Tóm tắt Luận án Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài sao biển asterina batheri goto, 1914 và astropecten polyacanthus müller & troschel, 1842

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN HÓA SINH BIỂN TRẦN THỊ HỒNG HẠNH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC LOÀI SAO BIỂN ASTERINA BATHERI Goto, 1914 VÀ ASTROPECTEN POLYACANTHUS Müller & Troschel, 1842 Chuyên ngành: Hóa Hữu cơ Mã số : 62.44.01.14 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC Hà Nội - 2015 Công trình được hoàn thành tại:. Viện Hóa sinh biển Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. VS Châu Văn Minh 2. TS. Nguyễn Hoài Nam Viện Hóa sinh biển Phản biện 1: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện 2: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Phản biện 3: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện họp tại: Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam - Số 18 Hoàng Quốc Việt – Cầu Giấy – Hà Nội vào hồi giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án tại thư viện.. 1 I. GIỚI THIỆU LUẬN ÁN 1. Đặt vấn đề Trái đất là hành tinh của các đại dương. Với hơn 70% diện tích bề mặt trái đất được bao phủ bởi nước mặn đại dương cũng là nơi chiếm đến trên 90% thể tích khu vực sinh sống của trái đất và hầu hết các hoạt động của sự sống đều có liên quan đến cuộc sống dưới biển. Vì vậy không có gì đáng ngạc nhiên khi nói rằng môi trường biển chính là nơi ẩn chứa sự đa dạng sinh học loài lớn nhất. Từ đầu những năm 90 của thế kỷ trước, các nhà khoa học biển đã có cùng một mối quan tâm đó là khám phá nguồn tài nguyên sinh vật vô cùng phong phú dưới đáy đại dương. Tuy nhiên các nghiên cứu tại thời điểm đó thường không đầy đủ, tản mát và thiếu tính hệ thống. Từ đó dẫn tới hàng loạt tranh cãi giữa các nhà khoa học, bởi một số loài được tính nhiều lần, thậm chí hàng chục lần, khiến con số thống kê trở nên không chính xác. Những câu hỏi về sự đa dạng loài, nơi các sinh vật biển sinh sống và các mối quan hệ phức tạp giữa các loài sinh vật biển đã đưa đến một yêu cầu mới, cấp thiết về một nghiên cứu một cách có hệ thống toàn cầu. Việt Nam nằm ở ven bờ biển Đông với hơn 3260km chiều dài bờ biển chạy dọc từ Bắc tới Nam với hàng nghìn hòn đảo lớn nhỏ ven biển. Điều kiện địa lý đó đã đem lại nhiều thuận lợi, tiềm năng về nguồn tài nguyên thiên nhiên phong phú cho đất nước, tạo nên hệ sinh vật biển vô cùng phong phú, dồi dào cả về trữ lượng và thành phần loài. Ở Việt Nam, trong khoảng 30 năm trở lại đây, nguồn tài nguyên phong phú này mới bắt đầu thu hút đươc̣ sư ̣quan tâm của các nhà khoa học. Trong số các loài đôṇg thưc̣ vâṭ biển đã đươc̣ nghiên cứu , nhiều hơp̣ chất được phân lập thể hiện hoaṭ tính sinh hoc̣ cao và đáng quý như hoạt tính gây độc tế bào, hoạt tính ức chế các dòng tế bào ung thư thử nghiệm, hoạt tính chống oxy hóa, kháng viêm, kháng khuẩn. Sao biển là một loài sinh vật biển khá phổ biến ở các vùng biển Việt nam. Từ lâu sao biển đã được nhân dân ta sử dụng như là loại thực phẩm bổ dưỡng giúp tăng cường sức khỏe. Tuy nhiên các nghiên cứu khoa học gần đây đã chỉ ra rằng, ngoài tác dụng làm thực phẩm bổ dưỡng, các sản phẩm từ sao biển còn có tác dụng ngăn ngừa và điều trị bệnh. Ở Việt nam, các nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài sao biển còn rất hạn chế và để có thể sử dụng tối đa nguồn tài nguyên phong phú này cần có các nghiên cứu sâu hơn để làm cơ sở khoa học cho các ứng dụng trong thực tiễn 2 Điều này đã định hướng cho tác giả lựa chọn nội dung nghiên cứu luận án: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học loài sao biển Asterina batheri Goto, 1914 và Astropecten polyacanthus Müller & Troschel, 1842”. 2. Đối tƣợng nghiên cứu và nội dung của luận án Đối tượng nghiên cứu của luận án là 02 loài sao biển Asterina batheri và Astropecten polyacanthus. Nội dung chính của luận án là: 1. Nghiên cứu phân lập các hợp chất từ hai loài sao biển của Việt nam: Asterina batheri và Astropecten polyacanthus. 2. Xác định cấu trúc các hợp chất đã phân lập 3. Đánh giá hoạt tính sinh học các hợp chất phân lập được nhằm định hướng cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo. 3. Những đóng góp mới của luận án 3.1. Lần đầu tiên phân lập được 8 hợp chất mới từ hai loài sao biển nghiên cứu. Các hợp chất đó là: Astebatherioside A (AB1), Astebatherioside B (AB2), Astebatherioside C (AB3), Astebatherioside D (AB4), Astropectenol A (ASP1), Astropectenol B (ASP2), Astropectenol C (ASP3), Astropectenol D (ASP4). 3.2. Lần đầu tiên kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào in vitro của dịch chiết diclometan và 07 hợp chất phân lập từ loài A. polyacanthus đa ̃phát hiêṇ dịch chiết diclometan và 5 trong số 7 hợp chất thể hiện hoạt tính ức chế trên 3 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 từ 2,7  82,95 M. Trong đó hợp chất ASP7 và dịch chiết phân đoạn diclometan thể hiện hoạt tính ức chế mạnh trên dòng tế bào ung thư máu HL-60. 3.3. Lần đầu tiên cơ chế gây chết tế bào ung thư HL-60 ở cấp độ protein của hợp chất ASP7 và dịch chiết phân đoạn diclometan đã được nghiên cứu. Kết quả đã chỉ ra rằng hợp chất ASP7 và dịch chiết phân đoạn diclometan kích thích quá trình tế bào chết theo chương trình (appotosis). 3.4. Lần đầu tiên đánh giá hoạt tính kháng viêm thông qua việc ức chế sự sản sinh các yếu tố tiền gây viêm IL-12, IL-6 và TNF-α trên tế bào tua (đuôi gai) BMDC của 12 hợp chất phân lập từ 2 loài sao biển. Kết quả cho thấy các hợp chất phân lập từ loài A. polyacanthus thể hiện hoạt tính ức chế cả ba yếu tố tiền gây viêm với giá trị IC50 từ 1,82  34,86 M trong đó 3 hợp chất ASP1, ASP5 và ASP7 thể hiện hoạt tính mạnh nhất. 3 4. Bố cục của luận án Luận án gồm 115 trang với 18 bảng số liệu, 98 hình, 95 tài liệu tham khảo. Bố cục của luận án: Mở đầu (2 trang), Chương 1: Tổng quan tài liệu (28 trang), Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu (6 trang), Chương 3: Thực nghiệm (7 trang), Chương 4: Kết quả và thảo luận (61 trang), Kết luận và Kiến nghị (3 trang), Các công trình đã công bố (1 trang), Tài liệu tham khảo (7 trang) và Phụ lục phổ. II. NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ: Phần đặt vấn đề đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng, mục tiêu và nhiệm vụ nghiên cứu của luận án. CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Phần tổng quan tài liệu tập hợp các nghiên cứu trong nước và quốc tế về các vấn đề: 1.1. Giới thiệu chung về lớp sao biển (Asteroidea) 1.2. Tình nghiên cứu về các loài sao biển trên thế giới 1.3. Tình nghiên cứu về các loài sao biển ở Việt Nam CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Hai loài sao biển A. batheri và A. polyacanthus thu thập tại Cát Bà, Hải Phòng, Việt Nam. A. batheri A. polyacanthus 2.2. Phƣơng pháp phân lập các hợp chất Phối hợp các phương pháp sắc ký bao gồm: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký lớp mỏng điều chế và sắc ký cột (CC), sắc ký lỏng trung áp (MPLC) và cao áp (HPLC). 4 2.3. Phƣơng pháp xác định cấu trúc hoá học các hợp chất Phương pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm: phổ khối (ESI-MS) và phổ khối phân giải cao (FT-ICR-MS), độ quay cực ([]D), phổ cộng hưởng từ nhân (1D, 2D-NMR). 2.4. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro Hoạt tính gây độc tế bào của các hoạt chất được xác đ ịnh theo phương pháp MTT. 2.5. Đánh giá hoạt tính kháng viêm Hoạt tính kháng viêm của các hợp chất được đánh giá dựa trên khả năng ức chế sự sản xuất các yếu tố tiền gây viêm IL-12, IL-6 và TNF-α trên tế bào đuôi gai BMDC được kích thích bằng LPS. CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM 3.1. Phân lập các hợp chất Phần này trình bày cụ thể cách thức phân lập các hợp từ 02 mẫu sao biển A. batheri và A. polyacanthus. Việc phân tách các chất được nêu tóm tắt ở các sơ đồ hình 3.1, 3.2, 3.3. Hình 3.1. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài sao biển A. batheri 5 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn C1, C2 loài sao biển A. polyacanthus Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn C3, C4 loài sao biển A.polyacanthus 3.2. Hằng số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất 3.2.1. Hợp chất AB1: Astebatherioside A (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D 25 + 5,0 (c, 0,25, MeOH); Phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS m/z 842,32887 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C35H56O22N, 842,32940). 6 1 H-NMR và 13 C-NMR (xem bảng 4.2.2 phần luận giải) 3.2.2. Hợp chất AB2: Astebatherioside B (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D 25  2,3 (c, 0,25, MeOH); Phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS m/z 850,29569 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C34H53NO22Na, 850,29570) 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) H (ppm) Aglycon: 5,91 (br s, H-4), 6,85 (br s, H-5), 2,34 (s, H-2′), 11,15 (s, NH), Sugar: Qui I: 4,99 (d, J = 6,5 Hz, H-1′ʹ), 3,67 (H-2′′), 3,68 (H-3′′), 3,20 (H-4′′), 3,64 (H-5′′), 1,28 (d, J = 6,0 Hz, H-6′′). Qui II: 4,61 (d, J = 8,0 Hz, H-1′ʹ′), 2.96 (dd, J = 8,0, 9,0 Hz, H-2′ʹ′), 3,11 (H-3′ʹ′), 2,75 (t, J = 9,0 Hz, H-4′ʹ′), 3,10 (H-5′ʹ′), 1,05 (d, J = 6,0 Hz, H-6′ʹ′). Ara(p): 4,57 (d, J = 4,0 Hz, H-1′ʹ′′), 3,64 (H-2′ʹ′′), 3,66 (H-3′ʹ′′), 3,72 (br s, H-4′ʹ′′), 3,42 (dd, J = 4,0, 12,0 Hz, H-5′ʹ′′). Fuc: 4,31 (d, J = 6,5 Hz, H-1′ʹ′′′), 3,41 (H-2′ʹ′′′), 3,42 (H- 3′ʹ′′′), 3,55 (br s, H-4′ʹ′′′), 3,58 (H-5′ʹ′′′), 1,12 (d, J = 6,0 Hz, H-6′ʹ′′′). Ara(f): 5,03 (br s, H-1′ʹ′′′′), 3,90 (br s, H-2′ʹ′′′′), 3,65 (H-3′ʹ′′′′), 3,85 (H-4′ʹ′′′′), 3,44 và 3,51 (H- 5′ʹ′′′′) 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) C (ppm) Aglycon: 118,1 (C-2), 150,3 (C-3), 97,1 (C-4), 123,1 (C-5), 185,2 (C-1), 27,7 (C-2).Sugar: Qui I: 99,3 (C-1), 80,0 (C-2), 74,5 (C-3), 82,5 (C-4), 70,5 (C-5), 17,7 (C-6′′). Qui II: 103,2 (C-1), 74,6 (C-2), 76,1 (C-3), 75,2 (C-4), 71,7 (C-5), 17,6 (C-6). Ara(p): 100,5 (C-1), 79,4 (C-2), 71,0 (C-3), 65,8 (C-4), 63,3 (C-5). Fuc: 104,7 (C- 1), 70,2 (C-2), 79,3 (C-3), 70,6 (C-4), 69,9 (C-5), 16,3 (C-6). Ara(f): 109,0 (C-1), 81,3 (C-2), 77,6 (C-3), 85,0 (C-4), 61,6 (C- 5). 3.2.3. Hợp chất AB3: Astebatherioside C (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D 25 + 18,9 (c, 0,25, MeOH); Phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS m/z 418.17310 [M + H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C18H28NO10, 418,17132). 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) H (ppm) Aglycon: 5,92 (t, J = 3,0 Hz, H-4), 6,85 (t, J = 3,0 Hz, H-5), 2,32 (s, H-2′), 11,14 (s, NH), Sugar: Qui I: 4,96 (d, J = 7,5 Hz, H-1′ʹ), 3,55 (dd, J = 7,5, 9,0 Hz, H-2′′), 3,50 (H-3′′), 2,98 (H-4′′), 3,49 (H- 5′′), 1,17 (d, J = 6,5 Hz, H-6′′). Qui II: 4,52 (d, J = 8,0 Hz, H-1′ʹ′), 3,00 (H-2′ʹ′), 3,08 (H-3′ʹ′), 2,75 (t, J = 9,0 Hz, H-4′ʹ′), 3,07 (H-5′ʹ′), 0,99 (d, J = 6,5 Hz, H-6′ʹ′). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) C (ppm) Aglycon: 118,1 (C-2), 150,6 (C-3), 97,1 (C-4), 123,4 (C-5), 185,3 (C-1), 27,8 (C-2). Sugar: Qui I: 99,5 (C-1), 81,5 7 (C-2), 76,3 (C-3), 74,6 (C-4), 71,7 (C-5), 17,7 (C-6′′). Qui II: 103,8 (C-1), 74,8 (C-2), 76,1 (C-3), 75,2 (C-4), 71,9 (C-5), 17,7 (C-6). 3.2.4. Hợp chất AB4: Astebatherioside D (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D 25  1.0 (c, 0.25, MeOH); Phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS m/z 733,25355 [M + Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C30H46O19Na, 733,25310). 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) H (ppm) Aglycon: 6,71 (d, J = 2,0 Hz, H-4), 7,82 (d, J = 2,0 Hz, H-5), 2,34 (s, H-2′). Sugar: Qui I: 5,18 (d, J = 7,5 Hz, H-1′ʹ), 3,73 (H-2′′), 3,69 (H-3′′), 3,21 (t, J = 9,0 Hz, H-4′′), 3,72 (H-5′′), 1,34 (d, J = 6,5 Hz, H-6′′). Qui II: 4,58 (d, J = 8,0 Hz, H-1′ʹ′), 2.95 (dd, J = 8,0, 8,5 Hz, H-2′ʹ′), 3,10 (H-3′ʹ′), 2,75 (t, J = 8,5 Hz, H-4′ʹ′), 3,08 (H-5′ʹ′), 1,01 (d, J = 6,5 Hz, H-6′ʹ′). Fuc I: 4,42 (d, J = 7,0 Hz, H-1′ʹ′′), 3,56 (H-2′ʹ′′), 3,55 (H-3′ʹ′′), 3,48 (br s, H-4′ʹ′′), 3,70 (dd, J = 4,0, 12,0 Hz, H-5′ʹ′′), 1,15 (d, J = 6,0 Hz, H-6′′′′). Fuc II: 4,31 (d, J = 7,5 Hz, H-1′ʹ′′′), 3,32 (H-2′ʹ′′′), 3,32 (H-3′ʹ′′′), 3,40 (br s, H-4′ʹ′′′), 3,55 (H-5′ʹ′′′), 1,13 (d, J = 6,0 Hz, H-6′ʹ′′′). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) C (ppm) Aglycon: 136,9(C-2), 152,2 (C-3), 104,3 (C-4), 147,0 (C-5), 183,2 (C-1), 27,3 (C-2).Sugar: Qui I: 99,3 (C-1), 79,6 (C-2), 74,2 (C-3), 84,6 (C-4), 70,5 (C-5), 17,7 (C-6′′). Qui II: 103,0 (C- 1), 74,0 (C-2), 76,1 (C-3), 75,2 (C-4), 71,6 (C-5), 17,6 (C-6). Fuc I: 101,3 (C-1), 73,4 (C-2), 80,4 (C-3), 70,2 (C-4), 70,3 (C-5), 16,2 (C- 6′′′′). Fuc II: 105,2 (C-1), 71,9 (C-2), 73,2 (C-3), 70,9 (C-4), 70,3 (C- 5), 16,4 (C-6). 3.2.5. Hợp chất AB5: 3-[O--D-fucopyranosyl-(13)--D-fucopyranosyl- (14)-[-D-quinovopyranosyl-(12)]--D-quinovopyranosyl]-2-acetyl- pyrrole Chất bột màu trắng, [α]D 25 + 2 (c, 0.25, MeOH); 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) H (ppm) Aglycon: 5,90 (br s, H-4), 6,85 (br s, H-5), 2,34 (s, H-2′), 11,15 (s, NH). Sugar: Qui I: 4,99 (d, J = 6,5 Hz, H-1′ʹ), 3,70 (H-2′′), 3,71 (H-3′′), 3,20 (t, J = 9,0 Hz, H-4′′), 3,65 (H-5′′), 1,33 (d, J = 5,5 Hz, H-6′′). Qui II: 4,61 (d, J = 7,5 Hz, H-1′ʹ′), 2.95 (dd, J = 7,5, 9,0 Hz, H-2′ʹ′), 3,11 (H-3′ʹ′), 2,75 (t, J = 9,0 Hz, H-4′ʹ′), 3,10 (H-5′ʹ′), 1,05 (d, J = 5,5 Hz, H-6′ʹ′). Fuc I: 4,42 (d, J = 7,0 Hz, H-1′ʹ′′), 3,57 (H-2′ʹ′′), 3,56 (H-3′ʹ′′), 3,48 (br s, H-4′ʹ′′), 3,70 (dd, J = 4,0, 12,0 Hz, H-5′ʹ′′), 1,15 (d, J = 6,5 Hz, H-6′′′′). Fuc II: 4,31 (d, J 8 = 7,5 Hz, H-1′ʹ′′′), 3,34 (H-2′ʹ′′′), 3,33 (H-3′ʹ′′′), 3,39 (br s, H-4′ʹ′′′), 3,53 (H-5′ʹ′′′), 1,13 (d, J = 6,5 Hz, H-6′ʹ′′′). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) C (ppm) Aglycon: 118,2 (C-2), 150,3 (C-3), 97,1 (C-4), 123,2 (C-5), 185,2 (C-1), 27,7 (C-2). Sugar: Qui I: 99,3 (C-1), 79,7 (C-2), 78,9 (C-3), 84,8 (C-4), 70,3 (C-5), 17,7 (C-6′′). Qui II: 102,9 (C-1), 74,6 (C-2), 76,1 (C-3), 75,2 (C-4), 71,6 (C-5), 17,6 (C-6). Fuc I: 101,3 (C-1), 73,4 (C-2), 80,5 (C-3), 70,3 (C-4), 70,3 (C-5), 16,2 (C-6′′′′). Fuc II: 105,3 (C-1), 71,9 (C-2), 73,2 (C-3), 70,9 (C-4), 70,3 (C-5), 16,4 (C-6). 3.2.6. Hợp chất ASP1: Astropectenol A (chất mới) Chất bột màu trắng; [α]D 25 + 2,6 (c, 0,25, MeOH); FT-ICR-MS m/z 441,33458 [M+Na] + (tính toán lý thuyết cho công thức C27H46O3Na, 441,33447); 1 H-NMR và 13 C-NMR (xem bảng 4.2.3 phần luận giải) 3.2.7. Hợp chất ASP2: Astropectenol B (chất mới) Chất bột màu trắng; [α]D 25 3,4 (c, 0,25, MeOH); FT-ICR-MS m/z 455,31369 [M+Na] + (tính toán lý thuyết cho công thức C27H44O4Na, 455,31373); 1 H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz) H (ppm): 1,05 (m, Ha-1)/1,60 (m, Hb-1), 1,18 (m, Ha-2)/1,65 (m, Hb-2), 3,37 (m, H-3), 1,17 (m, Ha-4)/1,53 (m, Hb-4), 1,32 (m, H-5), 1,15 (m, Ha-6)/1,44 (m, Hb-6), 4,35 (dd, J = 5,5, 11,0 Hz, H-7), 1,62 (m, H- 9), 1,22 (m, Ha-11)/1,57 (m, Hb-11), 1,06 (m, Ha-12)/1,82 (m, Hb-12), 1,60 (m, Ha- 16)/1,85 (m, Hb-16), 1,17 (m, H-17), 1,04 (s, H-18), 0,65 (s, H-19), 1,44 (m, H- 20), 0,87 (d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,95 (m, Ha-22)/1,25 (m, Hb-22), 1,14 (m, Ha- 23)/1,25 (m, Hb-23), 1,10 (m, H-24), 1,50 (m, H-25), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, H-26), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, Hb-27), 4,54 (s, 3-OH), 6,35 (15-OH). 13 C-NMR (DMSO-d6, 125 MHz) C (ppm): 36,0 (C-1), 31,1 (C-2), 69,0 (C-3), 37,7 (C-4), 40,0 (C-5), 30,9 (C-6), 76,0 (C-7), 126,3 (C-8), 45,2 (C-9), 36,6 (C- 10), 19,3 (C-11), 38,2 (C-12), 42,0 (C-13), 139,3 (C-14), 101,6 (C-15), 40,2 (C- 16), 55,6 (C-17), 17,8 (C-18), 12,5 (C-19), 34,7 (C-20), 18,4 (C-21), 34,9 (C-22), 23,0 (C-23), 38,8 (C-24), 27,3 (C-25), 22,3 (C-26), 22,6 (C-27). 3.2.8. Hợp chất ASP3: Astropectenol C (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D 25 + 4,2 (c, 0,25, MeOH); 9 FT-ICR-MS m/z 415,32125 [M+H] + (tính toán lý thuyết cho công thức C27H43O3, 415,32122); 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H (ppm): 1,55 (m, Ha-1)/1,73 (m, Hb-1), 1,48 (m, Ha-2)/1,90 (m, Hb-2), 3,62 (m, H-3), 1,19 (m, Ha-4)/1,68 (m, Hb-4), 1,73 (m, H-5), 1,96 (m, Ha-6)/2,44 (dd, J = 7,0, 18,0 Hz, Hb-6), 1,98(m, H-11), 1,28 (m, Ha- 12)/2,32 (m, Hb-12), 6,23 (dd, J = 1,5, 3,5 Hz, H-15), 2,10 (ddd, J = 1,5, 7,5, 10,0 Hz, Ha-16)/2,36 (m, Hb-16), 1,45 (m, H-17), 0,77 (s, H-18), 0,97 (s, H-19), 1,55 (m, H-20), 0,90 (d, J = 6,5 Hz, H-21), 1,03 (m, Ha-22)/1,33 (m, Hb-22), 1,10 (m, Ha-23)/1,31 (m, Hb-23), 1,05 (m, Ha-24), 1,10 (m, Hb-24), 1,48 (m, H-25), 0,84 (d, J = 6,5 Hz, H-26), 0,82 (d, J = 6,5 Hz, Hb-27). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) C (ppm): 33,0 (C-1), 31,5 (C-2), 70,3 (C-3), 37,6 (C-4), 33,3 (C-5), 41,9 (C-6), 205,4 (C-7), 62,2 (C-8), 73,3 (C-9), 37,0 (C-10), 20,9 (C-11), 33,2 (C-12), 45,0 (C-13), 139,5 (C-14), 134,8 (C-15), 36,8 (C-16), 56,5 (C-17), 16,3 (C-18), 16,0 (C-19), 34,5 (C-20), 19,5 (C-21), 36,5 (C-22), 24,1 (C-23), 39,9 (C-24), 28,5 (C-25), 22,0 (C-26), 23,3 (C-27). 3.2.9. Hợp chất ASP4: Astropectenol D (chất mới) Chất bột màu trắng, [α]D 25 + 1,8 (c, 0,25, MeOH); FT-ICR-MS m/z 425,33996 [M+Na] + (tính toán lý thuyết cho công thức C27H46O2Na, 425,33955); 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H (ppm): 1,43 (m, Ha-1)/1,76 (m, Hb-1), 1,37 (m, Ha-2)/1,83 (m, Hb-2), 3,57 (m, H-3), 1,25 (m, Ha-4)/1,78 (m, Hb-4), 1,78 (m, H-5), 1,23 (m, Ha-6)/1,67 (m, Hb-6), 5,25 (dt, J = 2,0, 5,0 Hz, H-7), 1,55 (m, Ha- 11)/1,81 (m, Hb-11), 1,53 (m, Ha-12)/1,84 (m, Hb-12), 2,29 (m, H-14), 1,35 (m, Ha-15)/1,51 (m, Hb-15), 1,25 (m, H-16), 1,27 (m, H-17), 0,53 (s, H-18), 0,88 (s, H-19), 1,52 (m, H-20), 0,91 (d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,98 (m, Ha-22)/1,32 (m, Hb- 22), 1,11 (m, Ha-23)/1,31 (m, Hb-23), 1,10 (m, H-24), 1,51 (m, H-25), 0,85 (d, J = 6,5 Hz, H-26), 0,83 (d, J = 6,5 Hz, Hb-27). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) C (ppm): 30,0 (C-1), 32,0 (C-2), 71,1 (C-3), 38,5 (C-4), 33,7 (C-5), 30,4 (C-6), 121,9 (C-7), 141,1 (C-8), 74,4 (C-9), 39,4 (C-10), 27,7 (C-11), 36,3 (C-12), 44,2 (C-13), 51,6 (C-14), 23,6 (C-15), 28,5 (C-16), 56,5 (C-17), 11,6 (C-18), 15,6 (C-19), 36,7 (C-20), 19,3 (C-21), 36,6 (C-22), 24,4 (C- 23), 40,0 (C-24), 28,5 (C-25), 23,1 (C-26), 23,3 (C-27). 3.2.10. Hợp chất ASP5: 5α-cholest-7-ene-3β,6α-diol Chất bột màu trắng, [α]D 25 + 45 (c, 0.25, MeOH); 10 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H (ppm): 1,09 (m, Ha-1)/1,21 (m, Hb-1), 1,75 (m, Ha-2)/1,37 (m, Hb-2), 3,53 (m, H-3), 1,22 (m, Ha-4)/2,20 (m, Hb-4), 1,65 (m, H-5), 3,75 (br d, J = 7,0 Hz, H-6), 5,13 (br s, H-7), 1,21 (m, H-9), 1,56 (m, Ha- 11)/1,42 (m, Hb-11), 1,07 (m, Ha-12)/2,01 (m, Hb-12), 1,79 (m, H-14), 1,11 (m, Ha-15)/1,31 (m, Hb-15), 1,49 (m, Ha-16)/1,25 (m, Hb-16), 1,18 (m, H-17), 0,51 (s, H-18), 0,79 (s, H-19), 1,31 (m, H-20), 0,89 (d, J = 7,0 Hz, H-21), 1,30 (m, Ha- 22)/0,96 (m, Hb-22), 1,54 (m, Ha-23)/1,36 (m, Hb-23), 1,10 (m, Ha-24)/1,73 (m, Hb-24), 1,86 (m, H-25), 0,84 (d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,83 (d, J = 7,0 Hz, Hb-27). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) C (ppm): 39,7 (C-1), 31,2 (C-2), 70,9 (C-3), 34,1 (C-4), 48,9 (C-5), 70,1 (C-6), 122,4 (C-7), 141,5 (C-8), 49,5 (C-9), 35,5 (C-10), 21,7 (C-11), 39,8 (C-12), 43,9 (C-13), 55,1 (C-14), 24,2 (C-15), 28,3 (C-16), 56,5 (C-17), 12,3 (C-18), 14,3 (C-19), 36,5 (C-20), 19,2 (C-21), 36,4 (C-22), 23,2 (C- 23), 37,5 (C-24), 28,3 (C-25), 22,9 (C-26), 23,2 (C-27). 3.2.11. Hợp chất ASP6: 5α-cholest-8(14)-ene-3β,7α-diol Chất bột màu trắng, [α]D 25  85 (c, 0.25, MeOH); 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H (ppm): 1,60 (m, Ha-1)/1,63 (m, Hb-1), 1,30 (m, Ha- 2)/1,67 (m, Hb-2), 3,57 (m, H-3), 1,18 (m, Ha-4)/1,54 (m, Hb-4), 1,69 (m, H-5), 1,34 (m, Ha-6)/1,46 (m, Hb-6), 4,45 (br s, H-7), 2,02 (m, H-9), 1,41 (m, Ha- 11)/1,58 (m, Hb-11), 1,09 (m, Ha-12)/1,58 (m, Hb-12), 1,31 (m, Ha-15)/2,27 (m, Hb-15), 1,34 (m, Ha-16)/1,81 (m, Hb-16), 1,11 (m, H-17), 0,79 (s, H-18), 0,60 (s, H-19), 1,41 (m, H-20), 0,88 (d, J = 6,0 Hz, H-21), 1,03 (m, Ha-22)/1,10 (m, Hb- 22), 1,08 (m, Ha-23)/1,31 (m, Hb-23), 1,07 (m, Ha-24)/1,08 (m, Hb-24), 1,47 (m, H-25), 0,80 (d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,82 (d, J = 7,0 Hz, Hb-27). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) C (ppm): 36,8 (C-1), 31,8 (C-2), 71,4 (C-3), 38,3 (C-4), 37,7 (C-5), 36,1 (C-6), 67,2 (C-7), 128,9 (C-8), 44,7 (C-9), 37,3 (C-10), 19,9 (C-11), 37,3 (C-12), 43,5 (C-13), 148,7 (C-14), 25,6 (C-15), 27,4 (C-16), 57,0 (C-17), 18,5 (C-18), 12,5 (C-19), 34,9 (C-20), 19,6 (C-21), 36,5 (C-22), 24,3 (C-23), 40,1 (C-24), 28,5 (C-25), 23,3 (C-26), 23,1 (C-27). 3.2.12. Hợp chất ASP7: 5α-cholest-7,9(11)-diene-3β-ol Chất bột màu trắng, [α]D 25 + 15 (c, 0.25, MeOH); 1 H-NMR (CDCl3, 500 MHz) H (ppm): 1,94 (m, Ha-1)/1,34 (m, Hb-1), 1,47 (m, Ha- 2)/1,87 (m, Hb-2), 3,58 (m, H-3), 1,29 (m, Ha-4)/1,71 (m, Hb-4), 1,40 (m, H-5), 11 1,88 (m, Ha-6)/1,49 (m, Hb-6), 5,35 (br s, H-7), 5,44 (d, J = 6,5 Hz, H-11), 2,28 (m, Ha-12)/2,09 (m, Hb-12), 2,14 (m, H-14), 1,11 (m, Ha-15)/1,33 (m, Hb-15), 1,49 (m, Ha-16)/1,34 (m, Hb-16), 1,23 (m, H-17), 0,49 (s, H-18), 0,88 (s, H-19), 1,33 (m, H-20), 0,90 (d, J = 7,0 Hz, H-21), 1,37 (m, Ha-22)/0,99 (m, Hb-22), 1,73 (m, Ha-23)/1,36 (m, Hb-23), 1,12 (m, Ha-24)/1,08 (m, Hb-24), 1,50 (m, H-25), 0,84 (d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,83 (d, J = 7,0 Hz, Hb-27). 13 C-NMR (CDCl3, 125 MHz) C (ppm): 35,3 (C-1), 32,2 (C-2), 71,6 (C-3), 38,4 (C-4), 39,8 (C-5), 29,9 (C-6), 120,9 (C-7), 136,9 (C-8), 144,5 (C-9), 36,3 (C-10), 119,2 (C-11), 42,9 (C-12), 42,9 (C-13), 52,2 (C-14), 24,5 (C-15), 29,0 (C-16), 56,9 (C-17), 11,8 (C-18), 20,1 (C-19), 36,7 (C-20), 19,0 (C-21), 36,7 (C-22), 23,8 (C-23), 40,1 (C-24), 28,6 (C-25), 22,4 (C-26), 23,2 (C-27). 3.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất 3.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro * Nơi thực hiện: Phòng Hóa hợp chất thiên nhiên, Khoa Dược, Trường Đại học Chungnam, Hàn Quốc. 3.3.2. Hoạt tính kháng viêm * Nơi thực hiện: Phòng Hóa hợp chất thiên nhiên, Khoa Dược, Trường Đại học Chungnam, Hàn Quốc. CHƢƠNG 4. THẢO LUẬN KẾT QUẢ 4.1. Phân lập các hợp chất Phân lập các hợp chất theo các phương pháp thường quy hiện đang thực hiện tại Viện Hóa sinh biển. 4.2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất Phần này trình bày chi tiết kết quả phân tích phổ và xác định cấu trúc của 12 hợp chất được phân lập từ hai loài sao biển A. batheri và A.polyacanthus, trong đó có 8 hợp chất mới và 4 hợp chất đã biết. * Bảng 4.2.1 Tổng hợp cấu trúc các hơp̣ chất phân lâ ̣ p đươc̣ từ 2 loài sao biển trong khuôn khổ của luâṇ án : 12 Các hợp chất phân lập từ loài sao biển A. batheri AB1: Astebatherioside A (chất mới) AB2: Astebatherioside B (chất mới) AB3: Astebatherioside C (chất mới) AB4: Astebatherioside D (chất mới) AB5: 3-[O--D-fucopyranosyl-(13)--D-fucopyranosyl-(14)-[-D- quinovopyranosyl-(12)]--D-quinovopyranosyl]-2-acetyl-pyrrole Các hợp chất phân lập từ loài sao biển A. polyacanthus ASP1: Astropectenol A (chất mới) ASP2: Astropectenol B (chất mới) ASP3: Astroptectenol C (chất mới) ASP4: Astroptectenol D (chất mới) 13 * Dưới đây trình bày chi tiết phương pháp xác định cấu trúc của 2 hợp chất mới  Hợp chất AB1 (Astebatherioside A) Hợp chất AB1 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C35H55O22N trên cơ sở sự xuất hiện píc ion phân tử tại m/z 842,32887 [M + H] + (tính toán lý thuyết cho công thức C35H56O22N, 842,32940) trên phổ khối lượng phân giải cao FT-ICR-MS. Trên phổ 1H NMR xuất hiện các tín hiệu đặc trưng của một nhóm acetoxyl metyl [H 2,34 (3H, s, H- 2)], một proton amin [H 11,15 (1H, s, NH)] và hai proton olefinic [H 5,90 (H-4) và 6,85 (H-5); mỗi tín hiệu 1H, br s] gợi ý cho sự có mặt của một aglycon dạng khung pyrrole có chứa nhóm thế acetyl. Nhận định này được chứng minh bởi sự xuất hiện các tín hiệu cacbon tại C 118,2 (C, C-2), 150,3 (C, C-3), 97,2 (CH, C- 4), 123,2 (CH, C-5), 185,2 (C, C-1), và 27,7 (CH3, C-2) (Zhang et al., 2006) và bằng phân tích chi tiết các tương tác trên phổ COSY và HMBC (hình 4.2.2, 4.2.7 và 4.2.8). Hình 4.2.1: Cấu trúc hóa học của AB1 Hình 4.2.2: Một số tương tác COSY và MHBC của AB1 ASP5: 5α-cholest-7-ene-3β,6α-diol ASP6: -cholest-8(14)-ene-3β,7α-diol ASP7: 5α-cholest-7,9(11)-diene-3β-ol 5α 14 Hình 4.2.4: Phổ 1H NMR của hợp chất AB1 Hình 4.2.3: Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất AB1 Hình 4.2.5: Phổ 13C NMR của hợp chất AB1 Hình 4.2.6: Phổ HSQC của hợp chất AB1 Hình 4.2.7: Phổ HMBC của hợp chất AB1 Hình 4.2.8: Phổ COSY của hợp chất AB1 Ngoài ra, năm tín hiệu cacbon anome xuất hiện tại C 99,3 (C-1), 102,9 (C- 1), 101,3 (C-1), 105,1 (C-1) và 109,0 (C-1), có tương tác với các proton nome tương ứng tại H 4,98 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-1), 4,61 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-1), 4,41 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-1), 4,38 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-1) và 5,02 (1H, br s, H-1) trên phổ HSQC, khẳng định cho sự có mặt của 5 đơn vị đường. Trên phổ 1H NMR, bốn tín hiệu metyl gắn với CH (mỗi tín hiệu d, J = 6,0 Hz ) xuất hiện tại H 1,33 (3H, H-6), 1,05 (3H, H-6), và 1,14 (6H, H-6 và H- 6) gợi ý cho sự xuất hiện của 4 đơn vị đường quinovose và/hoặc fucose. Số liệu phổ 1H và 13C NMR hoàn toàn tương tự như các số liệu của 3-[O--D- fucopyranosyl-(13)--D-fucopyranosyl-(14)-[-D-quinovopyranosyl- (12)]--D-quinovopyranosyl]-2-acetyl-pyrrole (Zhang et al., 2006) ngoại trừ việc xuất hiện thêm các tín hiệu của một phân tử đường. Số liệu phổ 13C NMR của đơn vị đường xuất hiện thêm tại C 109,0 (CH, C-1), 81,3 (CH, C-2), 77,5 15 (CH, C-3), 85,2 (CH, C-4) 61,7 (CH2, C-5) và giá trị hằng số tương tác nhỏ (J ~ 0 Hz) của proton anome H-1 tại H 5,02 chứng minh sự có mặt của một đơn vị arabinofuranosyl và liên kết đường có cấu hình α (Iorizzi et al., 1995b). Phân tích chi tiết các tương tác trên phổ 1H–1H COSY cho phép gán toàn bộ giá trị proton của các đơn vị đường. Kết quả này cùng với tương tác HMBC giữa H-1 (H 4,98) và C-3 (C 150,3), giữa H-1 (H 4,61) và C-2 (C 78,9), giữa H- 1 (H 4,41) và C-4 (C 84,9) và giữa H-1 (H 4,38) và C-3 (C 80,3) chứng minh hai đường quinovose và hai đường fucose có vị trí liên kết trong chuỗi đường giống với hợp chất 3-[O--D-fucopyranosyl-(13)--D- fucopyranosyl-(14)-[-D-quinovopyranosyl-(12)]--D-quinovopyranosyl]-2- acetyl-pyrrole (Zhang et al., 2006). Tín hiệu cacbon C-3 của AB1 tại C 79,2 bị dịch chuyển mạnh về phía vùng trường thấp so với 3-[O--D-fucopyranosyl- (13)--D-fucopyranosyl-(14)-[-D-quinovopyranosyl-(12)]--D- quinovopyranosyl]-2-acetyl-pyrrole (Zhang et al., 2006) tại C 73,1 (C-3) gợi ý cho vị trí liên kết của đơn vị đường arabinofuranose tại cacbon này (De Marino et al., 2003). Dự đoán này được khẳng định bằng tương tác HMBC giữa H-1 (H 5,02) và C-3 (C 79,2). Như vậy, cấu trúc hóa học của AB1 được xác định là 3- [O--L-arabinofuranosyl-(13)--D-fucopyranosyl-(13)--D-fucopyranosyl- (14)-[-D-quinovopyranosyl-(12)]--D-quinovopyranosyl]-2-acetyl-pyrrole. Đây là một hợp chất pyrrole oligoglycosit mới và được đặt tên là astebatherioside A. Bảng 4.2.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất AB1 C aC C b,c H b,d, dạng píc (J = Hz) HMBC (H  C) Aglycon 2 118,0 118,2 - 3 150,3 150,3 - 4 97,1 97,2 5,90 br s 2, 5 5 123,1 123,2 6,85 br s 2, 3, 4 1' 185,2 185,2 - 2' 27,9 27,7 2,34 s 2, 1' NH 11,15 s 2, 3, 4 Qui I 1'' 99,3 99,3 4,98 d (7,0) 3 2'' 74,6 78,9 3,70 16 3'' 78,8 74,6 3,70 4'' 85,0 84,9 3,20 t (9,0) 5'' 70,2 70,3 3,65 6'' 17,7 17,7 1,33 d (6,0) 4'', 5'' Qui II 1''' 102,9 102,9 4,61 d (7,5) 2'' 2''' 74,6 74,7 2,95 dd (7,5, 9,0) 3''' 76,0 76,1 3,11 4''' 75,1 75,2 2,76 t (9,0) 5''' 71,6 71,6 3,10 6''' 17,7 17,6 1,05 d (6,0) 4''', 5''' Fuc I 1'''' 101,4 101,3 4,41 d (6,5) 4'' 2'''' 73,3 73,4 3,56 3'''' 80,5 80,3 3,56 4'''' 70,3 70,4 3,65 5'''' 70,3 70,3 3,70 6'''' 16,3 16,2 1,14 d (6,0) 4'''', 5'''' Fuc II 1''''' 105,4 105,1 4,38 d (6,5) 3'''' 2''''' 71,9 71,0 3,43 3''''' 73,1 79,2 3,43 4''''' 70,9 70,6 3,48 5''''' 70,2 70,1 3,56 6''''' 16,5 16,3 1,14 d (6,0) 4''''', 5''''' Ara(f) 1'''''' 109,0 5,02 br s 3''''' 2'''''' 81,3 3,91 br s 3'''''' 77,5 3,65 4'''''' 85,2 3,86 dd (5,0, 9,0) 5'''''' 61,7 3,43/3,51 aC of 3-[O--D-fucopyranosyl-(13)--D-fucopyranosyl-(14)-[-D-quinovopyranosyl-(12)]--D- quinovopyranosyl]-2-acetyl-pyrrole(Zhang et al., 2006), bđo trong DMSO-d6, c 125 MHz, d 500 MHz  Hợp chất ASP1 Hợp chất ASP1 được phân lập dưới dạng chất bột màu trắng. Công thức phân tử của nó được xác định là C27H46O3, trên cơ sở sự xuất hiện của pic ion phân tử tại m/z 441,33458 [M+Na] + trên phổ khối lượng phân giải cao (Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrum: FT-ICR-MS). Các phổ 1H- và 13C-NMR của hợp chất này đặc trưng cho một hợp chất thuộc dạng khung steroid, một lớp chất rất phổ biến đã được công bố từ các loài sao biển. Sự xuất hiện của một nhóm 17 oxymetin và một nhóm aldehit được xác định tương ứng bởi các tín hiệu proton cộng hưởng tại H 3,70 (1H, m, H-3) và 9,81 (1H, d, J = 3,0 Hz, H-6) trên phổ 1 H- NMR đo trong CDCl3. Ngoài ra, hai nhóm metyl gắn với cacbon không mang hydro [H 0,84 (H-18) và 0,73 (H-19), mỗi tín hiệu 3H, s] và ba nhóm metyl gắn với CH [H 0,87 (H-21), 0,84 (H-26) và 0,82 (H-27), mỗi tín hiệu 3H, d, J = 6,5 Hz] được xác định trên phổ 1H-NMR gợi ý cho sự có mặt của một hợp chất sterol dạng khung cholestan. Hình 4.2.9: Cấu trúc hóa học của ASP1 Hình 4.2.10: Một số tương tác COSY và MHBC của ASP1 Hình 4.2.12: Phổ 1H NMR của hợp chất ASP1 Hình 4.2.11: Phổ khối lượng phân giải cao của hợp chất ASP1 Hình 4.2.13: Phổ 13C NMR của hợp chất ASP1 Hình 4.2.14: Phổ HSQC của hợp chất ASP1 Hình 4.2.15: Phổ HMBC của hợp chất ASP1 Hình 4.2.16: Phổ COSY của hợp chất ASP1 18 Hình 4.2.17: Phổ ROESY của hợp chất ASP1 Hình 4.2.18 Các tương tác ROESY chính của hợp chất ASP1 Trên phổ 13C-NMR (CDCl3) xuất hiện 27 tín hiệu cacbon bao gồm một nhóm oxymetin [C 71,8 (CH, C-3)], một aldehyde [C 206,3 (CH, C-6)] và một cacbon bậc bốn mang ôxi [C 87,4 (C, C-8)]. Tất cả các số liệu phổ 13 C-NMR được gán với số liệu phổ 1H-NMR tương ứng trên cơ sở phân tích phổ HSQC (Bảng 4.2.3). Số liệu phổ 1H và 13C-NMR của ASP1 tương tự như các số liệu tương ứng của hợp chất 8-hydroxy-B-norconicasta-6α-aldehyde (Zhang et al., 2010) gợi ý cho vị trí của nhóm aldehyde tại C-6 và hai nhóm OH tại C-3 và C-8. Để xác định chính xác cấu trúc hóa học của ASP1, các phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều đã được đo lại trong dung môi DMSO-d6. Phân tích các tương tác trên phổ 1H-1H COSY (DMSO-d6) cho phép ghép nối các mảnh cấu trúc H2-1/H2-2/H-3/H2-4/H2-5/H-7/H-6, H-9/H2-11/H2-12, H-14/H2-15/H2-16/H- 17/H-20/H3-21, H-20/H2-22/H2-23/H2-24/H-25/H3-26 và H-25/H3-27. Kết quả này, cùng với các tương tác HMBC (đo trong DMSO-d6) giữa H-18 (H 0,77) và C-12 (C 35,6)/C-13 (C 44,1)/C-14 (C 57,3)/C-17 (C 55,0), H-19 (H 0,63) và C- 1 (C 36,6)/C-5 (C 44,0)/C-9 (C 60,7)/C-10 (C 41,2), H-7 (H 2,02)/C-8 (C 85,2) và 8-OH (H 4,46) và C-8 (C 85,2)/C-9 (C 60,7)/C-14 (C 57,3), cho phép xác định chính xác cấu trúc phẳng của ASP1. 19 Bảng 4.2.3. Số liệu phổ NMR của ASP1 C aδC δC b,c δC c,e δH d,e dạng pic (J = Hz) HMBC (H  C) 1 37,3 36,6 1,20 m/1,59 m 2 31,3 30,7 1,20 m/1,65 m 3 71,8 69,8 3,43 m 4 33,0 32,3 1,12 m/1,54 m 5 51,9 46,0 44,0 2,00 m 6 205,0 206,3 205,5 9,64 d (3,0) 7 7 60,1 63,6 63,2 2,02 dd (11,0, 3,0) 8 8 87,2 87,4 85,2 - 9 62,9 63,3 60,7 1,62 m 10 44,6 42,0 41,2 - 11 19,7 19,7 18,9 1,22 m/1,40 m 12 36,4 37,0 35,6 1,50 m/1,57 m 13 44,8 45,2 44,1 - 14 58,1 58,2 57,3 1,45 m 15 22,0 22,7 21,5 1,52 m/1,58 m 16 29,6 30,1 29,3 1,20 m/1,75 m 17 56,9 57,3 55,0 1,60 m 18 22,0 22,5 21,7 0,77 s 12, 13, 14, 17 19 14,9 14,6 13,9 0,63 s 1, 5, 9, 10 20 35,0 35,3 34,1 1,32 m 21 18,6 19,1 18,6 0,86 d (6,5) 17, 20, 22 22 36,9 36,1 0,98 m/1,31 m 23 24,5 23,4 1,15 m/1,30 m 24 39,9 39,7 1,10 m 25 28,5 27,4 1,50 m 26 23,0 22,3 0,84 d (6,5) 24, 25, 27 27 23,3 22,6 0,82 d (6,5) 24, 25, 26 8-OH - 4,46 s 8, 9, 14 aδC của 8β-hydroxy-B-norconicasta-6α-aldehyde (Zhang et al., 2010), bđo trong CDCl3, c 125 MHz, d 500 MHz, eđo trong DMSO-d6. Giá trị độ dịch chuyển hóa học 13C-NMR của C-3 (đo trong CDCl3) tại C 71,8 đặc trưng cho cấu hình  của nhóm OH tại C-3 (Miyaoka et al., 1997). Cấu hình tương đối tại C-7 và C-8 của ASP1 được xác định giống với hợp chất 8- hydroxy-B-norconicasta-6α-aldehyde (Zhang et al., 2010) bởi sự phù hợp về số 20 liệu phổ 1H và 13C-NMR giữa hai hợp chất và được khẳng định thêm bằng kết quả phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều tương tác không gian ROESY (rotating- frame overhauser spectroscopy) đo trong DMSO-d6. Các tương tác ROESY (Hình 4.2.17) giữa H-19 (H 0,63) và H-7 (H 2,02), 8-OH (H 4,46) và H-7 (H 2,02)/H- 18 (H 0,77) xác định cho cấu hình  của H-7 và 8-OH. Ngoài ra, proton H-5 (H 2,00) có tương tác ROESY với H-3 (H 3,43) và H-6 (H 9,64) cho phép xác định H-3, H-5 và H-6 cùng có cấu hình α. Từ các phân tích đã nêu, cấu trúc hóa học của hợp chất ASP1 được xác định là 3β,8β-dihydroxy-B-norcholest-7α- carboxaldehyde. Đây là một hợp chất mới và được đặt tên là astropectenol A. *Bằng phương pháp tương tự như trên, phối hợp các kết quả của các phép đo phổ ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC, 1 H- 1 H COSY, ROESY, FT-ICR-MS) đã xác định được đầy đủ cấu trúc hóa học của 12 hợp chất được phân lập từ loài 02 loài sao biển A. batheri và A. polyacanthus. 4.3. Kết quả thử hoạt 4.3.1. Hoạt tính gây độc tế bào in vitro Kết quả đánh giá hoaṭ tính gây đôc̣ tế bào của dịch chiết CH2Cl2 và các hợp chất phân lập được từ loài sao biển Astropecten polyacanthus trên các dòng tế bào ung thư máu (HL-60), ung thư tuyến tiền liệt (PC-3) và ung thư ruột kết (SNU- C5). Kết quả thu được (bảng 4.3.1) cho thấy, với dòng SNU-C5, chỉ có hợp chất ASP1 và ASP4 có biểu hiện hoạt tính. Các hợp chất ASP1, ASP3-ASP5, ASP7 và phân đoạn diclorometan ASP-C đều thể hiện hoạt tính trên hai dòng tế bào HL- 60 và PC-3. Trong đó, hợp chất ASP7 và dịch chiết ASP-C thể hiện hoạt tính rất tốt trên dòng tế bào ung thư máu HL-60 với giá trị IC50 tương ứng là 2,70 µM và 8,29 µg/ml, hoạt tính này cao hơn cả chất chuẩn dương được sử dụng là mitoxantrone (IC50 = 6,80 µM). Với hoạt tính mạnh và chọn lọc trên dòng tế bào ung thư HL-60, hợp chất ASP7 và phân đoạn ASP-C được lựa chọn để đánh giá khả năng kích thích quá trình tế bào chết theo chương trình (apoptosis). Bảng 4.3.1. Kết quả đánh giá hoạt tính diệt tế bào ung thư của các hợp chất trên các dòng tế bào 21 Bảng 4.3.1. Kết quả thử hoạt tính trên các dòng tế bào Hợp chất IC50 trên dòng tế bào (µM) HL-60 (máu) PC-3 (tuyến tiền liệt) SNU-C5 (ruột kết) ASP1 27,91 ± 1,37 31,29 ± 0,75 45.49 ± 7.40 ASP2 (-) (-) (-) ASP3 39,12 ± 3,11 64,10 ± 0,41 (-) ASP4 27,85 ± 1,70 41,19 ± 2,64 74.45 ± 3.15 ASP5 28,99 ± 1,19 82,95 ± 5,02 (-) ASP6 (-) (-) (-) ASP7 2,70 ± 0,05 27,28 ± 1,57 (-) ASP-C b 8,29 ± 0,20 25,42 ± 0,84 (-) Mitoxantrone a 6,80 ± 0,90 5,17 ± 0,34 17.96 ± 4.40 aChất chuẩn dương, bphân đoạn diclometan và số liệu biểu thị bằng đơn vị µg/ml 4.3.2. Kết quả đánh giá khả năng kích thích quá trình tế bào chết theo chƣơng trình (apoptosis) Các đặc điểm đặc trưng của quá trình apoptosis được đánh giá sau khi tế bào HL-60 được xử lý với phân đoạn ASP-C (1 và 10 µg/mL) và hợp chất ASP-5 (1 và 10 µM) trong 24 giờ. Phân tích tế bào (flow cytometric analysis) cho thấy phần trăm các tế bào tăng lên ở giai đoạn sub-G1 lần lượt là 17,21 và 43,42% (hình 4.2.2a) khi được xử lý tương ứng với phân đoạn ASP-C (10 µg/mL) và hợp chất ASP7 (10 µM). Điều này cho thấy phân đoạn ASP-C và hợp chất ASP7 kích thích quá trình apoptosis ở tế bào HL-60 và được xác nhận thêm bởi sự gia tăng các thể apoptosis ở các tế bào được xử lý khi nhuộm với thuốc nhuộm Hoechst 33342. Để xác định cơ chế có thể của sự kích thích apoptosis, chúng tôi đánh giá sự biểu hiện của các prototein liên quan đến apoptosis như Bcl-2, Bax, caspase-3, caspase-9 và poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) ở các tế bào HL-60 khi được xử lý với phân đoạn ASP-C (1 và 10 µg/ml) và hợp chất ASP7 (1 và 10 µM). Sự gia tăng mức độ biểu hiện của Bax l, và sự suy giảm mức độ biểu hiện của các protein Bcl-2, caspase-9, caspase-3, PARP đồng thời là sự gia tăng các protein được hoạt hóa: caspase-9, caspase-3, PARP phụ thuộc nồng độ đã được phát hiện. 22 Ngoài ra, hoạt hóa con đường ERK 1/2 đóng góp cho việc làm bền hóa C- myc, một protetin có khả năng gây ung thư. Tế bào HL-60 khi được sử lý với phân đoạn ASP-C và hợp chất ASP7 đã làm giảm mức độ biểu hiện của phospho- ERK1/2 và C-myc. Như vậy phân đoạn ASP-C và hợp chất ASP7 thúc đẩy quá trình apoptosis thông qua việc điều tiết giảm con đường ERK 1/2 và C-myc ở tế bào HL-60. Các kết quả này cho thấy phân đoạn ASP-C và hợp chất ASP7 kích thích quá trình apoptosis thông qua sự làm thay đổi mức độ biểu hiện của các protein liên quan đến quá trình apoptosis. 4.3.3 . Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm Hoạt tính kháng viêm được đánh giá dựa trên khả năng ức chế sự sản sinh của các cytokine tiền viêm (IL-12 (Interleukin-12) p40, IL-6 (interleukin-6) và yếu tố hoại tử khối u TNF-α (tumor necrosis factor α) ) trên tế bào đuôi gai (tế bào tua) có nguồn gốc tủy xương BMDCs được kích thích bằng LPS của các hợp chất phân lập được từ các loài sao biển Asterina batheri và Astropecten polyacanthus. Kết quả đánh giá (bảng 4.3.3) cho thấy hợp chất ASP4 và phân đoạn diclometan thể hiện khả năng ức chế mạnh sự sản sinh L-12 p40; Hai hợp chất ASP1 và ASP7 ức chế mạnh sự sản sinh IL-12 p40 và IL-6; ASP5 ức chế mạnh sự sản sinh IL-12 p40 và TNF-α. Các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính trung bình hoặc không có biểu hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh các cytokine tiền viêm được nghiên cứu. 23 Bảng 4.3.3. Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất Hợp chất Giá trị IC50 (μM) IL-12 p40 IL-6 TNF-α ASP1 3,96 ± 0,12 4,07 ± 0,13 (-) ASP2 34,86 ± 1,31 (-) (-) ASP3 6,55 ± 0,18 (-) 22,80 ± 0,21 ASP4 5,06 ± 0,16 16,73 ± 0,25 (-) ASP5 1,82 ± 0,11 5,76 ± 0,14 4,94 ± 0,12 ASP6 79.05 ± 2.05 (-) (-) ASP7 3,90 ± 0,14 2,61 ± 0,10 7,00 ± 0,16 ASP-C b 1,27 ± 0.11 8.82 ± 0018 11.48 ± 0.16 ASP-M b 11.47 ± 0.16 20.28 ± 0.22 36.99 ± 0.24 AB2 36,4 ± 0,25 (-) (-) AB3 31,1 ± 0,18 (-) (-) AB4 22,8 ± 0,15 (-) (-) SB203580 a 5,00 ± 0,16 3,50 ± 0,12 7,20 ± 0,13 aChất chuẩn dương, bsố liệu biểu thị bằng đơn vị µg/ml KẾT LUẬN 1. Về nghiên cứu hóa học Đã phân lập được tổng cộng 12 hợp chất từ hai loài sao biển, trong đó 5 hợp chất từ loài sao biển A. batheri và 7 hợp chất từ loài sao biển A. polyacanthus. Dựa vào các phương pháp phổ hiện đại, cấu trúc hóa học của chúng được xác định như sau:  Astebatherioside A (AB1)  Astebatherioside B (AB2)  Astebatherioside C (AB3)  Astebatherioside D (AB4)  3-[O--D-fucopyranosyl-(13)--D-fucopyranosyl-(14)-[-D- quinovopyranosyl-(12)]--D-quinovopyranosyl]-2-acetyl-pyrrole (AB5)  Astropectenol A (ASP1) 24  Astropectenol B (ASP2)  Astropectenol C (ASP3)  Astropectenol D (ASP4)  5α-cholest-7-ene-3β,6α-diol (ASP5)  5α-cholest-8(14)-ene-3β,7α-diol (ASP6)  5α-cholest-7,9(11)-diene-3β-ol (ASP7) Trong đó có 8 hợp chất mới là AB1-AB4 và ASP1-ASP4. Các hợp chất thu được từ loài A. polyacanthus đều là các sterol, một lớp chất rất phổ biến trong các loài sao biển. Trong 7 hợp chất thu được có 4 hợp chất mới, các hợp chất này đều là các steroid tuy nhiên đã có sự biến đổi ở một số vị trí trong khung tạo nên sự khác biệt so với các sterol đã được phân lập trước đây: đó là sự chuyển vị vòng B từ vòng 6 thành vòng 5 (ASP1), sự nối cầu peroxit tại vị trí C-7/C-15 (ASP2), sự xuất hiện cầu epoxy tại C-8/C-9 và nhóm keton tại C-7 (ASP3) cũng như sự xuất hiện nhóm thế hydroxyl tại vị trí C-9 (ASP4). Cấu trúc các hợp chất này ngoài việc được chứng minh bằng các phương pháp phổ (NMR, FT-HR-MS) thì còn được giải thích dựa trên con đường sinh tổng hợp lý thuyết của các hợp chất sterol phân lập từ loài sao biển A. polyacanthus. 2. Về nghiên cứu hoạt tính sinh học 2.1. Đã khảo sát hoạt tính gây độc tế bào in vitro của phân đoạn CH2Cl2 và 7 hợp chất từ loài sao biển A. polyacanthus và khả năng kích thích quá trình chết tế bào theo chu trình (apoptosis). Kết quả cho thấy: - Hợp chất ASP1 và ASP4 thể hiện hoạt tính yếu trên dòng tế bào SNU-C5. Các hợp chất ASP1, ASP3-ASP5, ASP7 và phân đoạn diclorometan ASP-C đều thể hiện hoạt tính trên hai dòng tế bào HL-60 và PC-3, trong đó hợp chất ASP7 và dịch chiết ASP-C thể hiện hoạt tính rất tốt trên dòng tế bào ung thư máu HL-60 với giá trị IC50 tương ứng là 2,70 µM và 8,29 µg/ml, hoạt tính này cao hơn cả chất chuẩn dương được sử dụng là mitoxantrone (IC50 = 6,80 µM). - Ở nồng độ 1 và 10 µM (đối với ASP7) và nồng độ 1 và 10 µg/ml (đối với ASP-C) quá trình apoptosis được thúc đẩy ở giai đoạn sub-G1 thông qua mức độ biểu hiện của các protein liên quan như: sự gia tăng mức độ biểu hiện của Bax l, và sự suy giảm mức độ biểu hiện của các protein Bcl-2, sự phân cắt 25 caspase-9, sự phân cắt caspase-3, sự phân cắt PARP và việc điều tiết giảm con đường ERK ½ và C-myc ở tế bào HL-60. 2.2. Đánh giá hoạt tính kháng viêm dựa trên ảnh hưởng ức chế sự sản sinh các cytokine tiền viêm của 12 hợp chất trên tế bào tua (đuôi gai) BMDCs được kích thích bằng LPS. Kết quả cho thấyhợp chất ASP4 thể hiện khả năng ức chế mạnh sự sản sinh L-12 p40; Hai hợp chất ASP1 và ASP7 ức chế mạnh sự sản sinh IL-12 p40 và IL-6; ASP5 ức chế mạnh sự sản sinh IL-12 p40 và TNF-α. Các hợp chất còn lại thể hiện hoạt tính trung bình hoặc không có biểu hiện hoạt tính ức chế sự sản sinh các cytokine tiền viêm được nghiên cứu. KIẾN NGHỊ Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu về hai loài sao biển của Việt nam A. batheri và A. polyacanthus. Các steroid phân lập từ loài A. polyacanthus thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cũng như hoạt tính kháng viêm rất thú vị. Bên cạnh đó các hợp chất phân lập từ loài A. batheri là các pyrrole và furan oligoglycoside rất hiếm gặp từ các loài sao biển. Do vậy, từ công trình nghiên cứu này tác giả có một số kiến nghị sau: - Đối với loài sao biển A. polyacanthus: cần có những nghiên cứu sâu hơn nữa về thành phần hóa học để từ đó có thể phát triển thành các sản phẩm phục vụ cho việc bồi bổ, nâng cao sức khỏe và phòng ngừa, hỗ trợ điều trị các căn bệnh như ung thư, viêm nhiễm - Đối với loài sao biển A. batheri: cần có những nghiên cứu tiếp theo về thành phần hóa học loài sao biển này để tìm ra yếu tố đặc trưng và phát sinh loài về mặt sinh thái học. 26 Các công trình công bố có liên quan đến luận án 1. Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Bui Thi Thuy Luyen, Nguyen Hoai Nam, Pham Van Cuong, Nguyen Van Thanh, Nguyen Xuan Nhiem, Tran Thi Hong Hanh, Eun-Ji Kim, Hee-Kyoung Kang, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, and Young Ho Kim. Steroidal constituents from the starfish Astropecthen polyacanthus and their anticancer effects. Chem. Pharm. Bull. 61(10) 1044-1051 (2013). 2. Nguyen Phuong Thao, Nguyen Xuan Cuong, Bui Thi Thuy Luyen, Tran Hong Quang, Tran Thi Hong Hanh, Sohyun Kim, Young-Sang Koh, Nguyen Hoai Nam, Phan Van Kiem, Chau Van Minh, and Young Ho Kim. Anti-inflammatory components of the starfish Astropecthen polyacanthus. Mar. Drugs 2013, 11, 2917-2926. 3. Nguyen Phuong Thao, Le Duc Dat, Ninh Thi Ngoc, Vu Anh Tu, Tran Thi Hong Hanh, Phan Thi Thanh Huong, Nguyen Xuan Nhiem, Bui Huu Tai, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Pham Van Cuong, Seo Young Yang, Sohyun Kim, Doobyeong Chae, Young-Sang Koh, , Phan Van Kiem, Chau Van Minh, and Young Ho Kim. Pyrrole and furan oligoglycosides from the starfish Asterina batheri and their inhibitory effect on the production of pro-inflammatory cytokine in lipopolysaccharide-stimulated bone marrow-derived dendritic cell. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 23 (2013) 1823-1827. 4. Trần Thị Hồng Hạnh, Nguyễn Phương Thảo, Lê Đức Đạt, Ninh Thị Ngọc, Phan Thị Thanh Hương, Vũ Anh Tú, Châu Ngọc Điệp, Nguyễn Tiến Đạt, Nguyễn Xuân Cường, Nguyễn Hoài Nam, Phan Văn Kiệm, Young Ho Kim, Châu Văn Minh. Các hợp chất steroid phân lập từ loài sao biển Astropecthen polyacanthus. Tạp chí Hóa học, Tập 51 (6ABC) 10-13, 2013. 5. Tran Thi Hong Hanh, Ninh Thi Ngoc, Le Đuc Đat, Phan Thi Thanh Huong, Nguyen Phuong Thao, Nguyen Tien Đat, Do Thi Thao, Nguyen Xuan Cuong, Nguyen Hoai Nam, Đo Cong Thung, Phan Van Kiem, Chau Van Minh. An anti-imflammatory pyrrole oligoglycoside from the starfish Asterina batheri living in Vietnamese seas. Journal of medicinal materials Vol.19, No.5, 279-283, 2014.