người mãn kinh, hoặc cả hai) bị ức chế tăng LH (acetate buserelin hoặc các ganirelix). Sau khi kiểm tra nội tiết tố và siêu âm cho thấy nang của buồng trứng có đường kính ít nhất là 18 mm, phụ nữ nhận được một shot kích hoạt hCG. Tinh dịch được thu thập và ly tâm và tinh trùng có thể cử động dể dàng trong dung dịch muối vô trùng. Tinh trùng được tiêm trực tiếp vào nang buồng trứng của tất cả nang có đường kính trên 18 mm, phục hồi tế bào trứng (quá trình này được hướng dẫn bởi siêu âm). Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 35 4.1.4. IUI (Intra uterine Inseminatio): bơm TT vào cổ tử cung Tinh trùng tươi thu được từ người đàn ông thông qua xuất tinh hoặc nếu đông lạnh, làm tan băng, kích thích tinh trùng hoạt động lại trước khi được tiêm vào cổ tử cung của người phụ nữ. Thụ tinh trong tử cung (IUI) dường như là phương pháp điều trị phổ biến nhất trong 4 kỹ thuật thụ tinh nhân tạo. Đây là một kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (ART) là phù hợp cho cả nam giới và phụ nữ. Tuy nhiên, họ sẽ phải trải qua bài kiểm tra về khả năng sinh sản trước để xác định xem đây là thủ tục phù hợp nhất cho họ. Nếu người một đàn ông có số lượng tinh trùng thấp, IUI không phải là một sự lựa chọn tốt để tinh trùng của ông này người tìm thấy một quả trứng và thụ tinh. Nếu người phụ nữ bị lạc nội mạc tử cung thì điều trị này có thể không là một lựa chọn mặc dù phụ thuộc vào mức độ tình trạng của bạn. Các yếu tố khác của người phụ nữ bao gồm:  Bị chặn ống dẫn trứng  Bị hư hỏng ống dẫn trứng  Chất lượng trứng kém  Sự rụng trứng có vấn đề Tỷ lệ thành công của IUI Có một khả năng thụ thai xảy ra trong 10 đến 20% các trường hợp cung cấp các điều kiện để thụ thai được thuận lợi. Con số này giảm dần theo tuổi là một phụ nữ lớn tuổi là ít những quả trứng được sản xuất. Nếu 2 hoặc 3 chu kỳ của IUI không thành công sau đó điều trị thụ tinh ống nghiệm sẽ được khuyến cáo. Quá trình IUI Bước 1 Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 36 Ở người phụ nữ: để bắt đầu, họ sẽ trải qua một loạt các bài kiểm tra bao gồm siêu âm. Điều này cho phép các chuyên gia kiểm tra kích thước của nang trứng để xem họ có khả năng sản xuất trứng trưởng thàn hay không.. Tiếp theo, người phụ nữ sẽ được quy định thuốc kích thích khả năng sinh sản để kích thích rụng trứng. Như vậy cơ hội thụ thai sẽ tăng lên. Các thuốc này sẽ được sử dụng vào lúc bắt đầu của chu kỳ kinh nguyệt của bạn vì đây là thời gian tốt nhất để kích thích buồng trứng sản xuất trứng trưởng thành. Ngoài phương pháp sử dụng thuốc, có thể tiêm hormone (HCG) cho người phụ nữ để giúp kích thích sự rụng trứng. Hormone này có thể gây ra trứng được giải phóng khỏi buồng trứng trong vòng 30 đến 40 giờ. Sau đó quá trình thụ tinh phải diễn ra từ 24 đến 48 giờ sau khi tiêm hormone này. Sự tăng trưởng của buồng trứng sẽ được theo dõi qua siêu âm và xét nghiệm máu để kiểm tra mức độ estrogen. Oestrogen là hormone chịu trách nhiệm cho sự tăng trưởng và phát triển của trứng. Một yếu tố quan trọng trong tất cả những điều này là thời gian. Thời gian quan trọng nhất khi tinh trùng phải được tiêm cùng một lúc như rụng trứng diễn ra. Điều này sẽ đảm bảo cơ hội tốt nhất có thể để thụ tinh. Bước 2 Ở người đàn ông: họ được yêu cầu sản xuất một mẫu tinh trùng có thể được thực hiện tại nhà. Lý tưởng nhất là người đàn ông không nên xuất tinh 3 ngày trước khi sản xuất mẫu này mặc dù đã kiểm tra với phòng khám. Nếu không có tinh trùng tươi thì sau đó có thể được sử dụng tinh trùng thay thế. Tinh trùng sẽ được đưa đến phòng thí nghiệm của bệnh viện để rửa, tách tinh trùng khỏe mạnh và loại bỏ tinh trùng kém chất lượng, yếu. Bước 3 Ở người phụ nữ: bước tiếp theo liên quan đến việc tiêm tinh trùng vào tử cung. Chuyên gia đặt một mỏ vịt bên trong âm đạo để cho phép tiếp cận vào cổ tử cung. Một ống thông (ống mỏng) được đưa vào tử cung qua đường âm đạo. Tinh trùng được tiêm vào ống này, nơi nó sẽ nhập vào tử cung. Thủ thuật này không đau, mất khoảng 30 phút. Kết quả của phương pháp sẽ được theo dõi qua siêu âm và xét nghiệm thai kỳ. Tác dụng phụ của IUI Một vài rủi ro:  Co thắt tử cung  Nhiễm trùng  Chuyển bệnh hoa liễu từ các nhà tài trợ tinh trùng  Mang thai nhiều (có thể gây ra rủi ro đối với mẹ và em bé) Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 37  Thất bại điều trị Ngoài ra có nguy cơ hội chứng siêu kích thích buồng trứng (OSS), gây ra các buồng trứng dể phóng to kích thước. Điều này có thể là một kết quả của thuốc khả năng sinh sản, mặc dù nó hiếm khi xảy ra. Nếu điều này xảy ra sau đó IUI sẽ được dừng lại cho đến khi nó đã được điều trị. Thụ tinh nhân tạo thành công Tỷ lệ thành công thụ tinh nhân tạo đã được xác định. Nói chung, tỷ lệ thành công của thụ tinh nhân tạo được coi là có từ 5 đến 30% cho mỗi chu kỳ. Một số chuyên gia về khả năng sinh sản tin rằng tỷ lệ thành công cao hơn rất nhiều, tuy nhiên những con số này đang được tranh luận. 4.1. Thụ tinh invitro Thông thường, một quả trứng và tinh trùng được thụ tinh bên trong cơ thể của một người phụ nữ. Nếu trứng được thụ tinh gắn với niêm mạc của tử cung và tiếp tục phát triển, một em bé được sinh ra khoảng 9 tháng sau đó. Quá trình này được gọi là thụ thai tự nhiên hoặc không được trợ cấp. Thụ tinh trong ống nghiệm ( IVF ) là một quá trình mà theo đó các tế bào trứng được thụ tinh bởi tinh trùng bên ngoài cơ thể. IVF là một hình thức của công nghệ hỗ trợ sinh sản (ART). Điều này có nghĩa là các kỹ thuật y tế đặc biệt được sử dụng để giúp đỡ một người phụ nữ mang thai. Thụ tinh ống nghiệm đã được sử dụng thành công từ năm 1978. Nó thường được thử kỹ thuật khác, khả năng sinh sản ít tốn kém đã thất bại. Thành công đầu tiên ra đời của một "em bé ống nghiệm", Louise Brown , xảy ra vào năm 1978. Robert G. Edwards , nhà sinh lý học phát triển điều trị, đã được trao giải thưởng Nobel Sinh lý và Y khoa năm 2010. Thụ tinh ống nghiệm có thể được sử dụng để giúp giải quyết vấn đề vô sinh nữ do các vấn đề của ống dẫn trứng , thụ tinh trong cơ thể khó khăn. Nó cũng có thể hỗ trợ trong vô sinh nam, nơi có khiếm khuyết chất lượng tinh trùng , và trong những trường hợp như vậy phương pháp tiêm tinh trùng (ICSI) có thể được sử dụng, một tế bào tinh trùng được tiêm trực tiếp vào tế bào trứng. Điều này được sử dụng khi tinh trùng gặp khó khăn khi thâm nhập vào trứng, và trong những trường hợp đối tác hoặc tinh trùng của một nhà tài trợ có thể được sử dụng. ICSI cũng được sử dụng khi số lượng tinh trùng rất thấp. ICSI kết quả về tỷ lệ thành công của thụ tinh ống nghiệm. Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 38 Đối với thụ tinh ống nghiệm để thành công nó thường đòi hỏi trứng khỏe mạnh , tinh trùng có thể thụ tinh, tử cung có thể duy trì một thai kỳ .Do chi phí của thủ tục, thụ tinh ống nghiệm thường được cố gắng chỉ sau khi lựa chọn ít tốn kém đã thất bại. Thụ tinh ống nghiệm cũng có thể được sử dụng với việc hiến trứng hoặc đẻ thuê nơi người phụ nữ cung cấp trứng không phải là cùng một người sẽ mang thai. Điều này có nghĩa rằng thụ tinh ống nghiệm có thể được sử dụng cho những phụ nữ đã trải qua thời kỳ mãn kinh, hiến tặng tế bào trứng có. Nếu thụ thai thành công, phôi sẽ được chuyển vào tử cung, trong đó nó có thể cấy ghép. Thụ tinh ống nghiệm cũng có thể được kết hợp với chẩn đoán di truyền preimplantation (PGD) để loại trừ sự hiện diện của các rối loạn di truyền . Một thử nghiệm tương tự nhưng nói chung đã được phát triển gọi là Preimplantation Genetic Haplotyping Phương pháp Về mặt lý thuyết, thụ tinh trong ống nghiệm có thể được thực hiện bằng cách thu nhận trứng từ ống dẫn trứng hoặc tử cung của người phụ nữ sau khi rụng trứng tự nhiên, trộn với tinh dịch và đưa vào tử cung. Tuy nhiên, không có kỹ thuật bổ sung, cơ hội mang thai sẽ vô cùng nhỏ. Kỹ thuật bổ sung thường xuyên được sử dụng trong thụ tinh ống nghiệm bao gồm buồng trứng siêu trứng để lấy nhiều trứng, siêu âm hướng dẫn phục hồi tế bào trứng qua âm đạo trực tiếp từ việc chuẩn bị buồng trứng, trứng và tinh trùng, cũng như văn hóa lựa chọn và kết quả phôi trước khi phôi chuyển vào tử cung. Kích thích buồng trứng mang nguy cơ kích thích quá mức. Chỉ định của kỹ thuật TTTON – cho trứng 1. Suy buồng trứng sớm 2. Suy buồng trứng sau phẫu thuật 3. Không quan sát được buồng trứng do dính 4. Đáp ứng kém với kích thích buồng trứng 5. Thất bại trên 4 chu kỳ TTTON 6. Tuổi tiền mãn kinh 7. Mãn kinh sinh lý 8. Bất thường di truyền Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 39 9. Hội chứng kháng buồng trứng Tiêu chuẩn người cho trứng 1. Tuổi 18 – 35 2. Đã có gia đình và có ít nhất một con bình thường khoẻ mạnh 3. Con nhỏ nhất lớn hơn 12 tháng 4. Không mắc bệnh lý nội ngoại khoa, bệnh lây truyền qua đường tình dục, bệnh lý di truyền nào 5. Test HBsAg, HIV, BW âm tính 6. Xét nghiệm nội tiết đánh giá chức năng buồng trứng bình thường 7. Không có tiền căn phẫu thuật trên buồng trứng 8. Không có khối u buồng trứng, lạc nội mạc tử cung, hội chứng buồng trứng đa nang 9. Không đang cho con bú 10. Không đang sử dụng nội tiết tránh thai Tiêu chuẩn người nhận trứng 1. Tuổi từ 18 – 45 2. Vô sinh cần thực hiện kỹ thuật TTTON – cho trứng do có một trong các chỉ định kể trên. Quy trình thực hiện 1. Thủ tục pháp lý: theo Nghị định của Chính phủ về Sinh con theo phương pháp khoa học tháng 2/2003 và Thông tư hướng dẫn cuả Bộ Y tế tháng 6/2003, người cho và nhận trứng phải thực hiện các cam kết trên nguyên tắc tự nguyện cho và nhận trứng. 2. Khám tổng quát và thực hiện các khảo sát để nhận những người cho và nhận trứng đúng tiêu chuẩn Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 40 3. Sử dụng nội tiết để điều chỉnh chu kỳ kinh nguyệt của người cho và nhận trứng cho giống nhau. 4. Kích thích buồng trứng của người cho trứng song song với chuẩn bị nội mạc tử cung của người nhận trứng bằng nội tiết. 5. Chọc hút lấy trứng của người cho trứng 6. Tinh trùng của chồng người nhận được lấy cùng ngày với ngày chọc hút trứng 7. Thụ tinh trong ống nghiệm trứng người cho với tinh trùng chồng người nhận 8. Chuyển phôi vào buồng tử cung người nhận trứng. Hỗ trợ giai đoạn hoàng thể 9. Thử thai và hỗ trợ nội tiết thai kỳ nếu có thai. Rủi ro Thụ tinh ống nghiệm đòi hỏi phải có một ý nghĩa vật lý, cam kết tình cảm, tài chính và thời gian. Căng thẳng và trầm cảm phổ biến trong số các cặp vợ chồng đối phó với vô sinh. Một phụ nữ dùng thuốc khả năng sinh sản có thể có đầy hơi, đau bụng , thay đổi tâm trạng, đau đầu, và tác dụng phụ khác. Nhiều loại thuốc thụ tinh ống nghiệm phải được tiêm, thường nhiều lần trong ngày. (Nhóm chăm sóc y tế sẽ dạy cho các cặp vợ chồng làm thế nào để kết hợp các loại thuốc và cung cấp cho một shot.) Tiêm lặp đi lặp lại có thể gây ra vết thâm tím. Trong một số trường hợp hiếm gặp, khả năng sinh sản các loại thuốc có thể gây ra hội chứng buồng trứng hyperstimulation (hội chứng OHSS). Tình trạng này gây ra một chất lỏng trong bụng và ngực. Các triệu chứng bao gồm đau bụng, đầy hơi, tăng cân nhanh chóng (10 kg trong vòng 3-5 ngày), giảm đi tiểu mặc dù uống nhiều chất lỏng, buồn nôn, nôn mửa và khó thở . Những trường hợp nhẹ có thể được điều trị với nghỉ ngơi tại giường. Trường hợp nghiêm trọng hơn yêu cầu tiêu thoát nước của chất lỏng với một cây kim. Nghiên cứu y khoa cho đến nay đã kết luận rằng thuốc khả năng sinh sản không liên quan đến ung thư buồng trứng. Rủi ro của trứng thu hồi bao gồm phản ứng để gây mê, chảy máu, nhiễm trùng và tổn thương đến cấu trúc xung quanh buồng trứng, ruột và bàng quang. Có một nguy cơ mang thai nhiều khi có nhiều hơn một phôi được đặt vào tử cung. Thực hiện nhiều hơn một em bé tại một thời điểm làm tăng nguy cơ sinh non và sinh thiếu cân. (Tuy nhiên, ngay cả một em bé sinh ra sau khi thụ tinh ống nghiệm có nguy cơ cao bị sinh non và trọng lượng sinh thấp.) Đó là chưa rõ liệu IVF làm tăng nguy cơ dị tật bẩm sinh. Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 41 IVF là rất tốn kém. Một số, nhưng không phải tất cả các bang đều có luật nói rằng công ty bảo hiểm y tế phải cung cấp một số loại hình bảo hiểm. Tuy nhiên, kế hoạch bảo hiểm không bao gồm điều trị vô sinh. Lệ phí cho một chu kỳ thụ tinh ống nghiệm duy nhất - bao gồm cả chi phí cho thuốc, phẫu thuật, gây mê, siêu âm, xét nghiệm máu, chế biến trứng và tinh trùng, lưu trữ phôi, cấy truyền phôi có thể nhanh chóng thêm lên. Tổng số chính xác của một chu kỳ thụ tinh ống nghiệm khác nhau với mỗi cá nhân, nhưng có thể chi phí nhiều hơn $ 12.000 - $ 17.000. Sau khi các thủ tục thống kê khác nhau từ một phòng khám khác và phải được giải thích một cách cẩn thận.  Tỷ lệ có thai phản ánh số lượng phụ nữ mang thai sau khi thụ tinh ống nghiệm. Nhưng không phải tất cả thai dẫn đến sinh sống.  Tỷ lệ sinh sống phản ánh số lượng phụ nữ sinh ra một đứa trẻ sống. Theo Hiệp hội Công nghệ hỗ trợ sinh sản (SART), cơ hội gần đúng của sinh một em bé sống sau khi thụ tinh ống nghiệm là như sau:  41-43% cho phụ nữ dưới 35 tuổi  33-36% cho phụ nữ tuổi 35 - 37  23-27% cho phụ nữ tuổi từ 38-40  13-18% đối với phụ nữ ở độ tuổi trên 41 c. Vi thụ tinh Kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm (TTTON) được thực hiện thành công từ nằm 1978, đến nay, trên thế giới đã có trên 1 triệu em bé ra đời. Trong quá trình phát triển đó, đã có rất nhiều tiến bộ và kỹ thuật mới đã được đưa vào ứng dụng nhằm mở rộng chỉ định điều trị và gia tăng hiệu quả thành công. Trong đó, kỹ thuật tạo nhiều thay đổi và ảnh hưởng lớn nhất là kỹ thuật ICSI. Sự phát triển của kỹ thuật ICSI Từ ICSI được viết tắt từ Intra-cytoplasmic Sperm Injection, có nghĩa là tiêm tinh trùng trực tiếp vào noãn để tạo phôi. Kỹ thuật được thực hiện thành công đầu tiên vào những năm đầu thập niên 90. Chỉ vài năm sau đó, ICSI đã được triển khai khắp các nơi trên thế giới và cho đến nay đã trở thành một trong những kỹ thuật điều trị phổ biến nhất trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản. Hiện nay, trên thế giới đã có hàng trăm ngàn em bé được sinh ra từ kỹ thuật ICSI. Chỉ định Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 42 • Tinh trùng bất thường về: số lượng, độ di động hoặc hình dạng • Vô sinh do không có tinh trùng, phải lấy tinh trùng bằng phẫu thuật • Bất thường thụ tinh (tinh trùng và noãn bình thường, nhưng không thụ tinh được) • Thất bại nhiều lần với TTTON bình thường Với những chỉ định được mở rộng như trên, khuynh hướng áp dụng ICSI trên thế giới ngày càng tăng. Tại châu Âu, thống kê gần đây nhất tại 537 trung tâm TTTON cho thấy có 95.221 chu kỳ ICSI trên tổng số 220.591 chu kỳ điều trị, chiếm tỷ lệ 43%. Một khảo sát tại Mỹ cũng cho thấy, chỉ trong vòng 5 năm (từ 1995 đến 2000), tỷ lệ các chu kỳ điều trị có thực hiện ICSI đã tăng lên từ dưới 10% lên đến xấp xỉ 50%. Số liệu riêng còn cho thấy tại một số trung tâm ở Bỉ, Hy lạp, Ý… số chu kỳ có áp dụng ICSI có thể đạt xấp xỉ 60%. Hiệu quả của ICSI Theo báo cáo thống kê ở Mỹ và châu Âu, tỉ lệ có thai của ICSI thường cao hơn một ít hoặc tương đương với kỹ thuật TTTON bình thường. Số liệu tại Bệnh viện Phụ Sản Từ Dũ cũng có kết quả tương tự. Số liệu công bố năm 2002 cho thấy tại châu Âu, tỷ lệ thai lâm sàng (trên chu kỳ chuyển phôi) từ các chu kỳ ICSI thay đổi từ 22%-35%, tùy theo trung tâm. Trong khi đó, theo một thống kê gần đây nhất của Hiệp hội sinh sản Hoa kỳ, với số liệu từ khoảng 28.000 chu kỳ ICSI, tỷ lệ thai lâm sàng đạt được là 36.6%. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cho thấy rằng, ngoại trừ những trường hợp dị dạng tinh trùng nặng, thì dù tinh trùng lấy trong tinh dịch, trong mào tinh hay trong tinh hoàn, tỉ lệ có thai đạt được cũng gần tương đương. Hay nói một cách khác, tỉ lệ thành công của ICSI ít phụ thuộc vào chất lượng và nguồn gốc tinh trùng. Như vậy, kỹ thuật ICSI có thể giúp một nam giới có chất lượng tinh trùng kém, thậm chí không có tinh trùng vẫn có khả năng có con như một nam giới có chất lượng tinh trùng tốt. Một số nghiên cứu cho thấy rằng ICSI có thể giúp tăng tỉ lệ thụ tinh, tăng số phôi có được, nhờ đó có thể giúp tăng tỉ lệ thành công. Với kỹ thuật TTTON bình thường, một số trường hợp tinh trùng không thể tự thụ tinh noãn do bất thường về thụ tinh, dẫn đến không có phôi để chuyển vào buồng tử cung. Với kỹ thuật ICSI, chúng ta có thể tránh gần như hoàn toàn các trường hợp trên. Ngoài ra, một số nghiên cứu còn thấy rằng phôi hình thành từ kỹ thuật ICSI, khi trữ lạnh có khả năng sống cao hơn phôi hình thành từ kỹ thuật TTTON bình thường. Do các ưu Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 43 điểm trên, nhiều trung tâm trên thế giới hiện có khuynh hướng áp dụng ICSI cho tất cả các trường hợp điều trị vô sinh. Một số các nguy cơ tìm ẩn của kỹ thuật ICSI Từ khi kỹ thuật ICSI ra đời đến nay, đã có nhiều quan ngại về một số nguy cơ có thể có đối với kỹ thuật ICSI như: • Noãn có thể bị tổn thương khi tiêm tinh trùng và ảnh hưởng đến chất lượng phôi. • Các trường hợp vô sinh nam có thể có nhiễm sắc thể và bệnh lý di truyền cao hơn bình thường. Khoảng 5-10% vô sinh nam do bất thường tinh trùng nặng (mật độ tinh trùng <5 triệu/ml), là có liên quan đến bệnh lý di truyền. Các bất thường này, có thể truyền sang con. Những bất thường này có thể truyền sang cho trẻ sinh sau này. Những bất thường này thường không gây ảnh hưởng đến sức khỏe, mà chủ yếu là trên khả năng sinh sản sau này • Tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể ở trẻ sinh ra do kỹ thuật ICSI có thể tăng nhẹ, đặc biệt ở các trường hợp tinh trùng yếu nặng, dị dạng. (Ở dân số bình thường, tỉ lệ bất thường nhiễm sắc thể thường khoảng 2%). Các trẻ sinh ra đầu tiên từ kỹ thuật này trên thế giới đến nay đã trên 10 tuổi. Nhiều khảo sát về sự an toàn của kỹ thuật ICSI đã được thực hiện, có những khảo sát lớn thực hiện trên hàng ngàn trẻ, hầu hết đều cho thấy đây là một kỹ thuật tương đối an toàn, không làm tăng tỉ lệ dị tật bẩm sinh. Các nghiên cứu gần đây đều cho thấy các bé sinh ra từ kỹ thuật ICSI phát triển bình thường. Ngoài ra, sự phát triển của các trẻ này vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu tại nhiều trung tâm trên thế giới. 5. Cấy truyền phôi [4] 5.1. Khái niệm: công nghệ cấy truyền phôi là một quá trình đưa phôi được tạo ra từ cá thể bò mẹ này (bò cho phôi) vào cá thể bò mẹ khác (bò nhận phôi). Phôi vẫn sống, phát triển bình thường trên trạng thái sinh lý sinh dục của bò nhận phôi phù hợp với trạng thái sinh lý sinh dục của bò cho phôi hoặc với tuổi phôi (sự phù hợp này gọi là sự đồng pha). Ý nghĩa của phương pháp cấy truyền phôi Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 44 Cấy truyền phôi phổ biến và nhân nhanh giống tốt, những đặc tính quý hiếm ra thực tế sản xuất trên cơ sở khai thác triệt để tiềm năng di truyền của những cá thể cái cao sản thông qua việc lấy, bảo quản phôi và cấy truyền phôi của chúng. Nâng cao cường độ chọn lọc, đẩy mạnh công tác giống trên cơ sở tăng nhanh tiến độ di truyền hằng năm. Hạn chế tối thiểu mức gia súc từ đó giảm chi phí đi kèm khác như : chuồng trại, vật tư, nhân lực.Giúp con người dễ dàng, thuận lợi trong việc xuất khẩu,vận chuyển, trao đổi giống giữa các nước, các vùng, các địa phương. Một số phương pháp giữ gìn, bảo tồn con giống dưới dạng trứng, phôi, tinh trùng – phương pháp giữ gìn vật liệu di truyền. Hạn chế một số dịch bệnh và nâng cao khả năng chống chịu bệnh, khả năng thích nghi của con vật trong môi trường mới : không lây truyền bệnh, tăng sức đề kháng,.. Làm cơ sở thúc đẩy mạnh việc nghiên cứu và phát triển một số nghành khoa học có liên quan : sinh lý, di truyền, thú y,.. 5.2. Phương pháp cấy truyền phôi ở bò Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 45 5.2.1.Chọn bò cho phôi: Bò cái có năng suất cao về một hoặc vài tính trạng mong muốn và các tính trạng đó phải được di truyền cho thế hệ sau. Yêu cầu của bò cho phôi:  Năng suất về tính trạng mong muốn đặc biệt cao, di truyền cho thế hệ sau, ưu tiên những tính trạng có hệ số di truyền cao và giá trị thương phẩm tương đối lớn.  Không mắc bất cứ một khuyết tật hay bệnh di truyền nào.  Khả năng sinh sản tốt, quá trình sinh sản bình thường. Cổ tử cung dể dàng khi đưa dẩn tinh quản, súng cấy phôi và đặc biệt là dụng cụ gội rửa phôi.  Thể trạng, sức khỏe tốt, vật nhanh nhẹ, không hung dữ và được tiêm phòng tất cả bệnh.  Không quá già (không nên quá 10 tuổi). 8. Cấy phôi cho bò nhận 10. Bò nhận phôi có chửa 11. Đàn con mang tiềm năng di truyền tốt của bò cho phôi 1. Chọn bò cho phôi 2. Chọn bò nhận phôi 3. Gây động dục hàng loạt 4. Gây rụng trứng ở nhiều bò cho phôi 5. Bò nhận phôi động dục 6. Phôi giống với đực giống tốt 7. Thu hoạch phôi 9. Bò cho phôi trở lại bình thường chờ chu kỳ sinh sản tiếp theo Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 46  Chu kỳ động dục bình thường, biểu hiện chu kỳ rõ ràng.  Buồng trứng hoạt động tốt. 5.2.2.Bò nhận phôi Bò cái nhận phôi không đóng góp về kiểu di truyền của con nhưng có tác động đến kiểu hình của con non trong thời gian mang thai và nuôi con. Yêu cầu của bò nhận phôi:  Sinh trưởng và phát triển bình thường, không khuyết tật, thể trạng tốt, không quá gầy và không quá béo.  Không mắc bệnh di truyền và bệnh truyền nhiễm (Brucellois, Trichomoniasis,..), phải được tiêm chủng định kỳ các bệnh đầy đủ.  Trạng thái sinh lý sinh sản bình thường. Yêu cầu chăm sóc, nuôi dưỡng bò nhận phôi:  Chăm sóc, nuôi dưỡng tốt.  Chủ động theo dõi quá trình mang thai, can thiệp nếu có sự cố xảy ra như : sẩy thai, đẻ non, đẻ khó,...  Số lượng bò nhận phôi gấp đôi số phôi cần cấy. 5.2.3. Gây động dục đồng pha Gây động dục đồng pha là quá trình kích thích cho con cái nhận phôi động dục đúng vào thời điểm động dục của con cái cho phôi. Đồng pha giữa cái nhận phôi và cái cho phôi còn có nghĩa trạng thái sinh lý sinh dục của con cái nhận phôi phù hợp với tuổi phôi. Mục đích của gây động dục đồng pha là tạo ra được nhiều bò nhận có thời gian động dục đồng thời với bò cho phôi hoặc phù hợp với tuổi phôi. 5.2.4. Gây rụng trứng nhiều Đây là một quá trình kích thích buồng trứng để tạo ra nhiều nang trứng rụng và rụng nhiều trứng hơn bình thường. Để khai thác tiềm năng di truyền siêu trội hoàn toàn của một con cái tốt, sử dụng cấy truyền phôi có thể thu được nhiều phôi nhất có thể từ Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 47 một con cái. Vì bò bình thường chỉ rụng một trứng sau mỗi lần động dục, đây là một quá trình không có hiệu quả. Có nhiều kỹ thuật để kích thích tăng số nang trứng có thể rụng trứng ở bò cái. Những áp dụng của cấy truyền phôi Những áp dụng khi kết hợp với gây rụng trứng nhiều của con cho phôi như sau: - Tăng số đời con của những bò cái có tiềm năng di truyền siêu trội. - Tăng tốc độ kiểm tra đời sau. - Giảm khoảng cách thế hệ bằng cách gây rụng trứng nhiều của những bò cái hậu bị trước lúc khi thành thục về tính và cấy phôi cho những con nhận đã trưởng thành. Điều này có thể làm tăng tốc độ chọn lọc di truyền. - Vận chuyển phôi từ nước này sang nước khác do đó có thể vượt qua được các vấn đề lây truyền bệnh tật và giảm thời gian kiểm dịch. Điều này cũng loại bỏ stress và giá vận chuyển gia súc sống. - Tạo sinh đôi. - Có thể thu phôi từ những bò cái vô sinh mà những bò cái đó không có khả năng duy trì quá trình có chửa bình thường. - Cấy truyền phôi có thể được dùng làm công cụ nghiên cứu. 5.2.5. Thu phôi - Phôi được dội rửa từ tử cung của bò cho phôi và ngày thứ 6,7 hay 8 sau khi phối giống. - Thu phôi được thực hiện bằng phương pháp không phẫu thuật có sử dụng catheter hai chiều, và phôi được tách ra khỏi dung dịch rửa bằng việc sử dụng các phin lọc phôi có bán sẵn. - Con cho phôi được phong bế thần kinh tủy sống để loại bỏ sự co bóp của trực tràng trong lúc thu phôi. - Dung dịch dùng để thu phôi được bán sẵn trong các túi nilon để dùng ngay. Albumin huyết thanh bò có thể được bổ xung để giảm nguy cơ phôi bị dính vào các dụng cụ thu phôi. - Tử cung có thể được dội rửa bằng cách đặt catheter vào thân tử cung và dội rửa thân tử cung và cả hai sừng tử cung cùng một lúc, hay đặt catheter vào sừng tử cung, dội rửa một sừng tử cung đó, sau đó lấy catheter ra và đặt vào sừng tử cung khác và lặp lại kỹ thuật. Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 48 - Cần khoảng 500ml dung dịch dội rửa cho mỗi con cho và xoa bóp dung dịch trong tử cung để tách phôi khỏi thành tử cung vào dung dịch và sau đó dung dịch đội rửa được hút ngược trở lại vào phễu lọc. 5.2.6. Cấy phôi - Phôi được cấy cho con nhận mà con nhận đó động dục càng gần với thời gian động dục của bò cho phôi càng tốt. Sai lệch 24 giờ có thể chấp nhận được. - Con nhận cần phải được sờ khám trước khi lấy phôi để kiểm tra xem nó có thể vàng chức năng tốt không. - Con nhận phải có chức năng sinh dục bình thường và tăng trọng trong tháng trước khi cấy phôi thì có thể đạt được tỷ lệ có chửa tốt. - Phôi có thể được cấy bằng phương pháp phẫu thuật hay không phẫu thuật. - Cấy phôi không phẫu thuật bao gồm đưa phôi vào cọng rạ 0,25ml, và dùng pipettes cấy phôi có bán sẵn, đặt phôi vào đầu sừng tử cung tương ứng với phía buồng trứng có thể vàng chức năng. - Nhìn chung, phong bế thần kinh tuỷ sống thường được sử dụng trong cấy phôi không phẫu thuật để loại bỏ co bóp trực tràng và do đó cho phép đặt phôi chính xác hơn và ít gây tổn thương hơn. - Cấy phôi phẫu thuật được thực hiện thông qua vết cắt tương ứng với phía buồng trứng có thể vàng chức năng. Phôi được cấy bằng catheter nhỏ vào đầu sừng tử cung cùng phía. Vết cắt được gây mê cục bộ trong lúc phẫu thuật. - Cấy phôi bằng phẫu thuật nhìn chung được thực hiện khi rất khó đưa qua tử cung và kỹ thuật cho phép chính xác hơn và cấy phôi ít tổn thương hơn vào sừng tử cung. Vì thế nhiều con nhận hơn có thể được sử dụng thành công và nhìn chung tỷ lệ có chửa cao hơn. Tuy nhiên, kỹ thuật này tốn nhiều thời gian. 6. Chuyển phôi Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 49 7. Một số kỹ thuật liên quan [8,9] 7.1.Bảo quản phôi, giao tử 7.1.1. Đông lạnh phôi Đông lạnh phôi là trữ lạnh phôi ở nhiệt độ cực thấp (-196oC) trong nito lỏng sẽ làm ngưng hoàn toàn các phản ứng enzyme nội bào, hô hấp tế bào, chuyển hóa, phát triển,... giúp lưu giữ chúng trong thời gian rất dài, mà sau khi rã đông những phôi này vẫn phát triển bình thường. Có 2 phương pháp đông lạnh phôi:  Phương pháp làm chậm  Phương pháp làm nhanh (Phương pháp thủy tinh hóa) Nguyên tắc chung: Để trữ tế bào sống trong thời gian dài thì tất cả các hoạt động chức năng bên trong tế bào phải ngừng lại. Ở nhiệt độ nito lỏng (-196oC) hầu hết các phản ứng hóa học không xảy ra được. Các phân tử nước tồn tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian như ngừng trôi đối với tế bào được trữ. Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng đến tế bào trữ lạnh là bức xạ môi trường. Tuy nhiên trong thực tế, yếu tố này không quan trọng và một nghiên cứu cho thất tế bào phôi chuột trữ lạnh sau khi được chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát triển bình thường sau khi rã đông và chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào. Giai đoạn chính ảnh hưởng đến sự thành công của trữ lạnh chính là làm lạnh và rã đông. Các bước tiến hành trong quá trình đông lạnh phôi: Chuyển phôi Chuyển hợp tử Chuyển phôi giai đoạn 2 tế bào đến giai đoạn morula Chuyển phôi giai đoạn blastocys Đặt một phôi (hợp tử tạo bên ngoài cơ thể) vào trong ống dẩn trứng thông qua kính soi ổ bụng. Phôi sau 5-7 ngày, nuôi qua giai đoạn blastocys để thuận lợi bám vào màng nội mạc tử cung để tăng tỷ lệ mang thai Chuyển phôi 1- 12 tế bào vào trong buồng tử cung Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 50  Chọn phôi: phôi được chọn trữ lạnh phải có chất lượng cao để chúng sống sót và phát triển thai tốt trong giai đoạn giải đông. Theo Kenedy và cộng sự vào năm 1983, chất lượng phôi được xếp thành 5 mức độ khác nhau, phôi tốt nhất là phôi loại 1.  Môi trường đệm: cũng giống như môi trường nuôi cấy tế bào động vật, trong đông lạnh phôi cũng cần có dung dịch đệm. Đối với những loài động vật khác nhau thì môi trường đệm cũng khác nhau. Ví dụ: PBS chứa 20% huyết thanh bê là môi trường đệm thường được dùng cho đông lạnh phôi bò. Ở các loài động vật khác môi trường đệm hay dùng là HEPES với 10 – 15% huyết thanh bê. Ở người môi trường đệm HEPES thay thế cho hệ đệm bicarbonat và có thể thêm 0,5 -1% HAS hay 10 – 15% huyết thanh của người nhận.  Chất bảo quản: Glycerol, DMSO, ethylen glycon, polyvinyl prolydine (PVP) và sucrose thường được sử dụng bổ sung như các chất bảo vệ chống lại sự đông lạnh phôi. PVP và sucrose sẽ khử nước tự do bên trong tế bào nhưng chúng không xâm nhập vài tế bào. Trong khi đó, Glycerol, DMSO và ethylen glycon khử nước tự do trong nội bào và tế bào giúp bảo vệ cytoplasm đi vào trong. Ở người chất bảo quản phôi thường được sử dụng là 1,2- propannediol (PROH) và dimethyl sufoxide DMSO. Khả năng sống sót của phôi liên quan đến nồng độ các chất bảo quản đông lạnh được thêm vào, phương pháp thêm chúng, nhiệt độ mà tại đó được thêm vào và cuối cùng là thời gian cân bằng.  Dụng cụ chứa phôi trong đông lạnh: có thể là các ống nhựa nhỏ, ống thuốc tiêm hay các cọng rạ dùng cho đông lạnh tinh trùng.  Thiết bị làm lạnh và đông: trong phương pháp làm lạnh và đông có thể sử dụng ancohol đặt vào vật chứa như là môi trường làm sạch, sau đó đưa vào đá khô hay nito lỏng. Trong các thiết bị chuyên dùng làm lạnh là nito lỏng nhưng nguồn điện cũng được sử dụng để hạ nhiệt. Một số thiết bị hiện đại có thể được chương trình hóa tốc độ giảm nhiệt, nên việc đông lạnh trở nên dể dàng và hiệu quả cao.  Tốc độ làm lạnh: <= 1oC/1 phút 7.1.2. Đông lạnh tinh trùng a.Chất bảo quản lạnh (Ở người):  Thành phần dung dịch đệm cơ bản bao gồm 3 thể tích 0,1M sodium citrate, 1 thể tích 0,33M fructose và 1 thể tích 0,33M glucose.  Môi trường đông lạnh: 4ml lòng đỏ trứng thêm vào 3ml glycerol và 13ml dung đệm cơ bản, bất hoạt ở 56oC trong 30 phút và để lạnh. Cuối cùng 200mg glyceril được thêm vào và chỉnh pH về 7,2 – 7,3. b.Đông lạnh và giải đông: Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 51  Đông lạnh nhanh: đặt cọng rạ chứa dung dịch vào hơi (khí) nito lỏng trong 8- 30 phút, sau đó đặt thẳng cọng rạ vào nito lỏng.  Đông lạnh chậm: giảm nhiệt từ -5oC đến -9oC, -40oC đến -80oC, đặt cọng rạ vào nito lỏng. 7.1.3. Đông lạnh trứng a.Đông lạnh trứng: Trứng rửa với dung dịch ấm PBS +30%HSA, chuyển sang 1,5M propannediol + 0,2M sucrose và cân bằng 15 phút trước khi nạp vào cọng rạ. b.Giải đông trứng: Các cọng rạ giải đông nhanh ở 30oC trong bể ổn nhiệt với 40 giây, chất bảo quản lạnh tách tách bỏ theo từng bước pha loãng ở nhiệt độ phòng.  0,1M propannediol + 0,2M sucrose, 5 phút  1,5M propannediol + 0,2M sucrose, 5 phút  0,2M sucrose, 10 phút  Dung dịch PBS :10 phút tại nhiệt độ phòng.  Chuyển vào môi trường nuôi ở 36oC 7.1.4. Xác định giới tính phôi 7.1.4.1.Xác định giới tính của phôi bằng phương pháp di truyền tế bào a. Barr body Gardner và Edwards (1968) đã báo cáo rằng có thể xác định giới tính bằng sử dụng Barr body của phôi nang (6-8 ngày tuổi) ở thỏ nuôi. Tuy nhiên, nhìn chung, rất khó quan sát Barr body của tế bào phôi vật nuôi bởi vì sự có mặt của những hạt nhỏ (granule) trong nguyên sinh chất (cytoplasm). Trong một số trường hợp, phôi cái có thể bị nhầm thành phôi đực. Vì thể, phương pháp này không thể áp dụng trong sản xuất. b. Phân tích nhiễm sắc thể của tế bào phôi Ở phương pháp này, một mẩu nhiễm sắc thể của một tế bào của phôi được sử dụng và giới tính của phôi được xác định bằng việc xác định thành phần của nhiễm sắc thể giới tính. Rất may là nhiễm sắc thể của bò gồm những nhiễm sắc thể giới tính acrocentric và metacentric. Vì thế, rất dễ dàng để phân biệt giới tính của phôi bằng việc kiểm tra thành phần hình thái cùa các nhiễm sắc thể giới tính (XY hay XX) nếu các mẫu nhiễm sắc thể được chuẩn bị tốt. các phương pháp phân tích nhiễm sắc thể được phân loại thành ba phương pháp bởi giai đoạn phát triển của phôi hay bởi phương pháp lấy vật liệu để phân tích. Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 52 (1) Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể sử dụng các tế bào trophoblast của phôi 15 ngày tuổi không có màng trong suốt. Hare và cs (1976) là những người đầu tiên sử dụng phương pháp phân tích nhiễm sắc thể của các tế bào phôi để xác định giới tính của phôi. Đầu tiên, họ lấy một phần (0,5mm) phôi 14-15 ngày tuổi bằng sử dụng panh và kéo nhỏ. Sau đó, họ thu vật liệu để phân tích nhiễm sắc thể bằng việc cắt phôi 11-15 ngày tuổi (kích thước <9mm) bằng một lưỡi dao thép không gỉ. Họ đã báo cáo rằng tỷ lệ thành công của phân tích nhiễm sắc thể dao động với kích thước của phôi (Hare và cs 1978). Tỷ lệ thành công là 9,0% (n=11), 63,6% (n=55) và 68,7% (n=32) khi phôi có kích thước 4,9mm, tương ứng. Wintenberger-Torres và Popescu (1980) đã cắt rời 1/3-1/10 phôi 13 ngày tuổi bằng kéo Wecker để dùng cho phân tích nhiễm sắc thể. Tuy nhiên, phương pháp này không được áp dụng rộng rãi bởi vì phôi 7 ngày tuổi vẫn còn ở trong màng trong suốt được dùng để cấy truyền phôi bò. (2) Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể bằng sử dụng một phần tế bào của phôi 6-7 ngày tuổi Ở phương pháp này, 10-20 tế bào được lấy ra khỏi phôi ở giai đoạn phôi dâu hay phôi nang sớm bằng thao tác dưới kính hiển vi và các tế bào được sử dụng để phân tích nhiễm sắc thể. Chỉ một số lượng nhỏ các tế bào, 10-20, được lấy ra khỏi phôi. Để lấy được ít nhất một hay hai đĩa nhân của pha giữa (metaphase) cần thiết để phân tích nhiễm sắc thể từ một mẫu, hơn 10% tế bào phải ở pha giữa. Theo Singh và Hare (1980), số tế bào trung bình ở phôi dâu 6 ngày tuổi là 50,2 và chỉ số phân bào (mitotic) trung bình là 8,9. Vì vậy, họ đã báo rằng xác định giới tính bằng việc sử dụng các tế bào lấy ra từ phôi dâu là phức tạp hơn và ít thành công hơn so với việc xác định giới tính sử dụng các tế bào trophoblast của phôi 12-15 ngày tuổi. (3) Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể bằng việc sử dụng một nửa phôi 6-8 ngày tuổi mà phôi đó được chia đôi. Gần đây, với sự phát triển của kỹ thuật cắt phôi, một nửa phôi được chia đôi có thể được sử dụng để phân tích nhiễm sắc thể. Nửa còn lại có thể được bảo quản trong thời gian ngắn hay đông lạnh đến khi kết quả của phân tích nhiễm sắc thể được biết. Sau khi giới tính đã được xác định, cấy phôi được thực hiện. Giai đoạn phát triển của phôi sử dụng ở phương pháp này tương tự như ở với giai đoạn phát triển của phôi được sử dụng rộng rãi trong cấy truyền phôi. Hơn nữa, từ khi Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 53 một nửa số tế bào tạo nên một phôi được sử dụng như vật liệu để phân tích nhiễm sắc thể thì dễ dàng thu được đĩa nhân của pha giữa và tỷ lệ thành công của xác định giới tính là cao. Bên cạnh một số thí nghiệm sử dụng phương pháp này ở Nhật Bản, Rall và Leibo (1987) đã báo cáo những kết quả của những thí nghiệm đã sử dụng nhiều phôi. Họ nhận thấy trung bình 2,64 đĩa nhân của pha giữa trong các mẫu hay ít nhất 1 trong 84,7% tất cả các mẫu các kết quả đủ tốt để cho phép áp dụng phương pháp này cho sản xuất trong tương lai. (4) Phương pháp tạo mẫu nhiễm sắc thể phôi Về cơ bản, các phương pháp thực hiện cùng một kỹ thuật như khi tạo mẫu nhiễm sắc thể của các mô tế bào thông thương. Đầu tiên số lượng tế bào tăng lên do nuôi cấy trước; những sợi spindle của tế bào bị phá huỷ do sử lý bằng colchicine hay colcemid để ngăn cản nhiễm sắc thể di chuyển về phía cực tế bào trong quá trình phân chia và giữ cho sự phân chia tế bào ở pha giữa (metaphase) đến giai đoạn giữa (mid-stage); sau đó các tế bào giãn nở do sử lý bằng dung dịch hypotonic để phân tán nhiễm sắc thể trong tế bào và làm cho việc kiểm tra dễ hơn, và ở bước cuối cùng, các tế bào được đặt trên phiến kính (slide glass) cùng với chất cố định và được làm khô nhanh chóng. Sau đó, các tế bào gắn vào phiến kính có thể kéo rộng nhờ sức căng bề mặt và sau đó được nhuộm. Để nâng cao tỷ lệ thành công về xác định giới tính bằng phương pháp này, các tế bào nên được nuôi cấy để đạt được một số lượng đĩa nhân ở pha giữa mà nhiễm sắc thể của nó dễ kiểm tra. Sau đó, các mẫu làm nhiễm sắc thể mà karyotypes cần được phân tích. Trong tương lai, thời gian cần thiết để phân biệt giới tính nên được rút ngắn và phương pháp bảo quản phôi để cấy truyền cần phải được cải tiến để nâng cao tỷ lệ sống sót của chúng. 7.1.4.2.Xác định giới tính phôi bằng các phương pháp miễn dịch Xác định giới tính phôi bằng sử dụng kháng thể H-Y Trong các thí nghiệm ghép da có sử dụng một dòng chuột cận huyết, ghép da được chuyển từ một con chuột cùng giới tính và chuyển từ chuột đực sang chuột cái đã được chấp nhận thành công. Mặt khác, ghép da chuyển từ chuột đực sang chuột cái bị từ chối bởi vì đã gây nên phản ứng miễn dịch (Eichiward và Silmeser, 1955). Hiện tượng này dường như gây nên bởi phản ứng của gen trên nhiễm sắc thể Y, mà nhiễm sắc thể này chỉ có ở con đực (Billing và Silvers, 1960). Kháng nguyên gây nên hiện tượng này được gọi là kháng nguyên Y hoà hợp tế bào, kháng nguyên H-Y. Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 54 Krco và Goldberg (1976) nuôi cấy phôi chuột trong một môi trường nuôi cấy có chứa những kháng thể này và chất bổ xung. Một số tiếp tục phát triển và một số dừng phát triển. Những phôi mà tiếp tục phát triển là phôi cái, nghĩa là, những phôi không bị ảnh hưởng bởi kháng thể đực. Những phôi dừng phát trển là phôi đực (Strzeminski, 1979; Esptein và cs, 1980). Do đó, những nghiên cứu về xác định giới tính hay tách giới tính những con vật thí nghiệm đã được thúc đẩy. Các thí nghiệm xác định giới tính hay tách giới tính những phôi gia súc như bò và dê cũng đã được tiến hành. Wachtel (1984) thực hiện xác định giới tính trên 75 phôI bò 7-11 ngày tuổi bằng phương pháp kháng nguyên huỳnh quang gián tiếp có sử dụng kháng nguyên monoclon. 34 phôi có huỳnh quang dương tính, 31 âm tính và 10 không rõ. Ngoài số này ra, 7 phôi đã được xác định giới tính đã được cấy cho 7 con nhận, 6/7 bê sinh ra đúng với giới tính đã được dự đoán trước. White và cs (1984) đã thực hiện xác định giới tính ở phôi bò 6-7 ngày tuổi (16 tế bào đến giai đoạn phôi nang sớm). Họ đã áp dụng phương pháp kháng nguyên huỳnh quang gián tiếp bằng việc sử dụng kháng huyết thanh H-Y tạo ra từ chuột: Trong số 125 phôI được kiểm tra, 89% những phôi đã được xác định giới tính sẽ là đực và 30% những phôi được xác định là cái phù hợp với kết quả xác định nhiễm sắc thể giới tính. Gần đây, White và cs (1987) đã thực hiện cấy truyền phôi theo phương pháp sau: Họ xác định giới tính của phôi bằng phương pháp kháng nguyên huỳnh quang gián tiếp và sau đó chia đôi phôi để cấy cho con nhận. Tỷ lệ sống (tỷ lệ phôi tạo ra bê thành công) của những phôi đã được xác định giới tính là 36% (n=86) và những phôi chưa được xác định giới tính là 38% (n=156). Tỷ lệ sống sót của hai nhóm phôi hầu như không có sự khác biệt nào. Hơn nữa, giới tính của 84% phôi được xác định là chính xác. Các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản 55 Tài liệu tham khảo [1] &pid=79&newlang=vietnamese [2] [3] dong-lanh-15-nam-van-song.35D5E8C7.html) [4] [5] [6] [7] [8] technology-intrafollicular-insemination-ifi/ [9] [10]