Tìm hiểu sự khác nhau về các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa giữa các dòng vi khuẩn Edwardsiella ictalurixác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và API 20E

). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 11 CHƯƠNG III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 3.1.1 Thời gian Từ tháng 01/2008 đến 05/2008. 3.1.2 Địa điểm - Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản Khoa Thủy sản - Trường Đại học Cần Thơ. - Phòng thí nghiệm gây cảm nhiễm Khoa Thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ. 3.2 Nội dung thực hiện - Phục hồi vi khuẩn từ nguồn vi khuẩn liệt kê ở Bảng 3.1 - Nuôi tăng sinh vi khuẩn. - Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống. - Định danh vi khuẩn bằng kit API 20E. - Dùng phương pháp PCR khẳng định kết quả định danh. - Tiến hành thí nghiệm gây cảm nhiễm, tái phân lập và tái định danh vi khuẩn. 3.3 Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 3.3.1 Vật liệu  Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn,  Đĩa petri, ống nghiệm,  Ống đong, lame, lamella,  Chai nấu môi trường, bình tam giác,  Cá từ, pipet, đầu cone, ống hút, găng tay,  Các vật liệu nghiên cứu khác, v.v…. 3.3.2 Thiết bị  Kính hiển vi,  Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy, Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 12  Bếp nấu môi trường, máy lắc, nồi thanh trùng,  Máy ly tâm, máy chu kỳ nhiệt, máy ủ nhiệt, máy so màu quang phổ,…  Cân điện tử, lò viba, bộ điện di….  Các thiết bị khác, v.v…. 3.4 Hóa chất, thuốc thử và môi trường dùng cho nghiên cứu  Cồn 700, cồn 960.  Môi trường phục hồi và nuôi cấy vi khuẩn: EIA (edwardsiella ictaluri agar), TSA (tryptone soya agar; Merck), NB (nutrient broth; Merck)  Bộ kít API 20E (bộ test + thuốc thử: TDA, IND, VP) (BIO MÉRIEUX). Môi trường  Các môi trường đường (glucose, arabinose, rhamnose, sorbitol, manitol, innositol, sucrose) (Merck) dùng để kiểm tra khả năng lên men của vi khuẩn.  Môi trường OF (Merck) dùng để kiểm tra khả năng oxi hóa và lên men của vi khuẩn.  Môi trường thạch Simon Citrate (Merck) dùng để kiểm tra khả năng sử dùng nguồn cacbon của vi khuẩn.  Môi trường MR-VP (Voges Proskauer; Merck) dùng cho phản ứng VP.  Môi trường NB (nutrient broth; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh indole.  Môi trường decarboxylase (Himedia) + yeast extract (Merck) + 1% acid amin (arginine, lysine và ornithin) (Merck) dùng kiểm tra khả năng khử amino acid.  Môi trường 0.1% pepton (Himedia) + 0.2% KH2PO4 (Merck) + 0.0012% phenol red (Merck) +0.1% glucose + 2% ure (Merck) dùng kiểm tra khả năng sử dụng urea của vi khuẩn.  Môi trường TSI (triple sugar iron; Merck) dùng kiểm tra khả năng sinh khí H2S của vi khuẩn. Thuốc thử  Dung dịch oxy già H2O2 3% cho phản ứng catalase.  Que thử Oxidase (Merck).  Đĩa ONPG (Ortho-nitrophenyl galactosidase; Merck)  Thuốc thử Kovac’s (Merck) cho phản ứng sinh indole. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 13  Thuốc thử Lugol’s Iodine (cách pha được trình bày ở phần Phụ lục) cho khả năng thủy phân tinh bột (starch).  Thuốc thử cho phản ứng VP.  Các dung dịch nhuộm Gram. Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR  LB (10g tryptone, 5g yeast extract và 5g sodium chloride, trong 1L nước cất ).  TE (pH 8.0) gồm 10mM Tris HCl và 1mM EDTA.  Hóa chất dùng trong khuếch đại DNA: Bufer 10X, MgCl2, dNTPs (10mM), Taq polymerase (5u), mồi, nước cất 2 lần.  Loading dye 6X, ethidium bromide, agarose, dung dịch chạy diện di TAE (Tris HCl:acetate:EDTA). 3.5 Phương pháp nghiên cứu 3.5.1 Số chủng vi khuẩn cần thiết - Chủng tham khảo: E223. - Chủng nghiên cứu: 6 chủng (2 chủng phân lập trực tiếp từ cá bệnh và 4 chủng phục hồi từ nguồn vi khuẩn của Khoa Thủy sản) 3.5.2 Nguồn vi khuẩn - Các dòng vi khuẩn E. ictaluri phân lập từ cá tra bị bệnh mủ gan từ nhiều nguồn khác nhau, sau khi phân lập được trữ ở -80 C. - Vi khuẩn phân lập trực tiếp từ cá bệnh (mẫu dịch vụ) - Chủng vi khuẩn E. ictaluri tham khảo mã số 223 được phân lập từ ao cá tra bệnh ở An Giang (Từ Thanh Dung, 09/2002, khoa thuỷ sản, trường Đại Học Cần Thơ) Bảng 3.1 Nguồn gốc các dòng vi khuẩn sử dụng cho đề tài STT Mã PTN Địa điểm Cơ quan phân lập 1 CAF255 Châu Phú Thận 2 CAF258 Châu Phú Tỳ tạng 3 2B1 Ô môn- CT Thận 4 3B3 Ô môn- CT Thận 5 C1 Thốt Nốt- CT Thận 6 C2 Thốt Nốt- CT Thận 7 E223 Chủng tham khảo - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 14 3.5.3 Phương pháp phục hồi và nuôi tăng sinh vi khuẩn - Vi khuẩn được phục hồi bằng cách cấy lên môi trường TSA, ghi nhận kết quả phục hồi của vi khuẩn sau 24-48 giờ ở 28 C. - Chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đặt trên máy lắc sau 24 - 48 giờ kiểm tra kết quả. 3.5.4 Định danh vi khuẩn theo phương pháp truyền thống Hình dạng, kích thước tính ròng và các đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp của Barrow và Feltham (1993). Các chỉ tiêu sinh hóa được thực hiện cho phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 3.2 và Bảng 3.3. Các chỉ tiêu sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống được thực hiện lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất hai lần lặp lại. Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở phụ lục 1. Bảng 3.2 Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng phương pháp sinh hóa truyền thống STT Chỉ tiêu kiểm tra 1 Nhuộm Gram 2 Hình dạng 3 Tính di động 4 Oxidase 5 Catalase 6 O/F 7 ONPG 8 Arginine 9 Lysin 10 Ornithine 11 Khả năng sử dụng citrate 12 Khả năng sinh H2S 13 Khả năng sinh urease 14 Khả năng sinh indole 15 Phản ứng VP Khả năng sử dụng các loại đuờng 16 Arabinosse 17 Glucose 18 Innositol 19 Mannitol 20 Rhamnose 21 Sorbitol 22 Sucrose Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 15 3.5.5 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux). Đọc kết quả theo 7 giá trị. Phương pháp - Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kit để giữ ẩm trong quá trình ủ trong tủ ấm. - Dùng que cấy tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước cất hoặc nước muối sinh lý (0.85% NaCl) tiệt trùng, lắc đều. - Dùng pipet tiệt trùng hút vi khuẩn cho vào các ô của bộ kit. Các ô CIT, GEL và VP thì cho đầy, các ô còn lại cho vừa đủ. - Cho paraffin tiệt trùng vào các ô ADH, LDC, ODC, H2S và URE. - Ủ trong tủ ấm ở 28C và đọc kết quả sau 48 giờ. Đọc kết quả - TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện cho phản ứng dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-). - IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vòng màu đỏ xuất hiện cho phản ứng dương (+), màu vàng cho phản ứng âm (-). - VP: Thêm một giọt mỗi dung dịch thuốc thử VP1, VP2. Đợi ít nhất 10 phút, màu hồng hoặc màu đỏ xuất hiện cho phản ứng dương (+). Nếu màu hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10-12 phút, được coi là phản ứng âm (-). - Các chỉ tiêu còn lại đọc kết quả dựa vào bảng chỉ tiêu, không cần sử dụng thuốc thử. Sau khi cho thuốc thử vào không nên đem ủ trở lại trong tủ ấm. Bảng 3.3: Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định bằng bộ kit API 20E Chỉ tiêu Âm tính Dương tính ONPG Không màu Vàng ADH Vàng Đỏ/cam LDC Vàng Đỏ/cam ODC Vàng Đỏ/cam CIT Vàng Xanh/xanh lá H2S Không màu Đen URE Vàng Đỏ/cam TDA Vàng Nâu sậm IND Vàng Hồng VP Không màu Hồng/đỏ (10 phút) GEL Không màu (còn kết tủa đen) Đen Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 16 GLU Xanh/xanh lá Vàng MAN Xanh/xanh lá Vàng INO Xanh/xanh lá Vàng SOR Xanh/xanh lá Vàng RHA Xanh/xanh lá Vàng SAC Xanh/xanh lá Vàng MEL Xanh/xanh lá Vàng AMY Xanh/xanh lá Vàng ARA Xanh/xanh lá Vàng 3.5.6 Phương pháp PCR Chiết tách Acid nucleic (Bartie và ctv, 2006)  Nuôi tăng sinh vi khuẩn (24 giờ) trong ống nghiệm có chứa 5ml môi trường LB.  Chuyển 1.5ml dung dịch vi khuẩn sang ống eppendorf và cho vào 100µl dung dịch TE (10mM Tris HCl và 1mM EDTA).  Đun ở 95C trong vòng 15 phút.  Làm lạnh trong nước đá.  Ly tâm 14000 vòng/phút trong 2 phút. Rút phần dung dịch. Đo hàm lượng DNA. Khuyếch đại ADN: (theo Panangala và ctv (2007) có chỉnh sửa) - Thành phần cho phản ứng: Đoạn mồi xuôi (EiFd-1): GTAGCAGGGAGAAAGCTTGC Đoạn mồi ngược (EiRs): GAACGCTATTAACGCTCACACC Bảng 3.4 Thành phần hóa chất thực hiện phản ứng PCR STT Thành phần tham gia phản ứng Hàm lượng 1 PCR Buffer 10 X 2 MgCl2 1.5 mM 3 dNTPs 200 µM 4 Taq DNA polymerase 5 U 5 Đoạn mồi (EiFd-1) 0.4 µM 6 Đoạn mồi (EiFd-1) 0.4 µM 7 Mạch khuôn 20 ng 8 Nước cất - - Chu kỳ nhiệt 1. Giai đoạn tiền biến tính: 95C trong 4 phút. 2. Tiếp theo là 30 chu kỳ gồm: - Giai đoạn biến tính: 95C trong 30 giây Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 17 - Giai đoạn gắn mồi: 53C trong 45 giây - Giai đoạn kéo dài chuỗi: 72C trong 30 giây. 3. Giai đoạn kéo dài chuỗi cuối cùng: 72C trong 10 phút. Điện di Quá trình điện di được thực hiện với dung dịch TAE 0,5X và bản thạch chứa 1.5% agarose. Đun nóng dung dịch agarose tan hoàn toàn. Sau đó để dung dịch nguội khoảng 50-60C cho ethidium bromide vào và đổ agarose vào khay. Thể tích gel tùy thuộc vào kích cỡ của khay đựng gel. Độ dày của gel chỉ cần cao hơn đáy của lược gel khoảng 0,3-0,5 cm và bề dày gel không quá 0,8cm Cho gel vào bồn điện di. Thêm dung dịch điện di cho vừa bao phủ gel. Dùng pipette hút 10µl cho mẫu cần phân tích trộn với một giọt 6X dung dịch nạp mẫu vào từng giếng một. Sử dụng thang DNA để xác định khối lượng phân tử của sản phẩm PCR. Sử dụng dòng điện từ 100-150V. Ngừng điện di khi màu xanh đậm di chuyển khoảng 1/2 đến 2/3 gel. Đọc kết quả Đặt gel lên bàn UV để đọc kết quả. Kết quả điện di được ghi nhận bằng máy đọc gel Vilber Lourmat. Căn cứ vào thang DNA 1 kb plus ladder (Invitrogen) để xác định trọng lượng phân tử. Trọng lượng phân tử đọan ADN của vi khuẩn E. ictaluri cần phát hiện là 407bp. 3.5.7 Thí nghiệm gây cảm nhiễm Mục đích của thí nghiệm gây cảm nhiễm trong đề tài này là để kiểm chứng lại kết quả tái định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kit API 20E. Thí nghiệm được bố trí như sau: - Bể composite (100L) và các dụng cụ được khử trùng bằng chlorine, xà phòng, rửa lại bằng nước sạch. Sau đó cho nước vào bể và lắp hệ thống sục khí liên tục vài ngày để loại hết chlorine. - Cá tra có trọng lượng 50-60g/con, màu sắc tươi sáng, phản ứng linh hoạt được chọn và bố trí ngẫu nhiên 6con/bể vài ngày cho cá quen dần với môi trường nước. Vẫn cho ăn bình thường, tiến hành kiểm tra ký sinh trùng và vi sinh trước khi gây cảm nhiễm. - Vi khuẩn sau khi phục hồi trên môi trường TSA, giữ trong tủ ấm 48 giờ ở 28C, sau đó chọn một khuẩn lạc nuôi tăng sinh trong môi trường nutrient broth 24 giờ, sau đó ly tâm 15 phút (4000 vòng/phút), rửa bằng nước muối sinh lý (0.85% NaCl), xác định mật độ vi khuẩn bằng máy so màu quang phổ ở bước sóng 650nm, xác định OD = 1(tương đương Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 18 109) (sau đó cho 10 µl dung dịch lên môi trường TSA đếm và xác định mật độ vi khuẩn), tiêm cho cá. Hình 3.1: Các bước chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm Vị trí tiêm là gốc vi ngực với liều lượng 0,2ml/cá. Sau khi tiêm theo dõi liên tục biểu hiện của cá trong 10 ngày, chọn những cá có dấu hiệu lờ đờ, bơi lội kém linh hoạt, tiến hành giải phẫu, phân lập lấy mẫu vi sinh thận, tỳ tạng và máu trên môi trường TSA. Theo dõi và ghi nhận sự phát triển của vi khuẩn trong tủ ấm ở 28 C trong 24 - 48 giờ. Nếu sau 10 ngày cá không có biểu hiện bất thường thì kết thúc thí nghiệm. Phục hồi trên TSA (28C- 48h) Tăng sinh trong NB Ly tâm và rửa nước muối 3 lần Xác định mật độ vi khuẩn Đo qua máy so màu (xác định OD =1, ở bước sóng 680nm) Đếm mật độ vi khuẩn trên môi trường TSA Gây cảm nhiễm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 19 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 4.1 Phương pháp sinh hóa truyền thống Kết quả quan sát, phân tích các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn nghiên cứu theo phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở Bảng 4.5 Hai chủng vi khuẩn phân lập trực tiếp trên cá bệnh (C1, C2), 4 chủng vi khuẩn phục hồi từ nguồn vi khuẩn của Khoa Thủy sản, trữ ở -80C (CAF255, CAF258, 2B1, 3B3) và chủng tham khảo (E223) sau khi phục hồi tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm gram, oxidase, catalase, O/F, tính di động. Sau đó kiểm tra các đặc điểm sinh hóa theo phương pháp của của Barrow và Feltham (1993), mỗi chỉ tiêu được lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại. Bảng 4.5 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống Chỉ tiêu CAF255 CAF258 2B1 3B3 C1 C2 E223 Chủng chuẩn của Hawke (1979) Di động + + + + + + + + Gram - - - - - - - - Hình dạng que que que que que que que que Oxidase - - - - - - - - Catalase + + + + + + - + O/F + + + + + + + + Indole - - - - - - - - H2S - - - - - - - - Urea - - - - - - - - Arginine - - - - - - - - Lysine + + + + + + + + Ornithine + + + + + + + - VP - - - - - - - - Citrate - - - - - - - - ONPG - - - - - - - - Rhamnose - - - - - - - - Sorbitol - - - - - - - - Mannitol - - - - - - - - Arabinose - - - - - - - - Innositol - - - - - - - - Glucose + + + + + + + + Sucrose - - - - - - - - Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 20 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp truyền thống của 6 chủng vi khuẩn nghiên cứu giống với chủng tham khảo E223 ở hầu hết các chỉ tiêu, trừ chỉ tiêu catalase. Tất cả các chủng đều có dạng hình que, gram âm (hình 4.2), cho phản ứng oxidase âm tính, có khả năng lên men và oxi hóa đường glucose (hình 4.3), không có khả năng sinh khí H2S và không tạo sản phẩm indole (hình 4.4). Tuy nhiên tất cả các chủng đều có khả năng thủy phân lysine và ornithine (hình 4.5). Kết quả phân tích của đề tài cũng tương tự với kết quả phân tích các đặc tính sinh lý và sinh hóa của E. ictaluri trên cá nheo Mỹ (Hawke, 1979) ngoại trừ chỉ tiêu ornithin là dương tính. Hình 4.2: Hình nhuộm gram vi khuẩn E. ictaluri Hình 4.3 Khả năng lên men và oxi hóa đường glucose của vi khuẩn E. ictaluri Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 21 Hình 4.4: Kết quả âm tính với indole của vi khuẩn E. ictaluri Hình 4.5: Khả năng thủy phân ornithin và lysine của vi khuẩn E. ictaluri Theo báo cáo của Lương Trần Thục Đoan (2006) về việc định danh chủng vi khuẩn E. ictaluri mã số 224 phân lập trên cá tra, ngoài các đặc điểm trên còn có thêm phản ứng dương với citrate. Theo Dung và ctv (2004), E. ictaluri cho phản ứng oxidase âm tính và catalate dương tính. Ở đây chủng E223 cho phản ứng âm tính với catalate có thể vi khuẩn bị biến đổi đặc tính vì trữ lâu trong tủ âm -80C. 4.2 Kết quả test API Song song với việc xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn bằng phương pháp truyền thống, đề tài cũng tiến hành xác định các chỉ tiêu sinh hóa của vi khuẩn bằng bộ kít API 20E. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.6. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 22 Bảng 4.6: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn bằng bộ kít API 20E Chỉ tiêu CAF255 CAF258 2B1 3B3 C1 C2 E223 Di động + + + + + + + Gram - - - - - - - Hình dạng que que que que que que que Oxidase - - - - - - - Catalase + + + + + + - O/F + + + + + + + ONPG - - - - - - - ADH - - - - - - - LDC + + + + + + + ODC - - - - - - - CIT - - - - - - - H2S - - - - - - - UREA - - - - - - - IND - - - - - - - VP - - - - - - - GLU + + + + + + + MAN - - - - - - - INO - - - - - - - SOR - - - - - - - RHA - - - - - - - ARA - - - - - - - SAC - - - - - - - Ghi chú: ONPG: beta galactosidase; ADH: arginine decarboxylase; LDC: lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: H2S production; UREA: ure; IND: indole; VP: phản ứng voges- proskauer; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; ARA: arabinose; SAC: sucrose. Kết quả ở Bảng 4.6 cho thấy hầu hết các chỉ tiêu đều âm tính trừ glucose và lysine. Các chủng vi khuẩn trữ ở -80C (E223, 3B3, CAF258, CAF255, 2B1) và 2 chủng phân lập trực tiếp từ cá bệnh (C1, C2) đều cho kết quả giống nhau khi so với chủng tham khảo E223. Năm 2007, Lê Minh Đương thực hiện thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn chủng E223 trên cá tra, sau đó tái phân lập vi khuẩn từ máu, lớp nhớt trên da, mang, não, gan, thận, tỳ tạng và tim cho kết quả dương tính ở các chỉ tiêu glucose, lysine và citrate, các chỉ tiêu còn lại đều âm tính. Trong đề tài này chủng E223 không có khả năng sử dụng citrate, điều này có thể do vi khuẩn bị biến tính khi trữ quá lâu ở -80C Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 23 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Hình 4.6: Kết quả test API vi khuẩn E. ictaluri Ghi chú: - âm tính + dương tính 1:Beta galactosidase (-); 2: Arginine (-); 3: Lysine (+); 4: Ornithine (-); 5: Citrate (-); 6: H2S (-); 7: Urea (-); 8: tryptophane (-); 9:indole (-);10: phản ứng Voges- Proskauer (-); 11: gelatin (-); 12: glucose (+); 13: Mannitol (-); 14: Inositol (-); 15: Sorbitol (-); 16: Rhamnose (-); 17: Sucrose (-); 18: Melibiose (-); 19: Amygdalin (-); 20: Arabinose(-) 4.3 Kết quả định danh vi khuẩn bằng PCR PCR là công cụ giúp phát hiện nhanh và chính xác mầm bệnh vi sinh vật trên tôm, cá. Đề tài ứng dụng phương pháp PCR để phát hiện E. ictaluri nhằm kiểm tra tính chính xác của kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E. Kết quả PCR được trình bày ở hình 4.7 Hình 4.7: Kết quả điện di sản phẩm PCR các chủng E. ictaluri Giếng M: thang đo DNA (1 kb plus Invitrogen); Giếng 1: đối chứng âm (nước); Giếng 2: chủng 223; Giếng 3: chủng 258; Giếng 4: chủng 3B3; Giếng 5: chủng C1;Giếng 6: chủng C2 Từ kết quả ở hình 4.6 cho thấy cả 5 mẫu đều hiện vạch tại vị trí 407 pb chứng tỏ có sự hiện diện của E. ictaluri, trên tất cả các mẫu đều không có sản phẩm 407bp 1650bp 850bp 650b p 100bp 200b p Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 24 phụ, tuy nhiên ở giếng số 3 và số 5 mẫu hiện vạch không rõ như các giếng còn lại có thể là do hàm lượng ADN chiết tách không đủ. Nồng độ của mạch khuôn và đoạn mồi sử dụng trong phản ứng này là 20ng và 0.4 µM, điều này cũng được ghi nhận bởi Panangala và ctv (2007) ông cho rằng điều kiện tối ưu nhất cho phản ứng PCR này là nồng độ của mạch khuôn lần lượt là 60, 30 và 20ng; nồng độ mồi trong khoảng 0.2 đến 0.8 µM, vì quy trình chạy 1 lần ra kết quả nên không cần phải tối ưu thêm nữa. Tuy nhiên nếu có điều kiện nên tiến hành thử giảm các thành phần để có thể tiết kiệm chi phí mà vẫn mang lại kết quả tốt nhất. Do điều kiện không cho phép nên chưa tiến hành chạy 2 mẫu CAF255 và 2B1. 4.4 Kết quả gây cảm nhiễm và tái định danh vi khuẩn Các chủng vi khuẩn nghiên cứu được gây cảm nhiễm trên cá khỏe để xác định khả năng gây bệnh mủ gan, sau đó tái phân lập và tái định danh vi khuẩn từ thận, tỳ tạng và máu. Các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của chủng vi khuẩn gây bệnh trước và sau khi gây cảm nhiễm được so sánh nhằm xác định tính đồng nhất của phương pháp định danh. 5 dòng vi khuẩn được chọn ngẫu nhiên cho thí nghiệm gây cảm nhiễm là E223, 3B3, CAF258, C1 và C2 với các mật độ lần lượt 1.3x107, 0.7x107, 0.2x107, 1x107 và 1.5x107 CFU/ml. Cá được thuần hóa cho que với môi trường nước thí nghiệm, sau đó được kiểm tra ký sinh trùng và phân lập vi sinh, trước khi tiến hành gây cảm nhiễm bằng phương pháp tiêm với liều lượng 0.2ml/cá. Sau 2 ngày theo dõi liên tục, cá ở các bể tiêm vi khuẩn chủng CAF258, C1 và C2 bắt đầu có biểu hiện bệnh lý như bơi lội lờ đờ, kém linh hoạt. Giải phẫu quan sát nội quan và lấy mẫu vi sinh ở thận, tỳ tạng và máu. Kết quả cho thấy bể tiêm vi khuẩn chủng CAF258 có tỷ lệ cá chết là 4/6 con, bể C1 có tỷ lệ cá chết là 3/6 và bể C2 có tỉ lệ cá chết là 4/6. Thận cá có những đốm trắng nhỏ li ti (hình 4.8) nhưng tỳ tạng thì không biểu hiện, bóng hơi cá rất mềm. Sự xuất hiện vi khuẩn đầu tiên ở thận đã được Ferguson và ctv (2001) ghi nhận khi tìm hiểu về bệnh mủ gan trên cá tra ở nuôi ở ĐBSCL. Tác giả cho biết đặc trưng của bệnh mủ gan là những đốm trắng kích thước 1- 3mm xuất hiện trên gan, thận và tỳ tạng nhưng ở giai đoạn mới bộc phát thì đốm trắng chỉ có ở thận và tỳ tạng. Điều này cũng được trình bày trong báo cáo kết quả gây cảm nhiễm chủng E. ictaluri 223 của Tiết Ngọc Trân (2006) khi gây cảm nhiễm bằng phương pháp ngâm sử dụng nồng độ 0,9x108 CFU/ml kết quả vi khuẩn xuất hiện ở hầu hết các cơ quan phân lập nhưng tỷ lệ cao nhất là ở thận trong mọi thời điểm thu mẫu. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 25 Hầu hết bên ngoài cơ thể cá vẫn bình thường, một số ít xuất huyết ở các gốc vây (hình 4.9), tiến hành lấy mẫu bệnh phẩm phân lập vi khuẩn ở thận, tỳ tạng và máu, cấy lên môi trường TSA, sau đó ủ ở 28C trong vòng 24 - 48 giờ thì thấy xuất hiện các khuẩn lạc nhỏ, tròn, trắng đục, không nhân. Tuy nhiên có một số cá chết mà không thấy dấu hiệu lâm sàng đặc trưng nêu trên. Hình 4.8: Thận cá tra gây cảm nhiễm dòng vi khuẩn CAF258 Đốm trắng ở thận ( ) Hình 4.9: Dấu hiệu bên ngoài của cá tra gây cảm nhiễm dòng E. ictaluri Xuất huyết ở các gốc vây ( ) Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa được thực hiện với vi khuẩn được tái phân lập gồm: nhuộm Gram, phản ứng O/F, oxidase, catalase, tính di động. Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở Bảng 4.7. Kết quả tái xác định các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa bằng bộ kít API 20E được trình bày ở Bảng 4.8. Các chủng vi khuẩn tái phân lập từ cá tra thí nghiệm đều có hình que, Gram âm, di động Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 26 yếu, phản ứng oxidase âm tính, phản ứng catalase, tất cả đều có khả năng lên men O/F trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí qua hai phương pháp sinh hóa và cho kết quả PCR giống nhau (hiện vạch 407 bp). Bảng 4.7: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng phương pháp sinh hóa truyền thống CAF258 C1 C2 Chỉ tiêu TCN SCN TCN SCN TCN SCN Di động + + + + + + Gram - - - - - - Hình dạng que que que que que que Oxidase - - - - - - Catalase + + + + + + O/F + + + + + + Indole - - - - - - H2S - - - - - - Urea - - - - - - Arginine - - - - - - Lysine + + + + + + Ornithine + + + + + + VP - - - - - - Citrate - - - - - - ONPG - - - - - - Rhamnose - - - - - - Sorbitol - - - - - - Mannitol - - - - - - Arabinose - - - - - - Innositol - - - - - - Glucose + + + + + + Sucrose - - - - - - Ghi chú: TCN: trước khi gây cảm nhiễm SCN: sau khi gây cảm nhiễm Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 27 Bảng 4.8: Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa các chủng vi khuẩn tái phân lập từ thí nghiệm cảm nhiễm bằng bộ kít API 20E CAF258 C1 C2 Chỉ tiêu TCN SCN TCN SCN TCN SCN Di động + + + + + + Gram - - - - - - Hình dạng que que que que que que Oxidase - - - - - - Catalase + + + + + + O/F + + + + + + ONPG - - - - - - ADH - - - - - - LDC + + + + + + ODC - - - - - - CIT - - - - - - H2S - - - - - - UREA - - - - - - IND - - - - - - VP - - - - - - GLU + + + + + + MAN - - - - - - INO - - - - - - SOR - - - - - - RHA - - - - - - ARA - - - - - - SAC - - - - - - Ghi chú: ONPG: beta galactosidase; ADH: arginine decarboxylase; LDC: lysine decarboxylase; ODC: ornithine decarboxylase; CIT: citrate; H2S: H2S production; UREA: ure; IND: indole; VP: phản ứng voges- proskauer; GLU: glucose; MAN: mannitol; INO: inositol; SOR: sorbitol; RHA: rhamnose; ARA: arabinose; SAC: sucrose TCN: trước khi gây cảm nhiễm SCN: sau khi gây cảm nhiễm Nhìn chung tất cả các chỉ tiêu ở 3 chủng vi khuẩn trước và sau khi gây cảm nhiễm ( CAF258, C1, C2) đều có kết quả giống nhau ở cả 3 phương pháp sinh hóa truyền thống, test API và chạy PCR. Trong khi đó, các bể tiêm vi khuẩn chủng E223 và 3B3 sau 10 ngày theo dõi không thấy xuất hiện dấu hiệu bất thường, một số cá thí nghiệm có hiện tượng xuất huyết ở các vây, tuy nhiên khi lấy mẫu vi sinh trên máu, thận và tỳ tạng cấy trên môi trường TSA sau 48 giờ ở 28C không thấy sự hiện diện của vi khuẩn ở bất kỳ cơ quan nào. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 28 4.5 Thảo luận Đề tài được thực hiện với nội dung tìm hiểu những chỉ tiêu sinh hóa khác nhau khi sử dụng phương pháp sinh hóa truyền thống và sử dụng bộ kít API 20E. Nhìn chung hầu hết các chỉ tiêu đều giống nhau khi sử dụng hai phương pháp này. Tuy nhiên, vẫn có sự sai khác ở một số chỉ tiêu là ornithine dương tính đối với phương pháp sinh hóa truyền thống và âm tính đối với kít API 20E. Theo ghi nhận từ nhiều tài liệu thì chỉ tiêu ornithine cũng có nhiều biến đổi. Cụ thể năm 1986, Waltmam và ctv tiến hành kiểm tra 119 dòng E. ictaluri thì có 100 dòng cho phản ứng dương tính với ornithine còn lại 19 dòng cho phản ứng âm tính. Trong khi Hawke (1979) tiến hành định danh vi khuẩn E. ictaluri trên cá nheo Mỹ thì kết quả trong số các chỉ tiêu về axit amin chỉ có lysine là dương tính còn arginine và ornithine thì âm tính. Như vậy trong 3 chỉ tiêu acid amin của E. ictaluri thì chỉ tiêu ornithin có khi là âm tính, có khi là dương tính. Năm 2007, Lê Minh Đương tiến hành gây cảm nhiễm cá tra bằng dòng vi khuẩn E223, sau đó tái phân lập vi khuẩn từ máu, lớp nhớt trên da, mang, não, gan, thận, tỳ tạng, tim rồi kiểm tra bằng bộ kít API 20E thì thấy ngoài chỉ tiêu glucose và lysine thì citrate cũng cho phản ứng dương tính. Trong khi cũng tiến hành gây cảm nhiễm và phân lập ở cá cơ quan tương tự đối với dòng vi khuẩn EHO2 thì lại có kết quả âm tính với citrate. Như vậy chỉ tiêu citrate cũng giống như ornithin có thể biến đổi giữa các chủng vi khuẩn E. ictaluri. Năm 2002, Từ Thanh Dung và ctv đã dùng kít API 20E cho việc định danh vi khuẩn E. ictaluri phân lập trên cá tra tại hai tỉnh An Giang và Cần Thơ. Ngoài đặc điểm lysine và glucose dương tính thì loài E. ictaluri phân lập ở nông hộ 3 còn có thêm khả năng sử dụng urea, đây là chỉ tiêu hơi khác so với kết quả của đề tài. Các kết quả nghiên cứu của Buller (2004), Hawke (1979) hầu hết chỉ ra chỉ tiêu urea là âm tính. Ngày nay API cũng là một phương pháp phổ biến trong việc định danh vi khuẩn đặc biệt là đối với các loài vi khuẩn gram âm. Nếu so sánh giữa API và sinh hóa truyền thống mà không nói về độ chính xác của kết quả thì dễ dàng nhận thấy API sẽ được chấp nhận nhiều hơn do không mất nhiều thời gian, công sức mà lại còn cho kết quả nhanh chóng. Nếu xét riêng từng phương pháp thì kít API hay phương pháp sinh hóa truyền thống đều có những ưu và nhược điểm riêng. Xét về mặt thời gian thì phương pháp sinh hóa truyền thống cho kết quả chậm hơn, các thao tác thực hiện phức tạp và dễ bị tạp nhiễm. Bộ kít API sẽ cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ làm do có sẵn kít và thuốc thử nên không cần phải mất nhiều thời gian cho việc chuẩn Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 29 bị. Tuy nhiên, chi phí sử dụng kít khá cao và kít API được thiết kế cho việc định danh vi khuẩn trên người, với nhiệt độ cơ thể là 37C, khi ứng dụng vào thủy sản cho nhóm E. ictaluri (nhiệt độ tối ưu để chúng phát triển là 28C) thì tính chính xác của phân tích cũng phải được lưu ý. Kết quả kiểm tra sinh hóa và kiểm tra API dường như được khẳng định hơn qua sự phát triển của cả 7 chủng vi khuẩn này trên môi trường Edwarrdsiella ictaluri agar, đây là môi trường dinh dưỡng đặc trưng cho loài vi khuẩn này, với các thành phần thích hợp, chỉ có E. ictaluri mới có thể mọc được trên môi trường này. Sau 2 ngày phát triển ở 280C, vi khuẩn đã tạo được các khuẩn lạc nhỏ, không nhân, rìa có dạng không đồng nhất. Trong nhóm Enterobacteriaceace đặc điểm dễ nhận biết để phân biệt E. ictaluri với các nhóm khác ở chỗ tất cả các chỉ tiêu hầu như âm tính, chỉ một vài chỉ tiêu dương tính. Theo thống kê của OIE (2006) trong số 5 loại đường gồm malonate, arabinose, trehalose, mannitol, sucrose thì E. ictaluri hầu như không có khả năng tạo axit từ các loại đường này. Kết quả này giống với kết quả test sinh hóa các chủng E. ictaluri trong đề tài, tuy nhiên điều kiện không cho phép nên đề tài chưa tiến hành phân tích chỉ tiêu malonate. Bảng 4.9: Các đặc điểm khác nhau giữa loài E. ictaluri với các loài khác thuộc nhóm Enterobacteriaceace (OIE, 2003). Chỉ tiêu Yersinia ruckeri Hafnia alvei E. tarda E. hoshinae E. ictaluri D- Mannitol + + + + - Sucrose - - + + - Trehalose + + - + - Arabinose - + + (-) - Malonate - d - + - Indole - - + - - H2S - - - - - Motility - + + + -** Citrate + - + (+) - ** Di động yếu ở 28C (Hawke, 1979). -: âm tính. +: dương tính d: có thể âm tính hoặc dương tính. Trong nhóm Enterobacteriaceace cho thấy 2 loài E. ictaluri và E. tarda thường được quan tâm nhiều do đây là 2 đối tượng gây tổn thất lớn cho nghề nuôi cá. Tuy nhiên E. tarda là loài vi khuẩn phát triển tốt ở vùng nước ấm, theo OIE (2006) chúng có thể phát triển được ở 42C, Việt Nam là vùng khí hậu nhiệt đới nên nhìn chung chưa thấy xuất hiện loại vi khuẩn này. Các kết quả nghiên Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 30 cứu thường tiến hành so sánh đặc điểm sinh hóa giữa hai loài này và OIE đưa ra kết luận chúng ta có thể phân biệt E. ictaluri với E. tarda dựa vào chỉ tiêu indole và H2S, E. tarda có khả năng sinh indole và H2S trong khi E. ictaluri thì không. Ngoài ra E. tarda còn phát triển được ở 42C và di động ở 37C. Định danh E. ictaluri bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng kít API 20E là 2 phương pháp phổ biến đã được rất nhiều người thực hiện. Dùng phương pháp nào cũng cho ra kết quả tuy nhiên đối với phương pháp kiểm tra truyền thống thì mất nhiều thời gian hơn trong khi dùng kít API chỉ cần vài ngày. Cái mới trong đề tài này là với phương pháp PCR chỉ cần khoảng 1 ngày chúng ta đã có thể nhanh chóng phát hiện E. ictaluri, mà kết quả lại chính xác vì chỉ đúng loài vi khuẩn này mới có thể bắt cặp với mồi và hiện vạch tại vị trí 407 bp. Kết quả nghiên cứu của đề tài cho phép phân biệt E. ictaluri với các loài khác dựa vào một số đặc điểm cơ bản là: vi khuẩn Gram âm, hình que ngắn, di động yếu hoặc không di động, oxidase âm tính, catalase dương tính, đặc biệt không tạo sản phẩm của indole và H2S. Vì vậy sau này khi làm việc với E. ictaluri ta không nhất thiết phải dùng kít API, không cần kiểm tra tất cả các chỉ tiêu như trong kít có sẵn, cũng chẳng cần mất nhiều thời gian cho việc định danh vi khuẩn bằng sinh hóa truyền thống mà điều quan trọng là phải kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm gram, di động, oxidase, catalase, đặc biệt là phải thử sản phẩm của H2S và indole, bởi đây là điểm quan trọng để phân biệt E. ictaluri và E. tarda. Nếu mọi chỉ tiêu đều giống đặc điểm của E. ictaluri, ta tiến hành kiểm tra chính xác lại bằng phản ứng PCR. Với cách làm này sẽ tiết kiệm được nhiều thời gian và chi phí, từ kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa cơ bản PCR cho phép phát hiện nhanh và sớm các mầm bệnh ở dạng tiềm ẩn. Đây sẽ là hướng đi mới trong việc chẩn đoán nhanh bệnh mủ gan ở cá tra nuôi, nếu nghi ngờ ao nuôi nhiễm bệnh thì không phải đợi đến khi bệnh bộc phát mà vẫn có thể chẩn đoán sớm. Nếu dùng phương pháp sinh hóa truyền thống mất khoảng 1 tuần, kít API cho kết quả khoảng 2 ngày trong khi dùng PCR chỉ cần khoảng 1 ngày cho việc ly trích mẫu và chạy PCR mà kết quả cũng dễ chấp nhận hơn. Tuy nhiên ở phương pháp nào cũng phải mất thời gian đầu cho việc kiểm tra các chỉ tiêu cơ bản. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 31 Đề xuất quy trình định danh E. ictaluri gây bệnh mủ gan trên cá tra Phân lập vi khuẩn trên TSA/NA Khuẩn lạc màu trắng không nhân, rìa có dạng không đồng nhất sau 24-48h Nhuộm Gram Gram âm, hình que ngắn Gram dương Oxidase âm tính, catalese dương tính H2S âm tính Oxidase dương tính Di động yếu hoặc không di động ở 37 ∙C Chạy PCR, hiện vạch 407pb Edwarsiella ictaluri Không tạo sản phẩm indole Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 32 CHƯƠNGV KẾT LUẬN- ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận Kết quả kiểm tra sinh hóa truyền thống không khác gì nhiều so với các kết quả nghiên cứu trước đây. Kết quả test API 20E không có sự khác nhau giữa các chủng. So sánh kết quả giữa test sinh hóa truyền thống và test API nhìn chung không gì khác nhau ngoài chỉ tiêu ornithin. 5 chủng E223, 3B3, CAF258, C1 và C2 chọn ngẫu nhiên để gây cảm nhiễm. Tiến hành tái phân lập và tái định danh các chủng CAF258, C1, C2 cho kết quả giống với các đặc điểm của các chủng vi khuẩn ban đầu. Riêng 2 bể E223 và 3B3 sau 10 ngày theo dõi vẫn không thấy có biểu hiện lạ không tìm thấy sự xuất hiện của vi khuẩn trên thận, tỳ tạng và máu. Kết quả PCR khẳng định 5 chủng vi khuẩn CAF258, E223, 3B3, C1 và C2 là Edwardsiella ictaluri (hiện vạch 407bp). Điều kiện không cho phép nên chưa tiến hành chạy PCR 2 chủng CAF255 và 2B1. 5.2 Đề xuất Áp dụng phương pháp PCR phát hiện sớm E. ictaluri gây bệnh mủ gan ở cá tra Dùng PCR phát hiện đồng thời 3 loại vi khuẩn Flavobacterium columnare (504bp), Edwardsiella ictaluri (407bp), và Aeromonas hydrophila (209bp). . Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. A.del Cerro, I. Marquez, J.A.Guijarro, 2002. Simultaneous Detection of Aeromonas salmonicida, Flavobacterium psychrophilum and Yersinia ruckeri, Three Major Fish Pathogens, by multiplex PCR. 2. Baldwin T.J. and J.C. Newton, 1993. Pathogenesis of Enteric septicemia of Channel catfish, caused by Edwardsiella ictaluri: Bacteriologic and light and electron microscopic finding. Journal of Aquatic Animal Health 1993;5:189-198. 3. Barrow, G. I. and R. K. A. Feltham. 1993. Cowan and Steel ‘s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn. Cambridge Univesity Press, Cambridge. 262 4. Bartie, K., Đ. T. H. Oanh, G. Huy, C. Dickson, M. Cnockaert, J. Swings, N. T. Phương, A. Teale. 2006. Tạp chí Công nghệ sinh học 4 (1): p31-40 5. Baxa D. V., J. M. Groff, A. Wishkovsky, R.P. Hedrick, 1990. Susceptibility of experimental infection with Edwardsiella ictaluri. 6. Buller N. B, 2004. Bacteria from fish and other aquatic animal: A Practical Indentification Manual, 353 trang. 7. Bùi Quang Tề, 2006, nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội. 395 trang 8. Bilodeau L., D. Wise and B. Wolters, 2002. Early detection of Edwardsiella ictaluri in NWAC103 channel catfish fingerlings. NWAC News. Edited by Jimmy L. Avery. Volume 5, number 2, page 1. 9. Cheryl L.Tars, Jayna S.Patel, Nancy D. Puhr, Evansowers, Cheryl A. Bopp, Nancy A. Strockbine, 2006. Indentification of Vibrio isolates using a multiplex- PCR assay and rpoB sequence determination. 10. Dung T.T, M. Crumlish, N.T.N.Ngọc, N.Q.Thịnh & Đ.T.M Thy, 2004. Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ, 2004. 11. Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007. Giáo trình nguyên lý chẩn đoán bệnh, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ. 85 trang 12. Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng, Nguyễn Thị Muội, 2004. Giáo trình bệnh học thủy sản. Khoa nuôi trồng thủy sản, đại học thủy sản Nha Trang, 345 trang. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 34 13. Ferguson, H.W, JF Turnbull, A Shinn, K.Thomson, TT Dung and M.Crumlish, 2001, Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, VietNam. Journal of fish disease 2001, 24, page 509-513. 14. G. Nicolas Frerichs, Stuart D. Millar, 1993. Manual for the isolation and Identification of fish bacterial pathogens. 15. Hawke, J.P, 1979. A bacterium associated with disease of pond cultured channel catfish. Journal of the Fisheries Research Board of Canada. 36: 1508-1512. 16. Hawke, J.P, R.M Durborow, R.L Thune and A.C Camus, 1998. ESC – Enteric Septicemia of Catfish. SRAC Publication No.477 17. Inglis V., Roberts R.J and Bromage N.R., 1993. Bacterial disease of fish. Institute of aquaculture. 18. J. A. Plumb and S. Vinitnantharat, 1989. Biochemical, biophysical and Serological Homogeneity of Edwardsiella ictaluri. 19. Kasornchandra J, W.A. Rogers and J.A. Plumb 1987. Edwardsiella ictaluri from walking catfish, Clarias batrachus L., in Thailan. Journal of Fish Diseases 10, 137-138. 20. Khawsak, P., W. Deesukon, P. Chaivisuthangkura, W. Sukhumsirichart, 2008. Multiplex RT- PCR asay for simultaneous detection of six viruses of penaeid shrimp. Mol cell probes 22 (3): 177- 83. 21. Lawrence M.L., R.K. Cooper and R.L.Thune, 1997. Attenuation, persistence and vaccine potential of an Edwardsiella ictaluri purA Mutant. Infection and Immunity, nov. 1997,p.4642-4652. Vol.65,no.11. 22. Lê Minh Đương, 2007. So sánh khả năng xâm nhập của hai dòng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 63 trang. 23. Lê Phú Khởi, 2006. Đánh giá thông tin liên quan đến quản lý sức khỏe cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở tỉnh An Giang. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ. 43 trang. 24. Lê Thị Bé Năm, 2002. Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 43trang. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 35 25. Lương Trần Thục Đoan, 2006. Khảo sát sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh mủ gan (Edwardsiella ictaluri) trên các cơ quan khác nhau của cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 51trang. 26. Manual of Diagnostic tesst for aquatic animals, 2003, 1/9/2003. http:// www.oie.int/fr/normes/fmanual/A_00029.htm, ngày truy cập 3/6/2008 27. M. Crumlish, T T Dung, J F Turnbull, N T N Ngoc and H W Ferguson, 2002. Indentification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish, Pangasius hypophthalmus (Sauvage), cultured in the Mekong Delta, Vietnam. Journal of fish dieases, 25, 733-736. 28. Năm 2006: Kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 773,64 triệu USD. 109. Cập nhật: 02/06/2008 29. Nguyễn Chính, 2005. Đánh giá tình hình sử dụng thuốc hóa chất trong nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus) thâm canh tại An Giang- Cần Thơ. Luận văn cao học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 74 trang. 30. Nguyễn Quốc Thịnh, 2002. Bước đầu nghiên cứu mô bệnh học bệnh đốm trắng trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus). Luận văn Đại Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 40 trang. 31. Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung, Ferguson H.W, 2003. Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan. Tạp chí khoa học. Đại học Cần Thơ, chuyên ngành thủy sản, 2004, 120- 125. 32. Panangala, V.S., C.A Shoemaker, V.L. Van Santan, K. Dybvig., P. H. Klesius. 2007. Multiplex-PCR for simultaneous detection of three fish- pathogenic bacteria, Edwardsiella ictaluri, Flavobacterium columnare and Aeromonas hydrophila. Diseases of Aquatic Organisms 74: 199- 208. 33. Phan Thị Mỹ Hạnh, 2004. Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng bệnh vi khuẩn do Edwardsiella ictaluri trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ, 47 trang. 34. Plumb, J.A, 1999. Edwardsiella Septicaemias. Fish disease and Disorders, Volume 3: Viral, Bacterial and Fungal infections. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 36 35. Plumb J.A and D.J. Sanchez, 1983. Susceptibility of five species of fish to Edwardsiella ictaluri. Journal of fish disease 6, 261-266. 36. Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chuyên môn bệnh học thủy sản, 2007. Bộ môn sinh học và bệnh thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học cần Thơ. 66 trang. 37. The aquatic Animal heath rearch Institure. Bangkock, Thailand. 2003. Diagnostic Bacteriology, 106 trang. 38. Tiết Ngọc Trân, 2007.So sánh khả năng gây bệnh của hai dòng vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh trên cá tra (Pangasius hypophthalmus) và cá nheo Mỹ (Ictalurus punctalus). Luận văn Đại Học, khoa thủy sản, Đại Học cần Thơ, 56 trang 39. Trần Thị Ngọc Hân, 2006. Khảo sát mô học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh mủ gan trong điều kiện gây cảm nhiễm. Luận văn đại học, khoa thủy sản, Đại Học Cần Thơ. 71 trang. 40. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005. Giáo trình bệnh học thủy sản, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ. 41. Từ Thanh Dung, 2006. Giáo trình bệnh vi khuẩn động vật thủy sinh, khoa thủy sản, trường Đại Học Cần Thơ, 37trang. 42. Từ Thanh Dung và Nguyễn Thị Như Ngọc, 2006. Thực tập bệnh vi khuẩn trên động vật thủy sản. 43. Victor S. Panangala, Craig A. Shoemaker, Vicky L. van Santen, Kevin Dybvig, Phillip H. Klesius, 2007, multiplex- PCR for simultaneous detection of 3 bacterial fish pathogen, Flavobacterium columnare, Edwadsiella ictaluri, and Aeromonas hydrophyla. Dieases of aquatic organisms, 74: 199- 208. 44. Waltman W. D., E. B. Shotts and T. C. Hsu, 1986. Biochemical characteristics of Edwardsiella ictaluri. Applied and environmental microbiology, 51, No. 1, p. 101-104. 45. William, M.L and M.L Lawrence, 2005. Identification and characerization of a two compoent hemolysin from E. ictaluri. Veterinary Microbiology. 108: 281-189. 46. Wongteerasupaya, C., V. Boonsaeng, W. Tongchuea, N. Sitidilokratana, P. Kanchanaphum, R. Klinputsorn, S. Panyim, 1998. Multiplex PCR for detection of Yellow-head virus and White sport syndrome virus in Penaeus monodon. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 37 47. Yang. B, X–L Song, J Huang, C-Y Shi, Q-H Liu and L Liu, 2006. A single-step multiplex PCR for simultaneous detection of white spot syndrome virus and infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp, 29, 301-305 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 38 PHỤ LỤC 1 Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ một giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn trải đều lên giọt nước cất. Để khô ở nhiệt độ phòng sau đó hơ lướt lam trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn trên lam. Các bước thực hiện: 1. Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I ) lên lam. Để 1 phút. 2. Rửa bằng nước cho hết màu tím trên lam (khoảng 2 giây), để khô. 3. Nhỏ dung dich Iodine (dung dịch II) lên lam, để khoảng 1 phút. 3. Lật nghiêng lam kính cho hết dung dịch Iodine trên lam. 4. Dùng dung dịch cồn: aceton (dung dịch III) để tẩy màu bằng cách nghiêng lam kính rồi nhỏ từ từ dung dịch III cho đến khi giọt nước cuối trên lam không còn màu tím. Rửa và để khô. 5. Nhỏ dung dịch Safranin (dung dich IV) lên lam, để khoảng 2 phút. Rửa và để khô ở nhiệt độ phòng. Quan sát ở vật kính 100X. Đọc kết quả Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh. Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ. 2 Quan sát tính di động Sự di động của vi khuẩn có thể quan sát bằng phương pháp giọt treo ở vật kính 40X. Các bước thực hiện như sau: 1. Cho vaseline lên 4 góc của lamelle và đặt ngửa lamelle trên bàn. 2. Cho một giọt nước lên lame. 3. Tiệt trùng que cấy, lấy một ít vi khuẩn cho lên lame hòa vào nước. 4. Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle sao cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn. 5. Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước được treo ngược trên lamelle 6. Đặt lam lên kính hiển vi quan sát tính di động của vi khuẩn ở vật kính 40X. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 39 3 Phản ứng oxidase: dùng dung dịch oxidase Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm dung dịch oxidase. Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển sang màu xanh trong vòng 10 giây và ngược lại. 4 Phản ứng catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 trong 100ml nước cất). 1.Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lam. 2. Nhỏ lên vi khuẩn một giọt 3% H2O2 Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại. 5 Khả năng len men và oxy hoá đường glucose (O/F) Các bước thực hiện: 1. Đun và khấy cho tan hoàn toàn môi trường O/F. 2. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội 450C. 3. Thêm 1% glucose tiệt trùng. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. 4. Cấy vi khuẩn vào 2 ống nghiệm có chứa môi trường OF. Sau đó phủ 0.5- 1ml dầu parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. Theo dõi và đọc kết quả sau từ một đến bảy ngày. Lên men (F) khi ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng. Oxidation (O) khi ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng. Không đổi (N) cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ. 6 Phản ứng decarboxylase (Arginine, Lysine, Ornithine) Các bước thực hiện: 1. Pha môi trường Decarboxylase (công thức trên nhãn) + 0.5% yeast extract. 2. Thêm 1% amino acid (Arginine, Lysine, Ornithine) cho các phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có amino acid. 3. Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm. 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Cấy một ít vi khuẩn vào trong 4 ống nghiệm sau đó phủ lên mỗi ống 0.5ml Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 40 parafin tiệt trùng, để trong tủ ấm ở 280C. Đọc kết quả từ 1-4 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu của ống đối chứng và ngược lại. 7 Khả năng sử dụng citrate 1. Pha môi trường Simmon,s Citrate agar (công thức pha chế trên nhãn). 2. Đun sôi và khuấy cho tan. 3. Cho khoảng 6ml môi trường vào ống nghiệm 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng trong ống nghiệm và để nguội. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng của ống nghiệm. Ủ ở 280C Sau 2-7 ngày, vi khuẩn sử dụng Citrate tạo màu xanh lơ trong môi trường Simmon,s Citrate agar cho kết quả (+) và ngược lại. 8 Khả năng sinh H2S Các bước thực hiện: 1. Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất). 2. Đun và khuấy cho tan hoàn toàn. 3. Tiệt trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội ở 450C. 4. Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm. 5. Để nghiêng ống nghiệm tạo một mặt phẳng nghiêng. 6. Cấy vi khuẩn trên bề mặt nghiêng và mặt đứng của ống nghiệm. Ủ ở 280C. Đọc kết quả sau 14-28 giờ Vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose và Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu vàng ở phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)). Vi khuẩn chỉ lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu vàng ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)). Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose hoặc Sucrose cho màu đỏ ở phần thạch nghiêng và màu đỏ ở phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)). Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 41 Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen trong ống nghiệm. 9 Khả năng sử dụng urea. Các bước thực hiện: 1. Pha 0.1% Pepton + 0.2% KH2PO4+ 0.0012% Phenol Red +0.1 % Glucose 2. Thêm 2% ure cho phản ứng. Môi trường làm đối chứng không có urea. 3. Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm. 4. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. 5. Cấy một ít vi khuẩn vào trong 2 ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. Đọc kết quả trong vòng 2 ngày. Phản ứng (+) khi các ống nghiệm có urea chuyển sang màu hồng. 10 Khả năng sinh indole Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội. 3. Cấy một ít vi khuẩn vào trong ống nghiệm. Để trong tủ ấm ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm. Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole sẽ cho phản ứng (+) với một vòng màu hồng đến đỏ sậm trên bề mặt của môi trường và ngược lại. 11 Phản ứng voges- proskauer (VP) Các bước thực hiện: 1. Cho khoảng 3ml môi trường MR – VP broth vào ống nghiệm. 2. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, để nguội. Thuốc thử: A : Hòa tan 5g alpha naphthol trong 100ml ethyl alcohol. B: Hòa tan 40g KOH trong 100ml nước cất. 3. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C. 4. Sau 48 giờ nhỏ 0.6ml thuốc thử A và 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm, lắc đều và để nghiêng ống nghiệm 30 phút. Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu 42 Kết quả: Sự chuyển màu hồng của môi trường cho phản ứng (+) và ngược lại. 12 Khả năng sử dụng các nguồn cacbohydrate Các bước thực hiện: 1. Môi trường Nutrient broth (công thức pha chế trên nhãn) + 0.4% Bromothymol blue (1.6%) 2. Thêm 1% đường (glucose, arabinose, cellobiose…) 3. Chỉnh pH = 6.8 4. Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm 5. Thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Để nguội 6. Cấy vi khuẩn vào trong các ống nghiệm. Ủ ở 280C 7. Đọc kết quả trong vòng 2-7 ngày Nếu môi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) và ngược lại 13 -galactosidase Cho vi khuẩn vào môi trường NB, thêm vào 0.2ml của 1.5% NaCl. Ủ qua đêm. Sau 48 giờ cho đĩa ONPG vào, giữ 20 phút và đọc kết quả: dương tính cho màu vàng trong vòng 4 giờ, ngược lại là âm tính.