Tiểu luận Ứng dụng chỉ thị sinh học phân tử trong nghiên cứu bệnh lý cây trồng

TIỂU LUẬN: ỨNG DỤNG CHỈ THỊ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN CỨU BỆNH LÝ CÂY TRỒNG Trần Văn Dương 1. Mở đầu Sự phát hiện ra enzym giới hạn (Smith & Wilcox, 1970) và phương pháp PCR (Mullis & Faloona, 1987) là cơ sở cho các phương pháp chỉ thị phân tử như RFLP (Botstein et al. 1980 ), microsatellites (Weber & May và Litt & Luty, 1989), RAPD (Welsh & McClelADN, 1990), AFLPs (Vos et al. 1995), v.v. Các phương này cho phép xác định các chỉ thị phân tử, lập bản đồ liên kết gen, đánh giá tính đa hình ADN...(1,2). Tuỳ những nghiên cứu cụ thể mà chỉ thị nào sẽ được lựa chọn sử dụng. Tuy nhiên, về cơ bản ta có thể sử dụng bất cứ chỉ thị nào trong đánh giá tính đa hình và lập bản đồ gen. Ở Việt Nam đã bước đầu ứng dụng thành công các chỉ thị này vào nghiên cứu gen, nghiên cứu tính đa hình trong sinh giới, tìm chỉ thị liên quan tới mội số tính trạng …(3,4) Bệnh ở thực vật do nhiều nguyên nhân. Có thể do côn trùng (sâu xanh, bọ xít…), nấm (fuccinia arachidis gây bệnh gỉ sắt ở lạc, cà chua), vi khuẩn (Xanthomonas oryze gây bệnh bạc lá lúa) hoặc virut (bệnh xoan lùn ở bông)… Tuy nhiên, trong cùng một loài thường có những giống mang gen kháng các bệnh trên. Chúng chủ yếu là các giống hoang dại, hoặc một số giống địa phương. Đây thực sự là nguồn nguyên liệu quý để các nhà chọn giống dùng để lai tạo ra các giống mang gen kháng. Bằng phương pháp chỉ thị phân tử người ta xác định các chỉ thị ADN liên quan tới gen kháng các bệnh đó. Chỉ thị này có thể liên kết chặt với gen kháng hoặc có thể chính là gen đó (tuỳ theo từng phương pháp cụ thể). Nhờ có sự hỗ trợ của chỉ thị phân tử (MAS) giúp các nhà chọn giống tiết kiệm thời gian chi phí trong quá trình chọn tạo (5). Chính vì những hữu ích và tiện dụng của chỉ thị phân tử trên chúng tôi quyết định thực hiện đề tài “Xác định chỉ thị phân tử liên quan đến bệnh rỉ sắt và héo xanh vi khuẩn ở cây lạc bằng một số kỹ thuật sinh học phân tử” mong muốn tìm hiểu các chỉ thị phân tử để chẩn đoán bệnh giúp đẩy nhanh quá trình chọn giống. 2. Tổng quan lài liệu Phương pháp RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) Nguyên lý Về nguyên lý, kỹ thuật RFLP dựa trên thực tế của sự biến dị và tái tổ hợp tự nhiên trong bộ gen ADN là nguyên nhân vài vị trí enzyme cắt giới hạn bị mất, được tạo ra hay được sắp xếp lại(6). Điều này dẩn đến khi sợi ADN bị cắt thành nhiều đoạn nhỏ bởi các enzym hạn chế thì giữa các giống/loài sẽ có những phân đoạn khác nhau về kích thước hay chiều dài. Phương pháp RFLP của ADN nhân là trình tự ADN có vị trí giới hạn ở 2 đầu và một trình tự đích ở giữa và không thể nhận biết bằng mắt thường được (do kích thước ADN quá lớn). Người ta phải dùng mẩu dò có gắn phóng xạ hay huỳnh quang để nhận biết các phân đoạn cắt hạn chế. Khi mẩu dò liên kết với ADN đích theo nguyên tác bổ sung, người ta có thể xác định được những phân đoạn cắt hạn chế riêng biệt từ một hỗn hợp các phân đoạn của ADN nhân trong chế phẩm xử lý cắt hạn chế. RFLP sản xuất ra một loạt băng khi lai Southern được thực hiện với sự kết hợp đặc biệt của enzym hạn chế và trình tự mẩu dò. Để thực hiện tốt kỹ thuật này cần phải có một loạt các đoạn ADN mẫu dò. Tập hợp các mẫu dò đó được gọi là thư viện (7,8). Kỹ thuật RFLP có thể được mô tả như sau: cắt ADN bằng một enzym giới hạn nào đó. Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose để phân giải chúng theo trọng lượng phân tử. Sau đó tiến hành lai, để lai, các mảnh ADN trong bản gel phải được biến tính thành sợi đơn và được chuyển lên một loại màng đặc biệt gọi là màng lai (màng celuloze hoặc màng nilon) và ở đó chỉ có ADN được giữ lại. Bên cạnh đó việc đánh dấu mẫu dò cũng được tiến hành ngay sau đó nhằm phát hiện ADN trên màng lai và nó cũng được sử dụng để lai với ADN trên màng. Theo nguyên tắc bổ sung, đoạn mẫu dò đã được đánh dấu sẽ tìm gặp và lai với đoạn ADN tương đồng với nó, chúng liên kết với nhau theo bằng liên kết hydro. Từ đó, chúng ta có thể phát hiện được các đoạn RFLP. Ứng dụng của RFLP RFLPs có thể sử dụng theo nhiều mục đích khác nhau. RFLPs có thể sử dụng trong nghiên cứu quan hệ huyết thống, tội phạm bằng cách xác định nguồn ADN mẫu.RFLPs có thể sử dụng để xác định tình trạng bệnh trong một cá thể. RFLPs có thể sử dụng để đo tỷ lệ tái tổ hợp để lập bản đồ di truyền với khoảng cách giữa các vị trí RFLP đo bằng centiMorgans. Gen đánh dấu thông qua RFLP là phương tiện giúp cho việc tuyển chọn các tính trạng sâu bệnh. Người ta xác định được kiểu đồng hợp tử hay dị hợp tử ở từng locut và kỹ thuật này có thể áp dụng trong trường hợp phân tích đa gen. Kỹ thuật RFLP đã ứng dụng ở lúa mì với các gen ARN ribosom để nghiên cứu bệnh đạo ôn trên lúa (Zhihong và cs, 1990). Kỹ thuật này còn áp dụng cho nhiều loại cây trồng như cà chua (bematzky và cs, 1986), rau diếp (lADNy và cs, 1987), khoai tây (Gebarat và cs, 1989) .v.v. Hiện nay, ở Việt Nam RFLP đã được ứng dụng trong nghiên cứu gen Kappa casein và õ-actoglobulin ở bò đực giống hướng sữa (10). Sử dụng RAPD và RFLP định vị gen kháng rầy nâu ở lúa Indica (11). Lập bản đồ xác định vị trí gen ảnh hưởng đến tính kháng mặn của lúa (Oryza sativa L)(12)… Chỉ thị RFLP có vài trò trong nhiều khía cạnh của sinh học phân tử, đặc biệt trong lĩnh vực lập bản đồ phân tử. Tuy nhiên, việc thực hiện phương pháp này mất nhiều thời gian, công sức trong thiết kế mẩu dò. Chi phí đắt, cho nên những chỉ thị tiện ích hơn lần lượt ra đời. Chỉ thị RAPD (Random Aplified Polymorphic ADN) Nguyên lý Kỹ thuật RAPD là loại chỉ thị dựa trên nguyên tắc PCR sử dụng các đoạn mồi ngẫu nhiên. Mồi thường gồm khoảng 10 nucleotide được sắp xếp theo một trình tự ngẫu nhiên nào đó, vì vậy xác suất bắt cặp một đoạn nucleotide trong genome có 10 gốc bổ trợ sẽ vào khoảng 1/410» 1/1010 = 1/1.000.000. Có nghĩa cứ khoảng 1 triệu gốc nucleotide sẽ có 1 vị trí gồm 10 gốc bổ trợ cho 10 gốc của mồi RAPD với trình tự xác định nào đó. Do kỹ thuật này chỉ sử dụng một loại mồi đồng nhất cho cả hai đầu của đoạn ADN cần nhân bản, ngoài ra 2 đoạn mồi này phải được kết cặp trên hai sợi đơn khác nhau của chuỗi ADN và phải đi theo chiều vào nhau, nên xác suất trên phải nhỏ đi nhiều. Trên thực tế xác bắt cặp của các mồi còn nhỏ hơn nhiều lần nữa, bởi trong điều kiện PCR thông thường chỉ tổng hợp được một đoạn ADN không dài quá năm nghìn nucleotide. Đối với ADN thực vật, các mồi RAPD thường cho sản phẩm PCR từ một vài băng đến vài chục băng có chiều dài từ 100-5000 nucleotide. Tuỳ vào các đối tượng thực vật khác nhau mà Tính đa hình trong kỹ thuật RAPD là do sự thay đổi base tại vị trí bắt mồi hoặc do thay đổi nhiểm sắc thể trong vùng được nhân (xen đoạn, mất đoạn, hoặc đảo đoạn) đẩn đến thây đổi kích thước hoặc cản trở sự nhân bản của ADN đích. Tính đa hình thướng được chỉ ra bởi sự có mặt hay vắng mặt của sản phẩm được nhân bản từ một locut đơn (9) Phương pháp Phương pháp RAPD do dùng mồi ngẩu nhiên, ngắn nên có rất nhiều sản phẩm được tạo ra. Kỹ thuật RAPD được tiến hành như sau: 1. Tách chiết ADN tổng số 2. Tiến hành phản ứng RAPD gồm có 4 bước: trong đó có bước gắn mồi- gắn mồi được thực hiện ở nhiệt độ không cao ± 36oC 3. Sản phẩm được điện di trên gel agarose Kết quả phản ứng RAPD là sẽ xuất hiện rất nhiều phân đoạn ADN với các kích thước khác nhau ở các locut khác nhau trên nhiễm sắc thể. Số lượng các phân đoạn ADN được nhân bản phụ thuộc vào độ dài và cấu trúc của đoạn mồi. Đối với hầu hết các thực vật thì đoạn mồi có kích thước trung bình 9-10 nucleotide sẽ nhân bản được từ 2-10 đoạn ADN. Ứng dụng Kỹ thuật RAPD có khả năng phát hiện được những thay đổi những thay đổi nhỏ trong hệ gen của các cá thể thân thuộc hơn hẳn so với kỹ thuật Isozym, kỹ thuật RFLP (Foolad et al, 1993) khi nghiên cứu về các dòng khoai tây được nuôi cấy thấy rằng: 63% trong tổng số 313 mồi phát hiện thấy đoạn ADN đa hình nhờ phương pháp RAPD trong khi RFLP là 16% và Isozym là 0 %. Do sự phát hiện tính đa hình dễ dàng nên kỹ thuật này được sử dụng cho việc nghiên cứu tính thuần của giống. Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây cho thấy kỹ thuật RAPD là một phương pháp rất hiệu quả trong việc phân tích quần thể và nguồn gốc loài, nghiên cứu di truyền loài, lập bản đồ di truyền. Kỹ thuật RAPD cũng được sử dụng để nhận biết và phân loại các giống cây khác nhau, sự đa hình di truyền trong các kiểu gen lúa nước và lúa nương, sự đa hình di truyền giữa lúa Indica và Japonica, xác định sự đa hình của các cây tái sinh có nguồn gốc từ mô sẹo, tế bào huyền phù và tế bào trần. Ưu điểm của kỹ thuật RAPD đánh giá toàn bộ hệ gen của sinh vật, đem lại tính đa hình cao. Phương pháp tiến hành đơn giản, ít tốn kém. Tuy nhiên, RAPD cũng có những nhược điểm do mồi không đặc hiệu nên có rất nhiều băng khó phân tích, dẩn đến khi phân tích kết quả rất dể sai lầm do cách đánh giá khách quan của từng người. Nhưng vì nó dể tiến hành nên phương pháp này hiện nay rất được ứng dụng ở những nước có điều kiện như nước ta. Hiện nay, phương pháp RAPD được ứng dụng trong nước ta trong nhiều lĩnh vực: như đánh giá tính đa hình ở lúa, đậu tương, lạc chè, cà phê, bông, vải, nhạn… định vị gen kháng rầy nâu ở lúa (4) Phương pháp SSR (Simple Sequence Repeats) Nguyên lý SSR hay còn gọi là Microsatellites, nó thường là những đoạn ADN ngắn có trình tự lặp lại của hai đến sáu nucleotide như CACACACA, và chúng có khuynh hướng chiếm các vùng ADN không mang mã (vùng dị nhiễm sắc như: tâm động hoặc đầu mút của nhiễm sắc thể), một vài đơn vị SSR (như CA) có thể được lặp lại bốn lần, một số đơn vị khác lại được lặp lại từ hai đến ba mươi lần. Vùng Microsatellites thường là những vùng siêu biến, nó không chỉ khác nhau giữa các loài mà còn giữa các cá thể có quan hệ gần gũi. Đó chính là cơ sở tạo ra tính đa hình của phương pháp SSR. Tính đa hình SSR thường biểu lộ tính trội (13). Cách thông thường nhất để dò Microsatellites là thiết kế các mồi PCR nó nằm duy nhất trong một locus trên genome, do vậy một cặp mồi PCR có thể đặc trưng cho từng cá thể trong loài, việc tạo ra các sản phẩm PCR có kích thước khác nhau đó cũng chính là các Microsatellites có kích thước khác nhau. Phương pháp Phương pháp SSR dựa trên nguyên tắc PCR với mồi đặc hiệu khoảng 20 nucleotide, với nhiệt độ bắt mồi 60 - 65oC, cho sản phẩm đặc hiệu có kích thước 100-300 bp, Sản phẩm được điện di trên gel Acrylamide Ứng dụng Giá trị SSRs là nó sinh ra tính đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Những chuỗi đa hình đơn giản này SSLPs đã được ứng dụng trong việc lập bản đồ cả ở hai đối tượng động vật và thực vật, ở người Microsetellite được gọi là thế hẹ thứ hai của các chỉ thị phân tử, ở thực vật tần số và số lượng microsetellite đã được xác định trên các cây nhiệt đới như: bắp cải, đậu tương, lúa mì và 34 giống cây trồng khác. Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật sự lặp lại (AT)n nhiều hơn ở động vật. Trong khi ở những loài động vật thì lại giàu microsetellite (GT)n. Những nghiên cứu trên lúa ( Wu ADN tanksley, 1993), Ngô (Senio ADN Heun, 1993) và Arabidopsis (Bell ADN Ecker, 1994) cũng cho kết quả tương tự. Tuy nhiên chỉ thị này cũng có nhược điểm cơ bản như quá trình thiết kế mồi rất tốn kém. SSR thường được dùng để lập bản đồ những vùng khó tính (vùng dị nhiểm sắc) Ở Việt Nam kỹ thuật SSRs đã được ứng dụng rộng rãi để nghiên cứu tính thuần của lúa [14], đánh giá quỹ gen của cây lúa [15], lập bản đồ phân tử các đặc điểm rễ ở lúa cạn [16]. Phương pháp AFLP ( Amplified Fragment Length Polymophism) Đây là phương pháp được phát triển bởi Vos và cs (1995). AFLP là một phương pháp có nhiều triển vọng trong việc phân tích tính đa dạng di truyền, lập bản đồ hệ gen và các nghiên cứu khác có liên quan đến hệ gen. AFLP khắc phục được các đặc điểm của phương pháp RFLPs với sự thuận tiện, thích hợp dựa trên PCR. Phương pháp sinh ra loại chỉ thị này được gọi là nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective Restriction Fragment Amplification: SRFA). Phương pháp này có nhiều ưu điểm là cho độ đa hình cao, có thể được sử dụng để phân tích ADN từ bất kỳ nguồn gốc nào hay phức tạp đến đâu ( Zabeau M và cộng sự, 1993). Do đó, kỹ thuật này có ảnh hưởng rất lớn đối với việc xác định tính đa hình ADN. Chỉ thị AFLP dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen. Kỹ thuật này bao gồm các bước sau: + Bước 1: ADN hệ gen được cắt bằng hai loại enzym. Một enzym cắt hiếm (a rare cutter) như Pst I hoặc EcoR I, và một enzym cắt thường (a frequent cutter) như Mse I, Taq I. Kết quả là sinh ra những mảnh cắt có một đầu là trình tự cắt hiếm và một đầu là trình tự cắt thường. Sau đó gắn phần thêm (adapter) vào hai đầu mảnh cắt (Restriction digetion-Ligation). Các adapter AFLP bao gồm hai phần là phần cốt lõi (core sequence) và chuỗi trình tự đặc hiệu của enzym. Cấu trúc của adapter EcoR I là: 5’-CTCGTAGACTGCGTACC CATCTGACGCATGGTTCC-5’ Cấu trúc của adapter MseI là 5’-GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’ Vị trí giới hạn trên adapter được loại bỏ bằng cách thay đổi cặp bazo cuối cùng. Vị trí giới hạn của EcoRI là 5’-GAATTC-3’, nhưng C trên adapter được thay bằng G do vậy mà sau khi đã gắn adapter vào mảnh ADN hệ gen thì vị trí này không thể bị cắt một lần nữa. Nhờ xảo thuật này mà ADN hệ gen có thể được cắt và gắn đồng thời. Nếu cắt ADN hệ gen bằng hai enzym EcoR I và Mse I sẽ có 3 loại mảnh cắt gồm: mảnh có hai đầu cắt bởi Mse I, mảnh có hai đầu cắt bởi EcoR I, và mảnh cắt có một đầu là EcoR I và một đầu là Mse I. + Bước 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mối đặc hiệu bổ trợ adapter và trình tự giới hạn của enzym. Bước này được thực hiện nhằm giảm bớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt và gắn adapter. Sự nhân bội chọn lọc đạt được bởi sử dụng những mồi được kéo dài phía điểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotide vào vị trí cắt. Do vậy mà chỉ có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các bazo thêm vào mới được nhân bội. Bước này bao gồm hai phản ứng nhân bội ADN mảnh cắt giới hạn. Phản ứng thứ nhất được gọi là nhân sơ bộ (Pre-amplification) hay còn gọi là tiền nhân bội. Phản ứng thứ hai gọi là nhân chọn lọc (Selective PCR). Các mồi AFLP gồm có 3 phần: chuỗi cốt lõi (CORE), chuỗi đặc hiệu enzym (ENZ) và phần thêm vào các nucleotide chọn lọc (EXT) (Zabeau, M ADN Vos, 1993). Điều này được minh hoạ sau đây với 3 nuleotide thêm vào được biểu thị bằng NNN. CORE ENZ EXT Mồi EcoR I: 5’- GACTGCGTACC AATTC NNN-3’ Mồi Mse I: 5’- GATGAGTCCTGAG TAA NNN-3’ Các mồi AFLP cho các enzym cắt hiếm khác cũng tương tự như mồi EcoR I, Taq I hay Mse I, chỉ khác ở chỗ phần đặc hiệu ENZ là tương tự với trình tự cắt của mỗi loại enzym. Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắt gịới hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu một số lượng lớn những mảnh cắt giới hạn. Mỗi bộ gồm tập hợp một số lượng lớn những mảnh cắt ADN có thể phân tích đồng thời phụ thuộc vào độ phân giải của hệ thống phát hiện. + Bước 3: Điện di các sản phẩm PCR trên gel acrylamide, cho 50- 100 mảnh cắt giới hạn, việc phát hiện các mảnh cắt này nhờ sử dụng các đồng vị phóng xạ hoặc nhuộm bạc. Kỹ thuật AFLP cung cấp một lượng vân tay ADN lý tưởng từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào. Đây là một kỹ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng. Tính đặc hiệu của loại đa hình này còn thể hiện bởi trình tự đặc hiệu và số lượng của các nucleotide được thêm vào đầu 3’ của mỗi mồi. Theo tính toán cứ thêm một nucleotide vào mồi AFLP thì số lượng băng ADN nhân bội trong phản ứng PCR lại giảm xuống 4 lần vì trong số các mảnh ADN chỉ có 1 trong 4 nucleotide được chọn lọc và nhân bội. Như vậy khi thêm 2 nucleotide vào đầu của mồi thì số băng ADN giảm xuông 42 lần, nếu thêm vào 3 nucleotide thì số lượng băng giảm xuống 43 lần. Việc thêm các nucleotide vào 2 đầu của các mồi AFLP dẫn đến kết quả tạo ra những bộ phụ (subset) của bộ vân tay. Điều này chỉ ra rằng thêm các nucleotide lựa chọn là con đường chính xác và hiệu quả để lựa chọn một bộ đặc hiệu những mảnh cắt cho quá trình nhân bội. So với các kỹ thuật đánh dấu khác như : RAPD, RFLP hay SSR thì AFLP cho số băng đa hình cao nhất.Tuy nhiên không phải cho tính đa hình cao là đánh giá tính đa hình chính xác nhất. Nguyễn Đức Thành đã đánh giá tính đa hình của 12 giống lúa nương cho thấy phương pháp AFLP cho số băng đa hình cao nhất, nhưng phương pháp SSR có mức độ phân biệt các giống lúa cao hơn so với AFLP. Điều này thể hiện ở chổ hầu hết hệ số Jacard giữa các giống lúa tính toán theo đa hình SSR có giá trị thấp hơn hệ số Jacard giữa các giống lúa khi tính toán theo đa hình AFLP [3]. Ở Việt Nam, phương pháp AFLP đã tiếp cận và sử dụng thành công như Viện Công nghệ Sinh học, Viện Di truyền Nông nghiệp, Viện Lúa đồng bằng sông cửu long … Ngoài các phương pháp chỉ thị trên còn có rất nhiều các chỉ thị phân tử khác như STS, CAP, … Do các ưu nhược điểm của các phương pháp trên mà chúng tôi đã chọn 2 phương pháp RAPD và SSR phù hợp với điều kiện thí nghiệm hiện nay của phòng. Chúng tôi đã chọn 2 phương pháp này để tìm chỉ thị liên quan đến bệnh gỉ sắt ở lạc 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Vật liệu - Tập đoàn 62 giống lạc cung cấp bởi trung tâm NCTN đậu đỗ - Thu thập lá của con lai F1, F2 và hạt F3 của 5 cặp lai 1: ICG11505 (kháng vừa héo xanh) x L12 (NS+CL) 2: GNQ (kháng héo xanh) x L08 ( NS+CL) 3: ICG950166 (Kháng rỉ sắt) x L12 (NS+CL) 4: L12 x ICG950166 (Kháng rỉ sắt) 5: L08 x ICG99051(Kháng rỉ sắt) Phương pháp nghiên cứu a) Phương pháp thu mẫu Các mẫu lá thu vào các ống effendoft, dữ trong nitơ lỏng và bảo quản ở -840C b) Phương pháp tách ADN Tách chiết theo phương pháp của Gawel và cs có cải tiến, trong đó tăng CTAB từ 2% lên 4%. Kiểm tra độ sạch và hàm lượng ADN bằng đo quang phổ hấp phụ kết hợp với việc điện di trên gel agaroza 0,8%. c) Phản ứng RAPD với mồi ngẫu nhiên: Thể tích mỗi phản ứng 25ml dung dịch, trong đó có 1X đệm PCR, 3mM MgCl2, 150mM 4dNTP, 300nM đoạn mồi, 0,75 đơn vị Taq polymeraza và 5-10ng ADN khuôn. Chu trình nhiệt là b1: 940C - 3 phút, b2: 940C - 1 phút, b3: 360C - 45 giây, b4: 720C - 10 phút, b5: 72 0C - 20 phút và b6: lưu giữ ở 40C. Từ b2 đến b4 lặp lại 45 chu kỳ. Điện di phân tích sản phẩm RAPD trên gel agaroza 1,4%, nhuộm bản gel bằng Ethidium bromid và chụp ảnh. d) Phản ứng SSR: - Thể tích mỗi phản ứng 20ml dung dịch, trong đó có 1X đệm PCR, 2-3mM MgCl2, 250mM 4dNTP, 1pM cặp mồi, 0,06U Taq polymeraza và 5-10ng ADN khuôn. Chu trình nhiệt là b1: 940C - 2phút, b2: 940C - 45giây, b3: 57-640C - 45giây, b4: 720C - 10 phút, b5: 72 0C - 20 phút và b6: lưu giữ ở 40C. Từ b2 đến b4 lặp lại 45 chu kỳ. Điện di kiểm tra sản phẩm SSR trên gel agaroza 2%, nhuộm bản gel bằng Ethidium bromid và chụp ảnh. - Điện di kiểm tra sản phẩm SSR trên gel agaroza 2% nếu xuất hiện khoảng cần tìm ta tiến hành phân tích trên gel acrylamid 6% () e) Phân tích số liệu: Dựa trên sự xuất hiện hay không xuất hiện của các phân đoạn ADN khi điện di sản phẩm RAPD, để làm cơ sở cho việc phân tích số liệu (theo quy ước 1 = xuất hiện, 0 = không xuất hiện). Số liệu được xử lý theo chương trình NTSYSpc version 2.0 (Applied Biostatistics Inc., USA., 1998) để lập ra biểu đồ so sánh hệ số tương đồng di truyền 4. Một số kết quả đạt được 1 2 3 4 5 6 7 M Kết quả tách chiết ADN + Đã tìm ra được phương pháp tách chiết ADN cho lạc, đó là phương pháp của Gawel và cs đã cho kết quả chất lượng ADN tốt. Hình 1: Kết quả điện di ADN tổng số trên gel Agarose 0.8%. + Kết quả cho thấy băng ADN gọn, đạt tiêu chuẩn để tiến hành các bước tiếp theo. Để xác định hàm lượng ADN la dựa vào marker. Ở hình 1 marker có trọng lượng 100ng, từ đó ta có thể xác định được trọng lượng phân tử của các giống: Các giống 1, 2, 6, 7 có trọng lượng khoảng 80-85ng, giống 4 có trọng lượng phân tử khoảng 250ng, còn giống 3 và 5 có trọng lượng phân tử khoãng 350ng. Khi xác định được trọng lượng phân tử của mỗi giống ta pha loãng các giống đó về nồng độ cần sữ dụng. Sau đó chạy kiểm tra lại nồng độ ADN các giống một lần nữa, thấy chúng đã tương ứng với nhau thì coi như là được, có thể tiến hành các bước tiếp theo. Kết quả đánh giá tính đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD Mặc dù chưa tìm được chỉ thị liên quan đến tính kháng bệnh rỉ sắt, nhưng bước đầu chúng tôi đã xác định được mức độ đa hình giữa các giống lạc Đã sàng lọc tổ hợp 82 mồi, mỗi tổ hợp mồi gồm 3 mồi, được 20 tổ hợp mồi và nhận được 11 mồi cho kết quả đa hình, thu được 2650 phân đoạn. (bảng 1) Primer Giống 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Tổng RA 45 4 4 3 3 3 4 4 4 4 1 3 7 1 3 3 1 2 2 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 116 UBC776 6 6 7 6 7 6 6 5 7 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 8 4 5 5 5 7 5 3 6 5 5 5 6 191 RA 31 5 5 5 5 5 5 5 2 5 5 5 5 5 5 3 4 4 4 4 5 4 5 5 2 5 5 4 5 3 4 5 5 4 147 RA36 8 8 8 7 6 8 8 8 9 8 8 9 8 8 8 8 8 8 8 10 9 8 10 7 8 9 9 8 8 5 8 7 8 265 OPL 3 4 3 4 4 3 6 4 4 4 4 4 4 2 4 4 4 4 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 128 RA159 10 5 10 11 10 7 10 10 10 10 8 11 11 10 11 11 10 11 11 8 10 10 8 10 10 11 11 10 11 8 8 8 10 320 RA 40 11 14 13 13 13 13 13 11 13 13 14 14 14 14 14 13 13 13 14 10 13 15 13 11 13 11 12 12 13 12 11 11 13 420 RA142 4 4 5 5 5 6 4 4 4 4 4 4 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 3 2 4 4 4 4 3 3 3 4 4 128 RA143 13 13 13 12 12 13 13 13 14 14 13 13 14 15 15 14 14 14 13 12 12 13 12 12 13 13 12 12 12 12 12 13 13 428 UBC 3 5 4 6 6 7 7 7 6 6 7 9 8 7 8 7 7 8 6 7 5 5 4 5 5 4 4 5 5 4 4 4 5 5 192 OPH 08 10 10 10 10 7 10 10 10 10 10 9 9 10 10 10 10 9 9 10 10 10 10 10 10 8 10 10 8 10 10 8 8 10 315 80 76 84 82 78 85 84 77 86 82 83 90 81 86 84 82 82 80 84 78 83 81 79 72 78 82 80 75 78 71 72 74 81 2650 Phân tích số liệu của 11 mồi RAPD trên phần mềm NTSYSpc2 cho kết quả hình cây Hình 3: Sơ đồ hình cây của 33 giống lạc - Qua sơ đồ ta thấy các giống lạc có hệ số tương đồng cao, các giống có hệ số tương đồng cao nhất là: ICGV11325 và ICGV11331; ICGV87157 và CL6: VAG15 và GNQ với hệ số tương đồng 96%. Các giống có những khác biệt lớn: ICGV10931, ICG87165 và ICG86699 chúng khác với các giống khác. 4.3 Phương pháp SSR + Bước đầu đã đánh giá tính đa hình bố mẹ + Sẻ phân tích quần thể F3 với 40 cặp mồi SSR + Dự đoán kết quả: lập bản đồ liên kết của lạc liên quan đến bệnh gỉ sắt 5. Tài Liệu Tham khảo Ralph van Berloo, Thesis Wageningen University - with references - with summaries in English ADN Dutch. Laboratory of Plant Breeding. P.O. Box 386, 6700 AJ, Wageningen, The NetherlADNs, 2000. Use of molecular markers in plant breeding Nguyễn Đức Thành, Phan Thị Bảy, Lê Hồng Điệp. 1999. Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa đạng phan tử ở lúa. Báo cáo khoa học, Hà Nội 1999, 1205tr Lê Thị Lan Oanh, M.Mohan, S.Nair.1999 Sử dụng kỹ thuật PCR – RAPD định vị gen kháng rầy nâu ở lúa indica. Báo cáo khoa học, Hà Nội 1999, 1259tr Nguyễn Văn Đồng, Vũ Đức Quang, Phạm Ngọc Lương, Trần Duy Quý, Henry T.Nguyen, Báo cáo khoa học, Hà Nội 1999, 1236tr Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc pháp triển hệ thống lúa lai hai dong thương phẩm Marker-assisted breeding ADN improvement of genotypePhương pháp RFLP giáo trình cao học nông nghiệp, 1997. Công nghệ sinh học trong cải tiến giống cây trồng. O.l.Gamgorg, G.C Phillip (Eds) (1995), Plant cell, Tissue ADN organ culture. Spinger verlag, Berlin – Heidelberg, pp. 281 - 296 Trịnh Thị Kim Thoa, Hoàng Tuấn Anh, Báo cáo khoa học, Hà Nội 1999, 1179tr. Áp dụng kỹ thuật PCR và RFLP để nghiên cứu gen Kappa casein và õ-actoglobulin ở bò đực giống hướng sữa tại Việt Nam Lê Thị Lan Oanh, M.Mohan, S.Nair Sử dụng kỹ thuật RAPD, RFLP định vị gen kháng rầy nâu ở lúa Vương Đình Tuấn, Y.Fukuta, M.Yano, T.Ban Lập bản đồ xác định vị gen ảnh hưởng đến tính Kháng mặn của lúa (Oryza sativa L.) Akio Miyao, Hui sun Zhong, Lisa Monna, Masahiro Yano, Kimiko Yamamoto, 2002. Characterization anh genetic mapping of simple sequance repeats in the rice genome Nguyễn Văn Đồng, Vũ Đức Quang, Phạm Ngọc Lương, Trần Duy Quý, Henry T. Nguyễn, Báo cáo Khoa học, 1999. Nghiên cứu ứng dụng công nghệ Sinh học trong việc phát triển hệ thống lúa lai hai dòng thương phẩm Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, Báo cáo Khoa học, 1999. ứng dụng ADN marker trong đánh giá quỹ gen cây lúa. Nguyễn Đức Thành, Nguyễn Thị Kim Liên, Trần Quốc Trọng, Quách Thị Liên, Lê Bích Thuỷ, Báo cáo Khoa học, 1999. Những kết quả bước đầu về tạo quần thể cho lập bản đồ phân tử các đặc điểm rễ ở lúa cạn.