Tóm tắt Luận án Nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất có khả năng ức chế bơm ngược ở vi khuẩn

do (∆Gliên kết) được tính toán bằng phương pháp MM/GBSA. Tần suất hình thành liên kết hydro được phân tích bằng phần mềm VMD, các tương tác khác được thống kê bằng công cụ PLIF của MOE. - ADMET được dự đoán bằng ADMETlab2.0. Thử nghiệm in vitro: - Thử nghiệm hiệp đồng với KS bằng phương pháp pha loãng trong môi trường lỏng, resazurin làm chất chỉ thị màu. - Thử nghiệm tích lũy H33342 đo độ hấp thu ở Ex 355 nm/Em 460 nm bằng máy HTS Victor2 V 1420 Multilabel. 4. Kết quả 4.1. Tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Đề tài đã xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự 7 đoán tốt để tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus. Mô hình được lựa chọn để sàng lọc ảo gồm: (i) Mô hình PH4: truy vấn RHHH (1 vòng thơm, 3 nhóm kỵ nước) được xây dựng từ 5 EPI có cấu trúc đa dạng và hoạt tính ức chế bơm IC50 < 10 µM. Khả năng phân loại của mô hình được đánh dựa trên 32 EPI và 350 decoy cho giá trị Se=87,5%; Sp=91,43% và MCC=0,69. (ii) Mô hình docking có vị trị gắn kết tại khoang trung tâm được xác định bằng công cụ SiteFinder, Dock/MOE và Define Binding Site/LeadIT. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 32 EPI và 2000 decoy, cho giá trị ROC-AUC là 0,684. Từ cơ sở dữ liệu ban đầu hơn 9,2 triệu chất, các EPI NorA đã được sàng lọc qua mô hình PH4 RHHH và mô hình docking phân tử tại khoang trung tâm NorA với điểm số docking ≤ −20 kJ/mol. Kết quả đã phát hiện được 498 chất từ tập DrugBank, 2.296 chất từ tập ZINC15, 137 chất từ tập TCM, 7 chất từ VKN và 12 chất từ tập dữ liệu nội bộ. Sau sàng lọc ảo, ClassyFire đã phân loại cấu trúc 2.950 EPI tiềm năng thành 12 nhóm cấu trúc chính, trong đó hợp chất dị vòng chiếm hơn 50%. Cấu trúc phổ biến là indol, amid, chalcon và quinolin. 12 chất nội bộ thoả các mô hình sàng lọc ảo EPI trên NorA gồm 6 chalcon, 3 dẫn xuất thiosemicarbazon, 1 dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid và 2 flavonol. Mô phỏng MD 20 ns với 10 EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo, sau đó mô phỏng MD 300 ns với 2 EPI được dự đoán tốt nhất là DB06364 và TCM22216. Kết quả MD xác định các acid amin tham gia gắn kết với các EPI trong suốt quá trình mô phỏng tại 8 khoang gắn kết là Asp 307, Glu 222, Phe 140, Asn 137, Asn 340 và Gln 51. Kết quả MD 300 ns cho thấy NorA tạo thành phức hợp bền vững với hai phối tử là DB06364 và TCM22216 với ∆Gliên kết tương ứng là −56,60 và −56,44 kcal/mol. Phân tích PCA và RMSF Cα cho thấy sự liên kết của các hợp chất trong quá trình mô phỏng không làm thay đổi đáng kể hình dạng của protein, đặc biệt là ở vị trí gắn kết. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo đều có tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống. 4.2. Tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Đề tài đã xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự đoán tốt để tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa. Mô hình được lựa chọn để sàng lọc ảo gồm: (i) Mô hình PH4: RHHa (1 vòng thơm, 2 nhóm kỵ nước và 1 hình chiếu điểm nhận liên kết hydro) được xây dựng từ 5 EPI có cấu trúc đa dạng và hoạt tính ức chế bơm MPC8 dưới 5 µM. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 19 EPI (MPC8 dưới 5 µM) và 700 decoy, cho giá trị Se=84,2%; Sp=98,3%, MCC=0,68. (ii) Mô hình 2D-QSAR được xây dựng từ 47 EPI có giá trị hoạt tính MPC8 trên aztreonam ở chủng P. aeruginosa PAM1723. Các thông số xây dựng mô hình gồm: F06[N-O], BCUT_SMR_0, PEOE_VSA-0, SMR_VSA2, MATS8p. Các giá trị đánh giá khả năng dự đoán của mô hình: Q2=0,71; 𝑅𝑝𝑟𝑒𝑑 2 =0,88, RMSE tập kiểm tra =0,25, 𝑟𝑚 2̅̅ ̅ tập kiểm tra =0,68, 𝑟𝑚 2 tập kiểm tra =0,17. 9 (iii) Mô hình docking tại túi xa có vị trị gắn kết được xác định bằng công cụ SiteFinder, Dock/MOE và Define Binding Site/LeadIT. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 129 EPI và 700 decoy, cho giá trị ROC-AUC là 0,678. Sàng lọc các EPI MexAB-OprM bằng các mô hình sàng lọc ảo với các yêu cầu cụ thể như thỏa mô hình PH4 RHHa, có giá trị hoạt tính MPC8 dự đoán < 10 µM và có điểm số docking ≤ −20 kJ/mol. Riêng tập ZINC15 do có số lượng chất lớn (9,2 triệu chất) đề tài chỉ chọn chất có MPC8 < 3 µM để tiết kiệm tài nguyên máy tính và thời gian nghiên cứu. Kết quả đã phát hiện được 17 chất từ tập DrugBank, 593 chất từ tập ZINC15, 1 chất từ tập TCM (TCM- 28434), không có chất nào từ VKN và dữ liệu nội bộ. ClassyFire đã phân loại cấu trúc 611 EPI tiềm năng thành 8 nhóm chính, trong đó, các hợp chất dị vòng chiếm hơn 60%, cấu trúc phổ biến nhất là dẫn xuất amid, piperazin, pyridin, pyrazol, acid benzoic và piperidin. Mô phỏng MD 20 ns được thực hiện cho 10 EPI tiềm năng nhất từ các mô hình sàng lọc ảo, sau đó, thực hiện mô phỏng MD 100 ns cho 2 phối tử ổn định và có khả năng gắn kết mạnh nhất (ZINC009296881 và ZINC009200074). Kết quả MD cho thấy các acid amin có tần suất gắn kết cao với EPI tại túi xa MexB là Lys 134, Phe 136, Phe 178, Tyr 327, Phe 615, Phe 617, và Leu 672. ZINC009296881 và ZINC009200074 đều có giá trị ∆Gliên kết tốt với MexB là –38,97 và –30,19 kcal/mol. Phân tích PCA và RMSF Cα cho thấy sự liên kết của các hợp chất trong quá trình mô phỏng đã gây ra tác động làm thay đổi đáng kể cấu dạng protein ở vị trí 10 vòng β (Ser 215-Ile 235) thuộc miền phễu gắn với kênh màng ngoài OprM, nhưng không làm thay đổi đáng kể các acid amin ở vị trí gắn kết túi xa. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo đều có tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống. 4.3. Tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Đề tài xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự đoán tốt để tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli. Mô hình được lựa chọn để sàng lọc ảo gồm: (i) Mô hình PH4: truy vấn RHHa (1 vòng thơm, 2 nhóm kỵ nước và 1 hình chiếu điểm nhận liên kết hydro) được xây dựng từ 5 EPI có cấu trúc đa dạng và hoạt tính ức chế bơm MPC4 dưới 5 µM. Mô hình được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 33 EPI (MPC4 dưới 5 µM) và 1629 decoy cho giá trị Se=96,9%, Sp=96,7%, và MCC=0,59. (ii) Mô hình 2D-QSAR: Mô hình 1 và mô hình 3 được xây dựng với giá trị hoạt tính tương ứng là MPC4 trên nhiều loại KS (115 chất) và MPC4 trên cùng 1 loại KS levofloxacin (54 chất). Phương trình mô hình 1: pMPC4 = 4,20711 + 3,04890*EEig12d - 2,58468*SlogP_VSA7 + 0,39631*MATS2m -1,29129*MATS5v Phương trình mô hình 3: pMPC4 = 3,52924 - 1,20213*GATS1p + 0,82656*nCb- + 2,95859*X0v Các giá trị đánh giá khả năng dự đoán của mô hình 1 và 3: Q2 là 0,83 và 0,89; 𝑅𝑝𝑟𝑒𝑑 2 0,93 và 0,90; RMSEtập kiểm tra là 0,30 và 0,38; 𝑟𝑚 2̅̅ ̅ tập kiểm tra là 0,81 và 0,75, 𝑟𝑚 2 tập kiểm tra 0,12 và 0,11. 11 (iii) Mô hình docking: hai vị trí gắn kết Túi xa (ROC- AUC=0,827), Túi gần (ROC-AUC=0,706) được xác định dựa vào phạm vi bán kính 6,5 Å từ phối tử đồng kết tinh tại hai chuỗi B và A của protein 4DX7. Đồng thời hai vị trí gắn kết này được đánh giá khả năng phân loại dựa trên 159 EPI và 1629 decoy. Ngân hàng dữ liệu được sàng lọc lần lượt qua các mô hình in silico để tìm kiếm các EPI trên AcrAB-TolC với các điều kiện ràng buộc giống với quá trình sàng lọc các EPI trên MexAB-OprM. Tuy nhiên, mô hình 2D-QSAR sử dụng để sàng lọc EPI AcrAB-TolC là mô hình kép gồm hai mô hình dự đoán 1 và 3. Quá trình docking được thực hiện đồng thời cho 2 vị trí gắn kết là túi gần và túi xa. Một chất được cho là có tiềm năng khi có điểm số docking tại một trong hai vị trí gắn kết ≤ −20 kJ/mol. Tại vị trí túi xa, xác định được 34 chất tiềm năng từ DrugBank, 107 chất từ ZINC15, 30 chất từ TCM, và 2 chất nội bộ. Tại vị trí túi gần, các EPI tiềm năng được đề xuất gồm 32 chất từ DrugBank, 82 chất từ ZINC15, 9 chất từ TCM và 1 chất nội bộ. Sử dụng ClassyFire để phân loại cấu trúc các EPI tiềm năng, kết quả cho thấy các EPI tiềm năng được chia thành 9 nhóm cấu trúc chính với hơn 50% là hợp chất dị vòng, cấu trúc chiếm ưu thế là amid, piperazin, quinolin, benzodioxol, phenylpiperidin, acid benzoic và morpholin. Từ các hợp chất nội bộ NB1, hai chất có điểm số docking tốt nhất trên túi xa là A4 và A9, tốt nhất trên túi gần là A9; cả hai chất đều thuộc nhóm dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid. Tương tự như trong mô phỏng MD với MexB, mô phỏng MD với AcrB cũng được tiến hành với quá trình 20 ns cho 10 chất tốt 12 nhất từ sàng lọc ảo và 100 ns cho 2 phức hợp ổn định và có khả năng gắn kết mạnh nhất ở mỗi vị trí gắn kết là DB02581-AcrBtúi xa, DB09233-AcrBtúi xa, DB02581- AcrBtúi gần và DB15224- AcrBtúi gần. Cả 4 phức hợp đều có giá trị ∆Gliên kết dưới −30 kcal/mol. Kết quả thống kê các acid amin tham gia tương tác trong quá trình mô phỏng MD thấy rằng ở túi gần, các acid amin có tần suất liên kết cao là Leu 564, Asp 566, Glu 640, Glu 645, Arg 653, và Ala 677. Các acid amin có tần suất gắn kết cao tại túi xa được xác định trong quá trình mô phỏng MD là Ser 134, Phe 136, Gln 176, Phe 178, Phe 615, Phe 617, Arg 620, Phe 628, Val 672, và Glu 673. Kết quả phân tích RMSF Cα và PCA cho thấy các acid amin có sự dao động mạnh trong quá trình mô phỏng MD là vị trí Ala 215-Ile 235 trên vòng β và các acid amin His 505-Pro 560 trên xoắn α; còn các acid amin tại vị trí gắn kết đều có độ ổn định cao. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo đều có tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống. 4.4. Khảo sát hoạt tính ức chế bơm ngược AcrAB-TolC in vitro Kết quả thử nghiệm in vitro trên chứng dương NMP cho thấy, NMP làm tăng tác dụng của KS bị đề kháng bởi bơm ngược, đồng thời làm tăng tích lũy H33342 mạnh hơn ở chủng đột biến tăng bơm so với chủng hoang dại và ảnh hưởng không đáng kể trên chủng mất bơm (Bảng 3.13). Như vậy, mô hình thử nghiệm in vitro phù hợp để khảo sát hoạt tính ức chế bơm AcrB ở E. coli. Từ kết quả sàng lọc ảo các EPI trên AcrAB-TolC, đề tài đã thu thập được DB01254 và hai hợp chất nội bộ là A4, A9 để tiến hành thử nghiệm hoạt tính ức chế bơm in vitro. Kết quả in vitro cho thấy 13 A4 và DB01254 tác dụng trực tiếp trên bơm E. coli AcrAB-TolC và làm giảm MIC của KS bị đề kháng do bơm, trong khi đó, A9 không có tác dụng ức chế bơm đáng kể (Bảng 3.13). Bảng 3.13. Kết quả thử nghiệm hoạt tính ức chế bơm AcrAB- TolC in vitro của DB01254, A4, và A9 Chất Mức độ giảm MIC KS (lần) (200 µM) Tỷ lệ % mức độ tăng tích lũy H33342 so với chứng âm (50 µM) Levofloxacin Oxacilin BW25113 ∆acrR ∆acrB NMP 4* 4* 66 87 14 DB01254 2 4 49 179 28 A4 2 4 76 52 9 A9 2 2 10 - - *NMP làm giảm MIC KS ở nồng độ 50 µM; (-) không thực hiện Để đánh giá thêm tiềm năng ức chế bơm AcrAB-TolC của các dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid nội bộ, đề tài tiến hành đánh giá hoạt tính của các hợp chất A1, A2, A3, A4, và A9. Kết quả thử nghiệm cho thấy các chất có hoạt tính ức chế bơm giảm dần theo thứ tự A4>A3>A2>A1>A9 (Bảng 3.14). Để đánh giá khả năng dự đoán của mô hình sàng lọc ảo, 30 hợp chất được lựa chọn tiến hành thử nghiệm in vitro. Do chứng dương NMP có MPC4 là 50 µM nên đề tài sử dụng những chất có MPC4 dự đoán ≤ 100 µM để khảo sát. Dựa trên khả năng tiếp cận với các chất thử trong thực nghiệm, đề tài chọn ra 30 chất có mức độ phù hợp với các mô hình sàng lọc ảo (PH4, 2D-QSAR, docking) khác nhau. Các chất được chia thành 7 nhóm thử nghiệm sao cho mỗi nhóm gồm tối thiểu 3 chất. Mức độ phù hợp với thử 14 nghiệm in silico được xác định như sau: thỏa/không thỏa mô hình PH4 RHHA; có/không có MPC4 dự đoán bằng cả 2 mô hình QSAR mô hình 1 và mô hình 3 đều dưới 100 µM; có/không có điểm số docking tại túi xa hoặc túi gần ≤ –20 kJ/mol. Bảng 3.14. Cấu trúc, hoạt tính ức chế bơm AcrAB-TolC của các dẫn chất imidazol-4,5-dicarboxamid Mã chất 2 3 4 5 Số lần giảm MIC KS (100 µM) Tỷ lệ % tăng tích lũy H33342 (100 µM) ∆Gliên kết 20 ns (kcal/mol) A1 - - - - 2 17% −10,43 A2 Cl - - - 2 23% −20,34 A3 - Cl Cl - 2 28% −31,09 A4 Cl - Cl Cl 4 88% −28,21 A9 NO2 - Cl - 2 10% −20,50 Trong thử nghiệm in vitro, chất có tác dụng hiệp đồng KS khi chất đó làm giảm MIC của levofloxacin và/hoặc oxacilin từ 2 đến 4 lần ở nồng độ ≤ 200 µM. Chất có tác dụng ức chế bơm AcrB được xác định khi có khả năng làm tăng tích lũy H33342 trên chủng vi khuẩn có bơm và không ảnh hưởng đáng kể trên chủng mất bơm. Để đánh giá khả năng phân loại chất có tác dụng và không có tác dụng của các mô hình in silico một cách chi tiết, nghiên cứu đã tiến hành thống kê như các giá trị như Se, Sp, Acc, Ya, E, GH và MCC (Bảng 4.8). 15 Bảng 4.8. Phân tích thống kê kết quả sàng lọc in silico với thử nghiệm in vitro Điều kiện in silico Se Sp Acc Ya E GH MCC Tác dụng hiệp đồng KS PH4 0,73 0,32 0,47 0,38 13,76 0,15 0,05 QSAR 0,73 0,74 0,73 0,62 22,22 0,47 0,45 Docking 0,73 0,68 0,70 0,57 20,63 0,42 0,40 PH4+QSAR 0,55 0,79 0,70 0,60 21,66 0,46 0,34 PH4+Dock 0,64 0,79 0,73 0,64 22,98 0,50 0,43 PH4+QSAR+Docking 0,55 1,00 0,83 1,00 36,11 0,89 0,66 Tác dụng ức chế bơm AcrB PH4 1,00 0,33 0,40 0,14 5,16 0,12 0,22 QSAR 0,67 0,59 0,60 0,15 5,55 0,17 0,16 Docking 1,00 0,59 0,63 0,21 7,74 0,24 0,36 PH4+QSAR 0,67 0,70 0,70 0,20 7,22 0,22 0,24 PH4+Dock 1,00 0,70 0,73 0,27 9,85 0,32 0,44 PH4+QSAR+Docking 0,67 0,85 0,83 0,33 12,04 0,35 0,39 5. Bàn luận 5.1. Tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Cấu trúc độ phân giải cao của NorA (7LO8) mới được công bố gần đây, nên các nghiên cứu dựa trên cấu trúc trước đây chủ yếu là mô hình tương đồng. Trong khi đó, nhiều nghiên cứu dựa trên phối tử trong và ngoài nước, đặc biệt là các mô hình 2D-QSAR đã được công bố. Trong nghiên cứu này, cấu trúc mới 7LO8 được sử dụng để xây dựng các mô hình docking, MD nhằm bổ sung cho các quan điểm trước đây, đồng thời mô hình PH4 dựa trên phối tử được xây dựng để sàng lọc nhanh các EPI NorA từ các cơ sở dữ liệu. Dự đoán ADMET cũng được tiến hành để đánh giá tiềm năng phát triển thành thuốc đường uống của các EPI sau sàng lọc ảo. 16 So với các nghiên cứu trước, truy vấn PH4 RHHH trong nghiên cứu nhấn mạnh vào tính kỵ nước của các EPI, phù hợp và bổ sung cho các nghiên cứu trước đó của Brincat 2012, Ngo 2016. Vị trí gắn kết trùng với khoang trung tâm, phù hợp với các nghiên cứu trước đó của Bhaskar 2016 và Felicetti 2022. Cấu trúc 7LO8 của NorA lần đầu tiên được thực hiện mô phỏng MD 20 ns với 10 EPI tiềm năng, sau đó là mô phỏng MD 300 ns với 2 EPI được dự đoán tốt nhất là DB06364 và TCM22216. Nghiên cứu này củng cố giả thiết của Handzlik 2013 về cấu trúc các EPI NorA mạnh gồm liên kết đôi liên hợp, các gốc indol, dihydronaphthyl-, 2-cloro-5-bromo-phenyl- hoặc piperidin thường làm tăng hoạt tính, đồng thời bổ sung các khung cấu trúc tiềm năng mới như quinolin, pyrol, piperazin và quinazolin. Ngoài ra, kết quả SAR của 6 chalcon nội bộ phù hợp với kết luận của Le 2022. Nhìn chung, các EPI NorA tiềm năng có các thuộc tính như: tối thiểu ba điểm kỵ nước, ít nhất một vòng thơm; nhóm nhận liên kết hydro và dị vòng nitơ thường làm tăng hoạt tính EPI, nhóm nitro làm giảm khả năng gắn kết. 5.2. Tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Các mô hình in silico dựa trên phối tử là các EPI trên MexAB- OprM còn rất hạn chế, đặc biệt chưa có công bố nào về mô hình hồi quy 2D-QSAR. Vì vậy, nghiên cứu này đã phát triển các mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính MPC8 của các EPI, giúp định hướng cho sự thay đổi cấu trúc nhằm tăng hoạt tính. Bên cạnh đó, 17 mô hình PH4 dựa trên các phối tử được xây dựng giúp sàng lọc nhanh các EPI tiềm năng từ ngân hàng dữ liệu. Đồng thời, docking phân tử với cấu trúc 6IIA được thực hiện nhằm khẳng định lại khả năng gắn kết vào túi xa của MexB của các EPI. Đây là vị trí gắn kết quan trọng đã được công bố trước đó. Sau đó, mô phỏng MD và dự đoán ADMET được tiến hành trên các EPI tiềm năng sau sàng lọc ảo nhằm làm rõ cơ chế gắn kết và khả năng phát triển thành thuốc đường uống. So với mô hình PH4 của Aparna và cộng sự, bên cạnh yếu tố vòng thơm và điểm nhận liên kết hydro, truy vấn RHHa của đề tài nhấn mạnh hơn vào tính kỵ nước của EPI giống với mô hình PH4 của Nakayama 2004. Mô hình 2D-QSAR các EPI trên MexAB-OprM lần đầu tiên đã được phát triển. Các đặc tính lý hóa được nhấn mạnh trong mô hình 2D- là yếu tố diện tích bề mặt Van der Waals, độ phân cực, và độ âm điện. Bên cạnh đó, việc lựa chọn các thông số có mức độ tương quan với nhau dưới 20%, giúp đa dạng hóa tối đa các thông tin phân tử có liên quan đến hoạt tính. Các acid amin tại túi xa tham gia gắn kết với các EPI trùng với các công bố trước đây của Nakashima 2013, Aparna 2014, Dey 2020, và Gervasoni 2022 gồm Lys 134, Phe 136, Phe 615 và Phe 617. Mô phỏng MD 20 ns được thực hiện cho 10 hợp chất có tiềm năng nhất từ các mô hình sàng lọc ảo, sau đó, mô phỏng MD 100 ns cho 2 phức hợp ổn định và có khả năng gắn kết mạnh nhất được thực hiện. Thống kê các acid amin tham gia tương tác trong quá 18 trình MD cho thấy sự tham gia tương tác của Phe 178, Tyr 327 và Phe 615 trùng với kết quả nghiên cứu của Kumar 2020. Nhìn chung, các EPI tiềm năng trên MexAB-OprM đa số đều có hai vòng kỵ nước, ít nhất là một dị vòng chứa nitơ; các nhóm thế halogeno làm tăng tương tác kỵ nước; nhóm cho liên kết hydro làm tăng khả năng gắn kết. Bên cạnh các dị vòng nitơ pyridin, indol, và quinolin giống với giả thiết của Lamut 2019 về các EPI mạnh, đề tài đề nghị một số dị vòng khác như piperazin, pyrazol, piperidin, oxadiazol, benzylpiperidin, benzodiazepin, purin, và triazol. 5.3. Tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính Tương tự như các mô hình in silico trên các EPI ở MexAB- OprM, các mô hình sàng lọc ảo dựa trên phối tử ở bơm AcrAB- TolC còn rất hạn chế. Vì vậy, mô hình PH4 dựa trên các phối tử và mô hình 2D-QSAR dự đoán hoạt tính MPC4 của các EPI đã được xây dựng nhằm bổ sung các cho mô hình in silico hiện có, giúp sàng lọc nhanh và định hướng cho sự thay đổi cấu trúc nhằm tăng hoạt tính các EPI. Mô hình docking phân tử với cấu trúc 4DX7 được thực hiện nhằm khẳng định lại khả năng gắn kết vào túi xa của AcrB, vị trí gắn kết quan trọng đã được công bố. Đồng thời, đề tài phát triển thêm mô hình docking tại vị trí gắn kết túi gần, khu vực truy cập của cơ chất, giúp tìm ra các phối tử có khả năng gắn kết vào nhiều vị trí khác nhau của AcrB. Cuối cùng, mô phỏng MD và dự đoán ADMET cũng được tiến hành cho các EPI tiềm năng. 19 Truy vấn PH4 RHHa tương đồng với truy vấn các EPI của bơm MexAB-OprM đã xây dựng. Điều này cho thấy, do tính tương đồng cao về cấu trúc và chức năng của hai bơm ngược này nên các EPI cũng có sự tương đồng về đặc điểm hóa học thiết yếu. Bên cạnh đó, các mô hình hồi quy 2D-QSAR có khả năng dự đoán tốt hoạt tính MPC4 của các EPI khi phối hợp với KS lần đầu tiên đã được xây dựng. Từ các thông số mô tả của các mô hình 2D- QSAR, các tính chất lý hóa cần thiết cho sự ức chế bơm AcrAB- TolC được nhấn mạnh là độ âm điện, độ phân cực, diện tích bề mặt Van der Waals, và vòng thơm. Các đặc tính này tương tự với các tính chất được quan tâm cho các EPI trên MexAB-OprM. Thống kê kết quả docking các EPI cho thấy các acid amin có tần suất gắn kết cao tại túi xa như Gln 176, Phe 178 và Phe 615 trùng với các công bố trước đó của Jamshidi 2018, Grimsey 2020 và Wang 2021. Mô phỏng MD được tiến hành với quá trình 20 ns cho 10 chất tốt nhất từ sàng lọc ảo và 100 ns cho 2 phức hợp ổn định và có khả năng gắn kết mạnh nhất ở mỗi vị trí gắn kết túi gần/túi xa. Kết quả thống kê các acid amin tham gia tương tác trong quá trình MD cho thấy tại túi xa ngoại trừ Phe 628 chưa được công bố về vai trò gắn kết, các acid amin còn lại đều giống với các công bố MD trước đó của Jamshidi 2018, và Grimsey 2020. Cấu trúc của các EPI trên AcrAB-TolC có sự tương đồng khá cao với các EPI trên MexAB-OprM, đặc biệt là các khung cấu trúc dị vòng như piperazin, quinolin, piperidin. Bên cạnh đó, nghiên cứu còn đề xuất một số khung cấu trúc EPI mới như phenyl 20 piperidin, morpholin, strychnos alkaloid, imidazol. Ngoài ra, từ ngân hàng nội bộ, dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid A4 và A9 được mô hình in silico dự đoán ức chế AcrAB-TolC tốt. 5.4. Khảo sát hoạt tính ức chế bơm ngược AcrAB-TolC in vitro Từ kết quả sàng lọc ảo các EPI trên AcrAB-TolC, nghiên cứu đã tìm ra và thu thập được 3 hợp chất tiềm năng. Thử nghiệm in vitro cho thấy, A4 và DB01254 có tác dụng trực tiếp trên bơm AcrAB-TolC và làm giảm MIC của KS bị đề kháng do bơm. Phân tích SAR của các dẫn xuất imidazol-4,5-dicarboxamid (A1, A2, A3, A4 và A9) cho thấy vòng imidazol, vòng morpholin và nhóm ceton cần thiết để tạo nên bốn điểm RHHa. So sánh hoạt tính ức chế bơm AcrB của 5 chất thử nghiệm, tỷ lệ % mức độ tăng tích lũy H33342 tăng dần theo số lượng nhóm thế cloro trong vòng phenyl. Hơn nữa, khi thay nhóm thế cloro bằng nhóm nitro (A9) hoạt tính ức chế bơm AcrB giảm. Bên cạnh đó, thử nghiệm in vitro còn phát hiện nhóm dẫn xuất depsid (T-02, 08, 09) và depsidon (T-05) phân lập từ địa y Usnea aciculifera, có tiềm năng ức chế bơm AcrAB-TolC. Trong đó, T- 08 là chất có tác dụng ức chế bơm AcrB mạnh nhất. Ngoài ra, hai saponin phân lập từ quả Solanum torvum S1 và S2 được phát hiện có tác dụng đặc biệt là giảm MIC của KS bị đề kháng, làm tăng vọt sự tích lũy H33342 ở chủng hoang dại và chủng tăng bơm, nhưng đồng thời cũng tăng đáng kể sự tích lũy H33342 ở chủng mất bơm. Do đó, S1 và S2 được đề nghị có cơ chế tác dụng khác, dự đoán liên quan tính thấm của màng tế bào. Đánh giá khả năng dự đoán phân loại của các mô hình in silico 21 qua kết quả phân tích ở Bảng 4.8 cho thấy các mô hình sàng lọc ảo đều có giá trị MCC dương, nghĩa là mô hình dự đoán tương quan thuận với kết quả thử nghiệm sinh học. Mô hình PH4 tuy có độ nhạy cao nhưng độ đặc hiệu, điểm GH và MCC thấp, chỉ thích hợp trong việc sàng lọc nhanh từ cơ sở dữ liệu lớn ban đầu. Khi phối hợp các mô hình in silico (PH4, 2D-QSAR, docking) cùng lúc giúp tăng đáng kể khả năng phân loại các EPI. Điều này thể hiện ở điểm GH của mô hình phối hợp tăng rõ rệt trong dự đoán tác dụng hiệp đồng KS là 0,89, đồng thời độ chính xác Ya hay còn gọi là giá trị tiên đoán dương của mô hình là 1,00. Bên cạnh đó, phân tích dựa vào hệ số MCC để đánh giá khả năng dự đoán hoạt tính ức chế bơm AcrB cho thấy mô hình phối hợp PH4+Docking có khả năng dự đoán tốt, thích hợp để sàng lọc trên cơ sở dữ liệu nhỏ như dữ liệu nội bộ trước khi thử hoạt tính sinh học. 6. Kết luận và kiến nghị Nghiên cứu này đã thực hiện được mục tiêu đặt ra ban đầu với bốn nội dung, cụ thể như sau: 1. Tìm kiếm các chất ức chế bơm NorA ở S. aureus từ các ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính: Nghiên cứu đã xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự đoán tốt các EPI trên NorA gồm: 2 mô hình PH4 (HHHa và RHHH), 1 mô hình docking phân tử tại khoang trung tâm của 7LO8 (cấu trúc NorA chụp bằng kính hiển vi điện tử nghiệm lạnh mới được công bố năm 2022). Sàng lọc ảo từ ngân hàng dữ liệu bằng mô hình kết hợp PH4 (RHHH) và docking đã phát hiện 2.950 EPI tiềm năng, với 50% là các hợp chất dị vòng. Các cấu trúc phổ 22 biến của các EPI tiềm năng là indol (8,43%), dẫn xuất amid (8,28%), chalcon (7,25%). Mô phỏng MD đã phát hiện các hợp chất EPI tiềm năng là DB06364 (XR5944 chống ung thư mục tiêu DNA) và TCM22216 (chất mới) có ∆Gliên kết 300 ns là -56,60 và - 56,44 kcal/mol. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng có khả năng phát triển thành thuốc đường uống. Đề tài còn tìm thấy các chalcon, flavonoid, imidazol-4,5-carboxamid và dẫn xuất thiosemicarbazon nội bộ là những ứng viên EPI triển vọng trên NorA. 2. Tìm kiếm các chất ức chế bơm MexAB-OprM ở P. aeruginosa từ ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính: Các mô hình in silico có khả năng dự đoán tốt EPI trên MexAB-OprM được xây dựng gồm: 1 mô hình PH4 (RHHa), 2 mô hình 2D-QSAR và 1 mô hình docking phân tử tại túi gắn kết xa của MexB. Trong đó, mô hình hồi quy 2D-QSAR lần đầu tiên được xây dựng nhằm dự đoán hoạt tính MPC8 của các EPI có tác dụng hiệp đồng với KS bị đề kháng do bơm MexAB-OprM. Sàng lọc ảo các EPI trên MexAB-OprM từ ngân hàng dữ liệu bằng mô hình kết hợp PH4, QSAR, docking đã phát hiện 611 EPI tiềm năng với 60% là các hợp chất dị vòng. Trong đó, các cấu trúc phổ biến là dẫn xuất amid (9,2%), piperazin (8,5%), và pyridin (6,5%). Mô phỏng MD đã phát hiện các EPI tiềm năng là hai chất mới ZINC009291881 và ZINC009200074 có ∆Gliên kết 100 ns với MexB là -38,97 và -30,19 kcal/mol. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng có khả năng phát triển thành thuốc đường uống. 3. Tìm kiếm các chất ức chế bơm AcrAB-TolC ở E. coli từ các 23 ngân hàng dữ liệu dựa vào các công cụ máy tính: Đề tài đã xây dựng được các mô hình in silico có khả năng dự đoán tốt các EPI trên AcrAB-TolC gồm: 1 mô hình PH4 (RHHa), 4 mô hình 2D-QSAR, 2 mô hình docking phân tử tại túi xa và túi gần của bơm AcrB. Trong đó, các mô hình hồi quy 2D-QSAR lần đầu tiên được xây dựng nhằm dự đoán hoạt tính MPC4 của các EPI khi hiệp đồng với các KS bị đề kháng do bơm AcrAB-TolC. Sàng lọc ảo các EPI trên AcrAB-TolC từ ngân hàng dữ liệu bằng mô hình kết hợp PH4, QSAR, docking tìm thấy hơn 170 EPI tiềm năng với 52% các hợp chất dị vòng. Các cấu trúc phổ biến gồm dẫn xuất amid (15,4%), piperazin (9,2%), quinolin (4,6%) và benzodioxol (4,1%). Mô phỏng MD đã phát hiện các EPI tiềm năng là DB02581 (ức chế thụ thể interleukin-2), DB09233 (cronidipin-thuốc chẹn kênh calci), DB15224 (lisavabulin-nghiên cứu lâm sàng pha 1/2a trong điều trị khối u) với ∆Gliên kết 100 ns là -40,76 kcal/mol, -42,30 kcal/mol và -31,06 kcal/mol. Đề tài còn tìm thấy các EPI tiềm năng là dẫn xuất imidazol-4,5-carboxamid, những hợp chất hoàn toàn mới, tổng hợp nội bộ và chưa từng được công bố về tác dụng ức chế bơm. Dự đoán ADMET cho thấy các EPI tiềm năng có khả năng phát triển thành thuốc đường uống. 4. Khảo sát hoạt tính ức chế bơm ngược AcrAB-TolC in vitro: Kết quả thử nghiệm hoạt tính sinh học giúp củng cố các giả thiết của các mô hình sàng lọc ảo các EPI trên bơm AcrAB-TolC ở E. coli. Phân tích khả năng dự đoán của các mô hình in silico trên 30 chất thử nghiệm cho thấy mô hình sàng lọc ảo kết hợp có khả năng phân loại dự đoán hoạt tính tốt nhất. 24 Thử nghiệm in vitro đã xác nhận hoạt tính ức chế bơm AcrAB- TolC của DB01254-dasatinid (thuốc ức chế tyrosin kinase đang sử dụng trên lâm sàng), A4-dẫn xuất imidazol-4,5-carboxamid (tổng hợp nội bộ) và T-08-dẫn xuất depsid đặc trưng trong loài địa y (phân lập nội bộ) bằng hai thử nghiệm hiệp đồng KS và tăng tích lũy huỳnh quang H33342. Một số kiến nghị được rút ra từ đề tài nghiên cứu này, gợi ý cho các hướng nghiên cứu tiếp theo trên bơm ngược và các EPI: • Phân tích sâu động lực học phân tử để làm rõ cơ chế gắn kết của EPI và cơ chất của bơm. • Xem xét khả năng tương tác thuốc có thể xảy ra do hiệu quả ức chế bơm, cũng như độ an toàn và độc tính của các chất nghiên cứu, đặc biệt là độc tính trên gan. • Thu thập các chủng vi khuẩn cần thiết để mở rộng mô hình thử nghiệm in vitro trên các bơm MexAB-OprM, NorA và các bơm khác. • Thử nghiệm với nhiều mô hình in vitro và in vivo khác nhau để kiểm tra khả năng ức chế bơm, khảo sát thêm hoạt tính làm thay đổi tính thấm của màng tế bào. • Đối với các chất ức chế AcrAB-TolC khởi nguồn (imidazol-4,5- dicarboxamid, A4; dẫn xuất depsid, T-08) có thể nghiên cứu tối ưu hóa cấu trúc nhằm thu được ứng viên thuốc có tiềm lực mạnh hơn và an toàn hơn trước khi tiến hành các bước thực nghiệm sâu hơn. DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 1. Thien-Vy Phan, Vu-Thuy-Vy Nguyen, Cao-Hoang-Hao Nguyen, Thanh-Thao Vu, Thanh-Dao Tran, Minh-Tri Le, Dieu- Thuong Thi Trinh, Viet-Hung Tran and Khac-Minh Thai (2023), “Discovery of AcrAB-TolC pump inhibitors: Virtual screening and molecular dynamics simulation approach”, Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 1-18. doi:10.1080/07391102.2023.2175381 2. Thien-Vy Phan, Phuong Nguyen Hoai Huynh, Vu-Thuy-Vy Nguyen, Thanh-Phuc Nguyen, Thanh-Thao Vu, Cam-Van Thi Vo, Minh-Tri Le, Bao Gia Dang Nguyen, Phuong Truong and Khac- Minh Thai (2023), “Discovery of novel AcrAB-TolC pump inhibitor by multistep virtual screening, synthesis and biological evaluation of asymmetric imidazole-4,5-dicarboxamide derivatives”, New Journal of Chemistry. doi: 10.1039/d3nj01603j 3. Thien-Vy Phan, Vu-Thuy-Vy Nguyen, Minh-Tri Le, Bao Gia Dang Nguyen, Thanh-Thao Vu and Khac-Minh Thai (2023), “Identification of effux pump inhibitors for Pseudomonas aeruginosa MexAB-OprM via ligand-based pharmacophores, 2D-QSAR, molecular docking, and molecular dynamics approaches”, Molecular Diversity. doi: 10.1007/s11030-023- 10758-9 4. Thai Khac Minh, Tran Thanh Dao, Phan Thien Vy, Do Tran Giang Son, Hoang Tung, Nguyen Hoang Minh, Le Minh Tri (2019), “Efflux Pumps and These Inhibitors”, VNU Journal of Science: Medical and Pharmaceutical Sciences, 35(2). doi:10.25073/2588-1132/vnumps.4188