Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA HỌC MAI HÙNG THANH TÙNG NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA HAI LOÀI KHỔ SÂM MỀM (BRUCEA MOLLIS WALL. EX KURZ) VÀ CƠM RƯỢU TRÁI HẸP (GLYCOSMIS STENOCARPA (DRAKE) GUILLAUM) Ở VIỆT NAM Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số: 62.44.27.01 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2012 Công trình được hoàn thành tại: Viện Hóa học – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Mạnh Cường 2. GS.TS. Young Ho Kim Phản biện 1: GS.TSKH. Phan Tống Sơn Phản biện 2: GS.TSKH. Trần Văn Sung Phản biện 3: PGS.TS. Hoàng Thanh Hương Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Hội trường (tầng 3), nhà A18 – Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 – Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội. Vào hồi: ......giờ......ngày ......tháng........năm 2012 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Thư viện Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ TRONG KHUÔN KHỔ LUẬN ÁN 1. Nguyễn Mạnh Cường, Trần Thu Hường, Trần Quốc Toàn, Huỳnh Minh Hùng, Mai Hùng Thanh Tùng, Nguyễn Quyết Chiến, (2010), Đóng góp mới về nghiên cứu thành phần hóa học cây Cơm rượu trái hẹp Glycosmis stenocarpa, Tạp chí Hóa học, 48 (4B), 516-520. 2. Mai Hùng Thanh Tùng, Trần Thu Hường, Trần Thế Bách, Nguyễn Quốc Bình, Bá Thị Châm, Nguyễn Mạnh Cường, (2011), Tác dụng gây độc tế bào ung thư của lá cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis), Tạp chí Dược liệu 16 (6), 356-360. 3. Mai Hùng Thanh Tùng, Nguyễn Thành Dương, Trần Thu Hường, Nguyễn Mạnh Cường, (2011), Các amít và flavonoit từ lá cây Khổ sâm mềm - Brucea mollis, Tạp chí Hóa học 49 (6A), 389-392. 4. Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức, Bùi Hữu Tài, Nguyễn Mạnh Cường, (2011), Các tecpenoit và phenolic glucoside từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz), Tạp chí Hóa học 49 (6), 765-768. 5. Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức,Young Ho Kim, Nguyễn Mạnh Cường, Đóng góp mới về nghiên cứu thành phần hóa học cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz), Tạp chí Khoa học và Công nghệ (2012) (đã nhận đăng). 6. Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức,Trần Thị Ngọc Diệp, Young Ho Kim, Nguyễn Mạnh Cường, Một số hợp chất béo và sterol được phân lập từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis), Tạp chí Khoa học và Công nghệ (2012) (đã nhận đăng). 7. Mai Hùng Thanh Tùng, Hồ Việt Đức,Trần Thu Hường, Nguyễn Mạnh Cường, Các isoprenoit và coumarin từ cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz), Tạp chí Khoa học và Công nghệ (2012) (đã nhận đăng). 1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Cho đến ngày nay dân số thế giới đã đạt được bảy tỷ người, một con số rất lớn và nhu cầu về khám chữa bệnh vì thế cũng tăng theo. Trong khi đó thì tình trạng sử dụng thuốc bừa bãi không theo hướng dẫn của bác sĩ dẫn đến kháng thuốc, đặc biệt là ở những nước đang phát triển đã vô tình tạo một áp lực lớn đối với ngành y tế thế giới phải cố gắng tìm ra những loại thuốc mới. Thiên nhiên là một kho thuốc khổng lồ, mà cho đến nay thế giới vẫn chưa khám phá hết. Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, nóng ẩm, có một hệ động thực vật đa dạng phong phú. Đây chính là tiềm năng to lớn mà chúng ta cần phải tận dụng. Hiện nay, tình trạng đốt phá rừng ngày càng gia tăng và không thể kiểm soát, đồng thời khí hậu thay đổi theo chiều hướng khắc nghiệt hơn, đã và đang làm cho một số lượng lớn các loài suy thoái dần. Nếu chúng ta không nhanh chóng nghiên cứu và bảo vệ nguồn gien này thì đó sẽ là một mất mát to lớn của loài người. Trong y học dân gian cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) được sử dụng để trị sốt rét, đau bụng, u nhọt, amíp, ghẻ lở... Ngoài ra, trong chương trình hợp tác giữa Việt Nam và Hàn Quốc nhằm tìm kiếm các loài thực vật có hoạt tính kháng lại dòng ung thư phổi người A549, nhóm tác giả Nguyễn Mạnh Cường đã phát hiện ra cây B. mollis có hoạt tính rất mạnh, dịch chiết MeOH từ lá cây ức chế tới 96% tế bào ung thư. Bên cạnh đó, các phân đoạn được tách ra từ lá cây Khổ sâm mềm cũng đã được thử trên các dòng ung thư khác nhau như LU-1 (ung thư phổi người), Hep-G2 (ung thư gan người), MCF- 7 (ung thư vú người). Kết quả cho thấy cặn chiết MeOH cũng cho hoạt tính gây độc tế bào mạnh dòng tế bào ung thư gan người (Hep-G2) với giá trị IC50 (μg/ml) 14,49. Đặc biệt có phân đoạn n-hexan cho hoạt tính gây độc tế bào rất mạnh cả ba dòng tế bào ung thư LU-1, Hep-G2, MCF-7 với các giá trị IC50 (μg/ml) lần lượt là 3,5; 1,03 và 5,8. Cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) thu hái tại Việt Nam đã được nghiên cứu. Từ cây Cơm rượu trái hẹp, nhóm tác giả Nguyễn Mạnh Cường đã phân lập được một số ancaloit như murrayanin, bisisomahanin và murrayafoline A. Trong đó, murrayafoline A có hoạt tính ức chế mạnh sự phát triển tế bào ung thư đại tràng thông qua con đường Wnt/b- catenin và có tác dụng đến tim mạch. Nhằm mục đích đi sâu nghiên cứu về thành phần hóa học và tác dụng dược lý của hai cây này, chúng tôi đã lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ở Việt Nam'' 2 2. Mục tiêu của luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài trên theo định hướng tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính kháng ung thư. 3. Nội dung nghiên cứu của luận án o Thu hái mẫu thực vật và xử lý mẫu; o Điều chế các cặn chiết từ các mẫu thực vật thu hái được; o Phân lập các hợp chất từ các cặn chiết; o Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được; o Thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập. 4. Ý nghĩa khoa học của luận án Luận án đã đóng góp những hiểu biết mới về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của hai loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và loài Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) ở Việt Nam. Các kết quả của luận án sẽ tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về chi Brucea và chi Glycosmis nhằm khai thác và ứng dụng có hiệu quả các hoạt tính quý báu của chúng trong lĩnh vực y dược. 5. Những đóng góp mới của luận án - Đây là nghiên cứu đầu tiên về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của cây Brucea mollis (Wall. ex Kurz) ở Việt Nam và trên thế giới. - Từ lá, thân và rễ cây Brucea mollis đã phân lập được 23 hợp chất, trong đó có 16 hợp chất lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea gồm: octatriacontan-1-ol (BM.01), tritriacontan-1-ol (BM.02), bombiprenone (BM.04), α-tocopherol (BM.05), vomifoliol 9-O-β-D-glucopyranoside (BM.09), soulameanone (BM.10), cytosine (BM.11), thymine (BM.12), axít tricosanoic (BM.14), cleomiscosin A (BM.16), 9-methoxycanthin-6-one (BM.17), 1β,6α-dihydroxy-4(14)- eudesmene (BM.18), niloticin (BM.19), dimethyl crenatin (BM.20), inosine (BM.21), leonuriside A (BM.23). - Từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) phân lập được 4 hợp chất gồm: N-methylpyrrolidine-2-cacboxamit (GP.24), đường sucrose (GP.25), (±) p-synephrine (GP.26), 4-{1-[α-L-arabinofuranosyl-(1''→4')- b-D-glucopyranosyl]-2-methylamino)ethyl}phenol (GP.27). Trong đó có một chất mới là GP.27. - Đã đánh giá độc tính tế bào ung thư của dịch chiết MeOH tổng và các cặn chiết n-hexan, điclometan, dịch nước từ lá cây Khổ sâm mềm đối với 3 chủng tế bào ung thư phổi người (LU-1), ung thư gan người (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7). Dịch chiết MeOH cho tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 (IC50 =14,49 µg/ml). Cặn chiết n-hexan ức chế 3 rất mạnh đối với cả ba dòng tế bào ung thư Lu, Hep-G2 và MCF-7 với giá trị IC50 (µg/ml) lần lượt là 3,5; 1,03 và 5,8. - Đã nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được trên bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính). Phát hiện hợp chất isobrucein B (BM.15), 9-methoxycanthin-6-one (BM.17) và niloticin (BM.19) cho hoạt tính rất mạnh với các giá trị IC50 (µg/ml) trong khoảng 0,23 - 3,73 (μg/ml). Trong đó hợp chất isobrucein B (BM.15) có hoạt tính mạnh nhất và cao hơn cả chất đối chứng dương ellipticine. 6. Bố cục của luận án Luận án gồm 167 trang, trong đó có 126 hình, 31 bảng. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (27 trang); Chương 2: Thực nghiệm (20 trang); Chương 3: Kết quả và thảo luận (86 trang); Kết luận và kiến nghị (2 trang); Danh mục các công trình khoa học đã công bố trong khuôn khổ luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (14 trang) với 141 tài liệu cập nhật đến năm 2011. Ngoài ra còn có phần Phụ lục với các hình phổ. II. NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN MỞ ĐẦU Phần Mở đầu đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. Chương 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần Tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu về chi Sầu đâu (Brucea), họ Simaroubaceae (Thanh Thất) 1.2. Sơ lược về lớp chất quassinoit, là lớp chất chính của chi Brucea 1.3. Đặc điểm thực vật và tình hình nghiên cứu về chi Cơm rượu (Glycosmis), họ Cam quýt (Rutaceae) Chương 2 – THỰC NGHIỆM Phần Thực nghiệm trình bày về nguyên liệu, phương pháp nghiên cứu, quá trình chiết tách, đặc điểm hóa lý và số liệu phổ của các chất được phân lập từ hai loài Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) và loài Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum). 4 Nguyên liệu: Cây Khổ sâm mềm (Brucea mollis Wall. ex Kurz) được thu hái vào tháng 3/2009, ở Mai Châu, tỉnh Hoà Bình. Tên khoa học của cây do TS. Trần Thế Bách (Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật) xác định. Mẫu tiêu bản của cây được lưu trữ tại phòng tiêu bản thực vật HN thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, kí hiệu mẫu là VK 2211 (HN). Cây cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa - (Drake) Guillaum) được thu hái tại xã Hoàng Hoa Thám, huyện Chí Linh, tỉnh Hải Dương, Việt Nam vào tháng 2/2009 , tên khoa học của cây được xác định bởi nhà thực vật học Ngô Văn Trại -Viện Dược liệu. Quy trình chiết: Mẫu thực vật sau khi thu hái về được rửa sạch, loại bỏ phần hư hỏng, phơi khô và sấy ở nhiệt độ 50-60oC cho đến khô. Sau đó mẫu được xay nhỏ và được ngâm chiết kiệt nhiều lần bằng MeOH ở nhiệt độ phòng. Sau khi cất loại dung môi, cặn cô được chiết phân đoạn với các dung môi có độ phân cực tăng dần như: n-hexan, cloroform hoặc điclometan, etyl axetat, BuOH và MeOH. Phân lập các chất: Tinh chế các cặn chiết thu được bằng phương pháp sắc ký cột với các chất hấp phụ khác nhau như: silica gel, RP-18, sephadex LH-20 và các hệ dung môi thích hợp. Xác định cấu trúc hóa học: Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-, HR-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (COSY, HSQC, HMBC). Phương pháp thử hoạt tính sinh học: Hoạt tính gây độc tế bào: Các dòng tế bào ung thư ở người gồm có: ung thư biểu mô (KB), ung thư gan (Hep-G2), ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF- 7), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) được cung cấp bởi GS.TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia . Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Cấu trúc của các hợp chất phân lập được Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và cách xác định cấu trúc của 27 hợp chất phân lập được từ hai cây Khổ sâm mềm và Cơm rượu trái hẹp. Dưới đây là bảng tổng hợp cấu trúc của các hợp chất phân lập được trong khuôn khổ luận án. 5 BM.01 Octatriacontan-1-ol (lần đầu tiên phân lập từ chi Bruea) BM.02 Tritriacontan-1-ol (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.03 Stigmast-5,22-dien-3-b-ol BM.04 Bombiprenone (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.05 α-tocopherol (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.06 Apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside BM.07 Luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside BM.08 Blumenol A 6 BM.09 Vomifoliol 9-O-β-D- glucopyranoside (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.10 Soulameanone (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.11 Cytosine (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.12 Thymine (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.13 Daucosterol BM.14 Axít tricosanoic (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) 7 BM.15 Isobrucein B BM.16 Cleomiscosin A (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) N N H H H3CO H H H H HO 1 2 3 4 56 78 9 10 11 12 13 14 15 16 17 BM.17 9-methoxycanthin-6-one (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.18 1β,6α-dihydroxy-4(14)-eudesmene (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) O O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 2829 30 BM.19 Niloticin (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.20 Dimethyl crenatin (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) 8 BM.21 Inosine (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) BM.22 Bruceolline F BM.23 Leonuriside A (lần đầu tiên phân lập từ chi Brucea) N O NH2 CH3 H H H H H H H 1 2 34 5 6 (S) GP.24 N-methylpyrrolidine-2-cacboxamit GP.25 Đường sucrose GP.26 p-synephrine 9 H O OHH HHO O O HO HO O OH H N CH3 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' HOH2C L ara D-glc H aglycon 1'' 2''3'' 4'' 5'' GP.27 4-{1-[α-L-arabinofuranosyl-(1''→4')-b-D-glucopyranosyl]-2- (methylamino)ethyl}phenol (Chất mới) Hợp chất BM.15: isobrucein B Hợp chất BM.15 được tách ra dưới dạng bột màu vàng, nhiệt độ nóng chảy 243- 246oC, [α]D25 -36,2 (c = 0,24 trong pyridin). Phổ 13C-NMR của BM.15 gần giống với hợp chất soulameanone (BM.10) ngoại trừ các tín hiệu xuất hiện ở δ 73,3 (C-19); 169,0 (C-1"); 20,3 (C-2"); 172,6 (C-1'); 53,0 (C-2') trong BM.15 và δ 28,8 (C-19); 17,8 (C-20) trong BM.10. Phổ 13C-NMR và DEPT của BM.15 có tất cả 23 tín hiệu cacbon bao gồm 3 nhóm metyl tại δ 22,5 (C-17), 11,5 (C-18), 20,3 (C-2"), 1 nhóm metoxy tại δ 53 (C-2'), 2 nhóm metylen tại δ 28,5 (C-6), 73,3 (C-19), 5 nhóm metin liên kết với ôxy tại δ 81,1 (C-1), 83 (C-7), 72,4 (C-11), 75,8 (C-12), 67,0 (C-15), 3 nhóm metin tại δ 43,5 (C-5), 42,8 (C-9), 51,5 (C-14) và 8 cacbon không liên kết hydro. Phổ 1H-NMR của BM.15 xuất hiện peak cộng hưởng của 1 proton olefin tại δ 6,11 (m, H-3). Kết hợp phân tích các tương tác trong phổ HMBC, COSY của BM.15 cho thấy trong phân tử có một nhóm liên hợp α,b-keton không no ở δ 196,9 (C-2), 124,3 (C-3), 162,9 (C-4), một nhóm cacbomethoxy ở δ 172,6 (C-1'); 53,0 (C-2') và một nhóm axetyl ở δ 169,0 (C-1"); 20,3 (C-2"). Phổ HMBC của BM.15 còn thể hiện tương tác của proton H-19 với các cacbon C-13, C-14. Điều đó chứng tỏ cầu epoxy được nối giữa C-8 và C-13. Từ các phân tích trên ta suy ra được hợp chất BM.15 là một dạng quassinoit khung C-20 (năm vòng, pentacyclic) có hai mạch nhánh ở C-13 và C-15. 10 Cấu trúc lập thể của BM.15 được xác định dựa vào phổ NOESY. Các tín hiệu cộng hưởng trên phổ NOESY của BM.15 cho thấy có tương tác giữa proton H-1/H-5, H3-18/H-6α, H-9/H-1;H-5, H19/H-7;H-14, điều đó chứng tỏ H-5 có cấu hình trans so với H3-18 và H-9 có cấu hình trans so với H2-19. Bên cạnh đó, trong phổ NOESY còn có tương tác giữa H-19/H-7;H-14, H-7/H- 12;H-14, các tương tác này chỉ ra rằng H-7, H-14 có cấu hình cis so với H2-19 và cầu nối metylenoxy giữa C-8 và C-13 là có cấu hình b. Phổ khối ESI-MS của BM.15 có một peak ion giả phân tử tại m/z 463,0 [M-H2O+H]+. Từ các phân tích trên, và so sánh với tài liệu tham khảo, ta có thể khẳng định hợp chất BM.15 là isobrucein B, CTPT C23H28O11. Hình 3.40. Các tương tác trong phổ HMBC, COSY và NOESY của hợp chất BM.15 Từ cây Khổ sâm mềm đã phân lập được hai quassinoit là soulameanone BM.10 và isobrucein B BM.15. Hai hợp chất này được thử hoạt tính kháng bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính). Kết quả thể hiện hợp chất BM.15 có hoạt tính rất mạnh, thậm chí mạnh hơn cả chất đối chứng dương ellipticine, trong khi đó thì hợp chất BM.10 lại không có hoạt tính. Khi so sánh về mặt cấu trúc của hai hợp chất này ta thấy hợp chất BM.15 có các đặc điểm như có hệ vòng picrasane với một nhóm keton ở vị trí C16; một hệ liên hợp α,b-keton không no ở vòng A; một cầu epoxymethanon nối giữa C8 và C13 và có các mạch nhánh este ở C13 và C15. Như vậy, các đặc điểm cấu trúc trên là cần thiết cho tác dụng kháng ung thư của các quassinoit. 11 Bảng 3.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15 Vị trí δH (ppm) (CDCl3, 500 MHz) δC (ppm) (CDCl3, 125 MHz) HMBC (H®C) COSY (H®H) NOESY (H®H) 1 4,17 (s) 81,1 (d) C18; C9 H5; H9; H11 2 196,9 (s) 3 6,11 (m) 124,3 (d) C1; C5; C17 H17 4 162,9 (s) 5 2,92 (d, J=12,5Hz) 43,5 (d) C3; C18 H6α H1; H9 6α 6b 1,86 (dt, J=13,0; 2,5 Hz) 2,41(dt,J = 14,5; 3,0 Hz) 28,5 (t) C4; C8; C10 H7, H5 H17, H18 7 4,74 (d, J = 3,0 Hz) 83,0 (d) C5; C19 H6 H12;H14; H19 8 45,6 (s) 9 2,33 (d, J = 3,5 Hz) 42,8 (d) C18; C19 H1; H18; H19 10 47,5 (s) 11 4,75 (d, J = 3,0 Hz) 72,4 (d) C8 H1; H19 12 4,28 (d, J = 1,0 Hz) 75,8 (d) C14 H7 13 80,5 (s) 14 3,04 (d, J = 12,5 Hz) 51,5 (d) H7; H19 15 6,31 (br s) 67,0 (d) 16 166,8 (s) 17 1,95 (s, 3H) 22,5 (q) H3; H5 18 1,18 (s, 3H) 11,5 (q) C1; C5 H6; H9 19α 19b 3,75 (dd,J = 8,0; 1,5 Hz) 4,81 (d, J = 7,5 Hz) 73,3 (t) C9; C13; C14 H7; H9; H14 1' 172,6 (s) 2' 3,83 (s) 53,0 (q) C1' H2'' 1'' 169,0 (s) 2'' 2,11 (s) 20,3 (q) H2' 12 Bảng 3.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất BM.15 và chất tham khảo Vị trí Hợp chất BM.15 (CDCl3) Isobrucein B (CDCl3) δH (ppm) (500 MHz) δC (ppm) (125 MHz) δH (ppm) (500 MHz) δC (ppm) (125 MHz) 1 4,17 (s) 81,1 (d) 4,31 (s) 82,9 2 196,9 (s) 198,4 3 6,11 (s) 124,3 (d) 6,14 (s) 125,2 4 162,9 (s) 162,9 5 2,92 (d, J = 12,5 Hz) 43,5 (d) 3,04 (br d, J = 2,0 Hz) 43,7 6 1,86 (dt, J=13,0; 2,5 Hz) 2,41(dt, J = 14,5; 3,0 Hz) 28,5 (t) 1,77 (ddd, J = 12,0; 2,0; 2,0 Hz) 2,36 (dd, J = 12,0; 2,0 Hz) 28,4 7 4,74 (d, J = 3,0 Hz) 83,0 (d) 5,04 (d, J = 2 Hz) 83,6 8 45,6 (s) 48,4 9 2,33 (d, J = 3,5 Hz) 42,8 (d) 2,88 (d, J = 4 Hz) 42,8 10 47,5 (s) 46,5 11 4,75 (d, J = 3,0 Hz) 72,4 (d) 5,51 (br d, J = 4 Hz) 75,4 12 4,28 (d, J = 1,0 Hz) 75,8 (d) 5,11 (d, J = 2 Hz) 75,9 13 80,5 (s) 82,7 14 3,04 (d, J = 12,5 Hz) 51,5 (d) 3,93 (br d) 50,5 15 6,31 (br s) 67,0 (d) 6,72 (br d) 69 16 166,8 (s) 168,1 17 1,95 (s, 3H) 22,5 (q) 1,74 (s) 22,2 18 1,18 (s, 3H) 11,5 (q) 1,44 (s) 11,4 19 3,75 (dd, J = 8,0; 1,5 Hz) 4,81 (d, J = 7,5 Hz) 73,3 (t) 3,90 (d, J = 7 Hz) 5,13 (d, J = 7 Hz) 73,5 1' 172,6 (s) 171,4 2' 3,83 (s) 53,0 (q) 3,77 (s) 52,4 1'' 169,0 (s) 179 2'' 2,11 (s) 20,3 (q) 2,11 (s) 20,7 13 Hình 3.41. Phổ 1H-NMR của hợp chất BM.15 Hình 3.42. Phổ DEPT của hợp chất BM.15 Hình 3.43. Phổ HSQC của hợp chất BM.15 14 Hình 3.44. Phổ HMBC của hợp chất BM.15 Hình 3.45. Phổ COSY của hợp chất BM.15 Hình 3.46. Phổ NOESY của hợp chất BM.15 15 Hình 3.47. Phổ ESI-MS của hợp chất BM.15 Hợp chất GP.27: 4-{1-[α-L-arabinofuranosyl-(1''→4')-b-D-glucopyranosyl]-2- (methylamino)ethyl}phenol (chất mới) Hợp chất GP.27 thu được dưới dạng chất rắn màu vàng nâu, tan tốt trong metanol. Các tín hiệu trong phổ 1H và 13C-NMR của GP.27 khá giống với hợp chất GP.26 (p-synephrine), ngoại trừ tín hiệu của hai nhóm đường tại δ 62,8, 64,8, 72,0, 72,4, 73,0, 73,8, 74,9, 76,3, 78,0, 94,0 và 98,2. Ta dự đoán đây là một dạng dẫn xuất diglycoside của p-synephrine. Trên phổ 1H-NMR cho thấy có hai proton anome tại δ 4,50 (1H, d, J = 8,0 Hz, H- 1') và 5,12 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-1") tương ứng với các cacbon tại δ 98,2 (C-1') và 94,0 (C-1"). Từ các dữ liệu phổ HMBC và COSY xác định được hai nhóm đường là D- glucopyranosyl và L-arabinofuranosyl. Proton anome (δ 4,5, J = 8,0 Hz) cho thấy nhóm đường D-glucopyranosyl có cấu hình b ; proton anome (δ 5,12, J = 3,5 Hz) của nhóm đường L-arabinofuranosyl chứng tỏ nhóm đường này có cấu hình α. Trên phổ HMBC xuất hiện tương tác mạnh giữa proton H-2' (δ 3,16) của phần đường glucopyranosyl với cacbon C-7 (δ 69,8) của phần aglycon và proton H-7 (δ 4,89) của phần aglycon với cacbon C-2' (δ 76,3) của phần đường glucopyranosyl, điều đó chứng tỏ nhóm đường b-O-D-glucopyranosyl là gắn vào vị trí C-7 của phần aglycon, ngoài ra còn có tương tác của proton H-1'' (δ 16 5,12) của phần đường arabinofuranosyl với cacbon C-4' (δ 74,9) của phần đường glucopyranosyl cho thấy hai nhóm đường gắn với nhau qua cầu C1''-O- C4'. Bảng 3.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất GP.27 Vị trí δH (ppm) δC (ppm) HMBC (H→C) COSY (H→H) NOESY (H→H) 1 158,7 (s) 2 6,82 (d, J = 8,0 Hz) 116,4 (d) C1, C4, C6 H3 3 7,27 (d, J = 8,0 Hz) 128,3 (d) C1, C2, C5, C6, C7 H2 H2, H7 4 132,8 (s) 5 7,27 (d, J = 8,0 Hz) 128,3 (d) C1, C3, C6, C7 H6 H6, H7, H8 6 6,82 (d, J = 8,0 Hz) 116,4 (d) C1, C2, C4 H5 7 4,89 (m) 69,8 (d) C3, C4, C5, C8, C2' H8 H8, H2' 8 3,14 (m) 56,8 (t) C7, C9 H7 9 2,75 (s) 33,8 (q) C8 H8 b-O-D-glc 1' 4,5 (d, J = 8,0 Hz) 98,2 (d) C2', C3' H2' 2' 3,16 (m) 76,3 (d) C4 (yếu), C7(mạnh), C1', C3' H1', H3' 3' 3,37(d, J = 9,5 Hz) 78,0 (d) C4' H2', H4' 4' 3,7 (t, J = 9,5 Hz) 74,9 (d) C3', C5' H3', H5' 5' 3,80 (d, J = 9,5 Hz) 72,4 (d) C6' H4', H6' 6' 3,67 (m), 3,82 (m) 64,8 (t) C5' H5' α-L-ara 1'' 5,12 (d, J = 3,5 Hz) 94,0 (d) C4'', C4' H2'' H3', H2" 2'' 3,38 (m) 73,8 (d) C3'' H1'', H3'' 3'' 3,31 (m) 72,0 (d) C4'', C5'' H2'', H4'' 4'' 3,71 (d, J = 6,5 Hz) 73,0 (d) C1'', C2'', C3'' H3'', H5'' 5'' 3,73 (m), 3,87 (m) 62,8 (t) C3'' H4'' H3" 1H-NMR đo trong CD3OD, 500 MHz; 13C-NMR đo trong CD3OD, 125MHz. 17 Phổ ESI-MS của GP.27 cho peak ion giả phân tử tại m/z 506,2 [M+2Na- H]+, và các mảnh 356,3 [M+2Na-H- aglycon]+; 194,2 [M+2Na-H-150-162]+; 150,1 [Mara]+. (với 150: aglycon; 162: glc). Từ các phân tích trên ta có thể đưa ra cấu trúc và sơ đồ phân mảnh của GP.27 là CTPT C20H31NO11 (M = 461) Hình 3.104. Sơ đồ phân mảnh của hợp chất GP.27 trong phổ ESI-MS Kiểm tra tư liệu đã công bố, cho đến nay chưa thấy một glycoside nào của p-synephrine được phát hiện. Do đó, có thể khẳng định hợp chất này là chất mới, nó là một dạng dẫn xuất diglycoside của p-synephrine (GP.26) và được xác định là 4-{1-[α-L-arabinofuranosyl-(1''→4')-b-D-glucopyranosyl]-2- (ethylamino)ethyl}phenol Hình 3.105. Các tương tác HMBC, COSY và NOESY của hợp chất GP.27 H O OHH HHO O O HO HO O OH H N CH3 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' HOH2C H 1'' 2''3'' 4'' 5'' H O OHH HHO O O HO HO O OH H N CH3 HO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1' 2' 3' 4' 5' 6' HOH2C H 1'' 2''3'' 4'' 5'' H H H H H H COSY NOESY 18 Hình 3.106. Phổ 1H-NMR của hợp chất GP.27 Hình 3.107. Phổ DEPT của hợp chất GP.27 Hình 3.108. Phổ HSQC của hợp chất GP.27 19 Hình 3.109. Phổ HMBC của hợp chất GP.27 Hình 3.110. Phổ COSY của hợp chất GP.27 20 Hình 3.111. Phổ NOESY của hợp chất GP.27 Hình 3.112. Phổ ESI-MS của hợp chất GP.27 3.2. Hoạt tính sinh học của các hợp chất được phân lập Các hợp chất BM.02¸07, BM.10, BM.15, BM.17, BM.19, BM.21, BM.22 được thử hoạt tính gây độc tế bào đối với bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu 21 mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính). Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm và của dữ liệu. Sau quá trình xử lí số liệu bằng phần mềm Table Curve, các giá trị IC50 đã được tính toán và cho thấy độ tin cậy cao (r2 ≥ 0,99 tương ứng sai số < 0,01). Kết quả thu được như sau: Bảng 2.1. Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất được tách ra trên bốn dòng ung thư Hợp chất Giá trị IC50 (mg/ml) trên bốn dòng tế bào ung thư khác nhau HL-60 LU-1 KB LNCaP BM.02 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.03 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.04 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.05 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.06 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.07 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.10 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.15 0,23 0,40 0,39 0,34 BM.17 0,91 1,61 3,73 1,01 BM.19 0,99 1,22 2,22 1,10 BM.21 > 20 > 20 > 20 > 20 BM.22 > 20 > 20 > 20 > 20 Ellipticine 0,66 0,72 0,89 0,69 Kết quả ở Bảng 2.1 cho thấy trong số các hợp chất được thử hoạt tính kháng ung thư thì có ba hợp chất là isobrucein B (BM.15), 9-methoxycanthin- 6-one (BM.17) và niloticin (BM.19) cho hoạt tính rất mạnh với cả bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính) với các giá trị IC50 trong khoảng 0,23-3,73 (μg/ml). Đặc biệt là hợp chất isobrucein B cho hoạt tính mạnh nhất và hơn cả chất đối chứng dương ellipticine. Hợp chất isobrucein B cho hoạt tính kháng mạnh bốn dòng ung thư là điều được dự đoán trước. Sở dĩ như vậy vì hợp chất isobruceine B có các đặc điểm cấu trúc tương tự các hợp chất quassinoit có hoạt tính đã được phân lập trước đây, bao gồm hệ vòng picrasane với một nhóm keton ở vị trí C16; một hệ liên hợp α,b-keton không no ở vòng A; một cầu epoxymethanon nối giữa C8 và C13 và có các mạch nhánh este ở C13 và C15. 22 Nhận định trên có thể thấy rõ qua một số hợp chất như: Bruceanol D tách ra từ B. antidysenterica cho hoạt tính gây độc tế bào mạnh kháng lại năm dòng ung thư gây u bướu ở người gồm: u ác tính (RPMI-7951, malignant melanoma), ung thư phổi người (A-549, lung carcinoma), u vòm họng (HCT-8, ileocecal adenocarcinoma), ung thư biểu mô (KB, epidermoid carcinoma of the nasopharynx), và u nguyên tủy bào (TE-671, medulloblastoma), với các giá trị ED50 (μg/ml) lần lượt là 0,09; 0,55; 0,09; 0,08 và 0,08. Hoặc brusatol gây độc tế bào mạnh đối với dòng ung thư bạch cầu P-388, IC50 (μg/ml) 0,0061. Trong bốn dòng ung thư mà isobrucein B kháng thì hoạt tính kháng các dòng ung thư KB, LU-1 và LNCaP là mới. Lớp chất ancaloit khung canthin-6-one là lớp chất có phổ hoạt tính rộng và mạnh, đặc biệt là hoạt tính kháng ung thư như ung thư bạch cầu A-388, ung thư phổi người A549, ung thư vú MCF-7, ung thư gan Bel-7402.... Chúng được tìm thấy nhiều ở một số loài như Eurycoma longifolia và Picrasma quassioides. Hợp chất 9-methoxycanthin-6-one có hoạt tính kháng mạnh bốn dòng ung thư KB, LU-1, LNCaP và HL-60. Đây cũng là các hoạt tính mới của hợp chất này. Niloticin là một tritecpenoit với bộ khung tirucall-7-ene và mạch nhánh có vòng epoxy. Nó cũng cho hoạt tính kháng mạnh cả bốn dòng ung thư KB, LU-1, LNCaP và HL-60. Đây là hoạt tính mới của hợp chất này. Một điều thú vị là cả ba hợp chất trên thuộc ba lớp chất khác nhau quassinoit, ancaloit, tritecpenoit và cùng được tách ra từ cây Khổ sâm mềm. KẾT LUẬN 1. Đã nghiên cứu thành phần hóa học của lá, thân và rễ cây Brucea mollis (Wall. ex Kurz). Từ lá cây đã phân lập và xác định cấu trúc 12 hợp chất bao gồm: octatriacontan-1-ol (BM.01), tritriacontan-1-ol (BM.02), stigmast-5,22-dien-3-b- ol (BM.03), bombiprenone (BM.04), α-tocopherol (BM.05), apigenin-7-O-β-D- glucopyranoside (BM.06), luteolin-7-O-β-D-glucopyranoside (BM.07), 23 blumenol A (BM.08), vomifoliol 9-O-β-D-glucopyranoside (BM.09), soulameanone (BM.10), cytosine (BM.11), thymine (BM.12). Trong đó, các hợp chất octatriacontan-1-ol (BM.01), tritriacontan-1-ol (BM.02), bombiprenone (BM.04), α-tocopherol (BM.05), vomifoliol 9-O-β-D-glucopyranoside (BM.09), soulameanone (BM.10), cytosine (BM.11), thymine (BM.12) lần đầu tiên được phân lập từ chi Brucea. Từ thân và rễ cây đã phân lập được 11 hợp chất bao gồm: daucosterol (BM.13), axít tricosanoic (BM.14), isobrucein B (BM.15), cleomiscosin A (BM.16), 9-methoxycanthin-6-one (BM.17), 1β,6α-dihydroxy-4(14)- eudesmene (BM.18), niloticin (BM.19), dimethyl crenatin (BM.20), inosine (BM.21), bruceolline F (BM.22), leonuriside A (BM.23). Trong đó, các hợp chất axít tricosanoic (BM.14), cleomiscosin A (BM.16), 9-methoxycanthin- 6-one (BM.17), 1β,6α-dihydroxy-4(14)-eudesmene (BM.18), niloticin (BM.19), dimethyl crenatin (BM.20), inosine (BM.21) và leonuriside A (BM.23) lần đầu tiên được phân lập từ chi Brucea. 2. Đã phân lập và xác định cấu trúc của 4 hợp chất từ rễ cây Cơm rượu trái hẹp (Glycosmis stenocarpa (Drake) Guillaum) bao gồm: N-methylpyrrolidine-2- cacboxamit (GP.24), đường sucrose (GP.25), (±) p-synephrine (GP.26) và chất mới có tên khoa học là 4-{1-[α-L-arabinofuranosyl-(1''→4')-b-D- glucopyranosyl]-2-methylamino)ethyl}phenol (GP.27). 3. Đã đánh giá độc tính tế bào của dịch chiết MeOH tổng và các cặn chiết n- hexan, điclometan, dịch nước từ lá cây Khổ sâm mềm đối với 3 chủng tế bào ung thư phổi người (LU-1), ung thư gan người (Hep-G2) và ung thư vú (MCF-7). Dịch chiết MeOH cho tác dụng gây độc tế bào mạnh đối với dòng tế bào ung thư gan người Hep-G2 (IC50 =14,49 µg/ml). Cặn chiết n-hexan ức chế rất mạnh đối với cả ba dòng tế bào ung thư LU-1, Hep-G2 và MCF-7 với giá trị IC50 (µg/ml) lần lượt là 3,5; 1,03 và 5,8. 4. Đã nghiên cứu đánh giá hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được trên bốn dòng ung thư KB (ung thư biểu mô), LU-1 (ung thư phổi người), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến) và HL-60 (ung thư máu cấp tính). Phát hiện 3 hợp chất isobrucein B (BM.15), 9-methoxycanthin-6-one (BM.17) và niloticin (BM.19) có tác dụng gây độc tế bào rất mạnh với các giá trị IC50 (µg/ml) trong khoảng 0,23-3,73 (μg/ml). Trong đó hợp chất isobrucein B (BM.15) có hoạt tính mạnh nhất và cao hơn cả chất đối chứng dương ellipticine.