Tóm tắt Luận án Nghiên cứu phát hiện các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ một số chủng xạ khuẩn biển thuộc chi streptomyces

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ----------------------------- CAO ĐỨC TUẤN NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN CÁC HỢP CHẤT THỨ CẤP CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG VI SINH VẬT KIỂM ĐỊNH PHÂN LẬP TỪ MỘT SỐ CHỦNG XẠ KHUẨN BIỂN THUỘC CHI STREPTOMYCES Chuyên ngành: Hóa hữu cơ Mã số: 9.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỮU CƠ Hà Nội – 2020 Công trình được hoàn thành tại: Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Đoàn Thị Mai Hương Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Lê Thị Hồng Minh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án tiến sĩ cấp Học viện, họp tại Học viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam vào hồi giờ ..’, ngày tháng năm 201. Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Học viện Khoa học và Công nghệ - Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của luận án Các sản phẩm tự nhiên đã được sử dụng làm thuốc chữa bệnh, chất gây nghiện hay chất độc từ trước đây rất lâu (Marderosian, 1969). Đến nay, các hợp chất tự nhiên, hầu hết có nguồn gốc từ lục địa, là nguồn đóng góp nhiều nhất cho công nghiệp dược phẩm (Harvey, 2000). Mặc dù các đại dương chiếm khoảng 70% diện tích bề mặt trái đất, được đánh giá có độ đa dạng sinh học cao, song các nghiên cứu về hợp chất tự nhiên từ biển chỉ phát triển mạnh trong thời gian gần đây (Fattorusso, 2012). Đã có hơn 30.000 hợp chất tự nhiên từ đại dương đã được xác định với cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng (Hu, 2011). Trong số đó, một số hợp chất có cấu trúc tương đồng với các hợp chất thứ cấp có nguồn gốc từ vi sinh vật. Điều này gợi ý có thể vi sinh vật đã tham gia vào quá trình sinh tổng hợp hoặc chính các vi sinh vật là nguồn sản xuất ra các hợp chất này (Molinski, 2009). Hơn nữa, nghiên cứu các hợp chất thứ cấp từ vi sinh vật biển có ưu điểm là chỉ yêu cầu thu một lượng mẫu tự nhiên nhỏ, từ đó tiến hành phân lập vi sinh vật và sinh khối lượng lớn trong phòng thí nghiệm, giúp tạo ra được lượng mẫu đủ lớn để thực hiện nghiên cứu về đặc điểm hoá học và hoạt tính sinh học. Việt Nam nằm trong khu vực Thái Bình Dương với hệ sinh vật biển đa dạng và phong phú, có tiềm năng to lớn về tài nguyên biển. Chính phủ Việt Nam đã có định hướng phát triển kinh tế biển, khai thác tài nguyên thiên nhiên và nghiên cứu các sản phẩm tự nhiên từ biển (Nguyễn Phú Trọng, 2018). Bên cạnh đó, Việt Nam hiện là một trong những nước có tỷ lệ kháng kháng sinh cao trên thế giới, đặc biệt, một số vi khuẩn gây ra những bệnh truyền nhiễm có khả năng lây lan cao trong cộng đồng để lại những hệ quả nặng nề về sức khoẻ và kinh tế (WHO, 2014). Vì vậy, việc tìm kiếm các thuốc chữa bệnh nhiễm khuẩn, có nguồn gốc từ biển với hiệu quả cao hơn, giá thành rẻ hơn và quan trọng nhất là có thể chủ động, tự sản xuất trong nước là một yêu cầu rất cấp thiết. Từ những lý do trên, đề tài: “Nghiên cứu phát hiện các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định phân lập từ một số chủng xạ khuẩn biển thuộc chi Streptomyces” đã được lựa chọn, thực hiện. 2 2. Mục tiêu nghiên cứu của luận án Phát hiện các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) từ một số chủng xạ khuẩn phân lập được từ vùng biển Việt Nam, cụ thể là: - Phân lập, sàng lọc và xác định một số chủng xạ khuẩn có hoat tính kháng VSVKĐ có nguồn gốc từ biển Việt Nam. - Phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất thứ cấp từ dịch nuôi cấy 2 chủng xạ khuẩn tiềm năng và khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ của các hợp chất thứ cấp phân lập được, làm cơ sở khoa học cho việc định hướng nghiên cứu ứng dụng các hợp chất có hoạt tính tốt cũng như 2 chủng xạ khuẩn nghiên cứu một cách hiệu quả. 3. Các nội dung nghiên cứu chính của luận án 1. Phân lập và nuôi cấy một số chủng xạ khuẩn biển Việt Nam từ trầm tích, hải miên và một số sinh vật biển khác; 2. Thử hoạt tính kháng VSVKĐ cặn chiết của các chủng xạ khuẩn biển phân lập được và lựa chọn 2 chủng xạ khuẩn biển có hoạt tính tốt để định danh, lên men sinh khối lượng lớn; 3. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ 2 chủng xạ khuẩn biển đã lên men sinh khối lượng lớn; 4. Xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất thứ cấp phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học; 5. Đánh giá hoạt tính sinh học kháng VSVKĐ của các hợp chất thứ cấp phân lập được từ chủng xạ khuẩn nghiên cứu. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Tài nguyên sinh vật biển 1.2. Xạ khuẩn (Actinomycetes) 1.2.1. Phân loại xạ khuẩn 1.2.2. Chi xạ khuẩn Streptomyces 1.2.3. Thuốc kháng sinh có nguồn gốc từ chi Streptomyces 1.3. Các hợp chất thứ cấp có hoạt tính kháng vi sinh vật từ chi Streptomyces biển 1.3.1. Các nghiên cứu trên thế giới 3 1.3.1.1. Streptomyces phân lập từ trầm tích biển 1.3.1.2. Streptomyces biển có nguồn gốc từ động vật thân mềm 1.3.1.3. Streptomyces biển có nguồn gốc khác 1.3.1.4. Một số hợp chất kháng vi sinh vật phát triển bằng phương pháp khai thác bộ gene xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (Genome mining) 1.3.2. Các nghiên cứu trong nước CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và hóa chất nghiên cứu 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp thu thập mẫu 2.2.2. Phương pháp phân lập xạ khuẩn biển từ các mẫu sinh vật và trầm tích biển (Williams, 1965; Williams, 1971; Vũ Thị Minh Đức, 2001) 2.2.3. Phương pháp làm sạch xạ khuẩn và lưu giữ giống sau phân lập ( Vũ Thị Minh Đức, 2001; Nguyễn Lân Dũng, 2003) 2.2.4. Phương pháp hoạt hóa và nuôi cấy xạ khuẩn (Vũ Thị Minh Đức, 2001; Nguyễn Lân Dũng, 2003) 2.2.5. Phương pháp tạo cặn chiết từ dịch nuôi cấy xạ khuẩn (Carlson, 2014; Tanouye, 2015) 2.2.6. Phương pháp định danh xạ khuẩn (Holt, 1989; Sambrook, 1989; Weisburg, 1991; Li, 2007) 2.2.7. Phương pháp lên men xạ khuẩn (quy mô 50 L) (Basilio, 2003; Nguyễn Văn Cách, 2004) 2.2.8. Phương pháp phân lập các hợp chất thứ cấp 2.2.9. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được 2.2.10. Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định (Hadacek, 2000) CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Kết quả thu mẫu Từ các thiết bị và phương pháp thu thập mẫu đã nêu, chúng tôi đã thu được 23 mẫu biển bao gồm: 4 - 09 mẫu thu nhận ở vùng biển Quảng Bình (2 mẫu trầm tích, 3 mẫu rong, 3 mẫu san hô mềm và 1 mẫu hải miên). - 14 mẫu thu nhận ở vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam (5 mẫu trầm tích, 2 mẫu san hô mềm, 1 mẫu hải miên, 2 mẫu da gai, 2 mẫu thỏ biển, 1 mẫu đuôi rắn và 1 mẫu thân mềm). 3.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn Từ 23 mẫu biển đã thu nhận ở 2 vùng biển Quảng Bình và Cù Lao Chàm, Quảng Nam, 35 chủng xạ khuẩn có hình thái và màu sắc khuẩn lạc khác nhau đã được phân lập. 3.3. Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các chủng xạ khuẩn đã phân lập 35 chủng xạ khuẩn đã phân lập được nuôi cấy lượng nhỏ (500 mL), tạo cặn chiết và thử hoạt tính kháng VSVKĐ. Kết quả (Bảng 4.1) cho thấy 24/35 chủng đã phân lập có tính kháng VSVKĐ, trong đó có 4/35 chủng có hoạt tính kháng từ 4 chủng VSVKĐ trở lên. Hai chủng G212 và G278 (kháng 5 chủng VSVKĐ), đại diện hai vùng biển nghiên cứu, được lựa chọn để thực hiện các nghiên cứu tiếp theo. 3.4. Kết quả định danh chủng xạ khuẩn G212 và G278 3.4.1. Quan sát đặc điểm hình thái các chủng nghiên cứu 3.4.2. Định danh các chủng nghiên cứu bằng trình tự gene 16S rRNA 3.4.2.1. Tách DNA tổng số các chủng nghiên cứu 3.4.2.2. Nhân gene 16S rRNA 3.4.2.3. Kết quả giải trình tự gene 16S rRNA Từ trình tự gene 16S rRNA của hai chủng G212 và G278, thực hiện so sánh với dữ liệu đã được công bố trên ngân hàng gene, kết hợp với cây phát sinh chủng loại, cho thấy hai chủng G212 và G278 có mối quan hệ gần gũi với các chủng thuộc chi Streptomyces. Trình tự gene 16S rRNA của 2 chủng G212 và G278 đã được đăng ký trên ngân hàng gene quốc tế với mã số tương ứng là MF187963 và MF960781. 3.5. Kết quả sinh khối lượng lớn hai chủng xạ khuẩn G212 và G278 Thực hiện lên men lượng lớn quy mô 50L đã thu nhận được 50L dịch nuôi cấy 2 chủng xạ khuẩn G212 và G278. 5 3.6. Kết quả phân lập các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G212 3.6.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết Đã tạo được hai cặn chiết EtOAc (EG212) và n-BuOH (BG212), từ dịch nuôi cấy (50L) của chủng Streptomyces sp. G212, với khối lượng tương ứng là 2,2 g và 21,4 g. 3.6.2. Phân lập hợp chất thứ cấp từ các cặn chiết chủng Streptomyces sp. G212 3.6.2.1. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ cặn chiết EtOAc (EG212) Từ cặn chiết EG212 (2,2 g), đã phân lập được 10 hợp chất là G212-1 (5 mg), G212-2 (6 mg), G212-3 (5 mg), G212-4 (7 mg), G212-5 (12 mg), G212-6 (7 mg), G212-7 (6 mg), G212-8 (8 mg), G212-9 (8 mg) và G212- 10 (6 mg). 3.6.2.2. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ cặn chiết n-BuOH (BG212) Từ cặn chiết BG212 (21,4 g), đã phân lập được 6 hợp chất là G212-11 (7 mg), G212-12 (13 mg), G212-13 (5 mg), G212-14 (6 mg), G212-15 (10 mg) và G212-16 (5 mg). 3.6.3. Hằng số vật lí và dữ liệu phổ của các hợp chất thứ cấp phân lập được từ chủng Streptomyces sp. G212 3.6.4. Tổng hợp hợp chất G212-2 và G212-3 Để khẳng định cấu trúc hóa học của 2 hợp chất mới 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G212-2) và 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3), chúng tôi đã tổng hợp toàn phần 2 hợp chất này từ hai hợp chất thương mại tương ứng là 2,4-dichlorobenzoyl chloride và 2,3- dimethoxybenzoic acid. 3.6.4.1. Tổng hợp hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G212- 2 TH) 3.6.4.2. Tổng hợp hợp chất 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) và đồng phân G212-6’ 3.7. Kết quả phân lập các hợp chất thứ cấp từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G278 3.7.1. Xử lý mẫu, tạo cặn chiết 6 Đã tạo được hai cặn chiết EtOAc (EG278) và n-BuOH (BG278), từ dịch nuôi cấy (50L) của chủng Streptomyces sp. G278, với khối lượng tương ứng là 3,26 g và 22,4 g. 3.7.2. Phân lập hợp chất thứ cấp từ các cặn chiết chủng Streptomyces sp. G278 3.7.2.1. Phân lập các hợp chất thứ cấp từ cặn chiết EtOAc (EG278) Từ cặn chiết EG278 (3,26 g), đã phân lập được 6 hợp chất (Hình 3.13) là G278-1 (6 mg), G278-2 (7 mg), G278-3 (5 mg), G278-4 (10 mg), G278- 5 (6 mg), G278-6 (6 mg). 3.7.2.2. Phân lập các chất thứ cấp từ cặn chiết n-BuOH (BG278) Từ cặn chiết BG278 (22,4 g), đã phân lập được 10 hợp chất (Hình 3.14) là G278-7 (7 mg), G278-8 (6 mg), G278-9 (5 mg), G278-10 (8 mg), G278- 11 (6 mg), G278-12 (20 mg), G278-13 (6 mg), G278-14 (10 mg), G278-15 (8,5 mg), G278-16 (5 mg). 3.7.3. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập từ chủng Streptomyces sp. G278 3.8. Hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được (Xem Bảng 4.33 và Bảng 4.34) CHƯƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Kết quả thu mẫu Tổng số 23 mẫu đã thu thập được bao gồm: 9 mẫu thu nhận ở Quảng Bình và 14 mẫu thu nhận ở Cù Lao Chàm, Quảng Nam. Số lượng mẫu ở các vùng khác nhau là khác nhau, tương ứng với sự đa dạng các loại sinh vật biển khác nhau trong các đợt thu mẫu để thực hiện luận án này. 4.2. Kết quả phân lập các chủng xạ khuẩn Từ 9 mẫu thu nhận ở khu vực biển Quảng Bình và 14 mẫu thu nhận ở vùng biển Cù Lao Chàm, Quảng Nam có tương ứng 15 và 20 chủng xạ khuẩn đã được phân lập. 4.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của các chủng thu được Kết quả thử hoạt tính kháng VSVKĐ của cặn chiết thô dịch nuôi cấy 35 chủng XK (Bảng 4.1) cho thấy 24/35 (68,6 %) chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ, trong đó có 4/35 (11,4 %) chủng có hoạt tính kháng từ 4 chủng 7 VSVKĐ trở lên; 11/35 (31,4 %) chủng phân lập kháng nấm kiểm định khá mạnh (MIC 2 – 64 µg/mL). Ngoài ra, có 15/35 (42,8%) chủng thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ Gram dương trong khi chỉ có 6/35 (17,1%) chủng thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ Gram âm. Bảng 4.1. Giá trị MIC (µg/mL) các chủng xạ khuẩn biển phân lập được. (* Chỉ thể hiện kết quả đối với các chủng có hoạt tính kháng VSVKĐ) TT Chủng (*) Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL) Gram dương Gram âm Nấm E. faecalis ATCC29212 S. aureus ATCC25923 B. cereus ATCC14579 E. coli ATCC25922 P. aeruginosa ATCC27853 S. enterica ATCC13076 C.albicans ATCC10231 15 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Quảng Bình 1 G183 - - 128 - - - - 2 G193 - - - - - - 64 3 G196 - - - 64 - - - 4 G197 - - 128 - - - - 5 G202 - - - 128 - - - 6 G207 128 - - - - - - 7 G212 128 - 128 - 64 256 256 8 G214 - - 128 - - - - 9 G216 - 256 - - - - - 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ vùng biển Cù Lao Chàm – Quảng Nam 1 G274 256 - - - - - - 2 G275 - - - - - - - 3 G276 256 - - - - - 8 4 G277 - - - - - - 256 5 G278 256 32 - 16 - 16 2 6 G280 256 - 256 16 32 - 32 7 G283 128 - - - - - - 8 G284 256 256 - - - - - 9 G285 - - - - - - 32 10 G288 - - - - - - 32 11 G289 - - - - - - 32 12 G290 - - 32 - 16 8 16 13 G291 - 128 - - - - - 14 G292 - - - - - - 32 15 G293 256 - - - - - - S 256 256 128 32 256 128 - C 32 (S: Streptomycine; C: Cyclohexamide; (-): giá trị MIC > 256 µg/mL) 8 4.4. Kết quả định danh các chủng xạ khuẩn G212, G278 Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng G212 có độ tương đồng (99,57%) so với chủng Streptomyces caelestis JS-5 (mã số EU124773) và (99,64%) so với chủng Streptomyces caelestis JS-4 (mã số EU124772). Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng G278 có độ tương đồng (99,86%) so với chủng Streptomyces sp. R1 (mã số MK757961) 4.5. Kết quả sinh khối lượng lớn chủng xạ khuẩn G212 và G278 Đã lên men thành công lượng lớn (50 L) cho các chủng G212 và G278 để tiếp tục các nghiên cứu tiếp theo. 4.6. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G212 Từ dịch nuôi cấy của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G212, đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất (Hình 4.31) trong đó có 2 chất mới (G212-2 và G212-3) và 1 chất lần đầu phân lập từ tự nhiên (G212-1): 1 hợp chất polyethylene terephthalate là ethylene terephthalate cyclic trimer (G212-1), 1 dẫn xuất dichlorophenyl là 2,4-dichlorophenyl 2,4- dichlorobenzoate (G212-2), 1 dẫn xuất phthalite là 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3), 2 hợp chất kháng sinh germicidine A (G212-4), germicidine B (G212-5), 1 dẫn xuất benzopyridine là 3,4-dihydroxy-6,7- dimethyl-quinolin-2-carboxylic (G212-9), 3 hợp chất cyclopeptide là cyclo- (Pro-Val) (G212-10), cyclo-(Pro-Tyr) (G212-11), cyclo-(Leu-trans-4- hydroxy-Pro) (G212-12), 2 dẫn xuất của nucleic acid là 2’-deoxythymidine (G212-7), 2’-deoxyuridine (G212-8), 2 hợp chất indol là N-[2-(1H-indol-3- yl)-2-oxo-ethyl] acetamide (G212-13), indole-3-carboxylic acid (G212-14) và các hợp chất 5-hydroxymethyl-4-hydroxy-2,4-dimethyl-2- cyclopentenone (G212-6), 1H-pyrrole-2-carboxylic acid (G212-15), 2- phenylacetic acid (G212-16). Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất mới (G212-2 và G212-3) được khẳng định bằng phương pháp tổng hợp toàn phần. Dưới đây trình bày tóm tắt phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất G212-1, G212-2 và G212-3. 9 Hình 4.31. Các hợp chất phân lập được từ chủng G212 4.6.1. Hợp chất Ethylene terephthalate cyclic trimer (G212-1) Hợp chất G212-1 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS cho pic ion giả phân tử ở m/z 577,1349 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C30H25O12, m/z: 577,1346). Kết hợp với dữ liệu phổ NMR cho phép xác định CTPT của hợp chất G212-1 là C30H24O12. Phổ IR của G212-1 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm carbonyl (νmax 1729 cm-1) và vòng thơm (νmax 1578 và 1457 cm-1). Trên phổ 1H-NMR của G212-1 chỉ xuất hiện 2 tín hiệu singlet ở H 8,10 và 4,69. Trên phổ 13C-NMR và DEPT của G212-1 xuất hiện các tín hiệu cộng hưởng của 1 nhóm carbonyl ở C 165,3; 1 nhóm methylene ở C 62,7; 1 nhóm methine vòng thơm ở C 129,7 và 1 carbon không liên kết trực tiếp với hydro ở C 133,8. Độ chuyển dịch hóa học của nhóm methylene (H 4,69; C 62,7) gợi ý liên kết của nhóm gắn trực tiếp với nguyên tử oxy. 10 Bảng 4.2. Dữ liệu NMR của hợp chất G212-1 và hợp chất tham khảo. C G212-1 Poly(ethylene terephthalate) δHa,c độ bội (J, Hz) δCa,d δC a,e,# 1 - 165,3 168 2 - 133,8 134 3 8,10 s 129,7 130 4 4,69 s 62,7 64 a trong CDCl3, b trong DMSO-d6, c 500 MHZ, d 125 MHz; e 75 MHz, # C của Poly(ethylene terephthalate) (Kint, 2003). Các dữ liệu phổ HR-ESI-MS, NMR đặc trưng cho hợp chất có cấu trúc đối xứng tương tự như các hợp chất polyethylene terephthalate (Štokr, 1982; Backson, 1995). Điều này cũng được khẳng định trên phổ HMBC giữa tương tác xa của proton vòng thơm và proton của nhóm methylene với nhóm carbonyl và với carbon của chính nhóm này. Căn cứ vào độ bội của G212-1 và CTPT C30H24O12, kết hợp với dữ liệu phân tích từ phổ X-ray, hợp chất G212-1 này được xác định là ethylene terephthalate cyclic trimer. Đây là một hợp chất lần đầu tiên phân lập từ tự nhiên, hợp chất này đã được báo cáo trước đó dưới dạng dẫn xuất tổng hợp (Kint, 2003). Hình 4.4. Tương tác HMBC và cấu trúc tinh thể X-ray của G212-1 4.6.2. Hợp chất 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G212-2) Hợp chất G212-2 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS của hợp chất G212-2 cho pic ion giả phân tử ở m/z 334,9194 [M+H]+ (cùng với các mảnh đồng vị của nguyên tử clo ở m/z 334,9194; 336,9167 và 338,9141). Từ dữ liệu phổ HR-ESI-MS kết hợp với phổ 13C-NMR cho phép xác định CTPT của chất G212-2 là C13H6Cl4O2. Phổ 1H-NMR và phổ COSY của hợp chất G212-2 cho tín hiệu của 2 hệ vòng thơm ABX [vòng A: H 7,40 (dd, J = 2,0; 8,5 Hz, H-5); 7,57 (d, J = 2,5, H- 11 3); 8,11 (dd, J = 8,5 Hz, H-6), và vòng B: H 7,23 (d, J = 8,5 Hz, H-6'); 7,32 (dd, J = 2,5; 8,5 Hz, H-5'); 7,50 (d, J = 2,5 Hz, H-3')]. Phân tích phổ 13C- NMR cùng với sự trợ giúp của phổ HSQC của hợp chất G212-2 đã chỉ ra sự có mặt của 13 nguyên tử carbon, bao gồm một nhóm carbonyl ở C 161,7; sáu nhóm methine sp2 ở C 124,6 (C-5'), 127,3 (C-6), 128,1 (C-6'), 130,3 (C- 3'), 131,5 (C-3), 133,3 (C-5) và 6 carbon không liên kết trực tiếp với hydro ở C 126,4 (C-1), 127,9 (C-2'), 132,4 (C-4'), 136,2 (C-4), 139,7 (C-2), 145,5 (C-1'). Bảng 4.3. Dữ liệu NMR của hợp chất G212-2 và hợp chất tổng hợp C G212-2 G212-2 TH δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c δH a,b,# độ bội (J, Hz) 1 - 126,4 - 2 - 139,7 - 3 7,57 d (2,5) 131,5 7,56 d (2.0) 4 - 136,2 5 7,40 dd (2,0; 8,5) 133,3 7,39 dd (2,0; 8,5) 6 8,11 d (8,5) 127,3 8,11 d (8,5) 7 - 161,7 1' - 145,5 2' - 127,9 3' 7,50 d (2,5) 130,3 7,50 d (2.5) 4' - 132,4 5' 7,32 dd (2,5; 8,5) 124,6 7,31 dd (2,5; 8,5) 6' 7,23 d (8,5) 128,1 7,23 d (8,5) a trong CDCl3, b 500 MHZ, c 125 MHz, #H của G212-2 TH Phổ COSY của G212-2 cho phép xác định 2 hệ tương tác spin-spin: H- 5/H-6 và H-5'/H-6' (Hình 4.10). Các mảnh cấu trúc sau đó được kết nối nhờ phân tích phổ HMBC. Trên phổ HMBC của hợp chất G212-2 cho thấy tương tác giữa H-5 (H 7,40) với C-3 (C 131,5), C-1 (C 126,4); tương tác giữa H- 3 (H 7,57) với C-1 (C 126,4), C-2 (C 139,7), C-4 (C 136,2); giữa H-6 (H 8,11) với C-2 (C 139,7), C-4 (C 136,2) xác nhận cấu trúc của vòng A bị thế ở 3 vị trí. Tương tác HMBC giữa H-3' (H 7,50) với C-1' (C 145,5), C-2' (C 127,9), C-4' (C 132,4); giữa H-5' với C-1' (C 145,5), C-3' (C 130,3), C-4' (C 132,4); giữa H-6' với C-1' (C 145,5), C-2' (C 127,9), C-4' (C 132,4) xác nhận cấu trúc của vòng B. Trên phổ HMBC (Hình 4.10) xuất hiện tương tác 12 xa của proton H-6 (H 8,11) với carbon carbonyl (C 161,7) khẳng định sự liên kết của nhóm carbonyl với vòng A. Độ chuyển dịch hóa học của C-1' (C 145,5) gợi ý sự liên kết của carbon này với nguyên tử oxy. Dựa vào CTPT của C13H6Cl4O2 và các dữ liệu phổ 2D-NMR, cấu trúc của G212-2 được xác định là 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate. Tuy nhiên, liên kết este giữa vòng A và vòng B chưa được khẳng định rõ ràng trên phổ HMBC nên cấu trúc của hợp chất G212-2 được khẳng định lại bằng phản ứng tổng hợp giữa 2,4-dichloro-benzoyl chloride và 2,4-dichlorophenol (Hình 4.11). Phản ứng được thực hiện ở 0 oC đến nhiệt độ phòng với sự có mặt của Et3N. Phổ 1H NMR của sản phẩm tổng hợp được (G212-2 TH) giống hệt với hợp chất tách từ tự nhiên G212-2 (Bảng 4.3). Như vậy hợp chất G212-2 được xác định là 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate và đây là một hợp chất mới. Hình 4.10. Một số tương tác chính trên phổ COSY và HMBC của G212-2 Hình 4.11. Phản ứng tổng hợp tạo thành G212-2 TH 4.6.3. Hợp chất 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) Hợp chất G212-3 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối phân giải cao của G212-3 xuất hiện pic ion giả phân tử ở m/z 181,0496 [M+H]+, tính toán lý thuyết cho CTPT C9H9O4, 181,0501. Kết hợp với dữ liệu phổ 13C-NMR cho phép xác định CTPT của G212-3 là C9H8O4. Phổ hồng ngoại của G212-3 có các đỉnh hấp thụ đặc trưng cho nhóm hydroxy (νmax 3475 cm-1) và nhóm chức carbonyl (νmax 1717 cm-1). Trên phổ một chiều (1H-NMR và 13C-NMR) của G212-3 xuất hiện tín hiệu của 1 nhóm methyl (H 2,38, C 16,0), 1 nhóm methylene (H 5,13, C 66,7), 1 nhóm methin sp2 (H 6,72, C 118,4), 5 carbon vòng thơm không 13 liên kết trực tiếp với hydro (C 113,5, 130,1, 134,7, 137,1 và 150,6) và 1 nhóm carbonyl (C 170,9). Độ chuyển dịch hóa học của các carbon C-3 (C 66,7), C-4 (C 137,1) và C-5 (C 150,6) cho phép dự kiến các carbon này gắn trực tiếp với nguyên tử oxy. Trên phổ HMBC của G212-3 (Hình 4.16) cho thấy tương tác xa giữa H-6 (H 6,72) với C-4 (C 137,1), C-5 (C 150,6), C-7 (C 130,1), C-7a (C 113,5) và C-8 (C 16,0). Tương tác giữa proton của nhóm methyl CH3-8 (H 2,38) với C-6 (C 118,4), C-7 (C 130,1), C-7a (C 113,5) cho phép xác định vòng A của hợp chất G212-3 và nhóm methyl CH3-8 gắn với vòng A ở vị trí C-7. Tương tác giữa proton của nhóm methylene CH2-3 (H 5,13) với carbon C=O (C 170,9), C-4 (C 137,1), C-3a (C 134,7), C-7a(C 113,5), C-7 (C 130,1) cho phép xác định vòng lactone B. Từ các dữ liệu phổ HMBC trên cho phép xác định đây là 1 dẫn xuất phthalite. Tuy nhiên, như đã trình bày ở trên, phổ HMBC của hợp chất G212-3 cho thấy proton của nhóm CH2-3 (H 5,13) tương tác với cả 2 carbon C-4 (C 137,1) và C-7 (C 130,1) nên có 2 khả năng về cấu trúc của hợp chất này ở vòng lactone B (Hình 4.12). Hình 4.12. Hai khả năng về cấu trúc của G212-3 Hình 4.16. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G212-3 Bảng 4.4. Dữ liệu NMR của G212-3 và hợp chất tổng hợp (G212-3 TH) C G212-3 G212-3 TH δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c δH a,b,# độ bội (J, Hz) 1 - 170,9 3 5,13 s 66,7 5,13 s 3a - 134,7 14 C G212-3 G212-3 TH δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c δH a,b,# độ bội (J, Hz) 4 - 137,1 5 - 150,6 6 6,72 s 118,4 6,72 s 7 - 130,1 7a - 113,5 8 2,38 s 16,0 2,38 s a trong DMSO-d6, b 500 MHZ, c 125 MHz, #H của hợp chất G212-3 TH Để khẳng định cấu trúc của hợp chất phân lập được cũng như để có thể có thêm chất phục vụ cho việc thử hoạt tính sinh học, chúng tôi tiến hành tổng hợp toàn phần hợp chất G212-3 và đồng phân G212-6′. Quy trình tổng hợp được trình bày trong Hình 4.17. đi từ hợp chất thương mại 2,3- dimethoxy benzoic acid qua 5 bước chính. Ngoài ra để phân biệt chính xác cấu trúc của 2 đồng phân G212-4′ và G212-5′, hợp chất G212-4′ được tổng hợp qua 1 bước từ hợp chất halogen hóa G212-1′. (a) HCHO, HCl đặc, 60-70 oC, 80%; (b) LiAlH4, THF, 72%; (c) i, KMnO4, NaOH, H2O; ii, Ac2O, 55% 2 bước; (d) LiAlH4, THF, 77%; (e) H2, Pd/C, THF, 97%; (f) BBr3, CH2Cl2, 0 oC - RT, 89%; (g) BBr3, CH2Cl2, 0oC-RT, 87%. Hình 4.17. Sơ đồ tổng hợp G212-3 TH và đồng phân G212-6′ 15 Tổng hợp 4-(chloromethyl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (G212-1′) Hợp chất thương mại 2,3-dimethoxy benzoic acid được biến đổi thành dẫn xuất phthalide G212-1′ với việc sử dụng HCl đặc và paraformaldehhyde ở nhiệt độ 60-70 oC trong 3 giờ với hiệu suất thu được là 80% (Bhattacharjee, 1980). Trên phổ 1H-NMR và 13C-NMR của G212-1′ cho tín hiệu của 1 nhóm carbonyl ở C 168,1, 1 nhóm methine (C 119,8, H 7,20), 2 nhóm methoxy (C 57,1; 62,5, H 3,93; 4,11), 2 nhóm methylene và 5 carbon không liên kết trực tiếp với hydro. Từ các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất thu được là dẫn xuất phthalide G212-1′. Tổng hợp 3,4-dimethoxy-6-methyl-1,2-phenylene dimethanol (G212-2′): Hợp chất G212-1′ sau đó được khử thành ancol G212-2′ sử dụng LiAlH4 trong dung môi THF cho hiệu suất 72% (Ying, 2011). So với hợp chất G212-1′, phổ 1H-NMR và 13C-NMR của G212-2′ thấy mất đi tín hiệu của nhóm carbonyl và xuất hiện thêm tín hiệu của 1 nhóm methyl ở C 19,6, H 2,39. Từ các dữ liệu phổ trên cho phép xác định hợp chất G212-2′ đã được mở vòng lactone tạo alcol. Tổng hợp 4,5-dimethoxy-7-methylisobenzofuran-1,3-dione (G212-3′) Quá trình oxy hóa đóng vòng hợp chất G212-2′ qua 2 bước, đầu tiên cho G212-2′ tác dụng với bằng KMnO4 cho sản phẩm acid, sau đó sản phẩm acid thô được đun hồi lưu với 5 mL Ac2O trong vòng 30 phút cho hợp chất phthalic anhydride G212-3′ với hiệu suất đạt 55%. So với hợp chất G212- 16 2′, phổ 1H-NMR và 13C-NMR của G212-3′ thấy mất đi tín hiệu của 2 nhóm methylene, thay vào đó là tín hiệu của 2 nhóm carbonyl ở C 162,6 và 160,9. Từ các dữ liệu phổ trên cho phép xác định cấu trúc của hợp chất G212-3′. Tổng hợp hợp chất G212-4′ và G212-5′ Hợp chất G212-3′ được khử hóa với LiAlH4 cho hỗn hợp 2 đồng phân G212-4′ và G212-5′ với tỉ lệ là 1:2. Hai đồng phân này được phân tách dễ dàng trên cột silica gel với hệ dung môi n-hexane/ EtOAc gradient. Trên phổ NMR của 2 hợp chất G212-4′ và G212-5′ đều cho tín hiệu của 1 nhóm methyl, 1 nhóm carbonyl, 1 nhóm methin, 2 nhóm methoxy và 5 carbon không liên kết trực tiếp với hydro. Phổ HMBC của chất G212-5′ (Hình 4.19) cho tương tác giữa proton của nhóm methyl 10 với carbon C-7a, là carbon gắn trực tiếp với nhóm carbonyl ở C 116.1, cho phép dự đoán cấu trúc của chất G212-5′, tuy nhiên cũng nhìn thấy tương tác của nó với C-3a và C-4. Do đó, để phân biệt chính xác cấu trúc của 2 đồng phân G212-4′ và G212- 5′, hợp chất G212-4′ đã được tổng hợp qua 1 bước từ hợp chất halogen hóa G212-1′ thông qua quá trình hydro hóa có sử dụng xúc tác Pd/C. Sau khi so sánh dữ liệu phổ NMR của hợp chất G212-4′ được tổng hợp từ hợp chất halogen hóa G212-1′ với dữ liệu phổ của 2 đồng phân G212-4′ và G212-5′ được tổng hợp từ hợp chất G212-3′ (Bảng 4.5), chúng tôi xác định được chính xác cấu trúc của 2 đồng phân G212-4′ và G212-5′. Hình 4.19. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G212-5′ 17 Bảng 4.5. Dữ liệu NMR của hợp chất G212-4′ và G212-5′ C G212-4′ tổng hợp từ G212-3′ G212-4′ tổng hợp từ G212-1′ G212-5′ δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c δH a,b độ bội (J, Hz) δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c 1 - 169,0 - - 170,8 3 5,12 s 68,0 5,12 s 5,24 66,7 3a - 137,8 - - 138,8 4 - 120,6 - - 140,7 5 7,02 s 117,6 7,02 s - 156,0 6 - 152,5 - 6,81 s 116,1 7 - 146,5 - - 136,0 7a - 126,8 - - 115,3 8 4,05 s 62,3 4,05 s 3,90 s 56,3 9 3,90 s 57,0 3,90 s 3,95 s 60,4 10 2,26 s 17,2 2,26 s 2,63 17,1 a trong CDCl3, b 500 MHz, c 125 MHz. Tổng hợp hợp chất G212-3 và G212-6′ Cuối cùng, cho từng hợp chất G212-4′ và G212-5′ phản ứng với BBr3 thu được hợp chất G212-3 tổng hợp (G212-3 TH) và G212-6′ với hiệu suất từ 87-89 %. So sánh dữ liệu phổ của hợp chất tách từ tự nhiên G212-3 với hợp chất tổng hợp G212-3 TH thấy dữ liệu phổ trùng khớp, như vậy hợp chất G212-3 chính là 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide. Hợp chất G212-3 và đồng phân tổng hợp được G212-6′ đều là các hợp chất mới. 18 Bảng 4.6. Dữ liệu NMR hợp chất G212-3 TH và G212-6′ C G212-3 TH G212-6′ δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c 1 170,9 169,8 3 5,13 s 66,7 5,11 s 68,1 3a 134,7 136,4 4 137,1 123,1 5 150,6 6,92 s 121,8 6 6,72 s 113,5 142,7 7 118,4 145,3 7a 111,5 111,5 8 2,38 16,0 2,08 s 16,4 OH-6 - 9,32 s - OH-7 - 9,67 s - a trong DMSO-d6, b 500 MHZ, c 125 MHz 4.7. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất thứ cấp phân lập từ chủng xạ khuẩn Streptomyces sp. G278 Hình 4.49. Các hợp chất phân lập được từ chủng G278 19 Từ dịch ngoại bào của chủng vi sinh vật Streptomyces sp. G278, đã phân lập và xác định cấu trúc của 16 hợp chất (Hình 4.49), trong đó có 6 hợp chất cyclodipeptide là cyclo-(Pro-Gly) (G278-1), cyclo-(Pro-Leu) (G278-2), cyclo-(Pro-Phe) (G278-3), cyclo (Pro-Tyr) (G278-4), cyclo-(Leu-Tyr) (G278-5), cyclo-(Pro-Trp) (G278-6), 1 hợp chất indol là 1H-indole-3- ethanol (G278-7) 1 hợp chất coumarin là scopoletin (G278-8), 1 hợp chất nucleoside là adenosine (G278-11), 1 hợp chất dioxan là 2-((-5-methyl-1,4- dioxan-2-yl)methoxy)ethanol (G278-12) và các hợp chất phenolic khác như benzyl salicylate (G278-9), N-phenylnaphthalen-2-amine (G278-10), N-(4- hydroxyphenylethyl)acetamide (G278-13), 2,4-dichlorophenyl 2,4- dichlorobenzoate (G278-14), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15), 3-hydroxyl-2-methylpyridine (G278-16). Trong đó có 2 hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên là G278-15 và G278-16. Dưới đây trình bày tóm tắt phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất G278-15 và G278-16. 4.7.15. Hợp chất 2,5-Bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15) Hợp chất G278-15 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối phân giải cao của G278-15 thể hiện pic ion giả phân tử ở m/z 431,1785 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C26H27N2O2S, m/z: 431,1793), kết hợp với dữ liệu phổ 13C-NMR cho CTPT là C26H26N2O2S, tương ứng với độ bội là 15. Phổ hồng ngoại của hợp chất G278-15 chỉ ra các tín hiệu dao động của các nhóm chức C=N (1635, 1581 cm-1) và C-O (1266, 1195 cm-1). Thêm vào đó, sự có mặt của nguyên tử lưu huỳnh trong cấu trúc của hợp chất G278- 15 được củng cố bằng tín hiệu dao động hấp thụ hồng ngoại của C-S ở νmax 715 cm-1. Trên phổ 1H-NMR xuất hiện các tín hiệu của một hệ ABX ở δH 7,54 (1H, dd, J = 2,0, 8,0 Hz, H-5), 7,72 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-4), 7,81 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-7), 1 proton thơm singlet ở 8,06 (1H, s, H-3′) và 3 nhóm methyl ở δH 1,37 (9H, s, 3 x CH3). Phổ 13C-NMR and DEPT cho tín hiệu của 13 nguyên tử carbon tương ứng với 3 nhóm methyl, 4 nhóm methin sp2 và 6 carbon không liên kết trực tiếp với hydro. Phân tích các tín hiệu tương tác từ phổ HMBC (Hình 4.38) cho phép xác định liên kết của nhóm tert-butyl ở C-6 của vòng thơm ABX thông qua tương tác của proton thuộc nhóm methyl ở δH 1,37 với C-6 (δC 148,3) và C- 20 8 (δC 34,8). Thêm vào đó, tương tác HMBC giữa proton H-3′ (δH 8,06) với C-2 (δC 157,5) và C-2′ (δC 132,4), cho phép xác định liên kết của chuỗi carbon C-3′/C-2′/C-2. Độ chuyển dịch hóa học của C-7a (δC 148,6) and C-3a (δC 141,3), C-2 (δC 157,5) gợi ý sự liên kết của các carbon này với các nguyên tử oxy và nitơ. Các dữ liệu phổ MS, NMR gợi ý cấu trúc của G278-15 có cấu trúc đối xứng với 2 đơn vị cấu trúc C13H13NO kết nối với nhau thông qua các liên kết C-3–C-3′ và C-2′–S–C-2′′ Bảng 4.31. Dữ liệu phổ NMR của hợp chất G278-15 C G278-15 δHa,b độ bội (J, Hz) δCa,c 2 - 157,5 3a - 141,3 4 7,72 d (8,0) 110,3 5 7,54 dd (2,0; 8,0) 123,9 6 - 148,3 7 7,81 d (2,0) 116,3 7a - 148,6 8 - 34,8 9 1,37 s 31,5 2′ - 132,4 3′ 8,06 s 131,3 a trong DMSO-d6, b 500 MHZ, c 125 MHz Hình 4.38. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G278-15 Kết hợp với các dữ liệu phân tích từ phổ, HR-ESI-MS, 2D-NMR khẳng định hợp chất G278-15 là 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene. Hợp chất này đã được tổng hợp trước đó và được sử dụng làm tác nhân phát quang, tuy nhiên đây là báo cáo đầu tiên của hợp chất này được phân lập từ tự nhiên (Li, 2008). 4.7.16. Hợp chất 3-hydroxy-2-methylpyridine (G278-16) 21 Hợp chất G278-16 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối phân giải cao của G278-16 cho pic ion giả phân tử ở m/z 110,0609 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho CTPT C6H8NO, m/z: 110.0606), kết hợp với dữ liệu phổ 13C NMR cho CTPT là C6H7NO. Trên phổ 1H-NMR, xuất hiện tín hiệu của 3 proton aromatic ở δH 7.01 (1H, dd, J = 5.0, 8.0 Hz, H-5), 7.09 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-4), 7.86 (1H, d, J = 5.0 Hz, H-6) và 1 nhóm methyl ở δH 2.30 (3H, s, H-7). Phổ 13C-NMR and DEPT chỉ ra sự có mặt của 6 nguyên tử carbon trong đó có 1 nhóm methyl, 3 nhóm methin sp2, 2 carbon không liên kết trực tiếp với hydro ở δC 147.7 (C-2) and 154.0 (C-3). Độ chuyển dịch hóa học của C-2, C-6 và C-3 cho phép xác định chúng được gắn trực tiếp với nguyên tử nitơ và oxy. Trên phổ HMBC (Hình 4.48) cho thấy tương tác xa giữa H-6 với C-2, C-4 và C-5 và tương tác gữa H-4 với C-2 và C-6 cho phép xác định sự có mặt của vòng pyridine. Đồng thời tương tác giữa proton của nhóm CH3 với C-2 và C-3; tương tác giữa H-5 với C-3 cho phép xác định nhóm OH gắn ở vị trí C-3 và nhóm CH3 gắn với carbon C-2. Kết hợp các dữ liệu phổ 2D- NMR, HR-MS cho phép xác định hợp chất G278-16 là 3-hydroxyl-2- methylpyridine. Đây là một hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên, hợp chất này đã được tổng hợp vào năm 2008 (Jida, 2008). Bảng 4.32. Dữ liệu NMR của hợp chất G278-16 và hợp chất tham khảo C G278-16 3-hydroxy-2-methylpyridine δHa,c độ bội (J, Hz) δCa,d δH b,e# độ bội (J, Hz) δC b,f# 2 - 147,7 - 144,7 3 - 154,0 - 146,3 4 7,09 d (8,0) 122,6 7,15 dd (1,2; 8,4) 122,3 5 7,01 dd (5,0; 8,0) 123,2 7,06 dd (4,7; 8,4) 122,4 6 7,86 d (5,0) 139,3 8,05 dd (1,2; 4,7) 139,7 7 2,30 s 18,4 2,53 m 18,4 a trong CD3OD, b trong CDCl3, c 500 MHZ, d 125 MHz, e 300 MHZ, f 63 MHz, #H của hợp chất tham khảo (Jida and Ollivier, 2008). Hình 4.48. Một số tương tác chính trên phổ HMBC của G278-16 22 4.8. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của các hợp chất sạch đã phân lập Các hợp chất phân lập và các hợp chất tổng hợp được thử nghiệm hoạt tính kháng VSVKĐ. Kết quả cho thấy 20/30 hợp chất phân lập và 3 hợp chất tổng hợp có hoạt tính kháng VSVKĐ (Bảng 4.33 và Bảng 4.34). Bảng 4.33. và Bảng 4.34. Giá trị MIC (µg/mL) của các hợp chất tự nhiên và tổng hợp (*Chỉ thể hiện các chất có hoạt tính kháng VSVKĐ) T T Chất (*) Nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL) Gram dương Gram âm Nấm E. faecalis ATCC29212 S. aureus ATCC25923 B. cereus ATCC14579 E. coli ATCC25922 P. aeruginosa ATCC27853 S. enterica ATCC13076 C.albicans ATCC10231 Các hợp chất phân lập từ chủng G212 và G278 1 G212-1 64 - - - - - - 2 G212-2 G278-14 - - 256 - - - 64 3 G212-3 64 128 128 - - 256 - 4 G212-4 16 64 32 - - 64 128 5 G212-5 64 - 128 - - 64 64 6 G212-6 32 64 64 128 - 128 64 7 G212-7 32 32 64 - 32 32 32 8 G212-8 16 32 32 - - 64 32 9 G212-9 128 - - 32 - 64 - 10 G212-15 64 256 - - - - - 11 G212-16 - - - 32 - - - 12 G278-5 - - - 32 - - - 13 G278-6 - - - 128 - - - 14 G278-8 - - - 64 - - - 15 G278-9 256 - - - - - - 17 G278-10 128 256 256 128 - - 128 18 G278-12 32 - - - - - 64 19 G278-15 64 - - - - - - 20 G278-16 256 256 - 64 - 256 64 Các hợp chất tổng hợp 1 G212-4' 64 64 128 128 64 128 - 2 G212-5' - 128 64 128 32 - 128 3 G212-6' 128 64 32 64 32 - 32 S 256 256 128 32 256 128 - C 32 (S: Streptomycine; C: Cyclohexamide; (-): giá trị MIC > 256 µg/mL) 23 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Luận án đã thu được các kết quả chính như sau: 1. Từ 23 mẫu thu thập được ở hai vùng biển Quảng Bình và Cù Lao Chàm – Quảng Nam đã phân lập, nuôi cấy và lưu giữ được 35 chủng xạ khuẩn biển. 2. Đã đánh giá được hoạt tính kháng VSVKĐ của 35 chủng phân lập, trong đó có 24/35 chủng (68,6 %) có hoạt tính kháng VSVKĐ, bao gồm 4/35 chủng (11,4 %) có hoạt tính kháng từ 4 chủng VSVKĐ trở lên. 3. Đã tuyển chọn được hai chủng xạ khuẩn G212 và G278 có hoạt tính kháng VSVKĐ cao và phổ rộng, kháng 5/7 chủng VSV thử nghiệm. Định danh 2 chủng này thuộc chi Streptomyces. Trình tự gene 16S rRNA của 2 chủng G212 và G278 đã được đăng ký trên cơ sở dữ liệu của GenBank với mã số tương ứng là MF187963 và MF960781. 4. Đã tiến hành nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 32 hợp chất thứ cấp từ 2 chủng xạ khuẩn G212 và G278 (gồm 30 hợp chất khác nhau). Trong đó có 2 hợp chất mới là 2,4-dichlorophenyl 2,4-dichlorobenzoate (G212-2), 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) và 3 hợp chất lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên là ethylene terephthalate cyclic trimer (G212- 1), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15) và 3-hydroxy- 2-methylpyridine (G278-16). Cấu trúc hóa học của 2 hợp chất mới phân lập từ chủng G212 là G212-2 và G212-3 được khẳng định bằng phương pháp tổng hợp toàn phần. Trong quá trình tổng hợp, đã tổng hợp thêm được 3 hợp chất mới là dẫn xuất của hợp chất G212-3. Cấu trúc hóa học của hợp chất mới lần đầu được phân lập từ tự nhiên G212-1 được khẳng định bằng phương pháp X-ray. 5. Các hợp chất phân lập được đã được khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ trong đó có 19/30 hợp chất có hoạt tính kháng VSVKĐ. 6. Ba analog của hợp chất G212-3 tổng hợp đều thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ thử nghiệm. Đồng phân tổng hợp G212-6’ thể hiện hoạt tính tốt đối với chủng nấm C. albicans và chủng Gram âm P. aeruginosa với giá trị MIC = 32 µg/ml, trong khi đồng phân phân lập từ tự nhiên G212-3 không thể hiện hoạt tính đối với chủng nấm C. albicans. 24 KIẾN NGHỊ 1. Cần tiếp tục có các nghiên cứu sâu hơn về các hoạt tính sinh học khác đối với 1 số hợp chất sạch có hoạt tính kháng VSVKĐ tốt nhằm hướng đến khả năng ứng dụng trong tương lai. 2. Cần tiếp tục nghiên cứu các chủng xạ khuẩn đã phân lập được nhằm tìm kiếm các chất mới có hoạt tính sinh học mà trong khuôn khổ luận án chưa có điều kiện nghiên cứu. Đồng thời mở rộng hướng nghiên cứu tại các vùng biển khác nhằm phát hiện các chủng VSV biển có khả năng sản sinh các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đã phân lập và xác định hoạt tính kháng VSVKĐ 35 chủng xạ khuẩn từ 23 mẫu biển thu nhận ở 2 vùng biển: Quảng Bình và Cù Lao Chàm, Quảng Nam. Trong đó, 24/35 chủng (68,6 %) có hoạt tính kháng VSVKĐ, bao gồm 4/35 chủng (11,4 %) có hoạt tính kháng từ 4 chủng VSVKĐ trở lên. 2. Đã tuyển chọn được hai chủng xạ khuẩn G212 và G278 có hoạt tính kháng VSVKĐ cao và phổ rộng, kháng 5/7 VSV thử nghiệm. Định danh 2 chủng này thuộc chi Streptomyces. Trình tự gene 16S rRNA của 2 chủng G212 và G278 đã được đăng ký trên cơ sở dữ liệu của GenBank với mã số tương ứng là MF187963 và MF960781. 3. Đã tiến hành nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hóa học của 32 hợp chất thứ cấp từ 2 chủng xạ khuẩn G212 và G278 (gồm 30 hợp chất khác nhau). Trong đó có 2 hợp chất mới là 2,4-dichlorophenyl 2,4- dichlorobenzoate (G212-2), 4,5-dihydroxy-7-methyl phthalide (G212-3) và 3 chất lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên là ethylene terephthalate cyclic trimer (G212-1), 2,5-bis(5-tert-butyl-2-benzoxazolyl)thiophene (G278-15) và 3-hydroxy-2-methylpyridine (G278-16). Trong quá trình tổng hợp để khẳng định cấu trúc của hợp chất G212-3, đã tổng hợp được 3 hợp chất mới là dẫn xuất của hợp chất G212-3. 4. Đã khảo sát hoạt tính kháng VSVKĐ của 30 hợp chất phân lập từ dịch nuôi cấy XK và 3 hợp chất tổng hợp trong đó có 19/30 hợp chất tự nhiên và 3 hợp chất tổng hợp thể hiện hoạt tính kháng VSVKĐ. 25 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Duc-Tuan Cao, Thuy-Linh Nguyen, Van-Hieu Tran, Huong Doan-Thi- Mai, Quyen Vu-Thi, Mai-Anh Nguyen, Hong-Minh Le-Thi, Van-Minh Chau and Van-Cuong Pham, Synthesis, Structure and Antimicrobial Activity of Novel Metabolites from a Marine Actinomycete in Vietnam’s East Sea, 2019. Natural Product Communication, 14 (1): 121-124. 2. Duc Tuan Cao, Van Hieu Tran, Van Nam Vu, Huong Doan Thi Mai, Thi Hong Minh Le, Thi Quyen Vu, Hung Huy Nguyen, Van Minh Chau, Van Cuong Pham, Antimicrobial Metabolites from a Marine-Derived Actinomycete Streptomyces sp. G278, 2019. Natural Product Research, 33:22, 3223-3230. 3. Cao Duc Tuan, Le Thi Hong Minh, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Doan Thi Mai Huong, Chau Van Minh, Pham Van Cuong, Identification and Antimicrobial Activity of Actinomycetes Strains isolated from samples collected in the coastal area Hue, Da Nang and Quang Nam Provinces, Vietnam, 2017. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 15 (4): 737-744. 4. Cao Duc Tuan, Vu Van Nam, Tran Van Hieu, Doan Thi Mai Huong, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Le Thi Hong Minh, Brian T. Murphy, Nguyen Quoc Vuong, Pham Van Cuong, Secondary metabolites from marine actinomycete Streptomyces sp. G212, 2017. Tạp chí Hóa học, 55 (6e): 85- 89. 5. Cao Duc Tuan, Tran Van Hieu, Doan Thi Mai Huong, Le Thi Hong Minh, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Brian Murphy, Nguyen Quoc Vuong, Pham Van Cuong, Secondary metabolites produced by marine actinomycette Streptomyces sp. G278. 2017, Tạp chí Hóa học, 55 (6e): 145-149. 6. Cao Duc Danh, Cao Duc Tuan, Vu Thi Quyen, Nguyen Mai Anh, Doan Thi Mai Huong, Pham Van Cuong, Chau Van Minh, Le Thi Hong Minh, Identification and antimicrobial activity of actinomycetes strains isolated from marine samples in the coastal area of Thanh Hoa – Quang Binh – Quang Tri, 2018. Vietnam Journal of Science and Technology, 56 (4): 424- 433.