Tóm tắt Luận án Nghiên cứu công nghệ sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ CÔNG THƯƠNG VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM ĐỖ THỊ KIM LOAN NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT DẤM BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CHÌM SỬ DỤNG PHỤ PHẨM TRONG SẢN XUẤT RƯỢU GẠO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT Chuyên ngành: Công nghệ sinh học thực phẩm Mã số: 62.54.02.05 Hà Nội - 2016 Công trình được hoàn thành tại Viện Công nghiệp thực phẩm Người hướng dẫn khoa học: 1. TS Nguyễn Thị Việt Anh 2. PGS.TS Lê Đức Mạnh Phản biện 1. PGS.TS Nguyễn Thị Minh Tú Phản biện 2. TS Nguyễn Quang Hào Phản biện 3. TS Phạm Hương Sơn Luận án được bảo vệ tại Hội đồng đánh giá luận án cấp Viện họp tại Viện Công nghiệp thực phẩm Vào hồi giờ, ngày tháng . năm Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Thư viện Viện Công nghiệp thực phẩm 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Dấm là một loại gia vị truyền thống dùng trong chế biến các món ăn ở nhiều nước trên thế giới. Ngày nay, dấm được sản xuất từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau và được sử dụng rất phổ biến trong công nghiệp thực phẩm với mức tiêu thụ ước tính trên toàn thế giới lên tới 3,2 tỉ lít dấm chứa 5% acid acetic mỗi năm. Trong đó, dấm gạo là loại phổ thông, có hương vị đặc trưng, phù hợp với khẩu vị của nhiều quốc gia, dân tộc trên thế giới, đặc biệt với văn hóa ẩm thực của người Phương Đông. Ở Việt Nam, dấm chủ yếu được sản xuất bằng phương pháp lên men bề mặt và một phần được pha chế từ acid acetic tinh khiết nên hiệu suất lên men không cao và tiềm ẩn nhiều nguy cơ mất an toàn thực phẩm. Bên cạnh nguồn nguyên liệu quả, hạt ngũ cốc, dấm còn được sản xuất từ một số loại phụ phẩm như: rượu vang chua, hành đỏ thứ phẩm, mật ong thứ phẩm,. Trong đó, nguồn dịch bã thải sau quá trình chưng cất rượu gạo còn sót một số thành phần có giá trị như: ethanol, đường, tinh bột, acid amin, vitamin, chất khoáng,. và đặc biệt là các chất thơm; thường được tận dụng làm thức ăn chăn nuôi, men bánh mỳ, men gia súc, Nghiên cứu tận thu nguồn phụ phẩm trong nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm nói chung và tận dụng dịch bã rượu từ qui trình sản xuất rượu gạo nói riêng để lên men dấm có ý nghĩa thực tiễn, vừa đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của thị trường về dấm, vừa giảm giá thành sản phẩm và góp phần giảm thiểu ô nhiễm môi trường. Đề tài luận án: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo” nhằm khai thác, tận dụng nguồn phụ phẩm dịch bã rượu tạo ra sản phẩm dấm an toàn, đáp ứng yêu cầu của người tiêu dùng, 2 góp phần nâng cao giá trị, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường từ các qui trình sản xuất rượu gạo lên men. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetic có khả năng sinh tổng hợp acid cao và phù hợp với môi trường lên men sử dụng dịch bã rượu. - Cải biến vi khuẩn acetic bằng kỹ thuật tạo đột biến ngẫu nhiên, nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp acid acetic, ứng dụng trong lên men dấm nồng độ cao. - Xây dựng qui trình lên men dấm nồng độ acid acetic cao từ môi trường bổ sung dịch bã rượu bởi chủng vi khuẩn acetic đột biến, theo phương pháp chìm, qui mô phòng thí nghiệm. Sản phẩm dấm lên men tạo thành có sự kế thừa và phát triển nguồn chất thơm tự nhiên từ dịch bã rượu, đạt chất lượng tốt, đảm bảo vệ sinh an toàn và đáp ứng thị hiếu của người tiêu dùng. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3.1. Ý nghĩa khoa học Luận án đã đưa ra cơ sở khoa học về việc sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo, kết hợp với kỹ thuật sinh học trong việc cải biến chủng vi khuẩn acetic có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao, ứng dụng trong sản xuất dấm an toàn, đáp ứng yêu cầu của người tiêu dùng. Cụ thể như sau: - Đã phân tích, đánh giá thành phần của dịch bã rượu tạo cơ sở cho việc tận dụng làm nguyên liệu cho sản xuất dấm. - Đã tuyển chọn được chủng vi sinh vật có khả năng lên men dấm từ môi trường bổ sung dịch bã rượu và cải biến được chủng vi khuẩn acetic mới có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao bằng phương pháp tạo đột biến ngẫu nhiên. 3 - Xây dựng được qui trình công nghệ sản xuất dấm từ dịch bã rượu đạt nồng độ acid acetic và hiệu suất lên men cao theo phương pháp lên men chìm bởi chủng vi khuẩn acetic đột biến. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn - Xử lí hiệu quả phụ phẩm dịch bã rượu từ qui trình sản xuất rượu gạo thành sản phẩm dấm có ích cho đời sống. - Sản xuất được sản phẩm dấm đạt nồng độ acid cao, chất lượng ổn định và đảm bảo yêu cầu vệ sinh an toàn thực phẩm. - Luận án đã bổ sung các kết quả nghiên cứu về vi khuẩn acetic và ứng dụng trong lên men dấm gạo nồng độ cao; dùng làm tài liệu tham khảo phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học, giảng dạy và trong sản xuất. 4. Những điểm mới của luận án - Từ nguồn mẫu thu thập ở Việt Nam và Nhật Bản đã phân lập, tuyển chọn, định tên được 04 chủng vi khuẩn acetic có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao, đạt trên 8%w/w. Bằng kỹ thuật đột biến sử dụng hóa chất NTG và tia UV đã cải biến được chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 có khả năng lên men acid acetic đạt trên 10%w/w. - Luận án là công trình nghiên cứu có hệ thống về công nghệ sản xuất dấm theo phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm của sản xuất rượu gạo từ khâu phân lập, tuyển chọn, định tên chủng, cải biến nâng cao hoạt tính lên men tạo acid acetic của chủng giống đến điều kiện lên men, thu nhận sản phẩm, phân tích thành phần hương thơm và chất lượng của sản phẩm dấm tạo thành. 5. Kết cấu của luận án Luận án gồm 140 trang, 4 chương, 38 bảng số liệu, 39 hình và đồ thị, 95 tài liệu tham khảo và 5 công trình có liên quan tới luận án đã được công bố. 4 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN Dấm ngày càng trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới với vai trò gia vị, phụ gia trong công nghiệp thực phẩm và có một số lợi ích đối với sức khỏe con người. Ngày nay, dấm trở nên đa dạng về chủng loại với nguồn nguyên liệu, kỹ thuật sản xuất khác nhau, điển hình như: dấm vang, dấm thơm, dấm táo, dấm pha trộn, dấm chưng cất, dấm gạo, dấm hành, dấm hồng vàng, Trong đó, dấm gạo là loại dấm phổ thông, có hương vị đặc trưng và phù hợp với khẩu vị của người tiêu dùng ở nhiều quốc gia, đặc biệt với văn hóa ẩm thực của người Châu Á. Quá trình lên men trong sản xuất dấm được thực hiện theo các phương pháp: lên men bề mặt, dòng chảy nhỏ giọt và lên men chìm. Trong đó, phương pháp lên men chìm là một giải pháp công nghệ tiên tiến với nhiều ưu điểm nổi trội, được áp dụng phổ biến trong sản xuất dấm ở nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là trong sản xuất dấm nồng độ acid acetic cao. Tuy nhiên, ở Việt Nam hiện nay, sản xuất dấm theo phương pháp lên men chìm còn nhiều hạn chế, mới đề cập đến trong một số nghiên cứu sơ bộ và sản xuất thử nghiệm qui mô nhỏ. Duy có nhà máy 100% vốn nước ngoài của hãng Ajinomoto sản xuất dấm gạo lên men theo phương pháp chìm, qui mô công nghiệp trên hệ thống dây chuyền thiết bị của Nhật. Bên cạnh nguồn nguyên liệu quả và hạt ngũ cốc, sản xuất dấm từ nguồn phụ phẩm không phải là vấn đề mới, được một số tác giả trên thế giới đề cập đến như: dấm hành đỏ ở Nhật, dấm dừa ở Thái Lan, dấm mật ong ở Tây Ban Nha,. Tuy nhiên, việc tận dụng phụ phẩm dịch bã rượu để lên men dấm chưa có nghiên cứu nào công bố. Đặc biệt, dấm lên men sử dụng dịch bã rượu không những tận dụng được các thành phần dinh dưỡng có giá trị mà còn có khả năng kế thừa và phát triển nguồn chất thơm tự nhiên của dịch bã rượu. 5 Các nghiên cứu về phân lập, tuyển chọn vi khuẩn acetic (AAB) trên thế giới nhằm lựa chọn các chủng có đặc tính công nghệ tốt như: khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao, chịu được nồng độ ethanol, chịu được acid acetic, chịu nhiệt và lên men ở nhiệt độ cao ứng dụng có hiệu quả trong sản xuất dấm. Ở Việt Nam, vấn đề này đã được một số tác giả nghiên cứu nhưng số lượng còn hạn chế. Việc đánh giá, tuyển chọn các chủng AAB đáp ứng được tiêu chí công nghệ của qui trình sản xuất dấm ít được quan tâm. Đặc biệt, việc tuyển chọn chủng AAB phù hợp với quá trình lên men dấm sử dụng phụ phẩm dịch bã rượu chưa có nghiên cứu trong và ngoài nước nào công bố. Bên cạnh việc phân lập, tuyển chọn AAB có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao và phù hợp với quá trình lên men dấm trong điều kiện khắc nghiệt, ứng dụng vi sinh vật đột biến theo phương pháp truyền thống trong chế biến thực phẩm là hướng nghiên cứu mới, đã đạt được những thành công nhất định. Với mục đích chọn lọc nhanh các dòng đột biến có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao và phù hợp lên men dấm trên môi trường sử dụng dịch bã rượu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu cải biến chủng AAB bằng kỹ thuật đột biến sử dụng hóa chất NTG, tia UV và kết hợp với tạo áp lực môi trường acid acetic. Trên cơ sở đó, xây dựng qui trình công nghệ lên men dấm từ nguồn nguyên liệu dịch bã rượu bởi chủng vi khuẩn acetic đột biến, thu được sản phẩm dấm an toàn và có nồng độ acid cao. Vì vậy, “Nghiên cứu công nghệ sản xuất dấm bằng phương pháp lên men chìm sử dụng phụ phẩm trong sản xuất rượu gạo” với mục tiêu phân lập, tuyển chọn, định tên, cải biến vi khuẩn acetic, lên men dấm nồng độ cao trên môi trường sử dụng phụ phẩm dịch bã rượu theo phương pháp chìm là nghiên cứu cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cao. 6 CHƯƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị + Nguồn mẫu phân lập vi khuẩn acetic: dịch dấm các loại, dấm bỗng, dịch thải nhà máy rượu, quả chín lên men,.... thu thập từ một số địa phương trong nước và từ Nhật Bản. + Dịch bã rượu và mẫu dấm đối chứng: dịch bã rượu thu nhận từ qui trình sản xuất rượu gạo lên men qui mô công nghiệp với công suất 1.500 kg/mẻ, tại Viện Công nghiệp Thực phẩm. Một số mẫu dấm nếp hoa vàng, dấm Tâm Đức loại chai thủy tinh, dấm gạo lên men Ajinomoto loại chai PET trên thị trường được sử dụng để so sánh. + Hóa chất: các hóa chất môi trường, hóa chất phân tích và hóa chất sinh học phân tử đạt tiêu chuẩn sử dụng, có nguồn gốc từ Việt Nam, Trung Quốc, Pháp, Mỹ. + Thiết bị: các thiết bị thí nghiệm thông thường, máy quang phổ UV- VIS T80, máy cất đạm Vapodest 10s-Gerhardt, hệ thống HPLC AGILENT 1200 series, hệ thống GC-MS Shimadzu, GC-6890 Plus- hãng Agilent, máy đọc trình tự gen, hệ thống thiết bị lên men Minifor 1 lít của hãng Lambda- Thụy Sỹ. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh và sinh học phân tử - Phân lập AAB trên môi trường GYC: glucose 1%, cao nấm men 1%, ethanol 3%, CaCO3 2% và agar 1,5% theo phương pháp pha loãng thông thường. - Sàng lọc AAB trên môi trường YEC (hoặc YEB): cao nấm men 1%, ethanol 4%, CaCO3 2% (hoặc Bromecresol green 0,002%) và agar 1,5% theo kiểu cấy chấm điểm và đục lỗ. - Tuyển chọn AAB có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao trên môi trường cơ bản YGEA (1% cao nấm men, 1% glucose, 6% 7 ethanol và 0,6% acid acetic) và trên môi trường lên men sử dụng 20% dịch bã rượu, bổ sung cao nấm men 1%, saccarose 1%, bổ sung ethanol đạt 6%Vol. và acid acetic đạt 0,6%. - Định tên AAB dựa vào trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA - Phương pháp tạo đột biến AAB bằng hóa chất NTG và NTG kết hợp với tia UV - Phương pháp xác định một số đặc tính cơ bản của AAB 2.2.2. Phương pháp công nghệ - Nghiên cứu lên men dấm trên qui mô bình tam giác 1000ml (200ml dịch), lắc 150 vòng/phút. - Nghiên cứu và thử nghiệm lên men dấm trên hệ thống thiết bị lên men Minifor 1 lít của hãng Lambda- Thụy Sỹ. 2.2.3. Phương pháp hóa lí - Xác định nồng độ ethanol bằng thiết bị Dujiadin-Salleron. - Xác định độ nhớt của dịch bằng nhớt kế Ostwald. - Định lượng một số đường tự do trong dịch bã rượu và acid hữu cơ trong dấm bằng phương pháp HPLC-RID và HPLC-PDA tương ứng. - Xác định các hợp chất bay hơi trong dịch bã rượu và dấm bằng phương pháp GC-MS. - Xác định hàm lượng methanol theo AOAC 972.11 trên hệ thống GC-FID (detector ion hóa ngọn lửa). 2.2.4. Phương pháp hóa học - Xác định hàm lượng acid tổng số bằng chuẩn độ acid-bazơ - Xác định tinh bột theo phương pháp thủy phân bằng acid - Xác định hàm lượng nitơ tổng số theo AOAC 2001.11 - Xác định hàm lượng aldehyde theo TCVN 1051-71 2.2.5. Phương pháp phân tích cảm quan Theo phép thử cho điểm thị hiếu với thang đo 9 điểm. 8 2.2.6. Phương pháp toán học - Qui hoạch thực nghiệm bậc hai và tối ưu hóa hàm mong đợi trên phần mềm Design Expert phiên bản 8.0.6. - Xử lí số liệu theo phương pháp phân tích phương sai ANOVA sử dụng phần mềm Statical Analysis Systems (SAS) 9.1. CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu thành phần dịch bã thải từ qui trình sản xuất rượu gạo 3.1.1. Phân tích một số thành phần cơ bản của dịch bã rượu Đã xác định được một số thành phần dinh dưỡng có giá trị như: tinh bột 1,78±0,14%; protein thô 3,52±0,43%; ethanol 0,26±0,08%; đường có khả năng lên men 3,27±0,62 g/l bao gồm: saccarose 1,36 ± 0,74 g/l; glucose 1,09 ± 0,14 g/l; maltose 0,58 ± 0,15 g/l; maltotriose 0,25± 0,12 g/l;. Bên cạnh đó, một số chỉ tiêu liên quan đến vấn đề vệ sinh và an toàn thực phẩm của dịch bã rượu cũng được xác định: hàm lượng aldehyde 30,8± 2,7 mg/l; thành phần methanol không tìm thấy; tổng số vi sinh vật hiếu khí 7,4×104 CFU/ml, tổng số nấm men- nấm mốc 1,6×104 CFU/ml. 3.1.2. Phân tích thành phần hợp chất bay hơi của dịch bã Kết quả phân tích GC-MS cho thấy, thành phần hợp chất bay hơi của dịch bã rượu bao gồm: acid acetic, ethyl acetate, benzeneethanol, ethyl lactate, 2-3-Butanediol, 1-ethoxy-Propane, 2-methyl-Propanoic acid, ethyl succinate, caffeine, propanoic acid, .; chúng có vai trò quan trọng trong tạo hương thơm của dịch bã rượu. Lên men dấm sử dụng phụ phẩm từ qui trình sản xuất rượu gạo không những tận dụng được các thành phần dinh dưỡng có giá trị mà còn có khả năng kế thừa và phát triển nguồn chất thơm tự nhiên từ quá trình lên men rượu gạo. 9 3.2. Phân lập và tuyển chọn AAB cho lên men dấm từ môi trường sử dụng dịch bã rượu 3.2.1. Phân lập các chủng AAB Đã phân lập được 65 chủng AAB trên 68 mẫu thu thập từ các địa phương khác nhau của Việt Nam và Nhật Bản. 3.2.2. Sàng lọc các chủng AAB Từ 65 chủng phân lập, đã sàng lọc được 12 chủng AAB, ký hiệu: M1, A2, A4, M3, M5, M8, M11, M12, M18, M27, M29, M32 có khả năng sinh tổng hợp acid cao trên môi trường YEB và YEC. 3.2.3. Tuyển chọn AAB sinh tổng hợp acid acetic cao Từ 12 chủng AAB sàng lọc, đã tuyển chọn được 04 chủng AAB có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao trên môi trường YGEA theo kiểu lên men lắc, bổ sung dần ethanol đến 9%Vol.; cụ thể như sau: chủng A2 đạt 8,34±0,05 %w/w acid acetic; chủng A4 đạt 8,12±0,06 % w/w acid acetic; chủng M3 đạt 8,00±0,07 %w/w acid acetic; chủng M5 đạt 8,38±0,03 % w/w acid acetic. 3.2.4. Định tên chủng AAB có khả năng sinh tổng hợp acid cao Đã định tên đến cấp độ loài 04 chủng AAB có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao: K. saccharivorans A2, K. saccharivorans A4, K. europaeus M3 và A. pomorum M5. 3.2.5. Một số đặc điểm của các chủng AAB đã tuyển chọn - Đã xác định một số đặc điểm hình thái tế bào và khuẩn lạc, đặc tính sinh lí, sinh hóa của 04 chủng đã tuyển chọn: K. saccharivorans A2, K. saccharivorans A4, K. europaeus M3 và A. pomorum M5 - Đã đánh giá khả năng chịu nồng độ ethanol và acid acetic của 04 chủng AAB: chủng K. saccharivorans A2 có dấu hiệu phát triển yếu trên môi trường chứa 12% (Vol.) ethanol và môi trường chứa 10% (w/w) acid acetic; K. europaeus M3 có khả năng chịu ethanol đến 12% (Vol.) nhưng không chịu được acid đến 8% (w/w); chủng K. 10 saccharivorans A4 và A. pomorum M5 chỉ chịu được nồng độ ethanol đến 10%(Vol.), nồng độ acid acetic đến 8%(w/w). - Kết quả đánh giá khả năng chịu nhiệt và sinh tổng hợp acid acetic ở các nhiệt độ khác nhau cho thấy: 04 chủng AAB đều phát triển tốt và sinh tổng hợp acid acetic cao nhất ở 30°C; ở nhiệt độ trên 35°C, khả năng lên men acid acetic của chủng K. saccharivorans A4 thấp hơn 03 chùng còn lại; ở nhiệt độ 40°C-45°C, các chủng phát triến yếu hoặc không phát triển được. 3.2.6. Lựa chọn chủng vi khuẩn acetic phù hợp với quá trình lên men dấm gạo trên môi trường sử dụng dịch bã rượu - Từ 04 chủng AAB, đã tuyển chọn được chủng K. saccharivorans A2 có khả năng sinh acid acetic cao và phù hợp với quá trình lên men dấm trên môi trường sử dụng dịch bã rượu: đạt 5,64±0,25% (w/w) acid acetic và hiệu suất lên men 84, 42±3,77% ở 30°C. - Đã xác định được điều kiện thích hợp nhất cho quá trình lên men dấm sử dụng dịch bã rượu bởi chủng K. saccharivorans A2: nồng độ ethanol ban đầu đạt 6 % (Vol.), nồng độ acid đầu đạt 6 g/l (theo acid acetic), nồng độ cao nấm men bổ sung 0,75g/l, nhiệt độ 30oC, thời gian lên men 7 ngày, lắc 150v/ph trong bình tam giác 1000ml, dấm có hàm lượng acid acetic 5,90±0,12 %(w/w). - Đã cải thiện qui trình lên men dấm từ tận dụng dịch bã rượu trên thiết bị Minifor của Lambda theo phương pháp bổ sung dần ethanol đến 9% Vol. bởi chủng K. saccharivorans A2; với điều kiện ban đầu đã lựa chọn, quá trình lên men dấm đạt nồng độ acid acetic trung bình 8,11±0,23% (w/w) với hiệu suất lên men 82,19±2,28% và thời gian lên men 5 ngày (hình 3.11). - Thành phần một số hợp chất bay hơi chính liên quan đến chất lượng hương thơm của dấm gạo lên men sử dụng dịch bã rượu bởi chủng K. saccharivorans A2 đã được xác định, bao gồm: 11 phenylethyl alcohol, hexadecanoic acid ethyl ester, butanoic acid ethyl ester, phenylethyl acetate,.. Hình 3.11. Sự biến đổi nồng độ ethanol và acid acetic trong quá trình lên men dấm 3.3. Cải biến AAB bằng kỹ thuật đột biến ngẫu nhiên 3.3.1.Khảo sát ảnh hưởng của NTG, UV đến tỉ lệ tế bào chết Kết quả khảo sát đã xác định được các mốc thời gian cho xử lí tạo đột biến bởi NTG là 40, 60, 80, 100, 120, 140 phút; xử lí tạo đột biến kết hợp NTG và UV là 60, 80, 100, 120 phút với tỉ lệ tế bào chết cao. 3.3.2. Đánh giá khả năng sinh acid của các dòng đột biến - Sau quá trình xử lí đột biến bằng hóa chất NTG, đã sàng lọc và lựa chọn được dòng đột biến K. saccharivorans A2 N140.7 có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao hơn chủng gốc K. saccharivorans A2 17% trên môi trường YGEA. - Kết quả xử lí đột biến tích lũy bởi NTG và tia UV đối với chủng K. saccharivorans A2 N140.7 đã sàng lọc được dòng đột biến K. saccharivorans A2 NV120.3 có khả năng lên men acid acetic cao trên môi trường YGEA, tăng 16 % so với K. saccharivorans A2 N140.7 và tăng 26% so với chủng K. saccharivorans A2. 3.3.3. Một số đặc tính của chủng đột biến 6,00 4,25 2,80 3,30 1,80 2,30 1,00 1,50 0,60 1,10 0,40 0,90 0,30 0,80 0,25 0,000,60 2,10 3,48 4,92 5,97 6,78 7,26 7,77 8,10 8,28 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 N ồ n g đ ộ a c id ( % a . a c e ti c ) N ồ n g đ ộ e th a n o l ( % V o l. ) Thời gian (h)Nồng độ cồn (% v/v) Nồng độ acid (% acid acetic) 12 - Chủng đột biến K. saccharivorans A2 NV120.3 có khả năng phát triển mạnh hơn so với K. saccharivorans A2 trên môi trường 7-11 % Vol. ethanol và trên môi trường 6-10% w/w acid acetic. - Khả năng chuyển hóa trong lên men dấm của chủng đột biến K. saccharivorans A2 NV120.3 mạnh hơn so với chủng tự nhiên K. saccharivorans A2: chủng đột biến có khả năng tạo acid acetic đạt 5,73 % (w/w) và ethanol sót 0,4 % (Vol.) với hiệu suất 88,93 %; trong khi đó, chủng tự nhiên lên men đạt 4,32 % (w/w) acid acetic và ethanol sót 1,5 % Vol. với hiệu suất 80,25 % trong 72 giờ lên men đầu tiên. Đồng thời, xác định thời điểm bắt đầu bổ sung ethanol trong quá trình lên men là 24 giờ, liều lượng dự kiến 0,5%/8 giờ/lần. 3.3.4. Xác định động học quá trình lên men dấm trên môi trường bổ dung dịch bã rượu Đã xác định động học của quá trình lên men dấm bởi chủng đột biến trên thiết bị Minifor 1 lit theo phương án bổ sung dần ethanol bắt đầu tại thời điểm 24 giờ với liều lượng 0,5%Vol./8 giờ/lần đến 80 giờ (tổng hàm lượng ethanol bổ sung đến 10% Vol.) và thực hiện quá trình lên men cho đến khi nồng độ ethanol sót không lớn hơn 0,5%. Đồng thời, đã xác định được thời gian lên men dấm là 120 giờ, với nồng độ acid acetic đạt 10,20% (w/w) và hiệu suất đạt 93,56%. Hình 3.2. Động học quá trình lên men dấm sử dụng dịch bã rượu 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 0 8 16 24 32 40 48 56 64 72 80 88 96 104 112 120 Ethanol (% v/v) OD Acetic acid (%) pH Thời gian lên men (giờ) N ồ n g đ ộ e th a n o l ( % V o l. ) T ố c đ ộ p h á t tr iể n V S V ( O D ) p H N ồ n g đ ộ a c id ( % a .a c id ) 13 3.3.5. Thử nghiệm lên men dấm trên môi trường bổ sung dịch bã rượu theo phương pháp lên men chìm Kết quả thử nghiệm lên men dấm (5 mẻ) theo phương pháp chìm bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 trên môi trường sử dụng dịch bã rượu, trong thiết bị Minifor 1 lít như sau: quá trình lên men ổn định, dịch dấm có nồng độ acid acetic cao trung bình đạt 10,19 ± 0,16% (w/w) và hiệu suất lên men 93,45 ± 1,42%. 3.3.6. Đánh giá thành phần các acid hữu cơ của dấm gạo lên men từ dịch bã rượu Thành phần các acid hữu cơ sinh tổng hợp trong quá trình lên men dấm gạo trên môi trường sử dụng dịch bã rượu bởi chủng đột biến K. saccharivorans A2 NV120.3 chủ yếu là acid acetic, chiếm 99,99% tổng số các acid hữu cơ và một lượng rất nhỏ acid oxalic; kết quả thành phần các acid có sự tương đồng với dấm gạo Ajinomoto. 3.4. Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất dấm lên men từ môi trường tận dụng dịch bã rượu bởi chủng AAB đột biến. 3.4.1. Nghiên cứu tỉ lệ bổ sung dịch bã rượu thích hợp Lựa chọn được phương án sử dụng 20% dịch bã rượu cho lên men, dấm sản phẩm có hàm lượng acid acetic cao nhất đạt 9,28 ± 0,09% (w/w) với hiệu suất 85,13 ±0,84%; đồng thời, hương thơm của dấm có mức độ ưa thích cao nhất và quá trình sản xuất thuận lợi. 3.4.2. Nghiên cứu điều kiện thanh trùng dịch lên men Chế độ thanh trùng dịch trước lên men: 100°C/30ph, có khả năng tiêu diệt các vi sinh vật tạp nhiễm đạt mức qui định ≤ 10 CFU/ml và kết quả quá trình lên men dấm đạt 9,28±0,18 % (w/w) acid acetic. 3.4.3. Nghiên cứu điều kiện nhân giống sinh khối thích hợp Điều kiện kỹ thuật nhân giống sinh khối thích hợp đối với chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 là: môi trường YEG, tỉ lệ tiếp giống 8%, thời gian chuyển giống 22-24 giờ, nhiệt độ nuôi 300C. 14 3.4.4. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số thành phần môi trường đến quá trình lên men 3.4.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường bổ sung Kết quả khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường saccaroza bổ sung trong khoảng 4g/l - 20g/l đến quá trình lên men dấm bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 thể hiện ở bảng 3.17. Bảng 3.17. Ảnh hưởng nồng độ đường bổ sung đến quá trình lên men dấm Nồng độ đường bổ sung (g/l) Nồng độ acid (% acid acetic) Hiệu suất lên men (%) 4 8,32 ± 0,24D 76,32 ± 2,22D 8 8,92 ± 0,09C 81,82 ± 0,84C 12 9,66 ± 0,16A 88,61 ± 1,46A 16 9,44 ± 0,17AB 86,59 ± 1,59AB 20 9,18 ± 0,12BC 84,21 ± 1,11BC Nồng độ đường bổ sung vào môi trường 12-16 g/l thì quá trình lên men dấm đạt hàm lượng acid acetic cao 9,44 - 9,66%(w/w) và hiệu suất lên men đạt 86,59 - 88,61%. Vì vậy, lựa chọn hàm lượng đường saccaroza bổ sung vào dịch lên men 12 g/l. 3.4.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu Hình 3.24. Ảnh hưởng nồng độ acid ban đầu đến quá trình lên men dấm Ảnh hưởng của nồng độ acid acetic ban đầu trong khoảng 0,4- 1,4% đến quá trình lên men dấm bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 thể hiện trên hình 3.24 cho thấy: một lượng acid acetic ban 81.19±1.71 B 84.02±1.68 B 88.74±1.35 A 82.08±1.09 B 74.80±1.36 C 8.68±0.18 D 9.16±0.18 BC 9.94±0.15 A 9.44±0.12 B 8.76±0.16 CD 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 10,50 0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 0,4 0,6 0,9 1,2 1,4 Hiệu suất lên men (%) Nồng độ acid acetic cuối (% ) N ồ n g đ ộ a c id a c e tic c u ố i(% ) H iệ u s u ấ t lê n m e n ( % ) Nồng độ acid acetic đầu (%) 15 đầu tạo điều kiện kích thích hoạt động của AAB, với nồng độ acid acetic trong khoảng 0,6-1,2% quá trình lên men dấm đạt hàm lượng acid acetic và hiệu suất lên men cao. Vì vậy, lựa chọn khoảng acid acetic ban đầu 0,6-1,2 % cho khảo sát tối ưu. 3.4.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của cao nấm men bổ sung Cao nấm men là nguồn dinh dưỡng hữu cơ hiệu quả nhất đối với quá trình lên men dấm của AAB. Nồng độ cao nấm men bổ sung khoảng 0,4 – 1,6 g/l có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình sinh tổng hợp acid acetic và hiệu suất lên men dấm (hình 3.25). Hình 3.25. Ảnh hưởng của cao nấm men đến quá trình lên men dấm Trong đó, hàm lượng cao nấm men bổ sung 1,00 g/l thì quá trình lên men dấm đạt hiệu quả cao với nồng độ acid acetic đạt 9,60± 0,12 % (w/w) và hiệu suất lên men đạt 88,06 ± 1,10 %. Tuy nhiên, để tiết kiệm tối đa chi phí sử dụng cao nấm men trong sản xuất mà vẫn đạt hiệu quả lên men cao, lựa chọn khoảng nồng độ cao nấm men 0,75- 1,25 g/l để nghiên cứu tối ưu. 3.4.4.4. Khảo sát ảnh hưởng của glycerol Ảnh hưởng của hàm lượng glycerol 0-1g/l đến quá trình lên men bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3. thể hiện trong bảng 3.18 cho thấy: nồng độ glycerol 0,5-1 g/l thì hiệu quả của quá trình lên men đạt cao nhất với hàm lượng acid acetic trong khoảng 9,00- 80.91±0.95 B 82.92±1.68 B 88.06±1.10 A 83.84±1.39 B 82.74±0.84 B 8.82±0.10 B 9.04±0.18 B 9.60±0.12 A 9.14±0.15 B 9.02±0.09 B 8,20 8,40 8,60 8,80 9,00 9,20 9,40 9,60 9,80 74,00 76,00 78,00 80,00 82,00 84,00 86,00 88,00 90,00 0,40 0,75 1,00 1,25 1,60 Hiệu suất lên men (%) Nồng độ acid acetic cuối (% ) N ồ n g đ ộ a c id a c e tic c u ố i (% ) H iệ u s u ấ t lê n m e n ( % ) Nồng độ cao nấm men (g/l) 16 9,18%w/w, hiệu suất lên men đạt 82,56 - 84,21%. Vì vậy, lựa chọn nồng độ glycerol bổ sung 0,5g/l cho quá trình lên men dấm. Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol đến quá trình lên men dấm Nồng độ glycerol bổ sung (g/l) Nồng độ acid (% w/w acid acetic) Hiệu suất lên men (%) 0 8,00 ± 0,21C 73,38 ± 1,93C 0,3 8,50 ± 0,23B 77,97 ± 2,08B 0,5 9,00 ± 0,12A 82,56 ± 1,10A 0,7 9,18 ± 0,26A 84,21 ± 2,40A 1,0 9,16 ± 0,03A 84,02 ± 0,32A 3.4.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của các thành phần khoáng chất MgSO4.5H2O, KH2PO4, (NH4)H2PO4 được lựa chọn là nguồn bổ sung khoáng chất cho quá trình lên men dấm bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3. Kết quả khảo sát đã lựa chọn được hàm lượng chất khoáng bổ sung vào môi trường lên men như sau: MgSO4 .5H2O 0,50 g/l; KH2PO4 1,50 g/l và (NH4)H2PO4 1,00 g/l. 3.4.5. Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho lên men dấm gạo 3.4.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol ban đầu Quá trình lên men dấm với nồng độ ethannol ban đầu (Vol.): 6%, 7%, 8%, 9% và bổ sung dần đến 10% với liều lượng 0,5% /lần ở một số thời điểm từ 24 h đến 80 h. Kết quả thể hiện trong bảng 3.22 Bảng 3.22. Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đầu đến quá trình lên men dấm Nồng độ ethanol ban đầu (% Vol.) Nồng độ acid acetic (%w/w) Hiệu suất lên men (%) 6 9,03 ± 0,44A 82,80 ± 4,04A 7 9,33 ± 0,44A 85,55 ± 4,04A 8 7,48 ± 0,27B 68,61 ± 2,48B 9 5,31 ± 0,20C 48,74 ± 1,85C Nồng độ ethanol ban đầu 6% -7%, quá trình lên men dấm có nồng độ acid acetic lớn nhất 9,03-9,33% và hiệu suât lên men đạt 82,80- 85,55%. Tuy nhiên, bổ sung dần thêm ethanol trong quá trình lên men tạo ra sự phức tạp và tăng chi phí sản xuất. Vì vậy, lựa chọn 17 nồng độ ethanol bổ sung ban đầu trong dịch trước lên men đạt 7%Vol.. 3.4.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của của nhiệt độ lên men Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên men trong khoảng từ 25-35°C đến quá trình lên men dấm bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 thể hiện trên hình 3.26: Hình 3.26. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình lên men dấm Nhiệt độ lên men tăng từ 27°C đến 30°C thì khả năng sinh tổng hợp acid acetic và hiệu suất lên men tăng dần, nhiệt độ tiếp tục tăng từ 30°C đến 33°C thì hàm lượng acid acetic và hiệu suất lên men giảm dần. Để xác định được nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình lên men lựa chọn khoảng nhiệt độ 27-33°C cho nghiên cứu tối ưu 3.4.5.3. Khảo sát ảnh hưởng của của nồng độ oxy hòa tan Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng oxy hòa tan đến quá trình lên men dấm bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 trong thiết bị Minifor 1 lít thể hiện trong hình 3.27. Với nồng độ oxy hòa tan 3 mg/l - 6 mg/l thì hàm lượng acid và hiệu suất lên men dấm tăng dần, nồng độ oxy 6mg/l- 7mg/l thì hiệu quả giảm đáng kể. Điều này cho thấy nồng độ oxy hòa tan ảnh hưởng đến sự phát triển của AAB và quá trình lên men dấm. Để lựa chọn được nồng độ oxy hòa 80.54±1.63 B 82.56±3.63 B 87.33±2.82 A 82.01±2.12 B 80.17±1.00 B 8.78±0.14 B 9.00±0.21 B 9.52±0.18 A 8.94±0.16 B 8.74±0.03 B 8,00 8,50 9,00 9,50 10,00 70,00 75,00 80,00 85,00 90,00 95,00 25 27 30 33 35 Hiệu suất lên men (%) Nồng độ acid acetic (% ) Nhiệt độ lên men (°C) N ồ n g đ ộ a c id a c e tic (% ) H iệ u s u ấ t lê n m e n ( % ) 18 tan thích hợp nhất cho quá trình lên men dấm trên thiết bị lên men chìm Minifor 1 lít, chúng tôi lựa chọn khoảng giá trị nồng độ oxy hòa tan 3-7mg/l cho nghiên cứu tối ưu. Hình 3.27. Ảnh hưởng của nồng độ oxy hòa tan đến quá trình lên men dấm 3.4.6. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình lên men dấm gạo 3.4.6.1. Thiết lập mô hình và kiểm định ý nghĩa thống kê Qui hoạch thực nghiệm được thiết lập theo kiểu kế hoạch hóa bậc hai tâm xoay (CCOD) với 4 yếu tố đầu vào: nồng độ oxy hòa tan A, nhiệt độ lên men B, nồng độ cao nấm men bổ sung C và nồng độ acid acetic ban đầu D; mỗi yếu tố tiến hành tại 5 mức. Hàm lượng acid acetic trong dấm Y1 (%w/w) và hiệu suất lên men Y2 (%) được biểu diễn bằng mô hình bậc 2 như sau: Y1 = 10,66 - 0,40A + 0,21B + 0,022C + 0,12D - 0,041AB + 0,019AC - 0,034AD + 0,019BC - 0,079BD + 0,026CD - 0,97A2 - 0,74B2 - 0,43C2 - 0,23D2 ; (3.1) Y2 = 95,16 - 3,55A + 1,85B - 1,84C + 1,05D - 0,37AB + 0,26AC - 0,30AD + 0,12BC - 0,70BD + 0,21CD - 8,64A2 - 6,57B2 - 3,77C2 - 2,08D2 ; (3.2) Xét ảnh hưởng của từng yếu tố (các yếu tố khác giữ ở mức trung bình) đến quá trình lên men cho thấy: nồng độ oxy hòa tan (A) và nhiệt độ lên men (B) ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng acid acetic trong dấm Y1 và hiệu suất lên men Y2; ngược lại, nồng độ acid đầu (D) là yếu tố ảnh hưởng ít nhất đến quá trình lên men (hình 3.28). 68.61±1.16D 78.70±1.10B 83.47±1.14A 80.91±0.55AB 74.48±1.38C 68.80±0.55D 7.48±0.18D 8.58±0.18B 9.10±0.12A 8.82±0.06AB 8.12±0.15C 7.50±0.06D 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 2,00 3,00 5,00 6,00 7,00 8,00 Hiệu suất lên men (%) Nồng độ acid acetic (% ) Nồng độ oxy hòa tan (mg/l) N ồ n g đ ộ a c id a c e tic (% ) H iệ u s u ấ t lê n m e n ( % ) 19 Hình 3.28. Ảnh hưởng của các yếu tố A, B, C, D đến hàm Y1 và Y2 3.4.6.2. Tối ưu hóa và kiểm chứng mô hình Giải bài toán tối ưu bằng phương pháp chập mục tiêu theo thuật toán hàm mong đợi trên phần mềm Design Expert 8.0.6. Kết quả như sau: với nồng độ oxy hòa tan 4,6mg/l; nhiệt độ lên men 31°C; nồng độ cao nấm men bổ sung 1g/l; nồng độ acid ban đầu 0,9% (w/w) thì hàm lượng acid acetic và hiệu suất lên men lớn nhất theo dự đoán lần lượt là 10,70% (w/w) và 95,44%. Thực nghiệm ở điều kiện tối ưu đã xác định để kiểm chứng lại mô hình; kết quả, hàm lượng acid acetic lớn nhất trong dịch dấm đạt 10,66 ± 0,07% (w/w) và hiệu suất lên men đạt 95,16 ± 0,67%. Như vậy, không có sự khác biệt giữa thực nghiệm và dự đoán trên phần mềm; mô hình hoàn toàn phù hợp với thực tế sản xuất. 3.4.7. Nghiên cứu điều kiện thanh trùng dịch dấm Lựa chọn được chế độ thanh trùng dấm gạo nồng độ cao: 85°C/12 phút; vừa tiêu diệt vi sinh vật đạt yêu cầu, vừa giữ được màu sắc và hương vị đặc trưng của dấm trong quá trình bảo quản. 3.4.8. Hoàn thiện qui trình sản xuất dấm Đã xây dựng qui trình sản xuất dấm gạo lên men trên môi trường bổ sung dịch bã rượu theo phương pháp chìm trong thiết bị Minifor 1 lit bởi chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 (hình 3.34). Quá trình lên men dấm kéo dài 5 ngày, đạt nồng độ acid acetic 10,66 ± 0,07% (w/w) và hiệu suất lên men 95,16 ± 0,67%. Perturbation Deviation from Reference Point (Coded Units) -1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 6 7 8 9 10 11 A A B B C C D D Perturbation Deviation from Reference Point (Coded Units) -1.000 -0.500 0.000 0.500 1.000 70 75 80 85 90 95 100 A A B B C C D D Y 2 Y 1 20 Hình 3.34. Sơ đồ qui trình sản xuất dấm gạo lên men từ dịch bã rượu Dịch bã Phối chế với nước Nước/ Dịch bã = 4/1 Đường 12g/l Cao nấm men: 1g/l Glycerol 0,5 g/l Muối khoáng Thanh trùng MT 100°C/20ph Bổ sung ethanol đến 7%, acid acetic 0,9%; giống VK acetic 10% 10% Acid acetic 99,6% Lên men: 31°C; 4,6mg/l O2, 120giờ Thanh trùng dấm: 85°C/12 phút Lọc dấm Tàng trữ Làm nguội nhanh đến 31°C ethanol 99,9% Lọc tinh Pha chế môi trường Dấm thành phẩm Chủng NV120.3 Nhân giống cấp 1: 8 ml/YEG Nhân giống cấp 2: 100 ml/YEG Bổ sung ethanol trong khoảng từ 40 đến 80 giờ LM; 0,5%Vol./lần/8 giờ 21 3.5. Đánh giá chất lượng dấm gạo lên men nồng độ cao 3.5.1. Phân tích một số thành phần hóa học cơ bản Một số thành phần cơ bản của dấm gạo lên men trên môi trường sử dụng dịch bã rượu được phân tích và đánh giá cùng với dấm gạo Tâm Đức, Ajinomoto thể hiện trong bảng 3.32 Bảng 3.32. Thành phần cơ bản của một số sản phẩm dấm Thành phần Dấm thí nghiệm Dấm Tâm Đức Dấm Ajinomoto Acid tổng số (%w/w acid acetic) 10,66 ± 0,07 3,74 ± 0,03 4,98 ± 0,05 Acid vô cơ (Định tính) Âm tính Âm tính Âm tính Ethanol (%Vol.) 0,1 ± 0,08 0 0 Aldehyde (mg/l) 7,04 ± 0,04 6,37 ± 0,07 8,65 ± 0,08 Methanol (mg/l) KPH KPH KPH Kết quả cho thấy, dấm thí nghiệm có hàm lượng acid acetic cao đạt 10,66 ± 0,07% w/w; acid vô cơ và methanol không phát hiện thấy trong tất cả các mẫu dấm; hàm lượng aldehyde trong khoảng 6,37- 8,65 mg/l, thấp hơn nhiều so với chỉ tiêu aldehyde của rượu mùi và rượu trắng [TCVN7043-7044. 2009]. Như vậy, sản phẩm dấm thí nghiệm của chúng tôi được đánh giá an toàn. 3.5.2. Phân tích chất lượng hương thơm của dấm Kết quả phân tích GC-MS mẫu dấm gạo lên men trên môi trường sử dụng dịch bã rượu D1, D2 và mẫu dấm Ajinomoto DAji cho thấy, một số lượng lớn các hợp chất dễ bay hơi trong các mẫu dấm, bao gồm: acid, ester, aldehyde, cetone, ketone, ether và một số hợp chất tạp chức khác. Trong đó, acetic acid, ethyl acetate và isobutyric acid là những thành phần chiếm tỉ lệ lớn nhất trong cả 3 mẫu dấm gạo: với tổng số 97,78% trong mẫu D1; 95,11% trong mẫu D2 và 98,61% trong mẫu DAji. Trong đó, mẫu dấm đối chứng lên men trên môi trường không bã D0 có thành phần chủ yếu là acid acetic với tỉ lệ 79,28%; các hợp chất thơm khác hầu như không thấy xuất hiện. 22 Căn cứ vào kết quả phân tích các hợp chất dễ bay hơi của dịch bã rượu B1, B2 và của mẫu dấm gạo lên men D1, D2 tương ứng cho thấy, một số chất thơm như: acetic acid, ethyl acetate, isobutyric acid, phenylethyl alcohol đã được kế thừa từ nguồn chất thơm của dịch bã rượu và được phát triển trong quá trình lên men. Ngoài ra, xuất hiện một số hợp chất dễ bay hơi khác như: propanoic acid, acetic oxide, 2.4.5-Trimethyl-1.3-dioxolane, acetaldehyde diethyl acetal. Trong đó, một số cấu tử chất thơm này cũng xuất hiện trong một số loại dấm thơm của Ý, dấm vang đỏ của Pháp và Tây Ban Nha 3.5.3. Đánh giá chất lượng cảm quan của dấm Chất lượng cảm quan: màu sắc, hương thơm, vị chua, mùi vị khó chịu, mức độ ưa thích chung của dấm gạo thí nghiệm được đánh giá cùng với mẫu dấm gạo Ajinomoto, dấm gạo Tâm Đức theo phép thử cho điểm thị hiếu (bảng 3.35). Bảng 3.35. Điểm đánh giá mức độ ưa thích về một số chỉ tiêu chất lượng cảm quan của các mẫu dấm Chỉ tiêu cảm quan Các mẫu dấm F0,01 LSD0,01 Ajinomoto Thí nghiệm Tâm Đức Màu sắc 6,27 ±0,78b 6,93 ±0,91a 6,30 ±0,75b 6,3 0,56 Hương thơm 7,57±0,63a 7,53±0,57a 6,60±0,62b 24,5 0,41 Vị chua 7,17 ±0,99a 7,33 ±0,84a 7,03 ±0,96a 0,7 0,63 Mùi vị khó chịu 5,43 ±0,94a 5,30 ±0,92a 5,37 ±0,76a 0,1 0,60 Mức độ ưa thích chung 7,73 ±0,69a 7,77 ±0,73a 6,87 ±0,78b 17 0,50 Kết quả cho thấy, chất lượng cảm quan của dấm gạo lên men từ môi trường bổ sung 20% dịch bã rượu bởi chủng đột biến K. saccharivorans A2 NV120.3 được đánh giá có mức độ ưa thích tương đương với dấm gạo Ajinomoto của Nhật và có mức độ ưa thích cao hơn dấm gạo Tâm Đức. 23 CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án đã đạt được một số kết quả sau: 1. Đã tuyển chọn và định tên được 04 chủng vi khuẩn acetic có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao, đạt trên 8,0%w/w: K. saccharivorans A2, K. saccharivorans A4, K. europaeus M3, A. pomorum M5. Trong đó, lựa chọn được chủng K. saccharivorans A2 phù hợp với lên men dấm trên môi trường sử dụng dịch bã rượu đạt 8,11±0,23 % (w/w) acid acetic và hiệu suất lên men 82,19±2,28 % với tổng nồng độ ethanol bổ sung 9% Vol. 2. Đã cải biến chủng bằng kỹ thuật đột biến ngẫu nhiên và sàng lọc được chủng đột biến K. saccharivorans A2 NV120.3 có khả năng sinh tổng hợp acid acetic cao hơn 26% so với chủng tự nhiên K. saccharivorans A2 khi lên men dấm sử dụng dịch bã rượu. 3. Đã đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố đến quá trình lên men và xác định được điều kiện tối ưu của quá trình lên men dấm nồng độ cao trên môi trường sử dụng 20% dịch bã rượu theo phương pháp chìm như sau: nồng độ oxy hòa tan 4,6 mg/l; nhiệt độ lên men 31°C; nồng độ cao nấm men bổ sung 1,0 g/l; hàm lượng acid acetic ban đầu 0,9%. Khi đó, quá trình lên men dấm đạt 10,69% (w/w) acid acetic và hiệu suất đạt 95,36% với tổng nồng độ ethanol là 10% Vol. 4. Đã xây dựng được qui trình công nghệ lên men dấm nồng độ cao từ môi trường sử dụng dịch bã rượu theo phương pháp lên men chìm trên hệ thống lên men Minifor 1 lít của hãng Lambda- Thụy Sỹ. 5. Đã xác định được một số thành phần hợp chất tạo hương thơm của dấm gạo lên men trên môi trường bổ sung 20% dịch bã rượu: acetic acid, ethyl acetate, isobutyric acid, phenylethyl alcohol, propanoic acid,. Đánh giá được một số chỉ tiêu chất lượng và mức độ ưa thích về chất lượng cảm quan của dấm gạo thí nghiệm, dấm gạo Ajinomoto và dấm gạo Tâm Đức. 24 KIẾN NGHỊ 1. Cần có thêm các nghiên cứu thử nghiệm chủng đột biến K. saccharivorans A2 NV120.3 trong lên men dấm từ môi trường tận dụng dịch bã rượu ở qui mô lớn hơn nhằm ứng dụng hiệu quả trong sản xuất dấm qui mô công nghiệp theo phương pháp lên men chìm. 2. Chủng K. saccharivorans A2 NV120.3 sàng lọc được từ quá trình xử lí tạo đột biến ngẫu nhiên bởi NTG và tia UV, chưa nghiên cứu chuyên sâu về cơ chế và gen đột biến. Vì vậy, xác định gen bị đột biến và vị trí đột biến để có thể đưa ra cơ chế của quá trình này. 3. Quá trình lên men dấm kèm theo sự tăng nhiệt độ, nghiên cứu cải biến chủng vi khuẩn acetic nhằm cải thiện khả năng chịu nhiệt và lên men ở nhiệt độ cao hơn, phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam là vấn đề cần thiết. CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 1. Nguyen Thi Viet Anh, Ha Thi Phuong, Bui Thi Thuy Ha, Nguyen Thi Hong Tu, Do Dinh Hai, Do Thi Kim Loan (2013), “Selection of acetic acid bacteria strains producing high acid acetic for rice vinegar production by submerged fermentation method”, International workshop on Agricultural engineering and post- harvest Technology for Asia subtainability (KC.07/11-15), Ministry of Science and Technology- Ministry of Agriculture and Rural Development, Hanoi, Vietnam, tr.450-458. 2. Đỗ Thị Kim Loan, Nguyễn Thị Việt Anh, Lê Đức Mạnh, Bùi Thị Thúy Hà (2014), “Nghiên cứu kĩ thuật lên men dấm gạo thơm theo phương pháp lên men chìm từ phụ phẩm của quá trình sản xuất rượu gạo”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 52(5C), tr. 352-358. 3. Đỗ Thị Kim Loan, Nguyễn Thị Việt Anh, Vũ Văn Hạnh, Bạch Hoàng My (2015), “Cải biến chủng vi khuẩn axit axetic bằng kỹ thuật đột biến ngẫu nhiên nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp axit axetic ứng dụng trong sản xuất dấm lên men nồng độ cao trên môi trường bổ sung dịch bã rượu”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Tạp chí Khoa học và Công nghệ Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 267(12), tr. 78-85. 4. Do Thi Kim Loan, Nguyen Thi Viet Anh, Le Duc Manh (2015), “Optimization of high-acidity vinegar fermentation from by- product of rice spirit production”, Journal of Science and Technology, Vietnam Academy of Science and Technology, 53(4B), tr.95-102. 5. Do Thi Kim Loan, Nguyen Thi Viet Anh (2016), “Study on Use of By-Product from Rice Spirit Processing for High-Acidity Vinegar Production by Submerged Fermentation Method”, Journal of Science and Technology, Technical Universities, 111, tr.36-41.