Tóm tắt Luận án Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây sâm cau (curculigo orchioides gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế

Biology, 19(7&8), p. 293-301. 2. Bùi Lê Thanh Nhàn, Nguyễn Bảo Hưng, Nguyễn Thị Thu Hiền, Hoàng Tấn Quảng, Trương Thị Bích Phượng (2020), Nghiên cứu hàm lượng lycorine của cây sâm cau Curculigo orchioides Gaertn. bằng lỹ thuật HPLC-FD, Báo cáo toàn văn Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc 2020, tr. 244-249. 3. Bùi Lê Thanh Nhàn, Hoàng Việt Hương, Trương Thị Bích Phượng (2022), Xác định một số chỉ tiêu hoá sinh của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) ở tỉnh Thừa Thiên Huế, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, trường Đại học Khoa học, Đại học Huế, Tập 20 (2), tr. 91-100. 4. Thanh-Nhan Bui-Le, Quang Hoang-Tan, Huong Hoang- Viet, Bich-Phuong Truong-Thi and Tung Nguyen-Thanh (2023), Protective Effect of Curculigo orchioides Gaertn. Extract on Heat Stress- Induced Spermatogenesis Complications in Murine Model, Curr. Issues Mol. Biol. 45(4), p. 3255-3267. 5. Bùi Lê Thanh Nhàn, Trương Thị Bích Phương, Hoàng Tấn Quảng (2023), Phân tích vùng gene trnL-trnF của cây Sâm cau (Curculigo orchioides) tự nhiên thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế, Tạp chí Đại học Huế: Khoa học tự nhiên, 132(1A), tr. 75-82. 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) là một loài thảo dược sống lâu năm thuộc họ Hạ trâm (Hypoxidaceae) thường phân bố ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới như Việt Nam,Trung Quốc, Ấn Độ, .... Các nghiên cứu về thành phần hoá học cho thấy, cây Sâm cau (C. orchioides) có chứa glycoside, alkaloid, saponin, triterpenoid, flavone và polysaccharide, Với thành phần hoạt chất phong phú này, Sâm cau đã được sử dụng rộng rãi trong y học bản địa các nước nhằm bảo vệ sức khoẻ, bảo vệ gan, chống oxy hóa, chống ung thư. Sâm cau cũng đã được sử dụng để tăng cường trí nhớ, an thần, bảo vệ thần kinh, điều trị loãng xương, chống đái tháo đường. Chiết xuất rễ củ cũng được sử dụng như một loại thuốc bổ để khắc phục chứng bất lực, liệt dương, rối loạn tiết niệu; vàng da; hoạt động chống hoại tử và hoạt tính kháng khuẩn. Với tác dụng và tiềm năng to lớn của loài cây thảo dược này trong y dược học, cây Sâm cau đã và đang bị khai thác quá mức dẫn đến tình trạng ngày càng cạn kiệt và nhiều nơi đã biến mất hẳn. Vì vậy, Liên minh Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế (IUCN) và Việt Nam đã đưa cây Sâm cau vào danh mục của sách đỏ cần được bảo vệ ở mức nguy cấp (mức EN, phân hạng VU A1c,d). Cùng với sự phát triển của nền kinh tế-xã hội, các stress cũng như sự ô nhiễm môi trường, tỷ lệ mắc bệnh ung thư và bệnh suy giảm chức năng sinh dục là một trong những vấn đề nhức nhối của xã hội hiện đại. Số người mắc bệnh ngày càng gia tăng và có xu hướng trẻ hoá bệnh nhân. Theo số liệu toàn cầu năm 2020, ung thư dạ dày đứng thứ năm trong số các bệnh ung thư thường gặp với hơn một triệu người mắc mới, đứng thứ tư về tỷ lệ tử vong do bệnh ác tính với 770.000 ca. Bên cạnh đó, theo ước tính của WHO có khoảng 80 triệu cặp vợ chồng vô sinh, trong đó vô sinh do nam giới chiếm khoảng 40 - 50%. Việt Nam là một trong những quốc gia có tỷ lệ vô sinh cao trên thế giới với 50% số ca mắc bệnh nằm ở độ tuổi dưới 30. Thống kê của Bộ Y tế nước ta cho thấy, mỗi năm có khoảng 2 1 triệu cặp vợ chồng mắc bệnh vô sinh, hiếm muộn, chiếm 8 - 10% ở các cặp vợ chồng đang ở độ tuổi sinh đẻ. Những nghiên cứu gần đây cho thấy chất lượng tinh trùng của đàn ông hiện nay đã giảm nhiều so với trước. Từ năm 1965 đến năm 2015, mật độ tinh trùng trung bình ở đàn ông đã giảm 32,5% sau 50 năm. Sự suy giảm quá trình sinh tinh không chỉ ảnh hưởng đến sức khỏe, tinh thần và kinh tế của nam giới mà còn ảnh hưởng đến sức lao động, cũng như hạnh phúc gia đình, sự phát triển nòi giống và gây hậu quả tiêu cực đối với đời sống xã hội. Vì vậy, nghiên cứu hoạt tính sinh học của cây Sâm cau đối với các tế bào ung thư dạ dày và quá trình sinh tinh là rất cần thiết. Tuy nhiên, việc nghiên cứu một cách tổng thể về cây Sâm cau tại Việt Nam nói chung và tỉnh Thừa Thiên Huế nói riêng, vẫn còn rất hạn chế. Việc xác định đúng cây Sâm cau và phân biệt với các giống sâm khác là rất cần thiết trong quá trình khai thác, sử dụng cũng như định hướng bảo tồn và phát triển nguồn cây dược liệu. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật học và đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) thu tại Thừa Thiên Huế”. 2. Mục tiêu và nội dung của đề tài 2.1. Mục tiêu chung Xác định được một số đặc điểm hình thái, hóa sinh, đa dạng di truyền và dược tính của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. 2.2. Mục tiêu cụ thể - Xác định được một số đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế; - Nghiên cứu được một số hoạt tính sinh học của cây Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. 3 2.3. Nội dung của đề tài - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, giải phẫu và đa dạng di truyền của cây Sâm cau tự nhiên phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa thiên Huế; - Nghiên cứu một số đặc điểm hoá sinh và sự tích luỹ dược chất của cây Sâm cau tự nhiên tại Thừa Thiên Huế; - Đánh giá hoạt tính sinh học của cây Sâm cau thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế, đồng thời xác định dược lý của cây Sâm cau trên mô hình động vật thực nghiệm. 3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3.1. Ý nghĩa khoa học Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về một số đặc điểm thực vật học cũng như hoạt tính sinh học của cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế. Đồng thời, luận án cũng là tài liệu tham khảo cho các hoạt động nghiên cứu và giảng dạy về sinh học và cây dược liệu. 3.2. Ý nghĩa thực tiễn Kết quả nghiên cứu cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc bảo tồn và phát triển loài dược liệu Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.) tại Thừa Thiên Huế nói riêng và Việt Nam nói chung. 4. Phạm vi nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu các đặc điểm hình thái của cây Sâm cau tự nhiên phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế. Các thông số của cây được xác định tại địa điểm thu mẫu. Các thí nghiệm phân tích thành phần dược chất và đánh giá đa dạng di truyền của cây Sâm cau được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học và Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế. Thí nghiệm in vivo về đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết Sâm cau trên mô hình thực nghiệm và giải phẫu hình thái cây Sâm cau được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Khoa Cơ bản, Trường Đại học Y dược, Đại học Huế. 4 Các thí nghiệm phân tích mô bệnh học được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh, Bệnh viện trường Đại học Y dược, Đại học Huế. Thí nghiệm phân tích nồng độ testosterone trong máu được tiến hành tại Khoa Sinh hoá, Bệnh viện Trung ương Huế. 5. Những đóng góp mới của luận án - Đề tài cung cấp các đặc điểm sinh học của loài Sâm cau phân bố tại Thừa Thiên Huế, bao gồm: chiều cao cây, kích thước lá, kích thước rễ củ, hình dạng và màu sắc hoa, quả, - Sử dụng kỹ thuật DNA mã vạch đã định danh được loài Sâm cau phân bố trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế là loài Curculigo orchioides Gaertn., thuộc chi Curculigo, họ Hypoxidaceae, 15 trình tự trnL-trnF có mã số tương ứng từ OR035735-OR035749 đã được ký gửi lên GenBank. - Đã đánh giá được mức độ đa dạng di truyền của các mẫu Sâm cau thông qua 6 mồi khuếch đại nhiều band DNA với độ đa hình cao. Sự khác biệt di truyền của các quần thể Sâm cau tại một số địa phương trong nước khá cao. Tỉ lệ locus đa hình của các quần thể Sâm cau đạt trung bình là 80,66% với khoảng cách di truyền giữa các mẫu từ 0,0611 đến 0,2958. - Đã xác định được một số thành phần hóa sinh ở mẫu rễ củ và mẫu lá trong cây Sâm cau phân bố tại Thừa Thiên Huế, bao gồm các chỉ tiêu về hàm lượng của nước (77,778 - 79,853%), tro (8,080 - 10,800%), cellulose (19,060 - 24,820%), vitamin C (0,088 - 0,172%), lipid tổng số (5,010 - 10,420%), protein (0,166 - 3,480 mg/g), flavonoid (0,508 - 2,129 mg/g), polysaccharide (24,859 - 102,274 mg/g), saponin (2,469 - 5,340 mg/g), alkaloid (9,553 - 10,039 mg/g), và lycorine (0,241 - 1,777 µg/mL). - Dịch chiết từ rễ củ của cây Sâm cau với nồng độ lycorine cao có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của các tế bào ung thư dạ dày, cũng như kích thích quá trình sinh tinh trên mô hình thực nghiệm, đặc biệt ở liều dùng dịch chiết 200 mg/kg thể trọng và 400 mg/kg thể trọng. 5 6. Kết cấu của luận án Luận án gồm 139 trang, gồm: Mở đầu: 4 trang; Chương 1: Tổng quan tài liệu: 34 trang; Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 18 trang; Chương 3: Kết quả và thảo luận: 52 trang; Phần kết luận và kiến nghị: 2 trang; Các công trình đã công bố liên quan đến luận án: 1 trang; Phần tài liệu tham khảo: 28 trang với 260 tài liệu tham khảo bằng tiếng Việt, tiếng Anh và Website. Luận án có 28 bảng, 28 hình. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án đã tham khảo và tổng kết về 4 vấn đề chính với các nội dung liên quan đến: (1) Giới thiệu chung về Sâm cau; (2) Một số kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền; (3) Thành phần hoá học của Sâm cau; (4) Dược tính của Sâm cau. Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU - Vật liệu thực vật: Loài Sâm cau (Curculigo orchioides Gaertn.), chi Thủy Tiên (Curculigo), họ Hạ trâm (Hypoxidaceae), bộ Măng tây (Asparagales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp thực vật một lá mầm (Liliopsida). - Vật liệu động vật: Chuột Swiss đực, 8 - 10 tuần tuổi được cung cấp bởi Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế, tỉnh Khánh Hòa. 2.2. ĐỊA ĐIỂM THU MẪU Cây Sâm cau được thu hái tại 3 địa điểm khác nhau trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế: thành phố Huế - núi Ngự Bình (tọa độ: 16º26’34”B, 107º35’54”Đ), huyện Hương Thủy - núi Thiên Thai (tọa độ: 16º24’22”B, 107º35’20’’Đ), huyện Hương Trà - núi Thiên Thọ (tọa độ: 16º21’45”B, 107º36’49”Đ). Phân tích RAPD còn sử dụng thêm các mẫu Sâm cau thu tại các tỉnh: Lai Châu, Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Kon Tum, Lâm Đồng. 6 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm sinh học - Các đặc điểm hình thái, sinh trưởng và phát triển của cây Sâm cau được mô tả theo phương pháp của Nguyễn Nghĩa Thìn (2006) có cải tiến gồm các chỉ tiêu về: lá, rễ củ, số nhánh, hoa, quả và hạt. - Các đặc điểm cấu trúc vi phẫu được thực hiện theo phương pháp nghiên cứu hiển vi của Trần Công Khánh (2005) và Dược điển Việt Nam (2017) 2.3.2. Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền cây Sâm sau 2.3.2.1. Kỹ thuật DNA mã vạch 2.3.2.2. Kỹ thuật RAPD 2.3.3. Phương pháp nghiên cứu các đặc điểm hoá sinh của Sâm cau 2.3.3.1. Xác định độ ẩm 2.3.3.2. Định lượng vitamin C bằng phương pháp sử dụng I2 2.3.3.3. Định lượng cellulose 2.3.3.4. Xác định hàm lượng tro 2.3.3.5. Xác định hàm lượng lipid tổng số 2.3.3.6. Xác định hàm lượng protein 2.3.3.7. Phân tích flavonoid tổng số 2.3.3.8. Phân tích polysaccharide 2.3.3.9. Phân tích saponin toàn phần 2.3.3.10. Phân tích alkaloid tổng số 2.3.3.11. Xác định hàm lượng lycorine 2.3.4. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của dịch chiết Sâm cau 2.3.4.1. Phương pháp đánh giá tác dụng của cao chiết Sâm cau lên khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư dạ dày 2.3.4.2. Đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau lên quá trình sinh tinh 2.4. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 7 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT HỌC VÀ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÂY SÂM CAU TẠI THỪA THIÊN HUẾ 3.1.1. Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau 3.1.1.1. Đặc điểm phân bố Cây Sâm cau ở Thừa Thiên Huế phân bố dưới tán rừng thông tại vùng núi thấp, nơi chuyển tiếp từ vùng núi cao xuống vùng đồng bằng ven biển; có nhiệt độ trung bình 24,0 - 25,2ºC, lượng mưa trung bình năm 2.600 - 2.800 mm và độ ẩm 83 - 84%. Các đặc điểm của khu vực phân bố Sâm cau tại Thừa Thiên Huế được mô tả ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Đặc điểm phân bố, thực bì và phẫu diện đất tại các vùng nghiên cứu Chỉ tiêu Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên Thọ Độ cao (m) 41 57 54 Độ dốc (độ) ≥ 30 độ ≤ 30 độ ≤ 30 độ Độ tàn che (%) 45 0 5 N (cây/ha) 44 108 105 Độ ẩm tầng 0 - 30 cm (%) 30 - 40 45 - 50 30 - 40 Độ dầy tầng thảm mục (cm) 0,2 - 1,2 0,1 - 0,4 0,2 - 0,4 Độ che phủ thực bì (%) 20 - 30 10 - 20 15 - 20 Chiều cao thực bì (m) 0,3 - 0,4 0,1 - 0,4 0,2 - 0,3 Màu sắc đất Đỏ nâu Vàng nhạt Xám Loại đất Đất Leptosols Đất Leptosols Đất Acrisols 3.1.1.2. Đặc điểm hình thái của Sâm cau Sâm cau (Curculigo orchioides Gaerrtn.) là cây thảo, sống lâu năm với các đặc điểm thực vật học được trình bày ở Hình 3.1 và Bảng 3.2: 8 Bảng 3.2. Đặc điểm thực vật học của cây Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Chỉ tiêu Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên Thọ Chiều dài củ (cm) 9,77a ± 3,11 6,60b ± 2,59 5,80c ± 2,36 Đường kính củ (cm) 1,25a ± 0,35 0,9b ± 0,19 0,73c ± 0,12 Chiều dài cuống lá (cm) 5,24c ± 2,52 5,67b ± 3,39 3,00a ± 0,53 Chiều dài lá (cm) 24,30b ± 9,64 40,54a ± 11,03 14,97c ± 3,33 Đường kính lá (cm) 1,85a ± 0,34 1,54b ± 0,36 1,22c ± 0,35 Số nhánh 3,42c ± 1,33 3,61b ± 1,51 6,65a ± 1,51 Hoa Màu vàng tươi Quả Thuôn dài chứa hạt Hạt Có rãnh sâu theo đường lượn sóng Hình 3.1. Hình thái cây Sâm cau bản địa tại tỉnh Thừa Thiên Huế Ghi chú: A. Cây Sâm cau C. orchioides Gaertn.; B. Lá; C. Thân rễ; D. Tiết diện ngang của củ; E. Tiết diện dọc của củ; F. Cây mang hoa; G. Một hoa hoàn chỉnh; H. Mặt trước của hoa; I. Mặt sau của hoa; K. Một quả hoàn chỉnh khi non; L,M. Quả già; N. Hạt. 9 3.1.1.3. Đặc điểm vi phẫu của Sâm cau Đặc điểm vi phẫu của lá Sâm cau Hình 3.2. Cấu trúc vi phẫu của lá cây Sâm cau Ghi chú: A. Trục giữa của lá; B. Phiến lá; C. Mép lá; D. Cuống lá. AbE - Biểu bì xa trục; AdE - Biểu bì hướng trục; AdG - Rãnh đính trục; APh - Phloem đính trục; BS - Bao mạch; Ep - Biểu bì; LM - Mép lá; MR - Gân giữa; MT - Nhu mô đồng hoá; MX - Metaxylem; Ph - Phloem; PX - Protoxylem; Sc - Cương mô; St - Khí khổng; Xy -Xylem. Đặc điểm vi phẫu của rễ củ Sâm cau Hình 3.3. Cấu trúc vi phẫu của rễ củ Sâm cau Ghi chú: A. Củ rễ Sâm cau; B. Tiết diện ngang của củ Sâm cau; C-G. Vi phẫu Sâm cau dưới kính hiển vi ở kích thước 40 µm (C) và 400 µm (D-G). Ck - Bần; End - Nội bì; Epi - Ngoại bì; Id - Dị bào; Ph - Phloem (Libe); PT - Nhu mô (Parenchymal Tissue); Ra - Tinh thể Calci oxalate (Raphide); SC - Ống tiết (Secretory Canal); SG - Hạt tinh bột; VB - Bó mạch; Xy - Xylem (Gỗ). 10 Đặc điểm vi phẫu của bột Sâm cau Hình 3.4. Cấu trúc vi phẫu của bột cây Sâm cau A. Khí khổng; B-C. Mạch dẫn xylem dạng xoắn; D. Tinh thể Calcium oxalate; E. Tế bào biểu bì; F-G. Hạt tinh bột; H-I. Sợi Fibre (chất xơ). 3.1.1.4. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây Sâm cau Sâm cau là loài cây sống lâu năm với các giai đoạn sinh trưởng diễn ra theo mùa được trình bày ở Bảng 3.3. Bảng 3.3. Các giai đoạn sinh trưởng và phát triển của Sâm cau Giai đoạn sinh trưởng và phát triển Tháng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Hạt nảy mầm, rễ củ đâm chồi x x Cây ra lá x x x x x x Cây ra hoa, kết quả x x x x x x Quả chín x x x x x x Lá tàn lụi x x x x x x Thu hoạch x x x x x 3.1.2. Đặc điểm di truyền cây Sâm cau 3.1.2.1. Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị DNA mã vạch quần thể Sâm cau ở Thừa Thiên Huế Kết quả phân tích và so sánh trình tự gene trnL-trnF trên cơ sở dữ liệu GenBank cho thấy, trình tự các mẫu thu được đều có độ giống nhau đạt 99% và độ bao phủ đạt 100% so với trình tự NC_053892 của loài Curculigo orchioides. Điều này chứng tỏ tất cả các mẫu ngiên cứu thu thập tại Thừa Thiên Huế là cùng 1 loài Curculigo orchioides Gaertn., thuộc 11 họ Hypoxidaceae, chi Cồ nốc (Curculigo). Đồng thời chúng tôi cũng đã xây dựng cây phát sinh chủng loại của các mẫu nghiên cứu (Hình 3.5). Hình 3.5. Sơ đồ cây phát sinh phả hệ của Sâm cau Các mẫu Sâm cau thu được phân chia thành các kiểu đơn bội khác nhau ở mỗi vùng với 5 loại haplotype được tạo thành và hệ số đa dạng haplotype (Hd) trung bình là 0,705 ± 0,088. 3.1.2.2. Phân tích đa dạng di truyền bằng chỉ thị RAPD Phân tích sự đa dạng di truyền của quần thể Sâm cau Thừa Thiên Huế với 6 quần thể khác (Lai Châu, Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam, Kon Tum, Lâm Đồng) bằng 6 mồi khuếch đại đã tạo ra 65 band DNA đều đa hình, có kích thước từ 200 bp đến 2000 bp. Sử dụng phương pháp gom cụm không có trọng số với giá trị trung bình số học bằng thuật toán UPGMA (Unweighted Pair Group Method using arithmetic Averages), chúng tôi đã xây dựng cây phát sinh chủng loại (Hình 3.6). Trên cây phát sinh chủng loại, các quần thể Sâm cau có mức độ tương đồng thấp ở các khu vực địa lý xa nhau. Mức độ tương đồng tăng lên khi so sánh các khu vực địa lý gần nhau tuy nhiên vẫn ở 12 mức thấp, điều này chứng tỏ Sâm cau có sự đa dạng di truyền rất lớn. Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của 7 quần thể Sâm cau nghiên cứu 3.2. ĐẶC ĐIỂM HOÁ SINH CỦA CÂY SÂM CAU Ở THỪA THIÊN HUẾ 3.2.1. Một số chỉ tiêu hoá sinh cơ bản Bảng 3.4. Một số chỉ tiêu hóa sinh cơ bản của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Chỉ tiêu Mẫu Địa điểm Núi Ngự Bình Núi Thiên Thai Núi Thiên Thọ Độ ẩm (%) Rễ củ 79,853a ± 0,311 78,437b ± 0,087 78,016c ± 0,125 Lá 78,833a ± 0,006 77,813b ± 0,080 77,778c ± 0,444 Cellulose (%) Rễ củ 19,960b ± 0,033 19,060c ± 0,028 21,080a ± 0,047 Lá 22,710b ± 0,029 21,870c ± 0,023 24,820a ± 0,067 Tro (%) Rễ củ 9,180a ± 0,263 8,080c ± 0,127 8,660b ± 0,073 Lá 10,800a ± 0,196 8,780c ± 0,127 9,340b ± 0.068 Vitamin C (%) Rễ củ 0,114b ± 0,006 0,147a ± 0,013 0,088c ± 0,011 Lá 0,136b ± 0,006 0,172a ± 0,006 0,103c ± 0,006 Lipid tổng (%) Rễ củ 8,170a ± 0,04 7,410b ± 0,04 5,010c ± 0,024 Lá 10,420a ± 0,03 9,390b ± 0,02 8,900c ± 0,018 Protein tổng (mg/g) Rễ củ 1,780c ± 0,042 3,480a ± 0,069 1,865b ± 0,021 Lá 0,166c ± 0,022 0,350a ± 0,013 0,190b ± 0,007 Ghi chú: Các chữ cái a, b, c theo sau trong cùng một hàng chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test) Kết quả phân tích trình bày ở Bảng 3.4 cho thấy, các chỉ tiêu hoá sinh của Sâm cau tại các địa điểm phân bố có sự sai khác, thể hiện ở cả mẫu rễ của và mẫu lá. 13 3.2.2. Phân tích định tính một số dược chất trong Sâm cau ở Thừa Thiên Huế 3.2.2.1. Định tính flavonoid Dịch chiết Sâm cau có phản ứng dương tính với dung dịch NaOH 10% và FeCl3. Kết luận: Có sự tồn tại của flavonoid trong Sâm cau. 3.2.2.2. Định tính polysaccharide Dịch chiết Sâm cau có phản ứng dương tính với thuốc thử Benedict và thuốc thử Felling Kết luận: Sâm cau có chứa thành phần polysaccharide. 3.2.2.3. Định tính saponin Dịch chiết Sâm cau có phản ứng tạo bọt với khi lắc và hình thành vòng phân cách màu hồng đến tím đỏ khi phản ứng với thuốc thử Liebermann-Burchard. Kết luận: cây Sâm cau Thừa Thiên Huế có chứa thành phần saponin triterpenoid. 3.2.2.4. Định tính alkaloid Dịch chiết Sâm cau có phản ứng dương tính với cả 3 loại thuốc thử Mayer, Dragendorff, Bouchardat. Kết luận: Có hoạt chất alkaloid tồn tại trong cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế. 3.2.3. Phân tích định lượng một số dược chất trong cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế 3.2.3.1. Hàm lượng flavonoid Bảng 3.5. Hàm lượng flavonoid của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Mẫu Flavonoid (mg/g) Lá Rễ củ Núi Ngự Bình 2,129a ± 0,003 0,875a ± 0,005 Núi Thiên Thai 1,145c ± 0,006 0,508c ± 0,004 Núi Thiên Thọ 1,836b ± 0,002 0,697b ± 0,004 Ghi chú: Các chữ cái a, b, c theo sau trong cùng một cột chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test) Kết quả ở Bảng 3.5 cho thấy: hàm lượng flavonoid trong các mẫu lá Sâm cau thu được cao hơn trong mẫu rễ củ, trong đó mẫu ở vùng núi Ngự Bình đạt giá trị cao nhất. 14 3.2.3.2. Hàm lượng polysaccharide Bảng 3.6. Hàm lượng polysaccharide của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Mẫu Polysaccharide (mg/g) Lá Rễ củ Núi Ngự Bình 24,859c ± 0,055 40,918c ± 0,147 Núi Thiên Thai 36,344a ± 0,192 102,274a ± 0,288 Núi Thiên Thọ 26,747b ± 0,192 68,237b ± 0,242 Ở Bảng 3.6 cho thấy: hàm lượng polysaccharide trong các mẫu rễ củ Sâm cau cao hơn mẫu lá rất nhiều, trong đó mẫu ở vùng núi Thiên Thai đạt giá trị cao nhất. 3.2.3.3. Hàm lượng saponin Kết quả phân tích hàm lượng saponin của Sâm cau tại Thừa Thiên Huế đạt giá trị cao nhất ở vùng núi Thiên Thọ (Bảng 3.7). Đồng thời, các mẫu rễ củ đều cho lượng saponin cao hơn mẫu lá. Bảng 3.7. Hàm lượng saponin của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Mẫu Saponin (mg/g) Lá Rễ củ Núi Ngự Bình 2,469c ± 0,009 2,751c ± 0,006 Núi Thiên Thai 2,512b ± 0,004 3,752b ± 0,010 Núi Thiên Thọ 4,379a ± 0,004 5,340a ± 0,003 3.2.3.4. Hàm lượng alkaloid tổng số Bảng 3.8. Hàm lượng alkaloid của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Mẫu Alkaloid (mg/g) Lá Rễ củ Núi Ngự Bình 2,737a ± 0,000 10,039a ± 0,020 Núi Thiên Thai 2,083b ± 0,007 9,850b ± 0,007 Núi Thiên Thọ 1,738c ± 0,007 9,553c ± 0,007 Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy: lượng alkaloid tổng ở trong mẫu rễ củ cao hơn rất nhiều so với mẫu lá, và các mẫu ở vùng núi Ngự Bình thu được lượng alkaloid lớn nhất trong 3 vùng nghiên cứu. 15 3.2.3.5. Phân tích lycorine bằng kỹ thuật HPLC Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ mẫu đến hàm lượng lycorine Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ mẫu đến hàm lượng lycorine Nhiệt độ (ºC) Nồng độ lycorine (µg/mL) 4 1,558a ± 0,156 25 1,177b ± 0,008 37 0,705c ± 0,161 65 0,258d ± 0,108 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ đến thời gian ủ mẫu cho thấy hàm lượng lycorine thu được cao nhất ở 4ºC (Bảng 3.9). Ảnh hưởng của thời gian chiết mẫu đến hàm lượng lycorine Kết quả khảo sát ở Bảng 3.10 cho thấy hàm lượng lycorine thu được cao nhất khi ủ mẫu ở 4ºC trong 10 phút. Bảng 3.10. Ảnh hưởng của thời gian chiết mẫu đến hàm lượng lycorine của Sâm cau Thời gian (phút) Nồng độ lycorine (µg/mL) 10 1,873a ± 0,016 30 1,361b ± 0,017 120 0,472c ± 0,004 300 0,141d ± 0,011 Phân tích các mẫu rễ củ tại các vùng nghiên cứu cho thấy hàm lượng lycorine thu được cao nhất ở mẫu của vùng núi Ngự Bình (Bảng 3.11). Bảng 3.11. Hàm lượng lycorine của Sâm cau tại các vùng nghiên cứu Mẫu Nồng độ lycorine (µg/mL) Lá Rễ củ Núi Ngự Bình 0,484a ± 0,101 1,873a ± 0,016 Núi Thiên Thai 0,340b ± 0,095 1,003b ± 0,216 Núi Thiên Thọ 0,241c ± 0,016 0,690c ± 0,074 16 3.3. ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ CỦA SÂM CAU 3.3.1. Đánh giá tác dụng ức chế tế bào ung thư dạ dày MKN45 của dịch chiết Sâm cau 3.3.1.1. Tác động của dịch chiết Sâm cau lên kiểu hình tế bào MKN45 Từ kết quả phân tích ở Hình 3.7 có thể thấy rằng, dịch chiết từ cây Sâm cau có tác động đến số lượng và kiểu hình của các tế bào nuôi cấy dòng MKN45. Bắt đầu từ nồng độ 200 μg/mL, dịch chiết đã có tác động đáng kể lên số lượng và hình thái của tế bào nuôi cấy. Hình 3.7. Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau lên mật độ và kiểu hình của tế bào ung thư dạ dày MKN45 (Thang đo 100 µm) 3.3.1.2. Tác động của dịch chiết Sâm cau lên sự tăng sinh tế bào MKN45 Hình 3.8. Tỷ lệ tăng sinh (A) và tỷ lệ ức chế (B) của tế bào MKN45 Hình 3.8 cho thấy, dịch chiết từ cây Sâm cau đã ức chế sự tăng sinh tế bào MKN45, với tỷ lệ sống sót càng thấp khi nồng độ dịch chiết trong môi trường nuôi cấy càng cao và chỉ đạt dưới 20% ở nồng độ 1.000 μg/mL. 17 3.3.2. Đánh giá tác dụng của dịch chiết Sâm cau đến quá trình sinh tinh ở chuột Swiss đực 3.3.2.1. Tác động của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi cho chuột Swiss đực uống dịch chiết Sâm cau ở các liều dùng 100 mg/kg, 200 mg/kg và 400 mg/kg đều cho thấy có sự phụ hồi về nồng độ testosterone trong máu so với nhóm đối chứng (Hình 3.9). Hình 3.9. Ảnh hưởng của dịch chiết Sâm cau đến nồng độ testosterone trong máu của chuột Swiss đực nghiên cứu Ghi chú: * So với nhóm đối chứng, # So với các nhóm stress nhiệt, *, #: p<0,05, **, ##: p<0,01, ***, ###: p<0,005. Ghi chú: C: Nhóm đối chứng, uống nước cất; C100: Nhóm chuột uống dịch Sâm cau ở liều dùng 100 mg/kg thể trọng; C200: Nhóm chuột uống dịch Sâm cau ở liều dùng 200 mg/kg thể trọng; C400: Nhóm chuột uống dịch Sâm cau ở liều dùng 400 mg/kg thể trọng; H : Nhóm chuột xử lý nhiệt ở 40°C; HC100: Nhóm chuột xử lý nhiệt kết hợp uống dịch Sâm cau ở liều dùng 100 mg/kg thể trọng; HC200: Nhóm chuột xử lý nhiệt kết hợp uống dịch Sâm cau ở liều dùng 200 mg/kg thể trọng; HC400: Nhóm chuột xử lý nhiệt kết hợp uống dịch Sâm cau ở liều dùng 400 mg/kg thể trọng. 18 3.3.2.2. Tác dụng bảo vệ quá trình phát sinh tinh của dịch chiết Sâm cau trên mô học tinh hoàn dưới tác động của nhiệt Hình 3.10. Cấu trúc mô tinh hoàn ở chuột tiếp xúc với nhiệt và được điều trị bằng dịch chiết Sâm cau Ghi chú: A - A'. Nhóm chứng (C); B - B'. Nhóm uống dịch chiết Sâm cau ở liều dùng 100 mg/kg thể trọng (C100); C - C'. Nhóm uống dịch chiết Sâm cau ở liều dùng 200 mg/kg thể trọng (C200); D - D'. Nhóm uống dịch chiết Sâm cau ở liều dùng 400 mg/kg thể trọng (C400); E - E'. Stress nhiệt ở 400C (H); F - F'. Nhóm bị stress nhiệt và uống dịch chiết Sâm cau ở liều dùng 100 mg/kg thể trọng (HC100); G - G'. Nhóm bị stress nhiệt và uống dịch chiết Sâm cau ở liều dùng mg/kg thể trọng (HC200); H - H'. Nhóm bị stress nhiệt và uống dịch chiết Sâm cau ở liều dùng 400 mg/kg (HC400); Le: Tế bào Leydig, Se: Tế bào Sertoli, Sg: Tinh nguyên bào, Sc: Tinh bào, rs: Tinh tử tròn, es: Tinh tử dài, S: Tinh trùng. 19 Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy các chuột đực khi tiếp xúc thường xuyên với nhiệt độ cao sẽ xuất hiện các dấu hiệu suy giảm quá trình sinh tinh. Quan sát dưới kính hiển vi quang học, tiết diện ngang của mô tinh hoàn ở các nhóm chuột đã được nhận diện và cho thấy sự sai khác (Hình 3.10). Bảng 3.12. Đặc điểm của mô học tinh hoàn theo hệ thống điểm Johnsen Nhóm Điều trị Điểm Johnsen C Nước cất 8,163 ± 0,109 C100 100 mg/kg 8,144 ± 0,159 C200 200 mg/kg 8,263 ± 0,102 C400 · 400 mg/kg 8,326 ± 0,175 H 40°C + Nước cất 5,000 ± 0,414 HC100 40°C + 100 mg/kg 5,815 ± 0,191 HC200 40°C + 200 mg/kg 6,300 ± 0,202 HC400 · 40°C + 400 mg/kg 6,374 ± 0,222 Hình 3.11. Đánh giá tổn thương mô tinh hoàn ở chuột tiếp xúc với nhiệt và được điều trị bằng dịch chiết Sâm cau theo hệ thống điểm Johnsen Ghi chú: * So với nhóm đối chứng, # So với các nhóm stress nhiệt, *, #: p<0,05, **, ##: p<0,01, ***, ###: p<0,005. Kết quả thu được thể hiện trong Bảng 3.12 và Hình 3.11 cho thấy: điểm số của Johnsen giữa các nhóm chuột đực trưởng thành được nuôi ở 20 điều kiện thường và có uống dịch chiết Sâm cau với liều 100 mg/kg, 200 mg/kg và 400 mg/kg không khác biệt đáng kể so với những con trong nhóm đối. Điểm số Johnsen của chuột chịu stress nhiệt ở 40ºC đã giảm đáng kể. Tuy nhiên, chuột đực bị stress uống dịch chiết Sâm cau cho thấy sự phục hồi đáng kể trong quá trình sinh tinh Phân tích điểm số Johnsen ở các mặt cắt ngang của ống sinh tinh, chúng tôi cũng đã xác định được tần số phân bố điểm giữa 8 nghiên cứu nhóm chuột đực nghiên cứu và trình bày ở Hình 3.12. Hình 3.12. Phân bố tần số của điểm số Johnsen của mặt cắt ngang ống dẫn tinh ở chuột tiếp xúc với nhiệt và được điều trị bằng dịch chiết Sâm cau 21 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Sâm cau tự nhiên thu tại tỉnh Thừa Thiên Huế được xác định là loài Curculigo orchioides Gaertn. bằng kỹ thuật DNA mã vạch với 15 trình tự trnL-trnF (mã số từ OR035735-OR035749) đã được ký gửi lên GenBank. Cây có rễ củ hình trụ, nằm ẩn dưới mặt đất, mặt ngoài sần sùi có màu vàng nâu đậm, mặt cắt màu kem. Các lá đơn thuôn dài hình mũi mác, có phủ lông trên bề mặt và cuống lá có màu xanh hoặc xanh tím. Hoa có màu vàng tươi, mọc thành cụm dưới bẹ lá từ tháng 4 đến tháng 10 hàng năm; sau đó sẽ tạo thành các quả nang, màu trắng xốp, chứa từ 2 - 14 hạt. Phân tích đa dạng di truyền của quần thể Sâm cau tại Thừa Thiên Huế và 6 quần thể khác ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD cho thấy mối quan hệ đa dạng di truyền và mức độ đa dạng cao với độ phân hoá di truyền theo Nei H > 0,388 và chỉ số Shannon I > 0,563. 2. Mẫu Sâm cau phân bố ở vùng núi Ngự Bình, thành phố Huế được đánh giá cao hơn so với hai vùng núi Thiên Thai và núi Thiên Thọ qua các chỉ số về độ ẩm (79,853% ở rễ củ và 78,833% ở lá), hàm lượng tro (9,180% ở rễ củ và 10,800% ở lá), lượng lipid tổng số (8,170% ở rễ củ và 10,420% ở lá), hàm lượng flavonoid (0,875 mg/g ở rễ củ và 2,129 mg/g ở lá), alkaloid (10,039 mg/g ở rễ củ và 2,737 mg/g ở lá), và lycorine (1,777 µg/mL ở rễ củ và 0,484 µg/mL ở lá). Các mẫu Sâm cau phân bố ở vùng núi Thiên Thai đạt giá trị cao nhất về hàm lượng vitamin C (0,147% ở rễ củ và 0,172% ở lá), hàm lượng protein tổng (3,480 mg/g ở rễ củ và 0,350 mg/g ở lá) và polysaccharide (102,274 mg/g ở rễ củ và 36,344 mg/g ở lá). Hàm lượng cao nhất của saponin (4,379 mg/g ở rễ củ và 5,340 mg/g ở lá) và của cellulose (21,080% ở rễ củ và 24,820% ở lá) được xác định trong các mẫu phân bố ở vùng núi Thiên Thọ. 22 3. Dịch chiết nước của Sâm cau có tác dụng chống lại sự tăng sinh của các tế bào ung thư dạ dày dòng MKN45 (IC50 = 221,9 μg/mL ở nồng độ 1.000 μg/mL). Dịch chiết nước từ rễ củ còn có tác dụng tốt đến quá trình sinh tinh, kích thích sản xuất hormone sinh dục, nồng độ testosterone ở chuột bị stress nhiệt tăng lên (2,885 nmol/L) so với chuột không được uống dịch chiết (0,196 nmol/L) ở liều dùng 400 mg/kg thể trọng; đồng thời tác dụng đến quá trình phân chia và biệt hoá, phát triển của các tế bào dòng tinh theo hướng tích cực. KIẾN NGHỊ 1. Cần triển khai và mở rộng phạm vi nghiên cứu, so sánh các đặc điểm sinh học của cây Sâm cau tại Thừa Thiên Huế với các xuất xứ khác ở trong và ngoài nước. 2. Cần nghiên cứu sâu hơn nữa về tầm ảnh hưởng của cây Sâm cau đến các cơ chế, con đường dẫn truyền tín hiệu đối với các quá trình sinh học.